本發(fā)明涉及蛋白的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，具體而言，涉及干擾素-γ作為咳嗽藥物靶點(diǎn)的用途。

背景技術(shù)：

慢性咳嗽是以咳嗽為惟一癥狀或主要癥狀、時(shí)間超過(guò)8周、胸部x線檢查無(wú)明顯異常者。國(guó)內(nèi)導(dǎo)致慢性咳嗽的常見(jiàn)已知原因包括咳嗽變異性哮喘、上氣道咳嗽綜合征、嗜酸粒細(xì)胞性支氣管炎、變應(yīng)性咳嗽與胃食管返流性咳嗽¹?？人苑瓷涞母惺芷髦饕挥诤粑勒衬?。與咳嗽反射相關(guān)的傳入神經(jīng)主要包括無(wú)髓鞘的c纖維和有髓鞘的aδ纖維，其中c纖維主要對(duì)化學(xué)刺激敏感；有髓aδ纖維主要對(duì)機(jī)械刺激敏感。然后傳入沖動(dòng)經(jīng)過(guò)迷走神經(jīng)傳入延髓，觸發(fā)咳嗽反射。慢性咳嗽的發(fā)生機(jī)制可能是咳嗽感受器受到化學(xué)、物理刺激增多，或者是咳嗽敏感性增加。

咳嗽敏感性是指機(jī)體在接受外界刺激(包括化學(xué)、機(jī)械、溫?zé)?時(shí)，表現(xiàn)出來(lái)的咳嗽難易程度?？人愿呙艟C合征(coughhypersensitivitysyndrome,chs)是指咳嗽敏感性升高，全面檢查仍不能歸于已知病因的一些特發(fā)性慢性咳嗽(又稱(chēng)為慢性特發(fā)性咳嗽)。chs也是慢性咳嗽的一種臨床常見(jiàn)類(lèi)型(約占慢性咳嗽總?cè)藬?shù)的8％～40％)，經(jīng)常以上呼吸道感染作為發(fā)病的啟動(dòng)因素(大約50％)²。chs的啟動(dòng)因素(如病毒感染、有毒氣體暴露等)往往已經(jīng)消失，但干咳癥狀持續(xù)³?？人悦舾行栽龈咧饕憩F(xiàn)為咳嗽閾值下降，輕微刺激就會(huì)引起咳嗽癥狀(如說(shuō)話(huà)、大笑、接觸冷空氣、煙霧等，部分chs病人的咳嗽甚至?xí)掷m(xù)不斷)。由于機(jī)制未明，目前尚未找到針對(duì)chs的特效藥物。

遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed-typehypersensitivity,dth)是致敏t淋巴細(xì)胞與相應(yīng)抗原作用后，引起以淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和組織細(xì)胞損傷為主要特征的炎癥反應(yīng)，屬于細(xì)胞免疫類(lèi)型。病毒與胞內(nèi)寄生菌是引起dth的重要抗原，主要效應(yīng)細(xì)胞為分化群8⁺(clusterofdifferentiation8⁺,cd8⁺)細(xì)胞毒t細(xì)胞(cytotoxictcell,ctl)與cd4⁺輔助性t細(xì)胞1(thelpertype1cell,th1細(xì)胞)。cd8⁺ctl細(xì)胞可以直接殺滅病原體感染的靶細(xì)胞；cd4⁺t細(xì)胞激活后形成th1細(xì)胞，通過(guò)分泌細(xì)胞因子[如干擾素-γ(interferon-γ,ifn-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,il-2)等]吸引與活化巨噬細(xì)胞在反應(yīng)部位聚集，形成組織的慢性炎癥^4-6；當(dāng)然，cd8⁺ctl細(xì)胞與cd4⁺t細(xì)胞的分工并非絕對(duì)，病原體感染時(shí)cd4⁺t細(xì)胞可能同時(shí)表現(xiàn)出溶細(xì)胞活性，而cd8⁺ctl細(xì)胞也能分泌ifn-γ等細(xì)胞因子^7,8。在這些細(xì)胞因子中，ifn-γ是τh1細(xì)胞與cd8⁺ctl細(xì)胞分泌的最重要細(xì)胞因子，且在下游炎癥信號(hào)通路中發(fā)揮核心作用^8-10。一些具有咳嗽癥狀的疾病如病毒感染后咳嗽、百日咳與肺結(jié)核等常伴隨肺部ifn-γ水平增高^11-13。在美國(guó)一項(xiàng)研究中，研究者征集了具有發(fā)熱與咳嗽癥狀的成年感冒患者，與細(xì)菌源性相比，病毒性感冒患者血清中的ifn-γ水平明顯升高¹¹。應(yīng)用ⅰ型ifn(與ifn-γ存在協(xié)同作用)抗病毒治療會(huì)導(dǎo)致部分病人出現(xiàn)咳嗽癥狀¹⁴,¹⁵。當(dāng)然，呼吸道病毒感染除了導(dǎo)致細(xì)胞免疫反應(yīng)外，還能一定程度刺激cd4⁺th2細(xì)胞分化形成，導(dǎo)致體液免疫反應(yīng)¹⁶。

日本有研究者進(jìn)行ifn-γ治療蕈樣肉芽腫的臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)最常見(jiàn)的副作用是流感樣癥狀，15例患者中有一例在ifn-γ治療50天后死亡，還有一例由于藥源性咳嗽退出試驗(yàn)(咳嗽在停藥后消失)¹⁷。另外，霧化吸入ifn-γ治療特發(fā)性肺纖維化時(shí)引起的最常見(jiàn)副作用就是咳嗽¹⁸。事實(shí)上，已有研究發(fā)現(xiàn)chs與器官自身免疫功能紊亂、肺部淋巴細(xì)胞增多有關(guān)¹⁹。更有研究發(fā)現(xiàn)chs病人肺部t淋巴細(xì)胞增多²⁰，t淋巴細(xì)胞增多是dth的表現(xiàn)之一。因而，我們推斷以肺部ifn-γ水平增高為特征的dth可能也是chs的發(fā)病機(jī)制之一。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)dth釋放的ifn-γ不僅可能增加咳嗽敏感性，還可能通過(guò)jak-pka-ampa信號(hào)通路引起迷走神經(jīng)元興奮，從而導(dǎo)致引起咳嗽。發(fā)明人的研究結(jié)果提示ifn-γ及其下游的jak-pka-ampa信號(hào)通路是病毒感染后咳嗽及chs治療的潛在靶點(diǎn)。

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供ifn-γ作為咳嗽藥物靶點(diǎn)的用途。本發(fā)明的研究結(jié)果顯示，ifn-γ及其基因與體內(nèi)的咳嗽敏感性密切相關(guān)，其為后期咳嗽的藥物研發(fā)提供了一個(gè)全新的藥物靶點(diǎn)以及新的治療手段和思路。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，我們采用以下技術(shù)方案：

第一方面，通過(guò)整體豚鼠咳嗽信號(hào)分析，發(fā)現(xiàn)ifn-γ氣管內(nèi)滴注能夠增加豚鼠咳嗽敏感性，表明體內(nèi)ifn-γ能在整體水平提高咳嗽敏感性。

第二方面，通過(guò)鈣成像技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)ifn-γ能夠通過(guò)兩面神激酶-蛋白激酶a-α-氨基-(3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸)，即jak-pka-ampa信號(hào)通路引起大鼠迷走神經(jīng)元的細(xì)胞外液鈣離子內(nèi)流，提高迷走神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度，進(jìn)而提高咳嗽敏感性。

最后利用膜片鉗技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)ifn-γ不僅能夠增加電刺激下豚鼠迷走神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢活l率，還能直接引起動(dòng)作電位發(fā)放(其機(jī)理可能涉及jak-pka-ampa信號(hào)通路)。迷走神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢豢梢韵蛏蟼魅胫袠?，引發(fā)咳嗽反射。

上述研究結(jié)果說(shuō)明ifn-γ不僅能夠增加咳嗽敏感性，還能通過(guò)jak-pka-ampa信號(hào)通路直接引起咳嗽。

這些研究結(jié)果提示干擾素-γ或其基因可以作為藥物靶點(diǎn)在篩選治療咳嗽藥物中的應(yīng)用。所述藥物包括①抑制所述干擾素-γ的表達(dá)水平、活性的藥物；②阻斷所述干擾素-γ與干擾素-γ受體結(jié)合來(lái)抑制迷走神經(jīng)細(xì)胞ca²⁺內(nèi)流的藥物；③靶向干擾素-γ的抑制劑在制備治療咳嗽藥物中的應(yīng)用；④所述咳嗽包括病毒感染后咳嗽或咳嗽高敏綜合癥。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

目前國(guó)際上還沒(méi)有研究報(bào)道ifn-γ具有提高咳嗽敏感性或引起咳嗽反射的效應(yīng)。發(fā)明人首次提出并驗(yàn)證了ifn-γ不僅能夠增加咳嗽敏感性，還能通過(guò)jak-pka-ampa信號(hào)通路直接引起咳嗽。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的“ifn-γ預(yù)處理對(duì)豚鼠咳嗽增加次數(shù)的影響”結(jié)果圖(圖中：＊，表示與骨肽組比較p<0.1；＊＊，表示與骨肽組比較p<0.05；n＝5～7)；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中“ifn-γ對(duì)大鼠迷走神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的間接影響”結(jié)果圖(曲線圖中縱坐標(biāo)表示f340/f380的比值；橫坐標(biāo)表示記錄時(shí)間，總共記錄3.6×10³s，即1h)。a圖，對(duì)照品處理前后cap刺激下f340/f380比值的峰值沒(méi)有明顯變化；b圖，ifn-γ處理后cap刺激下f340/f380比值的峰值明顯增高。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中“f340/f380比值變化的統(tǒng)計(jì)圖”(其中，＊，表示與基態(tài)(baseline)比較p<0.05；#，表示與對(duì)照品處理后(aftervehicle)比較p<0.05；n＝6)。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中“ifn-γ對(duì)大鼠迷走神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的直接作用”的結(jié)果圖(圖中，首先用對(duì)照緩沖液處理，未見(jiàn)明顯f340/f380比值變化；約15分鐘后用ifn-γ(1ng/ml)處理5min，可見(jiàn)明顯的f340/f380比值增加)。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中“不同濃度的ifn-γ處理對(duì)f340/f380比值的影響”圖(其中，＊，表示與基態(tài)(baseline)比較p<0.05；n＝6)。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例2中“細(xì)胞外液鈣離子內(nèi)流是ifn-γ增加胞內(nèi)鈣濃度的主要途徑”的結(jié)果圖(圖中，首先在無(wú)鈣緩沖液中使用ifn-γ處理，未見(jiàn)明顯f340/f380比值變化；然后換成含鈣緩沖液，可見(jiàn)ifn-γ刺激下f340/f380比值明顯增加)。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例2中“ifn-γ對(duì)細(xì)胞外液鈣離子內(nèi)流的影響的統(tǒng)計(jì)圖”(其中，＊表示與基礎(chǔ)狀態(tài)(baseline)比較p<0.05，n＝6)。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例2中“jak抑制劑ag490、pka抑制劑h89及ampa受體抑制劑cnqx預(yù)處理對(duì)ifn-γ的拮抗作用”的結(jié)果圖(圖a，對(duì)照緩沖液處理前后ifn-γ的作用沒(méi)有明顯變化；圖b，ag490(50μm)預(yù)處理后ifn-γ的升鈣作用明顯減弱；隨后高鉀刺激依然明顯增高鈣濃度，排除細(xì)胞活性問(wèn)題；圖c，h89(10μm)預(yù)處理后ifn-γ的升鈣作用明顯減弱；圖d，cnqx(10μm)預(yù)處理后ifn-γ的升鈣作用明顯減弱)。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例2中的“jak抑制劑ag490、pka抑制劑h89及ampa受體抑制劑cnqx預(yù)處理對(duì)ifn-γ的拮抗作用的統(tǒng)計(jì)圖”(其中，＊，表示與基態(tài)(baseline)比較p<0.05；#，表示與對(duì)照液處理后(aftervehicle)比較p<0.05；n＝6)。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例3中“ifn-γ預(yù)處理增加電刺激下神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢活l率”圖(圖中，在適度電刺激下(20pa×280ms)，基礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)，圖a神經(jīng)元發(fā)放的動(dòng)作電位(actionpotential,ap)數(shù)量較少；對(duì)照液灌流后，圖b神經(jīng)元的ap數(shù)量沒(méi)有明顯改變；ifn-γ(1ng/ml)灌流后，圖c同樣強(qiáng)度電刺激引發(fā)的動(dòng)作電位頻度明顯增多)。

圖11為本發(fā)明實(shí)施例3的“ifn-γ預(yù)處理后電刺激下神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢活l率圖的統(tǒng)計(jì)圖”(其中，＊表示與對(duì)照液處理后(aftervehicle)比較p<0.05，n＝4)。

圖12為本發(fā)明實(shí)施例3的“ifn-γ灌流引起神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放”結(jié)果圖(圖中，a為基礎(chǔ)狀態(tài)代表圖；b為對(duì)照液(cs)灌流后代表圖；c為0.25ng/mlifn-γ灌流后代表圖；d為1ng/mlifn-γ灌流后代表圖；e為4ng/mlifn-γ灌流后代表圖；f為16ng/mlifn-γ灌流后代表圖；g為40ng/mlifn-γ灌流后代表圖；h為160ng/mlifn-γ灌流后代表圖)。

圖13為本發(fā)明實(shí)施例3的“ifn-γ灌流引起神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放在12s內(nèi)動(dòng)作電位數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖”(其中，＊表示與對(duì)照液(cs)灌流后比較p<0.05，n＝4～5)。

圖14為本發(fā)明實(shí)施例3的“jak抑制劑ag490、pka抑制劑h89及ampa受體抑制劑cnqx預(yù)處理對(duì)ifn-γ的拮抗作用”結(jié)果圖((圖中，a為基礎(chǔ)狀態(tài)代表圖；b為對(duì)照液灌流后ifn-γ(16ng/ml)對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏挠绊懘韴D；c為ag490(50μm)灌流后ifn-γ(16ng/ml)對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏挠绊懘韴D；d為h89(10μm)灌流后ifn-γ(16ng/ml)對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏挠绊懘韴D；e為cnqx(10μm)灌流后ifn-γ(16ng/ml)對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏挠绊懘韴D；f為統(tǒng)計(jì)圖：＊，表示與基礎(chǔ)狀態(tài)比較p<0.05；#，表示與對(duì)照液處理后(ifnaftervehicle)比較p<0.05；n＝4)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。

首先，對(duì)下述實(shí)施例所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所使用到的溶液、以及細(xì)胞爬片的處理做一說(shuō)明：

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)：

動(dòng)物fmmu豚鼠40只，雄性，體重300-350g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：44002100004818。sd大鼠，雄性，體重200-250g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：44007200036817；置于室溫(22±2)℃，濕度(55±5)％，12小時(shí)交替照明下生活，自由飲水飲食。

2.主要試劑與儀器：

生理鹽水(江西潤(rùn)澤藥業(yè))；骨肽(黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司)；人源干擾素-伽瑪(ifn-γ)(上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司，用于豚鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn))；大鼠源ifn-γ(peprotech，用于大鼠原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn))；檸檬酸(廣州化學(xué)試劑廠)；乙醚(廣州化學(xué)試劑廠)；dmem/f12培養(yǎng)基(gibco)；胎牛血清(gibco)；雙抗(gibco)；f12培養(yǎng)基(gibco)；神經(jīng)元生長(zhǎng)添加劑(sciencecell)；35mm培養(yǎng)皿(nest)；25mm細(xì)胞爬片(nest)；層粘連蛋白(invitrogen)；多聚賴(lài)氨酸(碧云天)；ⅳ型膠原酶(gibco)；ⅱ型分散酶(sigma)；磷酸鹽緩沖液/pbs(博士德)；d-hanks液(吉諾生物)；hvg高真空密封脂(dowcorning)；辣椒素(tokyochemicalindustry)；戊巴比妥鈉(merck)；fura-2am(thermofisherscientific)；小動(dòng)物喉鏡(penn-century)；小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)肺功能測(cè)量系統(tǒng)(buxco)；熒光倒置顯微鏡(leica)；mcm針式過(guò)濾器(agela公司)；sutter玻璃電極(sutter公司)；12mm細(xì)胞爬片(fisher公司)；35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(corning公司)；倒置顯微鏡(zeiss)；膜片鉗放大器(heka_epc10系列)；玻璃電極拉制儀(sutter公司)。

3.溶液的配制：

細(xì)胞接種液：dmem/f12培養(yǎng)基+10％胎牛血清+1％雙抗。

細(xì)胞培養(yǎng)液：f12培養(yǎng)基+3％胎牛血清+1％雙抗+1％神經(jīng)元生長(zhǎng)添加劑。

使用d-hanks液配制含iv型膠原酶(1.5mg/ml)與ii型分散酶(1.5mg/ml)的消化液，過(guò)濾除菌，分裝后-20℃保存。

使用滅菌水配制多聚賴(lài)氨酸(0.1mg/ml)，過(guò)濾除菌，分裝后-20℃保存。

使用dmem/f12培養(yǎng)基配制層粘連蛋白(10mg/ml)，過(guò)濾除菌，分裝后-20℃保存。

有鈣細(xì)胞外緩沖液(ecs)：每500ml去離子水中含nacl3.8025g,kcl0.175g，cacl20.1g，mgcl2·6h2o0.1017g，nah2po4·2h2o0.025g，c6h12o6·h2o0.594g，hepes1.19g；使用1m的naoh調(diào)ph值至7.4。

無(wú)鈣細(xì)胞外緩沖液：每500ml去離子水中含nacl3.8025g，kcl0.175g，mgcl2·6h2o0.203g，nah2po4·2h2o0.025g，c6h12o6·h2o0.594g，hepes1.19g；使用1m的naoh調(diào)ph值至7.4。

電極內(nèi)液：每100ml去離子水中含cacl211.1mg，egta380.35mg，hepes238.3mg，mgcl2·6h2o10.17mg，kcl298mg，葡萄糖酸鉀2155.1mg，nacl46.8mg；使用1m的koh調(diào)ph值至7.1，使用甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓至285mosm。

電極外液：每500ml去離子水中含nacl3.978g,kcl0.2011g,cacl20.1g，mgcl2·6h2o0.1017g,nah2po4·2h2o0.025g,c6h12o6·h2o0.495g，hepes1.19g；使用1m的naoh調(diào)ph值至7.4，使用甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓至295mosm。

4.細(xì)胞爬片的處理：

將細(xì)胞爬片，用自來(lái)水沖洗15遍，再用純水沖洗10遍，烘干后高壓滅菌，再烘干備用；在超凈臺(tái)中將細(xì)胞爬片放入35mm培養(yǎng)皿底部，滴加1ml多聚賴(lài)氨酸(pdl，0.1mg/ml)，使之完全覆蓋細(xì)胞爬片，紫外照射30min，移入37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜；吸棄pdl，用滅菌水沖洗兩遍，加入1ml層粘連蛋白與1ml細(xì)胞接種液，混勻，移入培養(yǎng)箱中備用，臨用時(shí)用細(xì)胞接種液洗一遍。(這一步需要除氣泡、保證細(xì)胞爬片下沉)。

實(shí)施例1

ifn-γ預(yù)處理對(duì)整體豚鼠咳嗽敏感性的影響

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法：

豚鼠40只被隨機(jī)分成5組，分別用不同的溶液對(duì)豚鼠進(jìn)行預(yù)處理：生理鹽水對(duì)照組、骨肽對(duì)照組(濃度與高劑量ifn-γ組類(lèi)似)、低劑量、中劑量與高劑量ifn-γ組(8×10³、4×10⁴、2×10⁵iu，使用人源ifn-γ)。

利用buxco系統(tǒng)無(wú)創(chuàng)測(cè)量清醒狀態(tài)下豚鼠基礎(chǔ)咳嗽次數(shù)(0.3m檸檬酸霧化激發(fā)1min，觀察8min)。

使用乙醚麻醉豚鼠，在喉鏡光源引導(dǎo)下氣管內(nèi)滴注含上述造模劑的生理鹽水0.2ml；每周兩次，持續(xù)一周，最后一次滴注后5小時(shí)左右使用buxco系統(tǒng)無(wú)創(chuàng)測(cè)量清醒狀態(tài)下豚鼠咳嗽次數(shù)(方法同前)。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

將每只豚鼠最后一次測(cè)量的咳嗽次數(shù)減去基礎(chǔ)咳嗽次數(shù)，所得值即為增加次數(shù)(如果最后一次測(cè)量的咳嗽次數(shù)少于基礎(chǔ)值，則表示該只豚鼠咳嗽次數(shù)沒(méi)有增加，記為0)。結(jié)果如圖1所示，與骨肽對(duì)照組比較，低劑量的ifn-γ預(yù)處理有增加豚鼠咳嗽次數(shù)的趨勢(shì)(p<0.1)；中、高劑量ifn-γ預(yù)處理明顯增加了豚鼠咳嗽次數(shù)(p<0.05)，由此說(shuō)明ifn-γ預(yù)處理增加了豚鼠咳嗽敏感性。

實(shí)施例2

鈣成像實(shí)驗(yàn)

1.實(shí)驗(yàn)方法：

a.原代迷走神經(jīng)元培養(yǎng)：

麻醉、放血處死大鼠，手術(shù)從頸前開(kāi)顱取雙側(cè)迷走神經(jīng)節(jié)；顯微鏡下仔細(xì)剝離、縱向撕開(kāi)、剪碎；收集于含冷pbs的5ml離心管中。400g×5min離心，去上清，加0.5ml消化液，密封后37℃水浴消化40min。加2ml細(xì)胞接種液，用1ml槍頭小心吹打40～60次(避免氣泡)，密封。400g×5min離心，去上清；加2ml細(xì)胞接種液，用1ml槍頭小心吹打30～40次(避免氣泡)，密封。400g×5min離心，去上清；加2ml細(xì)胞接種液，用1ml槍頭小心吹打20次(避免氣泡)，接種于含細(xì)胞爬片(已處理)的35mm的培養(yǎng)皿中，移入培養(yǎng)箱。約2小時(shí)后小心吸棄原液，用pbs洗1遍，換2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中過(guò)夜。第二天即可用于實(shí)驗(yàn)。

b.鈣成像記錄：

本研究使用接種于25mm圓形玻璃爬片的原代迷走神經(jīng)元。首先在培養(yǎng)液中加入鈣成像指示劑fura-2am(終濃度為5μm)，在37℃培養(yǎng)箱中裝載30min。然后將細(xì)胞爬片取出，用ecs緩沖液洗滌1次；利用高真空密封脂將細(xì)胞爬片粘貼于細(xì)胞浴槽上，ecs緩沖液不斷灌流(流速為1ml/min)。將細(xì)胞浴槽放置于連接有氙燈與ccd攝像頭的熒光倒置顯微鏡(leica)下，待測(cè)。采集雙色熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)分別為340nm與380nm，發(fā)射波長(zhǎng)是510nm；每12s采集1次),通過(guò)f340/f380的比值計(jì)算神經(jīng)元胞漿內(nèi)ca²⁺濃度。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)將視野中的神經(jīng)元圈出，得到單個(gè)神經(jīng)元的鈣瞬變曲線圖。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

結(jié)果如圖2和圖3所示，f340/f380的比值可以反映神經(jīng)元胞漿內(nèi)ca²⁺濃度。結(jié)果提示cap(5×10^-8m)灌流10s能夠瞬間引起ca²⁺濃度升高；對(duì)照液灌流前后同樣劑量cap灌流引起的鈣濃度增加程度沒(méi)有明顯變化，ifn-γ(1ng/ml)灌流5min后同樣劑量cap灌流引起的鈣濃度增加程度明顯增高。

如圖4和圖5所示，對(duì)照緩沖液灌流5min未引起明顯的胞內(nèi)鈣濃度變化；ifn-γ(1ng/ml)灌流5min明顯增加神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度。1～200ng/ml的ifn-γ灌流可以劑量依賴(lài)性的增加胞內(nèi)鈣濃度(p<0.05)。

如圖6和圖7所示，在無(wú)鈣緩沖液中，ifn-γ(1ng/ml)灌流5min幾乎不能改變神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度；換成含鈣緩沖液，同樣劑量的ifn-γ灌流5min明顯增加神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度(p<0.05)。說(shuō)明細(xì)胞外液鈣離子通過(guò)細(xì)胞膜流入胞漿是ifn-γ增加神經(jīng)元內(nèi)鈣濃度的主要途徑。

如圖8和圖9所示，與對(duì)照緩沖液比較，jak抑制劑ag490、pka抑制劑h89及ampa受體抑制劑cnqx預(yù)處理10min后同樣劑量的ifn-γ(100ng/ml)灌流5min的升鈣作用明顯減弱(p<0.05)。說(shuō)明ifn-γ是通過(guò)jak-pka-ampa信號(hào)通路引起細(xì)胞外液鈣離子內(nèi)流。

實(shí)施例3

膜片鉗實(shí)驗(yàn)

1.實(shí)驗(yàn)方法：

本研究使用接種于12mm圓形玻璃爬片的原代迷走神經(jīng)元(培養(yǎng)方法同實(shí)施例2)。首先將細(xì)胞爬片取出，用電極外液洗滌3次；利用高真空密封脂將細(xì)胞爬片粘貼于細(xì)胞浴槽上，電極外液不斷灌流(流速為1ml/min)。將細(xì)胞浴槽放置于連接有ccd攝像頭的倒置顯微鏡(zeiss)下，待測(cè)。

使用電極拉制儀將玻璃電極拉至尖端電阻約為4～8mω(管內(nèi)充電極內(nèi)液時(shí))。被氯化的銀絲電極需浸入電極內(nèi)液中。在顯微操縱器控制下，玻璃電極尖端與神經(jīng)元細(xì)胞膜實(shí)行封接，電阻須達(dá)到gω以上；然后負(fù)壓破膜，實(shí)現(xiàn)全細(xì)胞記錄(設(shè)置鉗制電壓為-60mv；串聯(lián)電阻補(bǔ)償時(shí)間為10s，補(bǔ)償深度在80％左右)。實(shí)驗(yàn)記錄的神經(jīng)元還需滿(mǎn)足以下條件：貼壁良好的橢圓形且沒(méi)有軸突長(zhǎng)出；細(xì)胞尺寸較小(直徑少于35m，膜電容在15pf與30pf之間)；對(duì)cap刺激有反應(yīng)；靜息膜電位低于-40mv。然后切換到電流鉗記錄模式下檢測(cè)神經(jīng)元對(duì)電刺激或化學(xué)刺激的反應(yīng)(記錄頻率為20khz)。電刺激采用0～90pa之間以10pa遞增的模式，單個(gè)電刺激持續(xù)280ms。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖10和圖11所示，在適度電刺激下(20pa×280ms)，基礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)神經(jīng)元發(fā)放的動(dòng)作電位(ap)數(shù)量較少(興奮性較低)；對(duì)照液灌流后神經(jīng)元的興奮性沒(méi)有明顯改變；ifn-γ灌流明顯增加神經(jīng)元的興奮性(p<0.05)。

如圖12和圖13所示，與對(duì)照液比較，0.25～160ng/ml的ifn-γ灌流導(dǎo)致迷走神經(jīng)元產(chǎn)生的ap數(shù)量明顯增多，且有一定的量效關(guān)系。說(shuō)明ifn-γ是迷走神經(jīng)元興奮的刺激因素。

如圖14所示，與對(duì)照緩沖液比較，jak抑制劑ag490、pka抑制劑h89及ampa受體抑制劑cnqx預(yù)處理后同樣劑量的ifn-γ(16ng/ml)灌流引發(fā)的12秒內(nèi)ap數(shù)量明顯減少(p<0.05)。說(shuō)明ifn-γ是通過(guò)jak-pka-ampa信號(hào)通路引起迷走神經(jīng)元興奮。

綜上所述，通過(guò)整體豚鼠咳嗽信號(hào)分析，發(fā)現(xiàn)ifn-γ氣管內(nèi)滴注能夠增加豚鼠咳嗽敏感性，表明體內(nèi)ifn-γ能夠在整體水平提高咳嗽敏感性。通過(guò)鈣成像技術(shù)，發(fā)現(xiàn)ifn-γ能夠通過(guò)jak-pka-ampa信號(hào)通路引起細(xì)胞外液鈣離子內(nèi)流，提高大鼠迷走神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度，進(jìn)而提高咳嗽敏感性。利用膜片鉗技術(shù)，發(fā)現(xiàn)ifn-γ不僅能夠增加電刺激下豚鼠迷走神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢活l率，還能直接引起動(dòng)作電位發(fā)放(其機(jī)理可能涉及jak-pka-ampa信號(hào)通路)。迷走神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢豢梢韵蛏蟼魅胫袠校l(fā)咳嗽反射?？傊?，ifn-γ不僅能夠增加咳嗽敏感性，還能通過(guò)jak-pka-ampa信號(hào)通路直接引起咳嗽。

盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。