本發(fā)明涉及體外診斷免疫檢測領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種化學(xué)發(fā)光免疫檢測肺炎衣原體IgG試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae，Cpn）是1989 年確定的一種嚴(yán)格真核細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞微生物，根據(jù)2004年公布的伯杰氏細(xì)菌分類學(xué)手冊(cè)，已被更名為肺炎嗜衣原體，與鸚鵡熱嗜衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體、豚鼠嗜衣原體、貓嗜衣原體、獸類嗜衣原體共同組成嗜衣原體屬。CPn基因組大小約1.2Mbp，由21個(gè)Pmp基因，一個(gè)III型分泌毒力因子系統(tǒng)，3個(gè)絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶，2個(gè)磷脂酶-D樣蛋白基因組成。
Cpn的感染極為普遍，呈世界性的分布，主要引起人類的呼吸道感染，與人口密度呈正相關(guān)，在臨床上多以隱性、持續(xù)性感染形式存在，反復(fù)遷延導(dǎo)致難以治療的并發(fā)癥，與哮喘、支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病等心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。兒童感染率在20％左右，隨著年齡的增加感染率迅速上升，青壯年可達(dá)50-60％，老年70-80％。肺炎衣原體通過呼吸道分泌物的進(jìn)行人與人傳播，家庭、學(xué)校、軍隊(duì)以及其他人口集中的工作區(qū)域可存在小范圍的流行。目前，肺炎衣原體已是繼肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌之后引起社區(qū)獲得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）的主要病原體，肺炎衣原體急性感染率占23％，肺炎病人僅占感染者的小部分，70-90％為亞臨床表現(xiàn)。肺炎衣原體感染的潛伏期為15-23天，可引起上呼吸道感染，如鼻竇炎、中耳炎和咽炎，也可引起下呼吸道感染，如支氣管炎和肺炎。呼吸道感染多數(shù)表現(xiàn)為咽痛、發(fā)熱、咳嗽，病情通常較輕，有自限性。老年肺炎衣原體肺炎病人癥狀可能較為嚴(yán)重，有時(shí)甚至致死，尤其是合并細(xì)菌性感染或存在慢性阻塞性肺疾病等時(shí)。因此，Cpn感染早期診斷對(duì)于盡早發(fā)現(xiàn)和治療Cpn感染性疾病非常重要。
目前 ，國內(nèi)外一致認(rèn)為Cpn IgM、IgG等特異性抗體測定是臨床感染較為可靠的指標(biāo)之一，且特異性強(qiáng) 、靈敏度高。Cpn IgM一般在感染后7-9天左右開始升高，3-4周達(dá)高峰，持續(xù) 4-6個(gè)月。Cpn IgG出現(xiàn)較Cpn IgM稍晚，持續(xù)時(shí)間更長，特異性更強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，在感染后的恢復(fù)期，Cpn IgG抗體滴度明顯上升，高滴度或相隔大約兩周的雙份血清樣本IgG明顯升高，可判定處于感染發(fā)展期。
臨床檢測肺炎衣原體IgG的主要方法為酶聯(lián)免疫吸附法，但該方法存在著下述的不足之處：
（1） 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應(yīng)容器，在使用時(shí)只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無法進(jìn)行獨(dú)立的、單人份的檢測；
（2） 定量測定所用的試劑種類較多，每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時(shí)都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注試劑的操作也極為繁瑣；
（3） 缺少對(duì)檢測信息的相應(yīng)標(biāo)注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標(biāo)識(shí)才能了解或知悉檢測試劑的生產(chǎn)批號(hào)及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測過程中不受控，具有很大的隨意性；
（4） 檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；
（5） 檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復(fù)雜，容易發(fā)生操作差錯(cuò)，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度較差；
（6） 在檢測項(xiàng)目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項(xiàng)目數(shù)×48/96人份，如果需要檢測10個(gè)項(xiàng)目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10×48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測10個(gè)不同的項(xiàng)目，也需要配置10×48/96人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟(jì)合理的缺點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
目前肺炎衣原體IgG檢測技術(shù)存在以下缺點(diǎn)：檢測成本高、檢測靈敏度低、檢測線性范圍窄、重現(xiàn)性低、不能定量、操作復(fù)雜等。
本發(fā)明正是為了克服以上所述缺點(diǎn)，公開了一種檢測成本低、靈敏度高、檢測線性范圍廣、重現(xiàn)性高、可以定量、操作簡單的肺炎衣原體IgG試劑盒及其制備方法。本發(fā)明首先制備化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，主要包括：肺炎衣原體IgG單克隆抗體包被的磁顆粒、肺炎衣原體IgG單克隆抗體包被的吖啶酯以及肺炎衣原體IgG定標(biāo)品；然后利用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)定標(biāo)品進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)置于電腦軟件，測試實(shí)際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計(jì)算樣本濃度；最后對(duì)肺炎衣原體IgG全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行性能（靈敏度、線性、精密度、干擾性）的評(píng)價(jià)。
本發(fā)明與目前技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明選擇吖啶酯作為標(biāo)記材料，并應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，該發(fā)光體系為直接化學(xué)發(fā)光，與傳統(tǒng)的酶促化學(xué)發(fā)光相比，該反應(yīng)不需要酶的參與，更加節(jié)約成本；
2、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測靈敏度高，能夠達(dá)到3.0 AU/mL；
3、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)線性范圍寬，能達(dá)到3.0-200.0 AU/mL；
4、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)重復(fù)性高，批內(nèi)及批間差均在5%以內(nèi)，這是其它化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)難以達(dá)到的；
5、本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實(shí)現(xiàn)樣本的定量，通過內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線到測試軟件，只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值；
6、本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作更加簡便，減少了人為的誤差。
附圖說明
圖1為實(shí)施例3得到的肺炎衣原體IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：肺炎衣原體IgG化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒制備方法
（1）肺炎衣原體IgG單克隆抗體包被的納米磁珠制備：
取50mg羧基化的磁微粒（粒徑為0.05-1um）懸浮液，磁分離去上清，用0.02 M，pH為5.5 MES緩沖液重懸，加入0.5-2mL新配置的10 mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5 mg 肺炎衣原體IgG單克隆抗體，室溫下混懸2-10 h，磁分離，去除上清，用含2% BSA 的0.1 M pH為8.0的Tris緩沖液重懸到1mg/mL，得到肺炎衣原體IgG單克隆抗體包被的磁顆粒，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
（2）肺炎衣原體IgG衍生物標(biāo)記的吖啶酯的制備：
取50 uL 25mg/mL的肺炎衣原體IgG衍生物，加入150 uL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1-2 uL 5 mg/mL的吖啶酯混勻，室溫下避光反應(yīng)，1-2 h后取出，用2 mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進(jìn)行處理，最后加入得到的肺炎衣原體IgG衍生物標(biāo)記的吖啶酯溶液，收集離心管中的液體至保存管得到肺炎衣原體IgG衍生物標(biāo)記的吖啶酯，每瓶5 mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
（3）肺炎衣原體IgG定標(biāo)品的制備：
用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）將肺炎衣原體IgG配置成濃度為0 AU/mL、20AU/mL、40 AU/mL、80 AU/mL、160 AU/mL、320 AU/mL，每瓶0.5 mL分裝凍干，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
(4)化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入80uL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的雙氧水(H2O2)、1.0克疊氮化鈉、1.5克吐溫20，搖勻后避光存放。
(5)化學(xué)發(fā)光激發(fā)液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入0.6克氫氧化鈉、0.5克PC300、0.5g疊氮化鈉、1.5克Triton X-405，搖勻后避光存放。
實(shí)施例2：肺炎衣原體IgG化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法：
本發(fā)明以全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，本發(fā)明的方法學(xué)模式為競爭法，即儀器依次加入20 uL的樣品、50 uL的肺炎衣原體IgG單克隆抗體包被的磁顆粒以及50 uL的肺炎衣原體IgG包被的吖啶酯，反應(yīng)10 min后，進(jìn)行磁分離，儀器將反應(yīng)混合物送入暗室，依次加入50uL化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液、50uL化學(xué)發(fā)光激發(fā)液進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，最后記錄發(fā)光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測樣品的 肺炎衣原體IgG含量。
實(shí)施例3：肺炎衣原體IgG化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒性能評(píng)價(jià)
檢測曲線見附圖1。
靈敏度的檢測：
參照CLSI EP17-A 文件推薦實(shí)驗(yàn)方案，計(jì)算肺炎衣原體IgG化學(xué)發(fā)光免疫層析試劑盒的靈敏度，求得的靈敏度為1ng/ mL。
線性的檢測：
對(duì)濃度為0 AU/mL、20AU/mL、40 AU/mL、80 AU/mL、160 AU/mL、320 AU/mL標(biāo)準(zhǔn)品做線性分析，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，r=0.9985，另外，該試劑盒對(duì)肺炎衣原體IgG樣品檢測的線性范圍為3-200 AU/mL。
精密度測定：
取濃度為40 AU/mL及100AU/mL兩個(gè)肺炎衣原體IgG樣品，每個(gè)樣本每個(gè)濃度各做3個(gè)平行，用三批試劑盒進(jìn)行檢測，計(jì)算試劑盒批內(nèi)及批間差，結(jié)果表明該試劑盒批內(nèi)及批間差均小于5%。
干擾性實(shí)驗(yàn)：
取混合血清分別添加干擾物包括： 結(jié)合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯，添加比例按照 1:20 進(jìn)行，分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值，計(jì)算二者之間的偏差，以 ±10%為可接受范圍。結(jié)果表明，干擾性均達(dá)到 NCCLS 的文件標(biāo)準(zhǔn)，可用于臨床實(shí)驗(yàn)室肺炎衣原體IgG濃度的準(zhǔn)確評(píng)估。