本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學診斷領域，特別涉及一種快速定量同時檢測cTnI、CKMB、Myo時間分辨熒光免疫層析試劑及其制備方法。
背景技術：
：肌鈣蛋白是有肌鈣蛋白T(cTnT)，肌鈣蛋白C(cTnC),肌鈣蛋白I(cTnI)三個亞單位組成的復合體。cTnI的分子量為22.5kD，多肽的N端較骨骼肌TnI多26個氨基酸，氨基酸順序差異達40％，因而抗原性與骨骼肌明顯不同。cTnI作為一種新的診斷標志物被應用于急性心肌梗死(AMI)的臨床診斷，特別是對那些沒有心電圖診斷的患者更加重要。當AMI時，cTnI會在4～8小時內從損傷的心肌細胞釋放到血液中，并超出正常濃度范圍。通常，AMI發(fā)病12～18小時后，達到最高濃度，在5～10天內維持高值。在美國心臟病學會和美國心臟協(xié)會的最新指南顯示，由于對心肌的高特異性和診斷效率等原因，cTnI對檢測心肌功能障礙，具有較高的應用價值。肌紅蛋白(MYO)是橫紋肌組織特有的一種含有亞鐵血紅素的低分子色素蛋白，主要分布在心肌和骨骼肌組織中。在急性心肌損傷時，MYO最先被釋放到血液中，在癥狀出現(xiàn)2-3小時后MYO值超出正常上限，9-12小時達到峰值，24-36小時恢復正常。血清中肌紅蛋白可作為急性心肌梗死(AIM：acuteMyocardialinfarction)診斷的早期最靈敏的指標，但其特異性較差，骨骼肌損傷、創(chuàng)傷、腎功能衰竭等疾病都有可能導致其升高。所以MYO陽性雖不能確診AMI但可以用于早期排除AMI診斷的重要指標，如MYO陰性，則基本排除心肌梗死的可能。MYO還可以用于再梗死的診斷，結合臨床，如MYO重新升高，應考慮為再梗死或梗死延展。CK-MB是肌酸激酶(CK)的三個異構體(另兩個是CK-BB和CK-MM)之一。CK是一種肌肉代謝的主酶。CK-MB由兩個亞單位組成(MW＝40000每個)：亞單位M表示肌肉，亞單位B表示大腦。CK-MB主要存在于心肌中，少量存在于骨骼肌中。定量測定CK-MB是心臟常規(guī)檢查的一部分，并且有利于AMI的診斷。當發(fā)生AMI時，CK-MB即出現(xiàn)于血循環(huán)中并說明心肌層受到了損傷。CK-MB濃度在疼痛發(fā)作后4-8小時內升高，在12-24小時中達到峰值，然后在48小時后下降到正常狀態(tài)。CK-MB是在疼痛發(fā)作后的第一個48小時中圍手術期心肌梗塞選擇的標記物。CK-MB濃度還用于評定AMI的程度以及后來的再梗塞。從診斷靈敏性、特異性以及效率來看，CK-MB都要優(yōu)于依據(jù)電泳的CK同工酶。CK-MB的測定亦有助于溶栓療法下對心肌多次灌注液的效驗而進行的非侵入性評估。同時CK-MB水平的升高也和骨骼肌損傷有關，但并不像在AMI中CK-MB水平會有升高和下降的變化形式。時間分辨熒光(TRF)分析技術是以具有獨特熒光特性的鑭系元素及其螯合劑作為示蹤物，建立的一種新型的非放射性微量分析技術。自從1983年Pettersson等采用時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)法定量測定hCG以來，TRFIA方法學研究和臨床應用發(fā)展迅速，成為既RIA之后標記免疫分析發(fā)展的一個新的里程碑，國內外相繼研制出了多鐘TRFIA儀和配套的商業(yè)化試劑盒。TRFIA技術具有靈敏度高、標準曲線范圍寬、操作簡便、無放射性污染、多標記等優(yōu)點，廣泛地應用于腫瘤、傳染病、內分泌疾病、自身免疫性疾病、遺傳性疾病的臨床實驗室診斷，已成為生物醫(yī)學研究和臨床超微量生化檢驗常用的分析手段之一。將TRF、聚苯乙烯微球及硝酸纖維素膜結合，可用于快速體外診斷領域。專利(ZL03819391.4)涉及一種采用時間分辨熒光的基于膜的檢測，用于檢測測試樣本中分析物的存在和含量；專利(CN202149903U)發(fā)明C反應蛋白時間分辨熒光免疫層析定量檢測；專利(CN202166649U)發(fā)明新喋呤時間分辨熒光免疫層析定量檢測試紙條；專利(CN102879559A)發(fā)明一種時間分辨熒光免疫層析即時定量檢測試劑盒方法；專利(CN103760368A)發(fā)明一種AFP和Free-β-HCG時間分辨熒光雙標的定量檢測試劑盒；專利(CN204514928U)發(fā)明一種基于時間分辨熒光免疫層析法檢測胃蛋白酶原I和II的試紙條以及應用其的試紙條。目前，心肌三項聯(lián)合檢測的方法主要有膠體金免疫層析法、微流控法、熒光免疫層析法等。膠體金免疫層析法定性或定量檢測，靈敏度低、線性范圍窄，不能滿足定量、準確檢測的要求；微流控法能夠定量、準確、同時檢測心肌三項，但往往需要較多的樣本量，而且試劑成本高；熒光免疫層析法大多數(shù)采用熒光素或其他物質作為發(fā)光源，雖然有較高的線性范圍，但受背景信號的干擾，不能夠保證低端靈敏度。盡管時間分辨熒光免疫層析法已經廣泛用于多種項目的檢測，但是大多數(shù)都采用將時間分辨熒光微球固定在結合物釋放墊上，由于微球的釋放不均一，導致不精密度很大，無法滿足靈敏度要求高的項目，尤其是肌鈣蛋白I的檢測。此外，為了檢測全血樣本，多數(shù)廠家的結合物釋放墊采用人工處理過玻璃纖維，同樣增加了不精密度。綜上所述，在心肌三項聯(lián)合定量檢測時，迫切需要一種樣本量少、精密度高、檢測背景信號低、靈敏度高、線性范圍寬、樣品墊不需處理就能檢測全血樣本的時間分辨熒光免疫層析試劑。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種快速定量同時檢測cTnI、CKMB、Myo的時間分辨熒光免疫層析試劑，該試劑能在較短的檢測時間內完成cTnI、CKMB、Myo的檢測，檢測時間短，檢測靈敏度高。本發(fā)明還提供了快速定量同時檢測cTnI、CKMB、Myo的時間分辨熒光免疫層析試劑的制備方法。一種快速定量同時檢測cTnI、CKMB、Myo的時間分辨熒光免疫層析試劑，其特征在于：該試劑由試紙條和熒光液兩部分組成。所述的試紙條包括底板(1)、Fusion5(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸水墊(4)。所述Fusion5(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸水墊(4)水平方向順序連接固定于底板上。所述硝酸纖維素膜(3)上包被有Myo單克隆抗體1(5)、cTnI單克隆抗體1或多克隆抗體1(6)、CKMB多克隆抗體1(7)捕獲分子構成的檢測線和兔IgG抗體(8)構成的質控線。熒光液(9)包含Myo單克隆抗體2標記的熒光微球、cTnI單克隆抗體2標記的熒光微球、CKMB單克隆抗體2標記的熒光微球、羊抗兔抗體標記的熒光微球。所述的時間分辨熒光微球選自修飾過的聚苯乙烯微球。所述的聚苯乙烯微球，表面修飾官能團為羧基、羥基或環(huán)氧基的一種，粒徑為100～500nm。所述的時間分辨熒光微球內部填充鑭系元素的螯合物。所述的鑭系元素為銪、釤、鈊、鏑中的一種。所述的時間分辨熒光微球標記步驟如下：(1)肌鈣蛋白I單克隆抗體2標記時間分辨熒光微球的制備及稀釋：將時間分辨熒光微球溶于MES緩沖液中，加入活化劑活化；隨后加入氨基乙酸，使得微球表面連接手臂；洗滌、離心后，再次加入活化劑活化；再次洗滌、離心，將時間分辨熒光微球用硼酸緩沖液復溶，隨后加入肌鈣蛋白I單克隆抗體2進行反應，硼酸緩沖液、微球與抗體的質量比為10mg:0.01mg～10mg：2.0mg范圍內；反應完后加入封閉劑進行封閉；封閉過后，洗滌、離心，再次用硼酸緩沖液及封閉劑復溶、超聲，使微球均勻分散在緩沖液中，2-8℃避光保存。選擇合適的緩沖液稀釋熒光微球，工作濃度在0.5～50μg/ml，用于肌鈣蛋白I性能的評估。(2)Myo單克隆抗體2標記的熒光微球的制備及稀釋、CKMB單克隆抗體2標記的熒光微球的制備及稀釋、羊抗兔抗體標記的熒光微球的制備及稀釋過程同(1)所述。優(yōu)選的，采用銪粒子螯合物填充的時間分辨熒光微球，粒徑為：100～500nm；優(yōu)選的，硼酸緩沖液、微球與抗體的質量比例為：10mg:0.01mg～10mg：2.0mg；優(yōu)選的，熒光液的工作濃度為：0.5～50μg/ml；一種制備所述的快速定量同時檢測cTnI、CKMB、Myo的時間分辨熒光免疫層析試劑的方法，包括如下步驟：(1)制備檢測線和質控線：硝酸纖維素膜(3)在免疫熒光試紙條中用于固定包被抗體，同時也是免疫反應的發(fā)生的場所；檢測線(5)是將Myo單克隆抗體1使用檸檬酸鹽或蔗糖稀釋液稀釋，劃線于所述硝酸纖維素膜(3)上；檢測線(6)是將cTnI單克隆抗體1或多克隆抗體1使用檸檬酸鹽或蔗糖稀釋液稀釋，劃線于所述硝酸纖維素膜(3)上；檢測線(7)是將CKMB多克隆抗體1使用檸檬酸緩沖液或蔗糖溶液稀釋，劃線與所述硝酸纖維素膜(3)上；質控線(8)是將兔IgG抗體使用檸檬酸鹽或蔗糖稀釋液稀釋，劃線與所述硝酸纖維素膜(3)上。將劃好的硝酸纖維素膜置于真空干燥箱，在37～45℃下，烘干24～48小時。檢測線(5)、(6)、(7)位于同一位置或不同位置，若為不同位置，則檢測線(5)、(6)、(7)均位于質控線(8)同一側，即液體首先接觸的位置；(2)試紙條的組裝：在試紙條底板(1)由左到右依次粘附Fusion5(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸水紙(4)。將組裝好的大板切成小條，即得到所述快速定量同時檢測cTnI、CKMB、Myo的時間分辨熒光免疫層析試紙條。優(yōu)選的，檸檬酸鹽或蔗糖稀釋液稀中檸檬酸鹽或蔗糖占5-20％；優(yōu)選的，檢測線和質控線抗體的劃膜濃度為0.5～2mg/ml；優(yōu)選的，檢測線和質控線抗體的劃膜噴量為0.5～2.0μl/cm；以上快速定量同時檢測cTnI、H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑的檢測方法，其步驟包括：(1)標準曲線的繪制：取10～20μl的cTnI、CKMB和Myo混合標準品與80～500μl的熒光混合液(cTnI、CKMB、Myo、羊抗兔熒光液)混合，取混合液70～100μl滴加到試紙條的Fusion5上，反應時間15～20分鐘，通過與試紙條配套的時間分辨免疫層析定量分析儀讀取系統(tǒng)檢測信號1、系統(tǒng)檢測信號2、系統(tǒng)檢測信號3，然后以標準品的各濃度為橫坐標，各濃度系統(tǒng)檢測信號的平均值為縱坐標，擬合制備標準品曲線；(2)待測樣品的檢測，分別取10～20μl的待測樣品與80～500μl的熒光混合液(cTnI、CKMB、Myo、羊抗兔熒光液)混合，取混合液70～100μl滴加到試紙條的Fusion5上，反應時間15～20分鐘，通過系統(tǒng)檢測信號的值即可得到待測樣品中的cTnI、CKMB和Myo的濃度值。所述(1)中，cTnI、CKMB、Myo混合標準品的濃度分別為:cTnI：0、0.1、0.5、1.0、5.0、25.0、50.0ng/ml；CKMB：0、0.5、2.0、10.0、25.0、50.0、100.0ng/ml；Myo：0、5、20、100、200、400、800ng/ml。本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明采用Fusion5為樣品墊，摒棄了傳統(tǒng)的樣品墊及結合物釋放墊，無需預處理，可以進行全血、血清、血漿樣本的檢測，能夠極大的提高檢測精密度和準確性。(2)本發(fā)明將熒光液置于硝酸纖維素膜之外，不同于傳統(tǒng)方法將熒光微球固定于結合物釋放墊上，不存在熒光微球釋放不均一的現(xiàn)象，同樣能夠極大的提高檢測精密度和準確性。(3)本發(fā)明采用銪粒子螯合物填充的時間分辨熒光微球，由于其大的Stokes位移(激發(fā)波長為340nm左右，發(fā)射波長為615nm左右，差值為275nm左右)，能夠明顯降低背景信號值，提高檢測的靈敏度。(4)本發(fā)明的采用極少的樣本量(10～20μl)，能夠有效的排除樣本的干擾。附圖說明圖1是本發(fā)明快速定量同時檢測cTnI、CKMB和Myo的時間分辨熒光免疫層析試劑的結構示意圖(1為底板、2為Fusion5、3為硝酸纖維素膜、4為吸水墊、5為Myo檢測線、6為cTnI檢測線、7為CKMB檢測線、8為兔IgG質控線)：圖2是本發(fā)明Myo的標準品曲線；圖3是本發(fā)明cTnI的標準品曲線；圖4是本發(fā)明CKMB的標準品曲線；圖5是本發(fā)明奧普與化學發(fā)光法Myo的相關性曲線；圖6是本發(fā)明奧普與化學發(fā)光法cTnI的相關性曲線；圖7是本發(fā)明奧普與化學發(fā)光法CKMB的相關性曲線；具體實施方式下面結合實施例，對本發(fā)明作進一步說明：本發(fā)明中，H-FABP抗體、cTnI抗體和熒光微球的供應商和貨號如下所示抗體名稱目錄號廠家Anti-hMyoglobinclone7001100378MedixAnti-hMyoglobinclone7004100354Medix19C7單克隆抗體(cTnI)4T21Hytest16A11單克隆抗體(cTnI)4T21HytestG-129-C多克隆抗體(cTnI)G-129-CBiospacificAnti-hCK-MBclone7501100085MedixAnti-hCK-MBclone7502100086Medix200nm熒光微球FC02FBangslaboratories實施例1cTnI、CKMB、Myo時間分辨熒光免疫層析試紙條的制備：(1)檢測線(T1、T2、T3)溶液的制備：用10倍、50mM的檸檬酸鹽溶液分別稀釋cTnI單克隆抗體及多克隆抗體、CKMB多克隆抗體、Myo單克隆抗體至1～2mg/ml；(2)質控線(C)溶液的制備：用用10倍、50mM的檸檬酸鹽溶液稀釋兔IgG抗體至1～2mg/ml；在帶有背膠的底板(1)上采用搭接的方式，首先粘貼硝酸纖維素膜(3)，然后再硝酸纖維素膜(3)的兩端分別粘貼Fusion5膜(2)和吸水紙(4)。在硝酸纖維素膜(3)且靠近Fusion5膜(2)處，分別劃T1(Myo捕獲線(5))、T2(cTnI捕獲線(6))、T3(CKMB捕獲線(7))，在靠近吸水紙(4)的一端劃C(兔IgG)線，T1、T2、T3、C的間距都為3mm。在T線處，分別劃T1、T2、T3，在C線處劃C線。T1、T2、T3線抗體的終濃度為1mg/ml，C線兔IgG的終濃度為1mg/ml，C、T線的噴量為1.0μl/cm。將噴好的大卡置于37℃恒溫烘箱中烘烤24小時。烘烤完后，在濕度小于40％的房間，用切條機將其切成3.85mm寬度的試紙條，將其裝入塑料殼中壓實，然后裝入一袋干燥劑，封口置于干燥柜中保存，待用。具體如圖1所示。實施例2cTnI、CKMB、Myo時間分辨熒光免疫層析試紙條的檢測(1)制備cTnI、CKMB、Myo、羊抗兔時間分辨熒光微球將時間分辨熒光微球(粒徑為200nm左右)溶于100mMMES緩沖液(PH為6.0)中，加入活化劑(NHS,20mg/ml；EDC,20mg/ml)活化15分鐘；洗滌、離心，將時間分辨熒光微球用60mM硼酸緩沖液(PH為8.5)復溶，隨后加入肌鈣蛋白I單克隆抗體2進行反應2小時(微球與抗體的質量比在10mg:0.5mg)；反應完后加入封閉劑(BSA，100mg/ml)進行封閉2小時；封閉過后，洗滌、離心，再次用60mM硼酸緩沖液(PH為8.5)及封閉劑(BSA，100mg/ml)復溶、超聲，使微球均勻分散在緩沖液中，2-8℃避光保存。Myo單克隆抗體2標記的熒光微球的制備、CKMB單克隆抗體2標記的熒光微球的制備、羊抗兔抗體標記的熒光微球的制備過程同cTnI制備微球的過程相同。(2)滴配用PH為8.0、100mM的Tris緩沖液將步驟(1)中的cTnI、CKMB、Myo、羊抗兔包被的熒光微球進行稀釋。其中，cTnI、CKMB、Myo包被的熒光微球稀釋200～300倍，羊抗兔包被的熒光微球稀釋2000～3000倍，混合后即為所需要的熒光混合液。(3)標準曲線的繪制用小牛血清稀釋cTnI、CKMB、Myo混合標準品，濃度分別為:cTnI：0、0.1、0.5、1.0、5.0、25.0、50.0ng/ml；CKMB：0、0.5、2.0、10.0、25.0、50.0、100.0ng/ml；Myo：0、5、20、100、200、400、800ng/ml。分別取10μl混合標準品與80μl熒光混合液混合，再取80μl混合液滴加載實施例1中的cTnI、CKMB、Myo時間分辨熒光免疫層析試紙條上，反應15分鐘后，通過與cTnI、CKMB、Myo時間分辨熒光免疫層析試紙條配套的免疫層析讀數(shù)儀，分別讀取系統(tǒng)檢測信號1、系統(tǒng)檢測信號2、系統(tǒng)檢測信號3信號值，每個混合標準品的濃度檢測三次，具體數(shù)值如表1所示。表1標準品檢測值由表1數(shù)據(jù)可知，Myo的靈敏度可達5ng/ml，檢測上限可達800ng/ml；cTnI的靈敏度可達0.1ng/ml，檢測上限可達50ng/ml；CKMB的靈敏度可達0.5ng/ml,檢測上限可達100ng/ml。本發(fā)明心肌三項的聯(lián)合檢測性能均優(yōu)于膠體金層析法，同微流控聯(lián)合檢測試劑相近，體現(xiàn)出時間分辨熒光免疫層析法的優(yōu)勢。(4)制作ID卡：分別以標準品Myo、cTnI、CKMB濃度值為橫坐標，各濃度的T/C平均值為縱坐標，繪制標準品曲線，具體如圖2、圖3、圖4所示，燒錄ID卡，并導入配套儀器中。實施例3精密度檢測用實施例2中的測試方法，分別測試Myo、cTnI及CKMB的混合標準品(Myo濃度為100和400ng/ml、cTnI的濃度為1和25ng/ml、CKMB的濃度為10和50ng/ml)，每個標準品重復檢測十次，具體檢測數(shù)值如下表2所示。表2精密度測試結果表如表2數(shù)據(jù)可知，采用本發(fā)明的三聯(lián)檢測試紙條，Myo、cTnI、CKMB的精密度均小于10％，完全符合POCT產品精密度小于15％的要求。實施例4臨床樣本的相關性檢測用實施例2中的測試方法，分別選取40例國外化學發(fā)光法檢測Myo、cTnI、CKMB的臨床樣本(樣本濃度分別覆蓋標準品的檢測范圍)，用上海奧普生物的三聯(lián)檢測試劑進行檢測。具體檢測結果如表3所示。表3上海奧普三聯(lián)檢測與化學發(fā)光法檢測數(shù)據(jù)分別以化學發(fā)光法檢測的Myo、cTnI、CKMB濃度為橫坐標，上海奧普生物檢測Myo、cTnI、CKMB濃度為縱坐標，繪制樣本相關性曲線。如圖5、圖6、圖7所示。其中，Myo的相關性方程為y＝0.871x+8.437，R2＝0.992；cTnI的相關性方程為y＝1.129x+2.018，R2＝0.969；CKMB的相關性方程為y＝0.967x-0.887，R2＝0.970。三個項目的相關性系數(shù)R均大于0.95，完全符合臨床試驗的要求。當前第1頁1 2 3