本發(fā)明涉及一種化合物檢測方法，具體涉及一種茶多酚中EC含量的檢測方法。
背景技術：
：癌癥已成為21世紀威脅人類生存的頭號殺手，平均每年有600多萬人死于各種癌癥。中國已成為世界癌癥高發(fā)國之一，每年新增200多萬名癌癥患者，占全球總數(shù)的20％，并且每年呈快速增長趨勢。臨床上目前治療癌癥的藥物主要是化學藥品，但由于化學藥物毒性大，在殺死腫瘤細胞的同時也無選擇性的殺死白細胞、淋巴細胞等自身免疫細胞，導致各種并發(fā)癥和嚴重的不良反應，而且療程長，費用高，在臨床使用中有較大的局限性。中藥在治療癌癥方面有獨特的優(yōu)勢，以中藥為代表的天然藥物具有毒副作用小、作用靶點多樣、耐受性好等特點，在治療腫瘤方面越來越受到重視。茶多酚，又名抗氧靈、維多酚、防哈靈，是茶葉中所含的一類多羥基類化合物，簡稱TP，主要化學成分為兒茶素類(黃烷醇類)、黃酮及黃酮醇類、花青素類、酚酸及縮酚酸類、聚合酚類等化合物的復合體。其中兒茶素類化合物為茶多酚的主體成分，占茶多酚總量的65％～80％。兒茶素類化合物主要包括兒茶素(EC)、沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素沒食子酸酯(ECG)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)4種物質。研究表明，茶多酚等活性物質具解毒和抗輻射作用，能有效地阻止放射性物質侵入骨髓，并可使鍶90和鈷60迅速排出體外，被健康及醫(yī)學界譽為“輻射克星”。EC為茶多酚中的主要的組成成分之一，本發(fā)明的發(fā)明者研究發(fā)現(xiàn)，目前尚未有有效的檢測方法對其進行質量控制，研究及開發(fā)一種適合于常規(guī)檢測EC含量的檢測方法則顯得尤為重要。技術實現(xiàn)要素：發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種茶多酚中EC含量的檢測方法,該方法操作簡單，具有良好的精密度、重現(xiàn)性和可靠性，可用于EC含量的檢測和質量控制。技術方案：為了實現(xiàn)上述目的一種茶多酚中EC含量的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)設定高效液相色譜條件：色譜柱為C18，以濃度為0.1％-0.2％的乙酸水溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，洗脫方式為梯度洗脫，流速為0.8-1.2mL·min-1，柱溫為20-40℃，檢測波長為275-281nm，進樣量10-20μl；所述流動相A和B在液相進行過程中的體積比為(69-92)：(8-31)；(2)制備對照品溶液：稱取EC對照品，加入流動相A制成溶液，作為對照品溶液；(3)制備供試品溶液：稱取茶多酚粉末，加入流動相A，超聲提取，靜置，搖勻，濾過，作為供試品溶液；(4)含量測定：分別取對照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，進行高效液相色譜儀的操作，并記錄色譜圖，然后，利用色譜圖計算EC的含量。作為優(yōu)選，步驟(1)所述流動相A中乙酸的濃度為0.1％。作為優(yōu)選，步驟(1)所述檢測波長為278nm。作為優(yōu)選，步驟(1)所述流速為1.00mL·min-1，柱溫為35℃，進樣量20μl。作為優(yōu)選，所述流動相A和B在液相進行過程中0分鐘開始的體積比為92：8；25分鐘開始為69：31；35分鐘開始后為92：8。所述檢測方法，還包括對EC對照品溶液濃度X和峰面積積分值Y進行線性回歸的步驟；所述步驟為制備不同濃度的對照品溶液按上述色譜條件進行測定，得到不同的峰面積積分值，以峰面積積分值(Y)和對照品溶液濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程。所述檢測方法，還包括對高效液相色譜儀進行精密度檢測的步驟；所述步驟為將制備的對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣進行測定，得到不同的峰面積積分值，計算RSD，分析儀器精密度。所述檢測方法，還包括對供試品溶液的穩(wěn)定性進行檢測的步驟；所述步驟為制備供試品溶液，按上述色譜條件在不同時間分別進樣測定，測得不同峰面積積分值，計算RSD，分析供試品溶液的穩(wěn)定性。所述檢測方法，還包括檢驗EC含量的檢測方法的重復性的步驟；所述步驟為制備多份平行供試品溶液，按上述色譜條件分別進樣測定，測得不同峰面積積分值，計算RSD，分析所述方法重復性。所述檢測方法，還包括進行加樣回收率實驗的步驟；所述步驟為取已知含量的EC樣品，加入相應量的對照品，按上述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率。所述檢測方法，還包括進行EC定量限測定的步驟；所述步驟為將制備的對照品溶液稀釋測定，測得信噪比10∶1時，分析EC的最低檢測濃度。所述檢測方法，還包括EC檢測限測定的步驟；所述步驟為將制備的對照品溶液稀釋測定，測得信噪比3：1時，分析EC的最低檢測濃度。有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的茶多酚中EC含量的檢測方法具有以下優(yōu)點；本發(fā)明所述檢測方法以梯度洗脫方式，能有效地分離開茶多酚中較難分離的EGCG和EC兩種主要成分；且該方法簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，樣品分離度、對稱性及峰形均較好，且保留時間適中，更加適合于常規(guī)檢測，可有效用于EC含量的檢測和質量控制。附圖說明圖1為EC的結構示意圖；圖2為實施例4EC對照品溶液的高效液相色譜圖；圖3為實施例7EC樣品重復性檢測的高效液相色譜圖；圖4為某一批次的EC樣品的高效液相色譜圖；圖5為另一批次的EC樣品的高效液相色譜圖。具體實施方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1檢測方法(1)設定高效液相色譜條件：色譜柱為AgilentEclipseXDB-C18：4.6×250mm，5um，以濃度為0.1％的乙酸水溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，洗脫方式為梯度洗脫，流速為1.0mL·min-1，柱溫為35℃，檢測波長為278nm，進樣量20μl，流動相A和B在液相進行過程中0分鐘開始的體積比為92：8；25分鐘開始為69：31；35分鐘開始后為92：8；理論板數(shù)按EC計算應不低于2000。(2)制備對照品溶液：稱取EC對照品25mg，精密稱定，置于50ml容量瓶中，加入流動相A，稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.400mg·ml-1的溶液，作為對照品溶液(3)制備供試品溶液:稱取供試品粉末30mg，置于50ml容量瓶中，加入流動相A30ml，超聲提取20min，靜置，再用流動相A稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。(4)含量測定：分別取對照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，進行高效液相色譜儀的操作，并記錄色譜圖，然后利用色譜圖計算EC的含量。實施例2設定高效液相色譜條件中：以濃度為0.2％的乙酸水溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，洗脫方式為梯度洗脫，流速為1.2mL·min-1，柱溫為40℃，檢測波長為281nm，進樣量15μl。其他步驟與實施例1相同。實施例3設定高效液相色譜條件中：以濃度為0.15％的乙酸水溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，洗脫方式為梯度洗脫，流速為0.8mL·min-1，柱溫為20℃，檢測波長為275nm，進樣量10μl。其他步驟與實施例1相同。實施例4：對EC對照品溶液濃度X和峰面積積分值Y進行線性回歸精密量取對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL，置于10mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得到含EC分別為0.004、0.008、0.02、0.04、0.08mg·mL-1的對照品溶液，分別精密吸取上述各對照品溶液20μL，按實施例1色譜條件進行測定，分別得到峰面積積分值為135112、309673、734238、1478214、2966634，以峰面積積分值(Y)對對照品溶液濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程為A＝37105X-3222.3(R＝0.9999)。圖2為EC對照品溶液的高效液相色譜圖。如圖2所示：EC檢測濃度在0.004-0.080mg·mL-1范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。實施例5：對高效液相色譜儀進行精密度檢測精密吸取濃度為0.400mg·mL-1的對照品溶液20μL，按實施例1色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積積分值分別為：15067888、15014204、15056252、15009851、15001185、15063647。結果，RSD＝0.2％，表明儀器精密度良好。實施例6：對供試品溶液的穩(wěn)定性進行檢測精密量取同一供試品溶液20μL，分別在0、2、4、6、8、12、24h按實施例1色譜條件進樣測定，測得峰面積積分值分別為：15023546、15020217、15018955、15000503、15021305、15022587、15021849，結果：RSD＝0.1％，表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定。實施例7：檢驗EC的含量檢測方法的重復性稱取同一EC樣品粉末約30mg，平行6份，精密稱定，按實施例1所述方法制備供試品溶液，精密吸取20μL，按按實施例1色譜條件測定。圖3為EC樣品的高效液相色譜圖。如圖3所示：上述平行六份樣品，最終測得峰面積積分值分別為：14830292、14930292、14883765、14812486、14829659、14873144；結果，RSD＝0.3％，表明本發(fā)明所述方法重復性較好。實施例8：加樣回收率實驗取已知含量的EC樣品9份，每份約10mg，精密稱定，加入相應量的對照品，按實施例1方法制備供試品溶液，按按實施例1色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1。表1加樣回收率試驗結果(n＝9)實施例9：EC定量限的測定將對照品溶液稀釋測定，測得信噪比為10∶1時，EC的最低檢測濃度為0.13μg·mL-1。實施例10：EC檢測限的測定將對照品溶液稀釋測定，測得信噪比為3∶1時，EC的最低檢測濃度為0.045μg·mL-1。試驗例1：樣品含量測定取2個不同批次的供試品粉末各約30mg，精密稱定，按照實施例1的方法制成供試品溶液，分別取供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，按實施例1的色譜條件進行高效液相色譜儀的操作，并記錄色譜圖，然后，利用色譜圖計算EC的含量。圖4為某一批次的EC樣品的高效液相色譜圖序號為1，批次20160201；圖5為另一批次的EC樣品的高效液相色譜圖序號為1，批次20160202。根據(jù)圖4和圖5的高效液相色譜圖，得到各批次的EC樣品含量測定結果如表2所示：表2不同批次的EC樣品含量測定結果序號批次含量12016020170.2％22016020271.5％上述EC含量測定方法實現(xiàn)了對EC的質量檢測，經(jīng)過試驗表明，該方法線性關系、重現(xiàn)性、精密度、穩(wěn)定性、回收率均較好，且本發(fā)明所述方法準確、簡便、快捷，能夠更有效、全面的控制EC的質量。當前第1頁1 2 3