本發(fā)明涉及腫瘤診斷領域中一種多指標聯(lián)合診斷卵巢癌和/或非卵巢來源的惡性腫瘤的系統(tǒng)。

背景技術：

目前臨床上卵巢癌(卵巢惡性腫瘤)檢查的方式主要有：(1)物理檢查、(2)血清腫瘤標志物檢測、(3)細胞學或者組織學病例診斷(金標準)。腫瘤學標志物的檢測具有可重復性、簡便、成本低、靈敏度高、特異性高、與腫瘤大小或者分期密切相關、能進行治療效果的監(jiān)測等特點。CA125(糖類抗原125)是臨床上應用最為廣泛的卵巢癌腫瘤標志物。雖然較其他的腫瘤標志物有較高的靈敏性，但是由于盆腔炎癥、子宮內膜異位癥、子宮肌瘤時CA125也均可升高，其特異性較低。除了CA125人們還找到了許多對于診斷卵巢癌有價值的腫瘤標志物，但是單獨檢測一個標志物很難對腫瘤達到良好的診斷效果。腫瘤標志物存在于腫瘤細胞的表面或細胞內，也會存在于正常人的組織或者體液中，但含量很少。但是，在腫瘤患者體內，隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤相關基因的激活和失活，其編碼的蛋白可以在腫瘤患者的組織、體液和排泄物中檢出。

液態(tài)懸浮芯片技術(液態(tài)懸浮芯片法)又稱流式熒光檢測技術、微球懸浮列陣技術、液相芯片分析技術等。它將熒光微球編碼技術、流式細胞技術、激光技術、計算機技術、高速信號處理技術有機地整合在一起，此技術可以完成蛋白、核酸的同時檢測。

CXCL1為黑色素瘤生長激活因子，由趨化因子生長調節(jié)基因l編碼，屬于趨化因子CXC家族。CXCLl由人黑色素瘤細胞分泌，具有有絲分裂特性，與惡性黑色素瘤發(fā)病機制有關。CXCLl在巨噬細胞，中性粒細胞和上皮細胞中表達，并表現(xiàn)中性粒細胞趨化活性。

趨化因子配體18(C-C motif chemokine ligand 18，CCL18)基因是趨化因子超家族中CC類基因，即靠近氨基端的前兩個C間沒有插入其他氨基酸，又稱為β類趨化因子。CCL18定位于人染色體17q11.2，即人CC趨化因子的位置。

TM4SF1(TAL6，transmembrane 4L6family member 1，跨膜蛋白4L6家族成員1)是TM4SF家族的一個遠親，TM4SF家族有25個成員。TAL6與人角蛋白細胞的遷移有關。

C1D(DNA綁定蛋白1，nuclear nucleic acid-binding protein C1D)基因編碼的是一個保守的DNA綁定蛋白，C1D基因及蛋白在許多哺乳動物細胞及組織中表達，生理水平的C1D蛋白是無害的但對于細胞的生存卻至關重要，當C1D蛋白在細胞中的水平達到一個臨界值后可誘導細胞凋亡，因此C1D的表達在轉錄及轉錄后水平受到極為嚴格的調控。

TIZ(TRAF6-inhibitory zinc finger protein，抑制腫瘤凋亡相關因子6的鋅指蛋白，zinc finger protein 573(ZNF573))是TRAF6的細胞內綁定分子，當與TRAF6共同表達時可抑制TRAF6對核轉錄因子-kappa B(NF-kappa B)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase)的誘導活化，TIZ還可抑制NF-kappa B受體催化的信號。TIZ通過調節(jié)TRAF6的信號活性而在破骨細胞分化過程中起重要作用。

FXR1(Fragile X related gene 1，脆性X智力遲鈍相關基因1)是脆性X智力遲鈍相關基因家族中的一員，它們都有RNA綁定、與多聚核糖體相關、在核與胞漿間穿梭的生理功能，F(xiàn)XR1定位于3q28?；蚪Y構分析及生物學功能研究顯示，F(xiàn)XR1有兩個不均一核糖核蛋白K區(qū)域(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K homology,KH)和一個RGG盒，在體外可與人工RNA同聚物結合，F(xiàn)XR1P與大部分核糖體60S亞單位有關。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是如何更好地診斷卵巢癌、Ⅰ期卵巢癌和/或Ⅱ期卵巢癌、漿液性卵巢癌和/或乳腺癌、肝癌或肺癌。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了輔助診斷卵巢癌和/或非卵巢來源的惡性腫瘤的系統(tǒng)。

本發(fā)明所提供的輔助診斷卵巢癌和/或非卵巢來源的惡性腫瘤的系統(tǒng)，包括檢測血清中六種蛋白質含量的系統(tǒng)，所述六種蛋白質為CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體；所述非卵巢來源的惡性腫瘤為乳腺癌、肝癌或肺癌。

為了解決上述問題，本發(fā)明還提供了檢測血清中上述六種蛋白質含量的系統(tǒng)在制備輔助診斷卵巢癌和/或非卵巢來源的惡性腫瘤的系統(tǒng)中的應用，所述非卵巢來源的惡性腫瘤為乳腺癌、肝癌或肺癌。

上述系統(tǒng)和應用中，所述卵巢癌可為Ⅰ期卵巢癌和/或Ⅱ期卵巢癌。

上述系統(tǒng)和應用中，所述卵巢癌可為漿液性卵巢癌。

上述系統(tǒng)和應用中，所述檢測血清中六種蛋白質含量的系統(tǒng)包括通過液態(tài)懸浮芯片法或ELISA法檢測所述六種蛋白質的含量所需的試劑和/或儀器。

上述系統(tǒng)和應用中，所述檢測血清中六種蛋白質含量的系統(tǒng)包括A1)、A2)或A3)：

A1)CCL18抗體、CXCL1抗體，能與機體C1D IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質、能與機體TM4SF1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質、能與機體FXR1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質和能與機體TIZ IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質；

A2)CCL18抗體包被的微球、CXCL1抗體包被的微球，能與機體C1D IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的微球、能與機體TM4SF1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的微球、能與機體FXR1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的微球和能與機體TIZ IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的微球；

A3)CCL18抗體包被的酶標板、CXCL1抗體包被的的酶標板，能與機體C1D IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的的酶標板、能與機體TM4SF1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的酶標板、能與機體FXR1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的的酶標板和能與機體TIZ IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的酶標板。

上述系統(tǒng)和應用中，所述能與機體C1D IgG型自身抗體特異反應的物質可為C1D蛋白或其任一片段，所述能與機體TM4SF1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質可為TM4SF1或其任一片段，所述能與機體FXR1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質可為FXR1蛋白或其任一片段，所述能與機體TIZ IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質可為TIZ或其任一片段。

為了解決上述問題，本發(fā)明還提供了輔助診斷上皮性卵巢癌和/或非卵巢來源的惡性腫瘤的系統(tǒng)。

本發(fā)明所提供的輔助診斷上皮性卵巢癌和/或非卵巢來源的惡性腫瘤的系統(tǒng)，包括檢測血清中四種蛋白質含量的系統(tǒng)，所述四種蛋白質為C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體；所述非卵巢來源的惡性腫瘤為乳腺癌、肝癌或肺癌。

為了解決上述問題，本發(fā)明還提供了檢測血清中四種蛋白質含量的系統(tǒng)在制備輔助診斷上皮性卵巢癌和/或非卵巢來源的惡性腫瘤的系統(tǒng)中的應用，所述四種蛋白質為C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體；所述非卵巢來源的惡性腫瘤為乳腺癌、肝癌或肺癌。

上述系統(tǒng)和應用中，所述檢測血清中四種蛋白質含量的系統(tǒng)包括通過液態(tài)懸浮芯片法或ELISA法檢測所述四種蛋白質的含量所需的試劑和/或儀器。

上述系統(tǒng)和應用中，所述檢測血清中四種蛋白質含量的系統(tǒng)包括B1)、B2)或B3)：

B1)能與機體C1D IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質、能與機體TM4SF1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質、能與機體FXR1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質和能與機體TIZ IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質；

B2)能與機體C1D IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的微球、能與機體TM4SF1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的微球、能與機體FXR1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的微球和能與機體TIZ IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的微球；

B3)能與機體C1D IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的的酶標板、能與機體TM4SF1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的酶標板、能與機體FXR1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的的酶標板和能與機體TIZ IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質包被的酶標板。

上述系統(tǒng)和應用中，所述能與機體C1D IgG型自身抗體特異反應的物質可為C1D蛋白或其任一片段，所述能與機體TM4SF1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質可為TM4SF1或其任一片段，所述能與機體FXR1IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質可為FXR1蛋白或其任一片段，所述能與機體TIZ IgG型自身抗體發(fā)生特異反應的物質可為TIZ或其任一片段。

為了解決上述問題，本發(fā)明還提供了診斷卵巢癌和/或非卵巢來源的惡性腫瘤的方法。

本發(fā)明所提供的診斷卵巢癌和/或非卵巢來源的惡性腫瘤的方法，包括檢測來自待診斷患者的離體血清中六種蛋白質含量，根據(jù)所述六種蛋白質含量結合待診斷患者的臨床癥狀診斷待診斷患者是否患有卵巢癌和/或非卵巢來源的惡性腫瘤；所述六種蛋白質為CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體；所述非卵巢來源的惡性腫瘤為乳腺癌、肝癌或肺癌。

為了解決上述問題，本發(fā)明還提供了診斷上皮性卵巢癌和/或非卵巢來源的惡性腫瘤的方法。

本發(fā)明所提供的診斷上皮性卵巢癌和/或非卵巢來源的惡性腫瘤的方法，包括檢測來自待診斷患者的離體血清中四種蛋白質含量，根據(jù)所述四種蛋白質含量結合待診斷患者的臨床癥狀診斷待診斷患者是否患有上皮性卵巢癌和/或非卵巢來源的惡性腫瘤；所述四種蛋白質為C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體；所述非卵巢來源的惡性腫瘤為乳腺癌、肝癌或肺癌。

上文中，所述血清可為人血清，所述機體可為人。

本申請中，C1D IgG型自身抗體針對的抗原是蛋白質C1D，TM4SF1IgG型自身抗體針對的抗原是蛋白質TM4SF1，F(xiàn)XR1IgG型自身抗體針對的抗原是FXR1，TIZ IgG型自身抗體針對的抗原是FXR1。

實驗證明，液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測血清CCL18含量、CXCL1含量、C1D IgG型自身抗體含量、TM4SF1IgG型自身抗體含量、FXR1IgG型自身抗體含量和TIZ IgG型自身抗體含量這六種指標聯(lián)合診斷人上皮性卵巢癌的敏感性和特異性分別為100％和96.7％，ELISA法檢測血清CCL18含量、CXCL1含量、C1D IgG型自身抗體含量、TM4SF1IgG型自身抗體含量、FXR1IgG型自身抗體含量和TIZ IgG型自身抗體含量聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌的敏感性和特異性分別為96.1％和95.1％，兩種檢測方法的批內變異系數(shù)、批間變異系數(shù)均控制在12％以內，CUTOFF值驗證結果95％以上的檢測結果在CUTOFF值的范圍。聯(lián)合檢測血清CCL18含量、CXCL1含量、C1D IgG型自身抗體含量、TM4SF1IgG型自身抗體含量、FXR1IgG型自身抗體含量和TIZ IgG型自身抗體含量這六種指標聯(lián)合診斷卵巢癌的敏感性和特異性為90.4％和98.1％，聯(lián)合檢測血清中C1D IgG型自身抗體含量、TM4SF1IgG型自身抗體含量、FXR1IgG型自身抗體含量和TIZ IgG型自身抗體含量這四種指標聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌的診斷的敏感性和特異性為75.7％和96.6％；聯(lián)合檢測血清CCL18含量、CXCL1含量、C1D IgG型自身抗體含量、TM4SF1IgG型自身抗體含量、FXR1IgG型自身抗體含量和TIZ IgG型自身抗體含量這六種指標聯(lián)合診斷漿液性卵巢癌的陽性率為77.61％，顯著高于單獨檢測CA125診斷漿液性卵巢癌的陽性率67.16％。聯(lián)合檢測血清CCL18含量、CXCL1含量、C1D IgG型自身抗體含量、TM4SF1IgG型自身抗體含量、FXR1IgG型自身抗體含量和TIZ IgG型自身抗體含量這六種指標聯(lián)合診斷卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌患者中診斷的陽性率分別為94.9％、82.5％、77.5％、72.5％,對卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌患者診斷的ROC曲線下面積分別為0.983、0.960、0.918、0.938，說明檢測六個指標聯(lián)合診斷其他惡性腫瘤也有較高的診斷率。聯(lián)合檢測血清中C1D IgG型自身抗體含量、TM4SF1IgG型自身抗體含量、FXR1IgG型自身抗體含量和TIZ IgG型自身抗體含量這四種指標聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌的陽性率分別為85.2％、55.0％、52.5％、60.0％，對上皮性卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌患者診斷的ROC曲線下面積分別為0.905、0.865、0.873、0.891，檢測四個指標聯(lián)合診斷其他惡性腫瘤也有較高的診斷率。

附圖說明

圖1為ELISA法聯(lián)合檢測六種指標ROC曲線。

圖2為液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測六種指標ROC曲線。

圖3為液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測六指標診斷卵巢惡性腫瘤的ROC曲線。

圖4為檢測臨床血清樣本中的CA125含量診斷卵巢惡性腫瘤的ROC曲線。

圖5為液態(tài)芯片法聯(lián)合檢測六指標診斷上皮性卵巢癌的ROC曲線。

圖6為檢測臨床血清樣本中的CA125含量診斷上皮性卵巢癌的ROC曲線。

圖1-圖6中，橫坐標為1-特異度，縱坐標為靈敏度。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

1、融合蛋白SUMO-C1D、SUMO-CCL18、SUMO-CXCL1、SUMO-TM4SF1、SUMO-FXR1和SUMO-TIZ的制備

1.1、C1D、CCL18、CXCL1、TM4SF1、FXR1、TIZ原核表達載體的構建

采用Trizol試劑一步法提取卵巢組織(來源于廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科手術切除卵巢漿液性囊腺癌患者標本，并經病理確診)總RNA，并逆轉錄得到cDNA模板，PCR擴增C1D蛋白編碼基因、CCL18基因、CXCL1基因、TM4SF1基因、FXR1蛋白編碼基因和TIZ基因。將純化回收的PCR產物與pET SUMO(美國Invitrogen公司)連接，將連接產物轉化Mach1^TM-T1R感受態(tài)細胞(美國Invitrogen公司)，將經過轉化后的細胞在篩選培養(yǎng)基(含50μg/ml kanamycin的LB液體培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，用pET SUMO自帶引物以重組質粒為模板，進行行PCR反應鑒定轉化子。將經過PCR驗證已成功連接的菌液送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。將用核苷酸序列如GenBank Accesion Number NM_006333.3(Update Date是2015年3月15日)的第93-518位所示的人C1D蛋白編碼基因插入pET SUMO的653和654位之間且保持pET SUMO的其它序列不變得到的重組表達載體命名為pET-SUMO-C1D，該人C1D蛋白編碼基因編碼氨基酸序列如GenBank Accesion Number NP_006324.1(Update Date是2015年3月15日)第1-141位所示的人C1D蛋白；pET-SUMO-C1D表達融合蛋白SUMO-C1D蛋白(由SUMO和C1D蛋白融合而成)。將用核苷酸序列如GenBank Accesion Number NM_002988.3(Update Date是2016年3月3日)的第132-341位所示的人CCL18基因插入pET SUMO的653和654位之間且保持pET SUMO的其它序列不變得到的重組表達載體命名為pET-SUMO-CCL18，該人CCL18基因編碼氨基酸序列如GenBank Accesion Number NP_002979.1(Update Date是2016年3月3日)第21-89位所示的人CCL18；pET-SUMO-CCL18表達融合蛋白SUMO-CCL18(由SUMO和CCL18融合而成)。將用核苷酸序列如GenBank Accesion Number NM_001511.3(Update Date是2016年3月3日)的第182-403位所示的人CXCL1基因插入pET SUMO的653和654位之間且保持pET SUMO的其它序列不變得到的重組表達載體命名為pET-SUMO-CXCL1，該人CXCL1基因編碼氨基酸序列如GenBank Accesion Number NP_001502.1(Update Date是2016年3月3日)第35-107位所示的CXCL1；pET-SUMO-CXCL1表達融合蛋白SUMO-CXCL1(由SUMO和CXCL1融合而成)。將用核苷酸序列如GenBank Accesion Number NM_014220.2(Update Date是2015年3月15日)的第235-843位所示的人TM4SF1基因插入pET SUMO的653和654位之間且保持pET SUMO的其它序列不變得到的重組表達載體命名為pET-SUMO-TM4SF1，該人TM4SF1基因編碼氨基酸序列如GenBank Accesion Number NP_055035.1(Update Date是2015年3月15日)第1-202位所示的人TM4SF1；pET-SUMO-TM4SF1表達融合蛋白SUMO-TM4SF1(由SUMO和TM4SF1融合而成)。將用核苷酸序列如GenBank Accesion Number NM_005087.3(Update Date是2016年2月19日)的第241-2106位所示的人FXR1蛋白編碼基因插入pET SUMO的653和654位之間且保持pET SUMO的其它序列不變得到的重組表達載體命名為pET-SUMO-FXR1，該人FXR1蛋白編碼基因編碼氨基酸序列如GenBank Accesion Number NP_005078.2(Update Date是2016年2月19日)第1-621位所示的人FXR1蛋白；pET-SUMO-FXR1表達融合蛋白SUMO-FXR1(由SUMO和FXR1蛋白融合而成)。將用核苷酸序列如GenBank Accesion Number NM_152360.3(Update Date是2015年3月15日)的第503-2326位所示的人TIZ基因插入pET SUMO的653和654位之間且保持pET SUMO的其它序列不變得到的重組表達載體命名為pET-SUMO-TIZ，該人TIZ基因編碼氨基酸序列如GenBank Accesion Number NP_689573.3(Update Date是2015年3月15日)第1-607位所示的人TIZ，pET-SUMO-TIZ表達融合蛋白SUMO-TIZ(由SUMO和TIZ融合而成)。

1.2融合蛋白SUMO-C1D、SUMO-CCL18、SUMO-CXCL1、SUMO-TM4SF1、SUMO-FXR1和SUMO-TIZ的表達

將pET-SUMO-C1D、pET-SUMO-CCL18、pET-SUMO-CXCL1、pET-SUMO-TM4SF1、pET-SUMO-FXR1和pET-SUMO-TIZ這六個重組表達載體分別單獨轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，獲得重組大腸桿菌。將轉入pET-SUMO-C1D的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET-SUMO-C1D，將轉入pET-SUMO-CCL18的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET-SUMO-CCL18，將轉入pET-SUMO-CXCL1的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET-SUMO-CXCL1，將轉入pET-SUMO-TM4SF1的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET-SUMO-TM4SF1，將轉入pET-SUMO-TM4SF1的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET-SUMO-FXR1，將轉入pET-SUMO-TIZ的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET-SUMO-TIZ。

將BL21(DE3)/pET-SUMO-C1D、BL21(DE3)/pET-SUMO-CCL18、BL21(DE3)/pET-SUMO-CXCL1、BL21(DE3)/pET-SUMO-TM4SF1、BL21(DE3)/pET-SUMO-FXR1和BL21(DE3)/pET-SUMO-TIZ這六個菌株分別單獨接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基)中，37℃水平振搖培養(yǎng)(200-250rpm)養(yǎng)至0D600值(以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基為空白對照)達到0.5時，加入IPTG至體系中IPTG的濃度為1mM進行誘導表達。上述誘導表達均是用1mM的IPTG在37℃誘導5-6小時。

由于誘導細菌表達的蛋白可能以可溶性或包涵體蛋白形式存在，兩種存在形式的蛋白需采用兩種不同的方式進行蛋白的純化，所以為了驗證目的蛋白的存在形式，將誘導并碎裂后的BL21(DE3)/pET-SUMO-C1D、BL21(DE3)/pET-SUMO-CCL18、BL21(DE3)/pET-SUMO-CXCL1、BL21(DE3)/pET-SUMO-TM4SF1、BL21(DE3)/pET-SUMO-FXR1和BL21(DE3)/pET-SUMO-TIZ菌液離心，分別取上清和沉淀，用pET-SUMO的特異性抗體His-tag(小鼠His-tag一抗)進行Western-Blot檢測。結果顯BL21(DE3)/pET-SUMO-C1D、BL21(DE3)/pET-SUMO-CCL18和BL21(DE3)/pET-SUMO-CXCL1在菌液碎裂以后的上清液里有目的蛋白條帶，而BL21(DE3)/pET-SUMO-TM4SF1、BL21(DE3)/pET-SUMO-FXR1和BL21(DE3)/pET-SUMO-TIZ在菌液碎裂以后的沉淀里有目的蛋白的條帶。SUMO-TM4SF1、SUMO-FXR1和SUMO-TIZ以包涵體蛋白形式存在。

1.3融合蛋白SUMO-C1D、SUMO-CCL18、SUMO-CXCL1、SUMO-TM4SF1、SUMO-FXR1和SUMO-TIZ的純化

采用鎳螯合柱親和層析法從BL21(DE3)/pET-SUMO-C1D、BL21(DE3)/pET-SUMO-CCL18和BL21(DE3)/pET-SUMO-CXCL1的菌液碎裂以后的上清液中純化目的蛋白，從BL21(DE3)/pET-SUMO-TM4SF1、BL21(DE3)/pET-SUMO-FXR1和BL21(DE3)/pET-SUMO-TIZ菌液碎裂以后的沉淀里純化包涵體蛋白并進行復性，得到目的蛋白。將上述目的蛋白進行SDS-PAGE檢測。結果表明純化后的目的蛋白均為單一的目的條帶，從BL21(DE3)/pET-SUMO-C1D的菌液碎裂以后的上清液中純化得到融合蛋白SUMO-C1D；從BL21(DE3)/pET-SUMO-CCL18的菌液碎裂以后的上清液中純化得到融合蛋白SUMO-CCL18；從BL21(DE3)/pET-SUMO-CXCL1的菌液碎裂以后的上清液中純化得到融合蛋白SUMO-CXCL1；從BL21(DE3)/pET-SUMO-TM4SF1菌液碎裂以后的沉淀里純化包涵體蛋白并進行復性得到融合蛋白SUMO-TM4SF1；從BL21(DE3)/pET-SUMO-FXR1菌液碎裂以后的沉淀里純化包涵體蛋白并進行復性得到融合蛋白SUMO-FXR1；從BL21(DE3)/pET-SUMO-TIZ菌液碎裂以后的沉淀里純化包涵體蛋白并進行復性得到融合蛋白SUMO-TIZ。

其中，包涵體蛋白的復性方法如下：

①洗脫后的蛋白液放入透析卡中；

②將透析卡放入裝有1×PBS緩沖液中(加入1％氧化型和0.5％的還原型谷胱甘肽)，4℃攪拌透析復性；

③每兩小時換液一次，共換液四次，收集復性后的蛋白。

為了進一步驗證所純化的蛋白是否為融合蛋白SUMO-C1D、SUMO-CCL18、SUMO-CXCL1、SUMO-TM4SF1、SUMO-FXR1和SUMO-TIZ，將純化的目的蛋白用His-tag抗體(小鼠His-tag一抗)進行Western-Blot檢測，結果顯示純化的目的蛋白即實驗所需的融合蛋白SUMO-C1D、SUMO-CCL18、SUMO-CXCL1、SUMO-TM4SF1、SUMO-FXR1和SUMO-TIZ。

2、多指標聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌液態(tài)懸浮芯片的制備

本實驗通過摸索合適的條件成功的建立了液態(tài)懸浮芯片法檢測血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體含量的體系，并分別用液態(tài)懸浮芯片法和ELISA法檢測了30例體檢正常婦女、30例卵巢良性腫瘤患者、60例上皮性卵巢癌患者血清內CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體的水平。比較兩種方法在診斷上皮性卵巢癌中的優(yōu)劣。

2.1材料

2.1.1血清資料

血清標本均來自廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科2003年9月至2012年12月住院并經病理學檢查確診的卵巢腫瘤患者及2008年普查時的正常健康婦女。其中卵巢上皮性癌60例(惡性組)，臨床分期按國際婦產科聯(lián)盟(FIGO,2004)標準，Ⅰ-Ⅱ期16例，Ⅲ-Ⅳ期44例；漿液性42例，黏液性18例；中位年齡46.7歲(13歲-73歲)。卵巢良性腫瘤組30例(良性組)，卵巢黃素囊腫3例，卵巢巧克力囊腫13例，卵巢成熟畸胎瘤12例，卵巢黃體囊腫2例，患者中位年齡歲32.4(11歲-50歲)。正常健康婦女(對照組)30例，心肺、肝功均正常，既往無卵巢疾患，婦科檢查及盆腔B超檢查未發(fā)現(xiàn)異常，中位年齡34.4歲(25歲-45歲)。

2.1.2抗原、抗體

2.1.3主要試劑配制

(1)0.03MPB緩沖液:稱取2.839Na₂HPO₄，1.369g KH₂pO₄定容至1L，調節(jié)pH至7.2。

(2)PB:0.0lM磷酸鹽緩沖液：

PBS(pH 7.4)：調節(jié)PB溶液的pH值至7.4，加水至IL。分裝后高壓蒸汽20min，或過濾除菌，保存于室溫。

(3)SA-PE稀釋液:PBS(pH7.4)，1％BSA。

2.1.4主要儀器

2.2、液態(tài)懸浮芯片檢測方法

2.2.1抗原、抗體的制備及脫鹽

2.2.1.1抗原、抗體制備

將步驟1純化的目的蛋白(融合蛋白SUMO-C1D、SUMO-CCL18、SUMO-CXCL1、SUMO-TM4SF1、SUMO-FXR1和SUMO-TIZ)先用超濾管超濾濃縮。

2.2.1.2抗原、抗體脫鹽

(1)平衡柱子：用PBS(pH 7.4)平衡PD-10柱；

(2)上樣：在柱子平衡后，將樣品加到柱子；

(3)洗脫：樣品全部進入柱子內后，柱頂加入水或適宜緩沖液洗脫；

(4)洗脫后，用Eppendorf小管每管收集1ml，SDS-PAGE鑒定是否有目的蛋白，并用BCA法測蛋白濃度。

2.2.2生物素化CCL18多克隆抗體和生物素化CXCL1多克隆抗體的制備

(1)將待生物素化的CCL18多克隆抗體、CXCL1多克隆抗體用PBS(pH 7.4)稀釋到1mg/ml；

(2)用PBS(pH 7.4)對蛋白質充分透析；

(3)用1mlDMSO溶解N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB)1mg；

(4)向1ml蛋白質溶液加入120μl NHSB溶液；

(5)在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2-4h；

(6)加入9.6μL1mol/L NH₄Cl在室溫下攪拌10min；

(7)將上述混合液加入到透析卡中，PBS液體4℃攪拌透析，以除去游離的生物素；得到生物素化CCL18多克隆抗體和生物素化CXCL1多克隆抗體。

2.2.3 BCA法測蛋白濃度

用BCA法測蛋白濃度。

2.2.4抗原、抗體包被微球反應

實驗中所選擇的微球為BIO-RAD公司生產Bio-Plex磁性聚苯乙烯磁性微球，Bio-Plex懸液芯片的核心技術是把微小的顆粒亦稱微球(bead或microsphere)分別染成不同的熒光色，然后再把針對不同檢測物的蛋白質或寡核苷酸探針以共價的方式耦聯(lián)到不同顏色的磁珠上，磁珠直徑為6.5um。磁珠的制作過程按照嚴格的搭配比例摻入兩種不同的紅色分類熒光染料，根據(jù)比例不同可以把球型基質分類為100種，從1到100進行編號。實驗中選了了六種不同編號微球。本實驗中的各種緩沖液均為BIO-RAD公司磁性微球配套使用的緩沖液，包括微球活化液、微球清洗液、微球儲存液等，保證了實驗過程中反應緩沖體系的穩(wěn)定性及可靠性。

用CCL18單克隆抗體溶液(溶劑是PBS(pH 7.4)，溶質是CCL18單克隆抗體，該溶液的濃度是8μg/mL)包被62號微球，得到CCL18(62號微球)；用CXCL1單克隆抗體溶液(溶劑是PBS(pH 7.4)，溶質是CXCL1單克隆抗體，該溶液的濃度是8μg/mL)包被34號微球，得到CXCL1(34號微球)；用融合蛋白SUMO-C1D溶液(溶劑是PBS(pH 7.4)，溶質是融合蛋白SUMO-C1D，該溶液的濃度是12μg/mL)包被29號微球，得到C1D(29號微球)；用融合蛋白SUMO-C1D溶液(溶劑是PBS(pH 7.4)，溶質是融合蛋白SUMO-C1D，該溶液的濃度是12μg/mL)包被29號微球，得到C1D(29號微球)；用融合蛋白SUMO-TM4SF1溶液(溶劑是PBS(pH 7.4)，溶質是融合蛋白SUMO-TM4SF1，該溶液的濃度是8μg/mL)包被37號微球，得到TM4SF1(37號微球)；用融合蛋白SUMO-FXR1溶液(溶劑是PBS(pH 7.4)，溶質是融合蛋白SUMO-FXR1，該溶液的濃度是4μg/mL)包被52號微球，得到FXR1(52號微球)；用融合蛋白SUMO-TIZ溶液(溶劑是PBS(pH 7.4)，溶質是融合蛋白SUMO-TIZ，該溶液的濃度是8μg/mL)包被55號微球，得到TIZ(55號微球)。

2.2.5液態(tài)懸浮芯片法檢測血清自身抗原(CCL18和CXCL1)和血清自身IgG型抗體(C1D抗體、TM4SF1抗體、FXR1抗體和TIZ抗體)含量

(1)將CCL18(62號微球)、CXCL1(34號微球)、C1D(29號微球)、TM4SF1(37號微球)、FXR1(52號微球)和TIZ(55號微球)這6種偶聯(lián)好的微球用Assay Buffer(溶質是BSA，溶劑是PBS(pH 7.4)，溶質的質量百分濃度是1％)稀釋至6×10⁴個/ml濃度(3000個/孔)；

(2)1400rpm震蕩稀釋后微球30秒，每孔加入50μl；

(3)清洗微球；

(4)用Assay Buffer稀釋待檢測人血清；

(5)每孔加入50μl稀釋后的待檢測人血清，空白孔加入Assay Buffer作為對照，將表達自身抗原(CCL18和CXCL1)和自身IgG型抗體(C1D抗體、TM4SF1抗體、FXR1抗體和TIZ抗體)的血清作為陽性對照；

表達自身抗原(CCL18和CXCL1)和自身IgG型抗體(C1D抗體、TM4SF1抗體、FXR1抗體和TIZ抗體)的血清通過ELISA法鑒定：將CCL18單克隆抗體、CXCL1單克隆抗體、融合蛋白SUMO-C1D、SUMO-TM4SF1、SUMO-FXR1或SUMO-TIZ分別包被96孔板，按照下述ELISA實驗步驟操作，分別取5例正常、5例卵巢良性病變、14例卵巢癌血清做為待檢測血清。將正常、良性卵巢腫瘤患者血清A450值與卵巢癌患者血清A450值比較，明顯升高的卵巢癌患者血清為表達自身抗原(CCL18和CXCL1)和自身IgG型抗體(C1D抗體、TM4SF1抗體、FXR1抗體和TIZ抗體)的血清(也稱CCL18、CXCL1抗原和C1D、TM4SF1、FXR1、TIZ抗體陽性血清)，每個樣本重復3個。

(6)避光室溫1100rpm震蕩30秒，700rpm震蕩孵育1小時；

(7)運行清洗工作站MAG3×程序清洗微球；

(8)用Assay Buffer稀釋生物素標記檢測抗體(生物素化CCL18多克隆抗體、生物素化CXCL1多克隆抗體和生物素化羊抗人IgG-Fc)；

(9)每孔加入對應的稀釋的生物素標記檢測抗體；

(10)避光室溫1100rpm震蕩30秒，700rpm震蕩孵育30分鐘；

(11)運行清洗工作站MAG3×程序清洗微球；

(12)用Assay Buffer將Streptavidin-PE(SA-PE)(100×)稀釋成1×濃度；

(13)每孔加入50μl稀釋后的SA-PE；

(14)避光室溫1100rpm震蕩30s，700rpm震蕩孵育15分鐘；

(15)運行清洗微球；

(16)每孔加入125μl Assay Buffer重懸微球；

(17)放于平板搖床上，1100rpm震蕩1分鐘；

(18)送入Bio-Plex儀器檢測。

根據(jù)標準曲線對待檢測人血清中的CCL18和CXCL1進行定量，對待檢測人血清中的以下四種自身IgG型抗體進行定量：C1D抗體、TM4SF1抗體、FXR1抗體和TIZ抗體。標準曲線的制備方法如下：用Assay Buffer配制SUMO-CCL18和SUMO-CXCL1濃度分別為100000ng/ml10000ng/ml、1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml、1pg/ml、0pg/ml的標準品溶液。配制-系列濃度的100000ng/ml 10000ng/ml、1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml、1pg/ml、0pg/ml標準品IgG蛋白(抗人C1D、抗人TM4SF1、抗人FXR1或抗人TIZ)以繪制樣品檢測劑量-反應的標準曲線，取直線范圍之內的標準品做標準曲線。

2.3ELISA法檢測血清自身抗原(CCL18和CXCL1)和血清自身IgG型抗體(C1D抗體、TM4SF1抗體、FXR1抗體和TIZ抗體)含量

(1)用抗原包被96孔酶標板，每孔加入100uL，37度2h；用PBS(pH 7.4)溶解溶質(融合蛋白SUMO-C1D、SUMO-TM4SF1、SUMO-FXR1或SUMO-TIZ)，得到包被液，用該包被液包被96孔板，各包被液中溶質的濃度均為2ug/mL。

(2)甩盡包被液并拍干，按200μl/孔的量用洗板液洗板3次，每次振蕩5分鐘(洗滌液：PBS+0.5％吐溫20)。

(3)加入封閉液(含BSA的PBS溶液)在37度封閉lh；SUMO-C1D包被板所用的封閉液的溶質是BSA，溶劑是PBS(pH 7.4)，溶質的質量百分濃度是3％；SUMO-TM4SF1包被板所用的封閉液的溶質是BSA，溶劑是PBS(pH 7.4)，溶質的質量濃度是5％；SUMO-FXR1包被板所用的封閉液的溶質是小牛血清，溶劑是PBS(pH 7.4)，溶質的體積濃度是1％；SUMO-TIZ包被板所用的封閉液的溶質是脫脂奶粉，溶劑是PBS(pH 7.4)，溶質的質量濃度是3％。

(4)拍干，按200μl/孔的量用洗板液洗板3次，每次振蕩5分鐘。

(5)將待檢測血清用PBS(pH 7.4)稀釋100倍后加到已包被的板上，每孔100μl。用PBS(pH 7.4)作為陰性對照，用表達自身抗原(CCL18和CXCL1)和血清自身IgG型抗體(C1D抗體、TM4SF1抗體、FXR1抗體和TIZ抗體)的血清作為陽性對照。37℃溫育1小時。用洗液洗3次，加辣根過氧化物酶標兔抗人IgG，用PBS(pH 7.4)稀釋，稀釋度為1:40000，每孔100μl，37℃溫育1小時。

(6)洗液洗3次，甩干。

(7)加入TMB顯色液100ul每孔。

(8)加終止液，測定A450值。

將標準品IgG蛋白(抗人C1D、抗人TM4SF1、抗人FXR1或抗人TIZ)用PBS(pH 7.4)稀釋成不同的濃度，按照上述步驟包被、洗板、封閉、與二抗反應、終止、測A450，根據(jù)包被濃度與相應的A450值繪制曲線，選取線性范圍的包被濃度制作標準曲線，得到ELISA法檢測血清C1D、TM4SF1、FXR1、TIZ IgG型自身抗體標準曲線。根據(jù)標準曲線對待檢測人血清中的C1D、TM4SF1、FXR1、TIZ IgG型自身抗體進行定量，采用血清CCL18、CXCL1ELISA檢測試劑盒檢測血清自身抗原CCL18和CXCL1。

2.4液態(tài)懸浮芯片法與ELISA法分別進行六種指標聯(lián)合檢測的準確度和精密度比較

分別用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法和2.3的ELISA法檢測血清自身抗原(CCL18和CXCL1)和血清自身IgG型抗體(C1D抗體、TM4SF1抗體、FXR1抗體和TIZ抗體)含量，每個檢測指標重復檢測20個復孔作為評價兩種檢測方法的批內變異系數(shù)，每個檢測指標重復檢測20天作為評價兩種檢測方法的批間變異系數(shù)。

采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用t檢驗，和方差分析，兩種方法Logistic回歸分析，繪制受試者工作曲線(ROC曲線)，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2.4.1液態(tài)懸浮芯片法與ELISA檢測法分別進行多指標聯(lián)合檢測的準確度比較

將檢測結果繪制各自的ROC曲線，根據(jù)ROC曲線確定每個檢測因子在診斷卵巢癌時判定陽性的CUTOFF值。ROC曲線是反映敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標，它對所有可能的閾值作計算顯示敏感度和特異度之間相互關系，以FPR(1-特異度，1-specificity)為橫坐標，TPR(靈敏度，sensitivity)為縱坐標，繪制ROC曲線，通過改變診斷界點，獲得多對TPR與FPR值，從而能動態(tài)的、客觀的反應診斷系統(tǒng)的效能，通過計算ROC曲線下面積AUC(Area Under the Curve,AUC)來評價診斷效率，曲線下面積越大，診斷準確性越高。

分別用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法和2.3的ELISA法檢測六種指標(血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體)含量，通過Logisti回歸分析計算出液態(tài)懸浮芯片法和ELISA法診斷上皮性卵巢癌的陽性預測值，根據(jù)陽性預測值分別繪制兩種方法聯(lián)合檢測六種指標的ROC曲線(圖1和2)，以約登指數(shù)最大的診斷點為最佳診斷點，高于此界值定義為診斷陽性，低于此界值定義為陰性。分別計算兩種方法聯(lián)合診斷各自的陽性和陰性診斷例數(shù)，用四個表法比較兩者進行多指標聯(lián)合檢測的準確度。結果用液態(tài)懸浮芯片法和ELISA法檢測聯(lián)合檢測六種指標對上皮性卵巢癌診斷的ROC曲線下面積分別為0.990和0.984，液態(tài)懸浮芯片法和ELISA法聯(lián)合檢測六種指標診斷的準確度分別為98.33％和95.33％(表1)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P＝0.02)。說明液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體的準確度高于ELISA法。

表1、液態(tài)懸浮芯片法和ELISA法聯(lián)合檢測六種指標準確度的比較

液態(tài)懸浮芯片準確度：98.33％，ELISA準確度：95.33％，χ²＝39.31，P＝0.02

2.4.2液態(tài)懸浮芯片法與ELISA法分別進行六種指標聯(lián)合檢測的精密度比較

為了評價液態(tài)懸浮芯片法與ELISA法對上皮性卵巢癌診斷的精密度，以兩種方法的批內變異系數(shù)和批間變異系數(shù)來進行精密度的評價。取正常血清、良性、卵巢癌患者血清各1例分別用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法和2.3的ELISA法檢測六種指標(血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體)含量，每個檢測指標重復檢測20個復孔作為評價兩種檢測方法的批內變異系數(shù)(表2和3)。每個檢測指標重復檢測20天作為評價兩種檢測方法的批間變異系數(shù)(表4和5)。結果顯示液態(tài)懸浮芯片法對血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體檢測的精密度高于ELISA法。

表2兩種方法批內變異系數(shù)(n＝20)

表3兩種方法批內變異系數(shù)(n＝20)

表4兩種方法批間變異系數(shù)(n＝3,20天)

表5兩種方法批間變異系數(shù)(n＝3,20天)

表2-表5中，CCL18表示血清CCL18，CXCL1表示血清CXCL1，C1D表示血清C1D IgG型自身抗體，TM4SF1表示血清TM4SF1IgG型自身抗體，F(xiàn)XR1表示血清FXR1IgG型自身抗體，TIZ表示TIZ IgG型自身抗體。芯片表示2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法，Elisa表示2.3的ELISA法。

通過檢測本實驗中液態(tài)懸浮芯片法進行六種指標聯(lián)合檢測診斷卵巢癌的準確度為98.33％；為了評價液態(tài)懸浮芯片法對上皮性卵巢癌診斷的精密度，以檢測樣本的批內變異系數(shù)(室內質控)和批間變異系數(shù)(室間指控)來進行精密度的評價，結果對于同一個樣本同一時間檢測的20個復孔、同一樣本的重復檢測20天的變異系數(shù)均小于12％。說明本實驗建立的液態(tài)懸浮芯片檢測體系對上皮性卵巢癌診斷的準確度高、誤差小、穩(wěn)定性好。

2.5液態(tài)懸浮芯片法與ELISA檢測法分別進行六種指標聯(lián)合檢測的敏感性、特異性和同一致比較

2.5.1液態(tài)懸浮芯片法與ELISA檢測法分別進行六種指標聯(lián)合檢測的敏感性、特異性比較

分別用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法和2.3的ELISA法檢測六種指標(血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體)含量，通過Logisti回歸分析計算出液態(tài)懸浮芯片法和ELISA法診斷上皮性卵巢癌的陽性預測值，根據(jù)陽性預測值分別繪制兩種方法聯(lián)合檢測六種指標的ROC曲線，以約登指數(shù)最大的診斷點為最佳診斷點，高于此界值定義為診斷陽性，低于此界值定義為陰性。分別計算兩種方法聯(lián)合診斷各自的陽性和陰性診斷例數(shù)，用四個表法比較兩者進行多指標聯(lián)合檢測的敏感度和特異度。結果液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體含量聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌的敏感性和特異性分別為100％和96.7％，ELISA法聯(lián)合檢測血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體含量聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌的敏感性和特異性分別為96.1％和95.1％(表6和表7)。液態(tài)懸浮芯片法和ELISA法聯(lián)合檢測的陽性似然比、陰性似然比、陽性預測值、陰性預測值、誤診率、漏診率見表7，說明液態(tài)懸浮芯片法診斷上皮性卵巢的性能高于ELISA法。

表6液態(tài)懸浮芯片法和ELISA法聯(lián)合檢測六種指標靈敏度和特異度的比較

注：液態(tài)懸浮芯片表示2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法，ELISA表示2.3的ELISA法。

表7液態(tài)懸浮芯片法和ELISA法聯(lián)合檢測六種指標診斷性能的比較

注：液態(tài)芯片表示2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法，ELisa表示2.3的ELISA法。

2.5.2液態(tài)懸浮芯片法與ELISA檢測法分別進行六種指標聯(lián)合檢測的同一性比較

將液態(tài)懸浮芯片法與ELISA法檢測的血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體含量做相關性分析，結果表明兩種方法檢測血清CCL18的相關系數(shù)為0.908，血清CXCL1的相關系數(shù)為0.928，血清C1D IgG型自身抗體的相關系數(shù)為0.896，血清TM4SF1IgG型自身抗體的相關系數(shù)為0.910,血清FXR1IgG型自身抗體相關系數(shù)為0.911，血清TIZ IgG型自身抗體的相關系數(shù)為0.887。說明兩種檢測方法的同一性好。

2.6液態(tài)懸浮芯片法與ELISA法分別進行六種指標聯(lián)合檢測的CUTOFF值驗證

選取1例陽性表達血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體的標本稀釋至CUTOFF值附近，用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法與2.3的ELISA法檢測的血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體含量，重復檢測20次。若95％以上結果落在臨界范圍(即CUTOFF值加減20％)則認為該CUTOFF值設定可靠。結果由表8所示，用液態(tài)懸浮芯片法與ELISA法檢測的血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體含量的CUTOFF值95％以上檢測值均落在正常檢測范圍內。

表8液態(tài)懸浮芯片法與ELISA檢測法CUTOFF值驗證

液態(tài)懸浮芯片法將六種指標聯(lián)合檢測的敏感度、特異度均高于ELISA法。進一步驗證兩種法檢測對聯(lián)合診斷的同一性，結果兩種方法有良好的同一性，但是液態(tài)懸浮芯片法較ELISA法有更大的檢測范圍。

綜上所述，本實驗成功的建立了液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體含量的檢測體系，與傳統(tǒng)的ELISA法相比，其靈敏度、特異度均高于ELISA法，且此檢測方法聯(lián)合檢測六種指標對上皮性卵巢癌有高精密度、誤差小及穩(wěn)定性好的特點。

3、多指標聯(lián)合檢測卵巢癌的臨床驗證

本部分通過臨床多樣本的檢測研究聯(lián)合檢測血清CCL18、CXCL1抗原、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體，并與應用較為廣泛的卵巢癌標志物CA125比較，分別研究聯(lián)合檢測六指標和CA125對惡性盆腔包塊診斷的價值和診斷性能、比較聯(lián)合檢測盒CA125對卵巢惡性腫瘤診斷的優(yōu)劣性。

研究中發(fā)現(xiàn)六指標聯(lián)合檢測聯(lián)合診斷不能很好的診斷出器官特異性腫瘤(卵巢癌和非卵巢癌)，在其他惡性腫瘤血清中也會升高，在臨床使用六指標檢測時如果結合臨床表現(xiàn)及其他輔助檢查對卵巢來源和非卵巢來源的惡性腫瘤診斷效果會更好。但是，聯(lián)合檢測C1D、TM4SF1、FXR1、TIZ IgG型血清自身抗體對上皮性卵巢惡性腫瘤的陽性率明顯高于其他惡性腫瘤，可以較好的區(qū)分上皮性卵巢惡性腫瘤與其他惡性腫瘤，如果結合臨床癥狀和其他檢查效果會更好。聯(lián)合檢測血清六指標診斷早期卵巢癌的效果好于檢測自身抗體譜和CA125。聯(lián)合檢測六個指標對漿液性卵巢癌診斷好于CA125，聯(lián)合檢測六個指標對卵巢癌病理分級上與CA125差別不大。

3.1臨床樣本資料

血清標本均來自廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科2003年9月至2009年10月住院并經病理學檢查確診的盆腔包塊患者及2008年普查時的正常健康婦女。其中卵巢惡性腫瘤119例(惡性組)，臨床分期按國際婦產科聯(lián)盟(FIGO,2004)標準，Ⅰ-Ⅱ期37例，Ⅲ-Ⅳ期82例；漿液性67例，黏液性33例，其它5例；中位年齡48.5歲(16歲-75歲)。卵巢良性腫瘤組(盆腔良性包塊組)(良性組)204例，子宮肌瘤42例，子宮腺肌癥15例，輸卵管結核4例，輸卵管積水4例，輸卵管囊腫7例，巧克力囊腫33例，黃體囊腫5例，黃素囊腫3例，成熟畸胎瘤42例，漿液性囊腺瘤20例，粘液性囊腺瘤18例，闊韌帶肌瘤3例，其他18例；患者中位年齡43.6歲(15歲-59歲)。正常健康婦女(正常組)120例，心肺、肝功均正常；既往無卵巢疾患、無乳腺疾病、無肝臟疾病、無肺臟疾病史；婦科檢查及盆腔B超檢查未發(fā)現(xiàn)異常、胸片及腹部B超未發(fā)現(xiàn)異常；中位年齡41.5歲(21歲-70歲)。乳腺癌組乳腺癌女性患者40例，血清標本均來自廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科2007年8月至2009年2月住院并經病理學檢測確診的女性乳腺癌患者,所有確診患者其臨床分期和病理學分型均符合UICC乳腺癌診治標準。Ⅰ-Ⅱ期27例，Ⅲ-Ⅳ期13例；浸潤性導管癌34例,浸潤性小葉癌5例,髓樣癌1例；中位年齡56.7歲(20歲-75歲)。肝癌組肝癌女性患者40例，血清標本均來自廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科2009年3月至2010年9月住院并經病理學檢測確診的女性肝癌患者,所有確診患者其臨床分期和病理學分型均符合全國肝癌學術會議(2001)制定的原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標準；Ⅰ-Ⅱ期28例，Ⅲ-Ⅳ期12例；肝細胞癌37例,肝內膽管癌3例；中位年齡55.9歲(38歲-87歲)。肺癌組肺癌女性患者40例，血清標本均來自廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸瘤科2007年4月至2009年3月住院并經病理學檢測確診的女性肺癌患者,所有確診患者其臨床分期和病理學分型均符合UICC肺癌診治標準；Ⅰ-Ⅱ期18例，Ⅲ-Ⅳ期22例；鱗癌22例,腺癌16例,小細胞肺癌2例；中位年齡54.3歲(22歲-68歲)。采血后4℃放置2小時，完全凝固后，2000rpm/min離心15分鐘，吸取血清分裝后-80℃保存。

表9、血清標本臨床資料

3.2方法

3.2.1液態(tài)懸浮芯片法檢測臨床血清樣本

采用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法檢測臨床血清樣本中的血清自身抗原(CCL18和CXCL1)和血清自身IgG型抗體(C1D抗體、TM4SF1抗體、FXR1抗體和TIZ抗體)含量。

3.2.2液態(tài)懸浮芯片診斷惡性盆腔包塊的診斷模型建立

使用SPSS13.0進行統(tǒng)計學處理，隨機將研究對象分為模型創(chuàng)建組和模型驗證組。對模型創(chuàng)建組使用基于最大似然估計的向前逐步回歸法篩選變量，建立Logistic回歸模型。將建立的診斷模型分別進行數(shù)學驗證和臨床驗證。

3.2.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0軟件進行Logistic回歸分析建立卵巢癌診斷模型，計量資料以t檢驗，單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義，繪制受試者工作特性(ROC)曲線，尋找靈敏度和特異度最佳的診斷閾值。

3.3、結果

3.3.1血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體在不同患者體內的含量

用液態(tài)懸浮芯片法檢測了563例(正常健康婦女血清120例，卵巢良性腫瘤204例，卵巢惡性腫瘤119例，乳腺癌40例，肝癌40例，肺癌40例)血清樣本中CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體的含量，各指標在血清內的含量如表10所示：

(1)C1D IgG型自身抗體:正常組與良性組比較P1＝0.082，正常組與惡性組比較P1＝0.000，良性組與惡性組比較P1＝0.000；正常組與乳腺癌組比較P1＝0.001；正常組與肝癌組比較P1＝0.007；正常組與肺癌組比較P1＝0.029?？梢娧鍍菴1D IgG型自身抗體含量惡性組高于正常組和良性組，正常組和良性組無差別；乳腺癌組、肝癌組、肺癌組高于正常組。

(2)TM4SF1IgG型自身抗體：正常組與良性組比較P2＝0.001，正常組與惡性組比較P2＝0.000，良性組與惡性組比較P2＝0.000；正常組與乳腺癌組比較P2＝0.001；正常組與肝癌組比較P2＝0.003；正常組與肺癌組比較P2＝0.000?？梢娧鍍萒M4SF1IgG型自身抗體含量惡性組高于正常組和良性組，良性組高于正常組；乳腺癌組、肝癌組、肺癌組高于正常組。

(3)TIZ IgG型自身抗體：正常組與良性組比較P3＝0.134，正常組與惡性組比較P3＝0.000，良性組與惡性組比較P3＝0.000；正常組與乳腺癌組比較P＝0.000；正常組與肝癌組比較P＝0.035；正常組與肺癌組比較P＝0.009?？梢娧鍍萒IZ IgG型自身抗體含量惡性組高于正常組和良性組，正常組和良性組無差別；乳腺癌組、肝癌組、肺癌組高于正常組。

(4)FXR1IgG型自身抗體：正常組與良性組比較P4＝0.611，正常組與惡性組比較P4＝0.000，良性組與惡性組比較P4＝0.000；正常組與乳腺癌組比較P4＝0.000；正常組與肝癌組比較P4＝0.000；正常組與肺癌組比較P4＝0.000?？梢娧鍍菷XR1IgG型自身抗體含量卵巢惡性腫瘤組高于正常和良性組，正常組和良性組無差別；乳腺癌、肝癌、肺癌高于正常組。

(5)CCL18：正常組與良性組比較P5＝0.008，正常組與惡性組比較P5＝0.000，良性組與盆腔惡性組比較P5＝0.000；正常組與乳腺癌組比較P5＝0.000；正常組與肝癌組比較P5＝0.002；正常組與肺癌組比較P5＝0.002?？梢娧鍍菴CL18含量卵巢惡性腫瘤組高于正常組和良性組，良性組高于正常組；乳腺癌組、肝癌組、肺癌組高于正常組。

(6)CXCL1：正常組與良性組比較P6＝0.001，正常組與惡性組比較P6＝0.000，良性組與惡性組比較P6＝0.000；正常組與乳腺癌組比較P6＝0.000；正常組與肝癌組比較P6＝0.000；正常與肺癌組比較P6＝0.001?？梢娧鍍菴XCL1含量卵巢惡性腫瘤組高于正常組和良性組，良性組高于正常組；乳腺癌組、肝癌組、肺癌組高于正常組。

以上結果說明檢測血清樣本中血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體的含量可以判斷卵巢、乳腺、肝、肺腫瘤的良惡性。

表10、各指標在不同患者血清內的含量

P1:正常組與良性組比較；P2:正常組與惡性組比較；P3:良性組與惡性組比較；P4：正常組與乳腺癌組比較；P5：正常組與肝癌組比較；P6：正常組與肺癌組比較。CCL18表示血清CCL18含量，CXCL1表示血清CXCL1含量，C1D表示血清C1D IgG型自身抗體含量，TM4SF1表示血清TM4SF1IgG型自身抗體含量，F(xiàn)XR1表示血清FXR1IgG型自身抗體含量，TIZ表示TIZ IgG型自身抗體含量。

3.3.2液態(tài)懸浮芯片檢測各個指性標診斷惡腫瘤的ROC曲線及診斷性能比較

3.3.2.1液態(tài)懸浮芯片檢測各個指標診斷惡性腫瘤的ROC曲線下面積

用液態(tài)懸浮芯片法檢測了563例(正常健康婦女血清120例，卵巢良性腫瘤204例，惡性239例：卵巢惡性腫瘤119例、乳腺癌40例、肝癌40例、肺癌40例)血清樣本中CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體的含量。根據(jù)檢測得到的血清內血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體含量，分別繪制各個指標對惡性腫瘤診斷的ROC曲線，結果單獨檢測各個指標對惡性腫瘤診斷的ROC曲線下面積分別為0.917、0.913、0.762、0.727、0.830、0.865(表11)。

表11、液態(tài)芯片法單獨檢測各指標診斷惡性腫瘤ROC曲線下面積

表11中，CCL18表示血清CCL18含量，CXCL1表示血清CXCL1含量，C1D表示血清C1D IgG型自身抗體含量，TM4SF1表示血清TM4SF1IgG型自身抗體含量，F(xiàn)XR1表示血清FXR1IgG型自身抗體含量，TIZ表示TIZ IgG型自身抗體含量。

3.3.2.2液態(tài)懸浮芯片檢測各個指標診斷惡性腫瘤診斷性能比較

根據(jù)繪制的ROC曲線上約登指數(shù)最大的點為診斷點(CA125：35U/ml，CCL18：145.09ng/ml，CXCL1：144.71pg/ml、C1D：112.65pg/ml、TM4SF1：132.85ng/ml、FXR1：121.26ng/ml、TIZ：176.54ng/ml)，此時單獨檢測血清內CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體對惡性腫瘤診斷的敏感度和特異度分別是69.09％和87.09％、72.2％和87.76％、53.73％和84.79％、73.68％和86.32％、47.55％和83.00％、65.22％和83.19％。陽性似然比、陰性似然比、誤診率、漏診率如表12所示，可見單獨檢測各個指標對惡性腫瘤診斷的診斷效果均不是很理想。

表12、液態(tài)芯片法檢測六指標診斷惡性腫瘤的診斷性能比較

表11中，CCL18表示血清CCL18含量，CXCL1表示血清CXCL1含量，C1D表示血清C1D IgG型自身抗體含量，TM4SF1表示血清TM4SF1IgG型自身抗體含量，F(xiàn)XR1表示血清FXR1IgG型自身抗體含量，TIZ表示TIZ IgG型自身抗體含量。

3.3.3液態(tài)懸浮芯片診斷腫瘤的模型建立

由于單獨檢測各個指標對惡性腫瘤的診斷性能并不理想，本研究擬采用聯(lián)合檢測血清內CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體的含量，研究聯(lián)合檢測各個指標聯(lián)合診斷盆腔惡性腫瘤的診斷價值。

3.3.3.1聯(lián)合檢測六指標聯(lián)合診斷卵巢癌的模型的建立及驗證

3.3.3.1.1聯(lián)合檢測六指標聯(lián)合診斷卵巢癌的模型的建立

Logistic主要應用于臨床的診斷，根據(jù)危險因素預測某種疾病發(fā)生的概率。本實驗主要是通過檢測臨床血清樣本(59例卵巢惡性腫瘤、102例盆腔良性包塊、60例正常健康婦女血清)血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體的含量進行Logistic模型篩選，研究液態(tài)懸浮芯片聯(lián)合檢測的六種指標對盆腔惡性腫瘤的診斷意義，建立Logistic回歸模型。通過SPSS軟件的Logistic回歸模塊，單獨對六種指標進行Logistic逐步篩選法篩選出判斷對卵巢惡性腫瘤診斷有意義的因子，結果六種指標均是可以判斷腫瘤良惡性的因子。然后采用最大似然估計分析表法得出六種指標相互作用的參數(shù)估計，標準差和各個參數(shù)的Wald檢驗結果，最后根據(jù)這些參數(shù)，得出盆腔惡性腫瘤的診斷模型及P值(聯(lián)合檢測六指標聯(lián)合診斷卵巢癌的模型及P值)：

Logit(P)＝-11.151+0.008×C1D+0.011×TM4SF1+0.011×TIZ-0.008×FXR1+0.021×CCL18+0.20×CXCL1

P＝exp(-11.151+0.008×C1D+0.011×TM4SF1+0.011×TIZ-0.008×FXR1+0.021×CCL18+0.20×CXCL1)/(1+exp(-11.151+0.008×C1D+0.011×TM4SF1+0.011×TIZ-0.008×FXR1+0.021×CCL18+0.20×CXCL1))

P為估計概率值，P大于等于0.5時預報為惡性，P小于0.5時預報為良性。

其中，C1D表示血清內C1D IgG型自身抗體含量，單位是pg/ml；

TM4SF1表示血清內TM4SF1IgG型自身抗體的含量，單位是ng/ml；

TIZ表示血清內TIZ IgG型自身抗體的含量，單位是ng/ml；

FXR1表示血清內FXR1IgG型自身抗體的含量，單位是ng/ml；

CCL18表示血清內CCL18的含量，單位是ng/ml；

CXCL1表示血清內CXCL1的含量，單位是pg/ml；

3.3.3.1.2六指標診斷盆腔惡性腫瘤的模型的驗證

(1)數(shù)學驗證：獲得Logistic回歸模型的參數(shù)估計以后需要對模型進行檢驗，包括對回歸系數(shù)的檢驗及擬合優(yōu)度的檢驗。應用Omnibus Tests of Model Coefficients對模型的歸系數(shù)進行的卡方檢驗，是否顯著相關，模型系數(shù)檢驗結果P＝0.000，回歸系數(shù)通過檢驗。最大似然估計值-2Loglikelihood范圍在(0，正無窮大)，一般觀察此值是否隨步數(shù)變化遞增或遞減，以判斷方程收斂情況。所以，-2LL可用于檢驗Logistic回歸的顯著性。-2LL反映了在模型中包括了所有自變量后的誤差，用于處理因變量無法解釋的變動部分的顯著性問題，又稱為擬合劣度卡方統(tǒng)計量。當-2LL的實際顯著性水平大于給定的顯著性水平α時，因變量的變動中無法解釋的部分是不顯著的，意味著回歸方程的擬合程度越好。本模型中-2Loglikelihood卡方值為141.933，大于臨界卡方值12.592，說明模型擬合度好。Hosmer and Lemeshow Test是一個方程擬合度檢驗，假設擬合無偏差，查看P值，如果P>0.05，說明應該接受結果，即認同擬合方程與真實的方程基本沒有偏差，也就是說這個P值越大越好,本模型Hosmer and Lemeshow Test的P＝0.828。以上結果說明本模型可作為六種指標聯(lián)合標志物聯(lián)合診斷盆腔惡性腫瘤的可能性。

(2)臨床驗證：采用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法檢測臨床血清樣本(剩余的60例卵巢惡性腫瘤、102例盆腔良性包塊、60例正常健康婦女血清)中的血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體的含量聯(lián)合診斷卵巢惡性腫瘤進行上述聯(lián)合檢測六指標聯(lián)合診斷卵巢癌的模型的驗證。采用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法檢測臨床血清樣本(剩余的60例卵巢惡性腫瘤、102例盆腔良性包塊、60例正常健康婦女血清)中的血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體的含量聯(lián)合檢測診斷卵巢惡性腫瘤(簡稱液態(tài)芯片法聯(lián)合檢測六指標聯(lián)合診斷卵巢惡性腫瘤)ROC曲線下面積0.982(如圖3)，電化學發(fā)光法檢測臨床血清樣本中的CA125診斷卵巢惡性腫瘤的的ROC曲線下面積是0.916(如圖4)。液態(tài)芯片法聯(lián)合檢測六指標聯(lián)合診斷卵巢惡性腫瘤(表12中簡稱“聯(lián)合”)和電化學發(fā)光法檢測臨床血清樣本中的CA125診斷卵巢惡性腫瘤(表12中簡稱“CA125”)的準確度、敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、LR+、LR-、漏診率、誤診率如表13，可見診斷模型對于盆腔惡性腫瘤的診斷性能好于CA125。

表13、Logistic回歸模型驗證分析液態(tài)芯片法聯(lián)合檢測六指標診斷性能的比較

3.3.3.2聯(lián)合檢測四指標聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌的模型的建立及驗證

采用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法檢測臨床血清樣本中的血清C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體的含量聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌。

3.3.3.2.1Logistic回歸分析建立聯(lián)合檢測四指標聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌的模型

采用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法檢測臨床血清樣本(55例卵巢上皮性癌(上皮性卵巢癌)、102例盆腔良性包塊、60例正常健康婦女血清)中的血清C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體的含量(簡稱四種指標)進行Logistic模型篩選，研究液態(tài)懸浮芯片聯(lián)合檢測的四種指標聯(lián)合診斷盆腔惡性腫瘤的意義，建立Logistic回歸模型。通過SPSS軟件的Logistic回歸模塊，單獨對四種指標進行Logistic逐步篩選法篩選出判斷對卵巢惡性腫瘤診斷有意義的因子，結果四種指標均是可以判斷腫瘤良惡性的因子。然后采用最大似然估計分析表法得出四種指標相互作用的參數(shù)估計，標準差和各個參數(shù)的Wald檢驗結果，最后根據(jù)這些參數(shù)，得出上皮性卵巢癌的診斷模型(聯(lián)合檢測四指標聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌的模型及P值)：

Logit(P)＝-5.137+0.013×C1D+0.14×TM4SF1+0.06×TIZ-0.06×FXR1

P＝exp(-5.137+0.013×C1D+0.14×TM4SF1+0.06×TIZ-0.06×FXR1)/(1+exp(-5.137+0.013×C1D+0.14×TM4SF1+0.06×TIZ-0.06×FXR1))

P為估計概率值，P大于等于0.5時預報為惡性，P小于0.5時預報為良性。

其中，C1D表示血清內C1D IgG型自身抗體含量，單位是pg/ml；

TM4SF1表示血清內TM4SF1IgG型自身抗體的含量，單位是ng/ml；

TIZ表示血清內TIZ IgG型自身抗體的含量，單位是ng/ml；

FXR1表示血清內FXR1IgG型自身抗體的含量，單位是ng/ml。

3.3.3.2.2Logistic回歸分析建立聯(lián)合檢測四指標聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌的模型驗證

(1)數(shù)學驗證:獲得Logistic回歸模型的參數(shù)估計以后需要對模型進行檢驗，包括對回歸系數(shù)的檢驗及擬合優(yōu)度的檢驗。應用Omnibus Tests of Model Coefficients對模型的回歸系數(shù)進行的卡方檢驗，是否顯著相關，模型系數(shù)檢驗結果P＝0.000，回歸系數(shù)通過檢驗。本模型中-2Loglikelihood卡方值為299.989大于臨界卡方值9.488，說明模型擬合度好。本模型Hosmer and Lemeshow Test的P＝0.734。以上結果說明本模型可作為四種指標聯(lián)合標志物診斷上皮性卵巢癌的可能性。

(2)臨床驗證:采用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法檢測臨床血清樣本(剩余的50例上皮性卵巢惡性腫瘤、102例盆腔良性包塊、60例正常健康婦女血清)中的血清C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體的含量進行上述聯(lián)合檢測四指標聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌的模型的驗證(簡稱液態(tài)懸浮芯片聯(lián)合檢測四指標聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌)。液態(tài)懸浮芯片聯(lián)合檢測四指標聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌的ROC曲線下面積0.928(如圖5)，電化學發(fā)光法檢測臨床血清樣本中的CA125診斷上皮性卵巢癌ROC曲線下面積是0.910(如圖6)。液態(tài)懸浮芯片聯(lián)合檢測四指標聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌(表14中簡稱“聯(lián)合”)和電化學發(fā)光法檢測臨床血清樣本中的CA125診斷上皮性卵巢癌(表14中簡稱“CA125”)準確度、敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、LR+、LR-、漏診率、誤診率如表14，可見液態(tài)懸浮芯片聯(lián)合檢測四指標診斷上皮性卵巢癌對于上皮性卵巢癌的診斷性能好于CA125。

表14、Logistic回歸模型驗證分析聯(lián)合檢測四指標診斷上皮性卵巢癌診斷性能的比較

3.3.3.3六指標聯(lián)合檢測診斷卵巢和非卵巢惡性腫瘤及四指標聯(lián)合檢測(自身抗體譜)診斷卵巢上皮性惡性腫瘤

3.3.3.3.1六指標聯(lián)合診斷卵巢和非卵巢惡性腫瘤

采用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法檢測臨床血清樣本(119例卵巢惡性腫瘤、40例乳腺癌、40例肝癌、40例肺癌患者血清)中的血清CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體和TIZ IgG型自身抗體的含量(簡稱液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測六指標)，根據(jù)上述聯(lián)合檢測六指標聯(lián)合診斷卵巢癌的模型及P值評價液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測六指標在卵巢癌及其他腫瘤中的陽性率。結果見表15和表16，液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測六指標在卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌患者中診斷的陽性率分別為94.9％、82.5％、77.5％、72.5％,液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測六指標對卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌患者診斷的ROC曲線下面積分別為0.983、0.960、0.918、0.938，說明聯(lián)合檢測六個指標對其他惡性腫瘤的診斷也有較高的診斷率。

雖然液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測六指標不能很好的診斷出器官特異性腫瘤(卵巢癌和非卵巢癌)，在其他惡性腫瘤血清中也會升高，在臨床使用液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測六指標檢測時如果結合臨床表現(xiàn)及其他輔助檢查對卵巢來源和非卵巢來源的惡性腫瘤診斷效果會更好。

表15、液態(tài)懸浮芯片法檢測聯(lián)合檢測六指標對惡性腫瘤陽性率

表16、液態(tài)懸浮芯片法檢測聯(lián)合檢測六指標對惡性腫瘤的診斷性能

3.3.3.3.2自身抗體譜診斷上皮性卵巢癌診斷性能比較

采用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法檢測臨床血清樣本(105例上皮性卵巢癌、40例乳腺癌、40例肝癌、40例肺癌患者血清)中的血清C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體的含量(簡稱液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測四指標或自身抗體譜檢測)，根據(jù)上述聯(lián)合檢測四指標聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌的模型及P值評價聯(lián)合四指標檢測在其他腫瘤中的陽性率。液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測四指標在上皮性卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌患者中的陽性率分別為85.2％、55.0％、52.5％、60.0％(表17和18)。液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測四指標對上皮性卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌患者診斷的ROC曲線下面積分別為0.905、0.865、0.873、0.891，聯(lián)合檢測四個指標對上皮性卵巢惡性腫瘤的陽性率明顯高于其他惡性腫瘤，如果結合臨床表現(xiàn)，聯(lián)合檢測四個指標可以較好的區(qū)分上皮性卵巢惡性腫瘤與其他惡性腫瘤，如果結合臨床癥狀和其他檢查效果會更好。

表17、液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測四指標對惡性腫瘤陽性率

表18、液態(tài)懸浮芯片法檢測聯(lián)合檢測四指標對惡性腫瘤的診斷性能

3.3.3.4六指標聯(lián)合檢測、自身抗體譜檢測、CA125檢測在診斷早期(Ⅰ-Ⅱ期)卵巢惡性腫瘤的ROC曲線及診斷性能的比較

3.3.3.4.1六指標聯(lián)合檢測、自身抗體譜檢測、CA125檢測在診斷早期(Ⅰ-Ⅱ期)卵巢惡性腫瘤的ROC曲線下面積比較

采用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法檢測204例卵巢良性腫瘤患者和37例Ⅰ-Ⅱ期卵巢惡性腫瘤患者血清樣本中六指標(CCL18含量、CXCL1含量、C1D IgG型自身抗體含量、TM4SF1IgG型自身抗體含量、FXR1IgG型自身抗體含量、TIZ IgG型自身抗體含量)、自身抗體譜(血清C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體)含量，分別繪制各個指標單獨檢測及六指標、自身抗體譜聯(lián)合檢測對Ⅰ-Ⅱ卵巢惡性腫瘤診斷的ROC曲線。電化學發(fā)光法檢測臨床血清樣本中的檢測血清CA125的含量繪制CA125檢測對Ⅰ-Ⅱ卵巢惡性腫瘤診斷的ROC曲線。結果表明單獨檢測CCL18含量、CXCL1含量、C1D IgG型自身抗體含量、TM4SF1IgG型自身抗體含量、FXR1IgG型自身抗體含量、TIZ IgG型自身抗體含量單獨診斷Ⅰ-Ⅱ卵巢惡性腫瘤和單獨檢測CA125含量單獨診斷Ⅰ-Ⅱ卵巢惡性腫瘤的ROC曲線下面積分別為0.848、0.896、0.737、0.809、0.784、0.857、0.706，可見單獨檢測各指標對Ⅰ-Ⅱ期卵巢惡性腫瘤診斷效果均不高。聯(lián)合檢測六指標聯(lián)合診斷Ⅰ-Ⅱ期卵巢惡性腫瘤的ROC曲線下面積是0.976，聯(lián)合檢測自身抗體譜聯(lián)合診斷Ⅰ-Ⅱ期卵巢惡性腫瘤診斷的ROC曲線下面積是0.929，說明聯(lián)合檢測六個指標對Ⅰ-Ⅱ期卵巢惡性腫瘤的診斷效果好于檢測自身抗體譜和單獨檢測CA125。

3.3.3.4.2六指標聯(lián)合檢測、自身抗體譜檢測、CA125檢測在診斷早期(Ⅰ-Ⅱ期)卵巢惡性腫瘤的性能的比較

根據(jù)ROC曲線進一步分析單獨檢測血清CA125的含量和聯(lián)合檢測六指標、聯(lián)合檢測抗體譜對Ⅰ-Ⅱ期卵巢性惡性腫瘤的診斷性能。以最大約登指數(shù)作為診斷值(CA125:35U/ml，聯(lián)合檢測六指標：0.213,聯(lián)合檢測抗體譜:0.311)計算診斷效能。由表19可見單獨檢測血清CA125的含量對卵巢惡性腫瘤診斷的靈敏度和特異度分別是29.7％和74.2％，聯(lián)合檢測六指標對Ⅰ-Ⅱ卵巢惡性腫瘤聯(lián)合診斷的敏感度和特異度分別是69.37％和93.58％，聯(lián)合檢測自身抗體譜對Ⅰ-Ⅱ卵巢惡性腫瘤診斷的敏感度和特異度分別是60.29％和80.31％。分別計算陽性似然比和陰性似然比及誤診率和漏診率，結果表明液態(tài)芯片法聯(lián)合檢測六指標陽性似然比高于CA125,而陰性似然比低于CA125；誤診率和漏診率均低于CA125?？梢娐?lián)合檢測血清六指標聯(lián)合診斷Ⅰ-Ⅱ期卵巢癌的效果好于檢測自身抗體譜和CA125。

表19、CA125和液態(tài)芯片法聯(lián)合檢測六指標及抗體譜對I-II期卵巢惡性腫瘤診斷性能的比較

3.3.3.5液態(tài)懸浮芯片聯(lián)合檢測六指標對漿液性卵巢癌的診斷價值

采用2.2.5的液態(tài)懸浮芯片法檢測67例漿液性卵巢癌患者血清中的CCL18、CXCL1、C1D IgG型自身抗體、TM4SF1IgG型自身抗體、FXR1IgG型自身抗體、TIZ IgG型自身抗體的含量(簡稱液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測六指標)，根據(jù)上述聯(lián)合檢測六指標聯(lián)合診斷卵巢癌的模型及P值評價液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測六指標在漿液性卵巢癌患者血清中的陽性率，電化學發(fā)光法檢測臨床血清樣本中的67例漿液性卵巢癌患者血清中的CA125含量在漿液性卵巢癌患者血清中的陽性率，結果顯示：液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測六指標聯(lián)合診斷漿液性卵巢癌的陽性率為77.61％(67例漿液性卵巢癌患者，檢測出52例陽性)，單獨檢測CA125診斷漿液性卵巢癌的陽性率為67.16％(67例漿液性卵巢癌患者，檢測出45例陽性)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P＝0.008)。說明液態(tài)懸浮芯片法聯(lián)合檢測六指標對漿液性卵巢癌診斷好于CA125。眾所周知上皮性卵巢癌單克隆抗體是由漿液性卵巢癌細胞株OVCA133所產生的，所以CA125對漿液性卵巢癌敏感，對卵巢癌的診斷有重要意義，通過研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測六指標對漿液性卵巢癌的診斷具有更高的價值。