專利名稱：人類乙型肝炎病毒(hbv)dna聚合酶的體外活性試驗(yàn),及其在hbv dna聚合酶抑制劑的篩選 ...的制作方法
及其在HBV DNA聚合酶抑制劑的篩選中的應(yīng)用發(fā)明背景聚合酶是對(duì)活生物體十分重要的一種基礎(chǔ)酶。它們負(fù)責(zé)合成核酸并將它們轉(zhuǎn)化為合成蛋白質(zhì)必需的其它核酸。因此，在所有細(xì)胞類型包括致病性DNA病毒乙型肝炎病毒(HBV)中均可找到聚合酶。
HBV可導(dǎo)致肝炎，它是最常見的人類傳染病之一，所引發(fā)的肝細(xì)胞癌(HCC)是世界上最常見的癌癥之一。目前預(yù)防HBV感染和發(fā)病的最有效措施是通過免疫接種抵抗HBV。目前認(rèn)可的HBV疫苗由天然形式(質(zhì)粒衍生的)或重組形式(從酵母細(xì)胞純化)的主要表面抗原(HBsAg)組成。疫苗所誘導(dǎo)的抗體已顯示可結(jié)合大多數(shù)位于HBsAg的第124至147位殘基之間的抗原性‘a(chǎn)’表位，從而有效中和HBV復(fù)制。
盡管這類主動(dòng)免疫接種計(jì)劃已使人群中HBV感染降低，但所述‘a(chǎn)’表位內(nèi)的突變?cè)诓粩嘣龆?。疫苗誘導(dǎo)的這些HBV突變株受到關(guān)注，因?yàn)樗鼈兡芴颖墁F(xiàn)有的基于免疫的有效診斷系統(tǒng)并能獨(dú)立復(fù)制。
HBsAg的‘a(chǎn)’表位上的突變使HBV DNA聚合酶的重疊區(qū)產(chǎn)生氨基酸置換，尤其是改變它們?cè)谀孓D(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)部的位置，這可能意味著疫苗誘導(dǎo)的這些突變已改變了逆轉(zhuǎn)錄酶(病毒復(fù)制的關(guān)鍵因素)的活性。
HBV是一類通過逆轉(zhuǎn)錄RNA中間體而復(fù)制它們的基因組的DNA病毒。將該RNA前基因組包裝進(jìn)核衣殼并啟動(dòng)復(fù)制主要取決于HBV DNA聚合酶與衣殼包裝信號(hào)的相互作用。在所述前基因組RNA上有兩套衣殼包裝信號(hào)。只有其中的5’拷貝可作為引發(fā)反應(yīng)的模板。負(fù)鏈DNA合成開始后，DNA寡聚體(4個(gè)核苷酸)以一種未知機(jī)制被轉(zhuǎn)移至前基因組RNA的3’端，在那里它與它的互補(bǔ)序列雜交。逆轉(zhuǎn)錄隨后持續(xù)至該RNA模板的5’端。HBV DNA聚合酶與前基因組RNA的相互作用使DNA聚合酶N末端的酪氨酸殘基與所述衣殼包裝信號(hào)內(nèi)一段特異性核苷酸之間的共價(jià)連接。HBV逆轉(zhuǎn)錄酶是DNA聚合酶大區(qū)內(nèi)的4個(gè)結(jié)構(gòu)域之一。其它結(jié)構(gòu)域包括ⅰ)N末端蛋白質(zhì)，其使聚合酶與前基因組RNA共價(jià)連接；ⅱ)間隔壁區(qū)，其很少發(fā)生突變；以及ⅲ)RNA酶H結(jié)構(gòu)域，其與mRNA中間體的降解有關(guān)。
與其它聚合酶相似，對(duì)HBV DNA聚合酶活性的體外檢測(cè)可用于以下三種情況-鑒定新分離的復(fù)制型病毒，評(píng)估其與其它已知病毒的差異。這尤其常見于表面抗原帶有突變的HBV變體；-確定對(duì)已知感染者的待測(cè)物質(zhì)中病毒的成功分離；-評(píng)估有可能作為抗病毒試劑的聚合酶抑制劑的體外效力。
已建立各種系統(tǒng)用于測(cè)量缺乏病毒復(fù)制和其它病毒蛋白時(shí)HBV DNA聚合酶的體外活性。一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是，檢測(cè)HBV DNA聚合酶的引發(fā)活性不僅需要N末端蛋白質(zhì)還需要有功能的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域。因此這些系統(tǒng)的一個(gè)共同特點(diǎn)是，HBV DNA聚合酶的引發(fā)活性的檢測(cè)可指示HBV DNA聚合酶的活性。這類系統(tǒng)中的兩個(gè)利用了鴨的HBV(DHBV)DNA聚合酶，它們均證實(shí)了依賴模板并由蛋白質(zhì)引發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。其中一個(gè)DHBV系統(tǒng)利用DHBV DNA聚合酶的體外翻譯獲得了包含功能性DNA聚合酶的裂解物，另一系統(tǒng)將DHBV DNA聚合酶的一種活性融合蛋白從酵母的逆轉(zhuǎn)座子Tyl包裝至病毒樣顆粒中?；钚訢NA聚合酶可通過其引發(fā)活性測(cè)量，如在有引發(fā)核苷酸(即DHBV DNA聚合酶的[α-32P]dGTP)時(shí)放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)所指示的那樣。最近有人報(bào)道了一種類似的人類HBV DNA聚合酶的活性試驗(yàn)。所報(bào)道的所有構(gòu)建體中均包括帶衣殼包裝信號(hào)的聚合酶3’非編碼區(qū)一段350堿基對(duì)，從而說(shuō)明它對(duì)體外活性試驗(yàn)的重要性。
人HBV DNA聚合酶的體外活性試驗(yàn)的一個(gè)直接應(yīng)用可能是對(duì)新型抗病毒試劑的篩選。慢性HBV感染的抗病毒治療一直是一個(gè)問題，因?yàn)閿?shù)項(xiàng)臨床試驗(yàn)已顯示，參與研究的病人僅有30-40％能維持對(duì)干擾素或核苷類似物的應(yīng)答。在長(zhǎng)期HBV攜帶者和免疫受損的病人中該應(yīng)答率甚至更低。需要設(shè)計(jì)消除HBV的新化療方案，因?yàn)榇蠖鄶?shù)病人并未清除病毒感染，并因此是發(fā)展為更嚴(yán)重肝臟疾病和肝細(xì)胞癌(HCC)的高危人群。同樣特別需要評(píng)估這類試劑對(duì)人HBV表面抗原突變體的抗病毒效應(yīng)。
但是應(yīng)用現(xiàn)有的人HBV DNA聚合酶體外活性試驗(yàn)進(jìn)行抗病毒檢測(cè)存在限制因素。限制之一是所有現(xiàn)有系統(tǒng)都要求通過克隆將HBV DNA聚合酶的編碼區(qū)置于質(zhì)粒(如pGEM-T)上的一種病毒聚合酶啟動(dòng)子(如SP6或T7)的控制之下。此外，某些系統(tǒng)中表達(dá)的HBV DNA聚合酶在進(jìn)行其活性試驗(yàn)前需要進(jìn)一步純化(即免疫沉淀)。這些繁瑣的操作因HBV突變體的極大數(shù)量而無(wú)法實(shí)施。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明第一方面提供一種人乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶的體外活性試驗(yàn)，其包括利用已摻入了SP6病毒啟動(dòng)子的寡核苷酸作為5’寡核苷酸從樣品中經(jīng)PCR擴(kuò)增HBV DNA聚合酶，在真核細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞裂解物中直接轉(zhuǎn)錄和翻譯所述PCR產(chǎn)物，并在有放射性標(biāo)記試劑的情況下測(cè)定HBVDNA聚合酶的引發(fā)。
本發(fā)明第二方面提供本發(fā)明第一方面的試驗(yàn)在分析各種血清樣品的活性和/或篩選HBV DNA聚合酶的抑制劑時(shí)的應(yīng)用。
本發(fā)明第三方面提供本發(fā)明第一方面的試驗(yàn)在檢測(cè)和/或篩選潛在抗HBV藥物對(duì)人類HBV DNA聚合酶的DNA引發(fā)活性的抑制能力方面的應(yīng)用。這類應(yīng)用優(yōu)選包括以下步驟a)在指定體積的試驗(yàn)緩沖液中制備至少一份樣品，每份樣品在真核細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞裂解物中包含以線性PCR產(chǎn)物為模板經(jīng)體外翻譯成的HBVDNA聚合酶蛋白，以及HBV負(fù)鏈合成所需的含有能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)之序列的RNA模板，b)在等體積試驗(yàn)緩沖液中制備對(duì)照樣品，所述對(duì)照樣品包含以線性PCR產(chǎn)物為模板經(jīng)體外翻譯而成的HBV DNA聚合酶蛋白，和HBV負(fù)鏈合成所需的RNA模板，該RNA模板含有能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，為結(jié)合和引發(fā)人HBV DNA聚合酶所必需，c)將樣品保溫，以獲得含有DNA聚合酶和放射性標(biāo)記試劑的復(fù)合物，d)將所述復(fù)合物從試驗(yàn)緩沖液中分離出來(lái)，以及e)測(cè)定每份分離的復(fù)合物中放射性試劑的含量，該含量可以指示人HBV DNA聚合酶的DNA引發(fā)活性。
上述步驟c),d)和e)可替換為c)在適于上述人HBV DNA聚合酶的DNA引發(fā)活性的指定條件下，使上述每一試驗(yàn)管及上述每一對(duì)照管與等量的放射性標(biāo)記之核苷三磷酸(其包括已插入上述HBV負(fù)鏈DNA中的第一個(gè)核苷酸)一起保溫，導(dǎo)致形成一種復(fù)合物，該復(fù)合物中含有上述DNA聚合酶和上述放射性標(biāo)記的核苷三磷酸；d)通過硝酸纖維素膜過濾將上述復(fù)合物從上述每一試驗(yàn)管和上述每一對(duì)照管的試驗(yàn)緩沖液中分離出來(lái)；e)測(cè)定上述每份分離的復(fù)合物中放射性標(biāo)記的核苷三磷酸的含量，該含量可以指示上述人HBV DNA聚合酶的DNA引發(fā)活性；f)比較上述每一試驗(yàn)管和上述每一對(duì)照管中仍結(jié)合在硝酸纖維素膜上的上述分離的復(fù)合物中放射性標(biāo)記的核苷三磷酸的各自含量，試驗(yàn)管中分離的復(fù)合物中的放射性標(biāo)記之核苷三磷酸的含量低于對(duì)照管，則說(shuō)明上述人HBV DNA聚合酶的DNA引發(fā)活性被上述潛在的抗HBV藥物抑制。
本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶的一項(xiàng)簡(jiǎn)化的活性試驗(yàn)，其很可能比以前的試驗(yàn)更快。該方法涉及將SP6病毒聚合酶啟動(dòng)子引入一寡核苷酸，該寡核苷酸隨后作為5’寡核苷酸用于經(jīng)PCR從血清樣品中擴(kuò)增HBV DNA聚合酶。這種含有完整編碼區(qū)和一段3’非編碼區(qū)(300bp，帶衣殼包裝信號(hào))的PCR產(chǎn)物可直接在小麥生殖細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞提取物中轉(zhuǎn)錄和翻譯。在有放射性標(biāo)記的[α-32P]dTTP存在時(shí)，測(cè)量HBV DNA聚合酶向RNA中間體模板的引發(fā)，所述模板是其酶活性的關(guān)鍵指示物。本發(fā)明的應(yīng)用包括對(duì)各種血清樣品(包括有HBV主要表面抗原突變的那些)的活性試驗(yàn)，以及對(duì)HBV DNA聚合酶抑制劑的篩選。
本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)化方法，用于直接在擴(kuò)增自血清樣品的線性DNA模板中體外分析人HBV DNA聚合酶活性。該活性試驗(yàn)所涉及的蛋白質(zhì)一般在小麥生殖細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中通過線性DNA模板(其5’末端含有一個(gè)SP6病毒聚合酶啟動(dòng)子)的轉(zhuǎn)錄加翻譯而產(chǎn)生。
為達(dá)到此目的和其它目的，本發(fā)明提供直接從擴(kuò)增自血清樣品的線性DNA片段產(chǎn)生HBV DNA聚合酶的方法。在有放射性標(biāo)記試劑如[α-32P]dTTP存在時(shí)，可分析所得蛋白質(zhì)的引發(fā)活性，這是乙型肝炎病毒復(fù)制的關(guān)鍵步驟。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)單、敏感、快速的特別針對(duì)HBV DNA聚合酶活性的試驗(yàn)。本發(fā)明包括一種檢測(cè)血清樣品中HBV DNA聚合酶活性的方法，該方法包括
-用酚/氯仿從血清中經(jīng)一步法提取HBV病毒DNA；-通過PCR擴(kuò)增HBV DNA聚合酶的編碼區(qū)(2400堿基對(duì))及其3’非編碼區(qū)(310堿基對(duì))。其5’寡核苷酸包括5’近端SP6病毒聚合酶啟動(dòng)子；-以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板體外翻譯HBV DNA聚合酶；-在有放射性標(biāo)記的引發(fā)核苷酸時(shí)對(duì)含有翻譯的HBV DNA聚合酶的提取物進(jìn)行活性分析；本發(fā)明的其它主題還包括實(shí)施所述方法的試劑、測(cè)定物質(zhì)對(duì)聚合酶活性的抑制效應(yīng)的方法、以及對(duì)表面抗原突變的HBV變體之聚合酶活性的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，血清樣品可能含有一種HBV變體，其DNA聚合酶活性不確定。本發(fā)明可以對(duì)它進(jìn)行定性測(cè)定。當(dāng)需要對(duì)所述DNA聚合酶活性進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)，可對(duì)本發(fā)明的活性試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)(即在硝酸纖維素膜上測(cè)定引發(fā)的DNA聚合酶)。當(dāng)需要測(cè)定一種分子對(duì)所述DNA聚合酶的抑制效應(yīng)時(shí)，可以將引發(fā)的DNA聚合酶的量與對(duì)照樣品的產(chǎn)生量比較，所述對(duì)照樣品不含抑制分子。
以下將以實(shí)施例的形式并配以附圖提供參考，以便更好地理解本發(fā)明。


圖1顯示人HBV基因組的線性化結(jié)構(gòu)。人HBV DNA聚合酶的編碼區(qū)(方框)及其3’非編碼區(qū)(紅線)均包含在本發(fā)明的PCR擴(kuò)增中。下面的數(shù)字表示野生型HBVadw亞型基因組中的位置，如GenBank中所定義箭頭表示位置和PCR擴(kuò)增中所使用的寡核苷酸的方向，它們的序列展示于箭頭之上(5’)或之下(3’)。除了與該HBV DNA聚合酶的起始部分配對(duì)的序列(編碼區(qū)的頭27個(gè)堿基)，病毒SP6啟動(dòng)子(ATTTAGGTGACACTATAGAACTC)也已參入5’端。5’有義寡核苷酸的位置是2309至2335位(箭頭)，而3’反義寡核苷酸覆蓋了1917至1940位的區(qū)段(箭頭)。
圖2是一張照片，顯示PCR產(chǎn)物的電泳模式，其擴(kuò)增自攜帶野生型HBV的血清分離的病毒DNA。具有預(yù)期的2800堿基對(duì)大小的片段用箭頭指示。‘M’泳道上還顯示了分子量標(biāo)記的移動(dòng)位置(1 kb DNA梯度，MBIFermentas)。
圖3是一張放射性自顯影照片，顯示小麥生殖細(xì)胞裂解物在有[35S]甲硫氨酸存在時(shí)直接從PCR擴(kuò)增產(chǎn)物體外翻譯的野生型HBV DNA聚合酶。[35S]標(biāo)記的人HBV DNA聚合酶如所預(yù)期為90千道爾頓(kD)，用箭頭表示。圖左外側(cè)為分子量標(biāo)志(Rainbow蛋白質(zhì)遷移標(biāo)志，Amersham)的位置。
圖4是一張放射性自顯影照片，顯示野生型HBV DNA聚合酶(在小麥生殖細(xì)胞裂解物中合成)在有[α-32P]dTTP存在時(shí)的體外引發(fā)活性。[α-32P]dTTP標(biāo)記的人HBV DNA聚合酶如所預(yù)期為90千道爾頓(kD)，用箭頭表示。圖左外側(cè)為分子量標(biāo)志(Rainbow蛋白質(zhì)遷移標(biāo)志，Amersham)的位置。
圖5是一張放射性自顯影照片，顯示野生型HBV DNA聚合酶(第一泳道)、表面抗原突變體‘s’145(第二泳道)和‘s’126(第三泳道)在有[α-32P]dTTP存在時(shí)的體外引發(fā)活性。三種病毒株的[α-32P]dTTP標(biāo)記的人HBVDNA聚合酶如所預(yù)期均為90千道爾頓(kD)，用箭頭表示。圖左外側(cè)為分子量標(biāo)志(Rainbow蛋白質(zhì)遷移標(biāo)志，Amersham)的位置。
圖6概述了核苷酸類似物對(duì)人野生型HBV DNA聚合酶的抗引發(fā)效應(yīng)。柱表示保留在硝酸纖維素膜上的放射性標(biāo)記的人HBV DNA聚合酶，由cpm測(cè)定。對(duì)照指示人HBV聚合酶在沒有核苷酸類似物的情況下的體外引發(fā)活性。有特定核苷酸類似物時(shí)的活性分析結(jié)果有相應(yīng)表示(即+ddTTP表示有ddTTP時(shí)的活性分析)。有ddTTP或ddATP存在時(shí)保溫，相對(duì)于對(duì)照均無(wú)明顯的抗引發(fā)效應(yīng)。相反，有ddGTP,ddCTP時(shí)觀察到抑制效應(yīng)。與我們的結(jié)果一致的是，加入拉米夫定(lamivudine)也觀察到抗引發(fā)效應(yīng)，拉米夫定是3’硫胺胞嘧啶核苷的負(fù)鏈enontiomer，一種臨床上廣泛用于治療由活躍HBV復(fù)制的HBV攜帶者的胞嘧啶二脫氧核苷酸類似物。
總述野生型HBV病毒DNA可以用酚/氯仿從血清樣品中提取。在本發(fā)明第一步中用特異性寡核苷酸(圖1)實(shí)施PCR擴(kuò)增。5’有義寡核苷酸與HBVDNA聚合酶編碼區(qū)的頭27個(gè)核苷酸配對(duì)，并在其近端插入SP6啟動(dòng)子。3’反義寡核苷酸與HBV DNA聚合酶終止密碼子下游的300堿基對(duì)區(qū)域配對(duì)。所得線性DNA擴(kuò)增產(chǎn)物為2800堿基對(duì)(圖2)，直接將其用于在小麥生殖細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄/翻譯，方法按說(shuō)明書(Promega,U.S.A.)。
在有[35S]甲硫氨酸存在時(shí)，體外翻譯產(chǎn)生約90kD的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，與843氨基酸的聚合酶多肽的預(yù)計(jì)大小一致，見圖3。該結(jié)果與以前對(duì)DHBVDNA聚合酶活性試驗(yàn)的報(bào)道一致，這再次強(qiáng)烈表明已經(jīng)用上述線性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作模板適當(dāng)轉(zhuǎn)錄了人HBV DNA聚合酶。
為了分析人HBV DNA聚合酶活性，將體外翻譯反應(yīng)的混合物在包含dATP、dCTP、dGTP以及放射性標(biāo)記的[α-32P]dTTP的溶液中保溫，所述反應(yīng)混合物含有在缺乏任何放射性標(biāo)記氨基酸(即[35S]甲硫氨酸)的情況下新合成的聚合酶。核苷酸分析領(lǐng)域常規(guī)使用的任何標(biāo)記形式都可以用于對(duì)將被摻入引發(fā)的聚合酶中的核苷酸進(jìn)行標(biāo)記，如熒光標(biāo)記或吸附標(biāo)記，但優(yōu)選使用放射性標(biāo)記。本發(fā)明選用[α-32P]dTTP是因?yàn)樗噍^于其它三種核苷酸具有較高的引發(fā)特異性。
根據(jù)所使用的標(biāo)記類型，對(duì)引發(fā)產(chǎn)生的放射性標(biāo)記的聚合酶產(chǎn)物可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)。這通常包括從引發(fā)產(chǎn)生的放射性標(biāo)記的聚合酶產(chǎn)物中分離所標(biāo)記的單核苷酸(即[α-32P]dTTP)的步驟。在本發(fā)明中，引發(fā)反應(yīng)的產(chǎn)物優(yōu)選用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。圖4顯示人野生型HBVDNA聚合酶在[α-32P]dTTP，這種人源HBV DNA聚合酶的特異性引發(fā)核苷酸存在時(shí)的引發(fā)活性分析結(jié)果。通過放射性自顯影檢測(cè)具有預(yù)期大小的蛋白質(zhì)條帶可以指示HBV DNA聚合酶的引發(fā)活性。
也可以通過硝酸纖維素膜的過濾監(jiān)控所述聚合酶活性試驗(yàn)。在適當(dāng)條件下硝酸纖維素膜上只保留非顯著量的未摻入的[α-32P]dTTP，故可以觀察引發(fā)產(chǎn)生的放射性標(biāo)記聚合酶的定量結(jié)合。
本發(fā)明可以用以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，但在任何意義上本發(fā)明都不受限制于這些實(shí)施例。
實(shí)施例總的試驗(yàn)方法攜帶野生型HBV的血清中病毒DNA的分離如下將200μl血清樣品加入400μl裂解液(Tris-HCl 10 mM,pH7.4,EDTA 1 mM，和2％十二烷基硫酸鈉)和25μl蛋白酶K(20mg/ml)，在65℃保溫3小時(shí)。然后將病毒DNA用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。用以下寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。5’寡核苷酸 為 有 義 寡 核 苷 酸(AAATTTAGGTGACACTATAGAATATGCCCCTATCTTATCAACACTTCC)，在其近端(下劃線序列)包含一個(gè)SP6啟動(dòng)子，并在HBV DNA聚合酶編碼區(qū)的起始區(qū)具有其配對(duì)區(qū)(野生型HBV基因組中2309至2340位)。3’寡核苷酸為反義寡核苷酸(ACAGTAGCTCCAAATTCTTTATAAGGGTCA)，HBV DNA聚合酶的終止密碼子下游300個(gè)堿基對(duì)處具有其配對(duì)區(qū)(野生型HBV基因組中1940至1911位)。所得PCR產(chǎn)物因此比已公開的(50個(gè)堿基對(duì))短。[α-32P]dTTP(3000 Ci/mmole)和[35S]甲硫氨酸(1000 Ci/mmole)來(lái)自Amersham。非標(biāo)記的dATP,dCTP和dGTP來(lái)自Promega。
除非另有說(shuō)明，所述聚合酶活性試驗(yàn)在以下溶液中進(jìn)行，所述溶液含有100mM TrisHCl(pH7.5),10mM MgCl2,3mMNaCl,10％甘油，4mM二硫蘇糖醇，未標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸(dATP,dCTP和dGTP)各100μM和5μCi[α-32P]dTTP。反應(yīng)在30℃保溫30分鐘，然后取5μl等分試樣加入85μl tricine十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)樣品緩沖液(Novex,U.S.A.)，取10μl在10％SDS-PAGE上分析。電泳后，將凝膠浸泡在加了10％醋酸的10％甲醇中固定，并真空干燥。使干膠接觸X-線膠片，信號(hào)用激光密度測(cè)定法定量。
實(shí)施例1HBV表面抗原突變株的聚合酶活性試驗(yàn)本發(fā)明所報(bào)道的人HBV DNA聚合酶的簡(jiǎn)易活性試驗(yàn)，它的一個(gè)直接應(yīng)用是評(píng)估有主要表面抗原突變的HBV變體，尤其以下疫苗接種(即‘S’145)所誘導(dǎo)的變體的相關(guān)活性。如上述從含有這類HBV變體的血清樣品中提取病毒DNA。本發(fā)明涉及的突變株包括‘S’145(甘氨酸到精氨酸的突變)和‘S’146(蘇氨酸到丙氨酸的突變)，它們能逃避現(xiàn)有免疫檢測(cè)系統(tǒng)并能獨(dú)立復(fù)制。用所述病毒DNA為模板，以相同的寡核苷酸引物，在DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer,Cetus)上使用Taq聚合酶(Promega,U.S.A.)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR，每個(gè)循環(huán)包括在變性溫度(94℃)1.5分鐘，在退火溫度(53℃)2分鐘和在延伸溫度(72℃)4分鐘。
將含有SP6啟動(dòng)子并從每一HBV突變株中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物加入小麥生殖細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)。根據(jù)說(shuō)明書(Promega,U.S.A.)進(jìn)行體外的聯(lián)合轉(zhuǎn)錄/翻譯。簡(jiǎn)短說(shuō)，將10μl PCR產(chǎn)物加入25μl小麥生殖細(xì)胞提取物，該提取物中添加了SP6 RNA聚合酶、氨基酸混合物(在缺乏[35S]甲硫氨酸的情況下)、RNA酶抑制劑和反應(yīng)緩沖液。將反應(yīng)混合物在30℃保溫60分鐘。所得提取物含有翻譯的HBV DNA聚合酶，將其加入總的試驗(yàn)方法一節(jié)所述溶液中，并如上述分析聚合酶活性。這類分析的結(jié)果示于圖5，其說(shuō)明突變株‘S’145(泳道2)或‘S’146(泳道3)的HBV DNA聚合酶與野生型酶的(泳道1)相比顯示相似的引發(fā)活性?；蛘?，可用激光密度測(cè)定法進(jìn)行定量測(cè)定，其可比較所引發(fā)的放射性標(biāo)記聚合酶的強(qiáng)度。
實(shí)施例2檢測(cè)人類HBV DNA聚合酶的抑制劑篩選人HBV DNA聚合酶的抑制劑將提供HBV感染的新治療試劑，因?yàn)閷?duì)聚合酶活性的有效抑制將導(dǎo)致對(duì)HBV病毒復(fù)制的抑制。本發(fā)明所報(bào)道的簡(jiǎn)化活性試驗(yàn)?zāi)芨焖俜治鲂掳l(fā)現(xiàn)的分子對(duì)攜有主要表面抗原突變之HBV變體的DNA聚合酶的抑制效應(yīng)。簡(jiǎn)言之，先使候選抑制劑與如本發(fā)明的報(bào)道經(jīng)PCR擴(kuò)增和體外翻譯的野生型人HBV DNA聚合酶一起保溫。保溫時(shí)有[α-32P]dTTP以及上述其它條件存在。其抑制效應(yīng)可通過激光密度測(cè)定法和隨后的SDS-PAGE分析測(cè)定，或通過測(cè)定過濾后結(jié)合于硝酸纖維素膜上的放射性標(biāo)記HBV DNA聚合酶的量而測(cè)定。顯然，對(duì)這類抗病毒試劑的抑制效應(yīng)的分析可方便地應(yīng)用于HBV變體，包括本發(fā)明中也涉及到的疫苗誘導(dǎo)的‘S’145突變體(圖5)。衍生自上述試驗(yàn)的進(jìn)一步潛在抑制效應(yīng)試驗(yàn)可再擴(kuò)展至其它系統(tǒng)如產(chǎn)生HBV的細(xì)胞系以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。
根據(jù)所使用的標(biāo)記類型，標(biāo)記的HBV DNA聚合酶雜交產(chǎn)物可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)。這通常包括從標(biāo)記的人HBV DNA聚合酶中分離所標(biāo)記的單核苷酸的步驟。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過使樣品混合物(此時(shí)在所述試驗(yàn)方法中，包含標(biāo)記的人HBV DNA聚合酶和過量標(biāo)記的單核苷酸)濾過硝酸纖維素膜而進(jìn)行檢測(cè)。未摻入的過量標(biāo)記的單核苷酸流過濾膜，而標(biāo)記的聚合酶雜交反應(yīng)產(chǎn)物則被結(jié)合在硝酸纖維素膜上。在本發(fā)明報(bào)道的簡(jiǎn)化試驗(yàn)中，當(dāng)標(biāo)記為放射性標(biāo)記時(shí)，結(jié)合在濾膜上的放射活性的量可用平板閃爍讀數(shù)儀(plate reading scintillation counter)測(cè)定。這類測(cè)量與本發(fā)明所述前一個(gè)方法相比，明顯的優(yōu)勢(shì)在于其不含電泳步驟。
在本發(fā)明中，可分析以下能抑制HBV DNA聚合酶活性的核苷酸類似物的抗引發(fā)活性。這些包括ddTTP,ddGTP,ddCTP,ddATP和拉米夫定。試驗(yàn)條件與總的試驗(yàn)方法一節(jié)中所述相同。簡(jiǎn)言之，在特定核苷酸類似物的抗引發(fā)活性檢測(cè)中，試驗(yàn)混合物中的核苷酸以相應(yīng)的核苷酸類似物取代(即檢測(cè)ddGTP的抗引發(fā)活性時(shí)，以ddGTP代替dGTP)。相反，當(dāng)檢測(cè)ddTTP以及拉米夫定的抗引發(fā)活性時(shí)無(wú)需核苷酸取代(因?yàn)楸景l(fā)明中放射性標(biāo)記的核苷酸是dTTP)。保溫結(jié)束時(shí)，將反應(yīng)混合物通過常規(guī)印跡轉(zhuǎn)移至一張硝酸纖維素膜(2×2cm)上。然后通過將硝酸纖維素膜在400ml Tris HCl(pH7.5),100mM NaCl,20mM MgCl2，和0.5％牛血清白蛋白中洗滌而分離出未摻入的放射性標(biāo)記dTTP。結(jié)合在硝酸纖維素膜上的放射性標(biāo)記的人HBV DNA聚合酶然后用平板閃爍讀數(shù)儀測(cè)定。示于圖6的結(jié)果說(shuō)明，在有ddCTP和ddGTP存在時(shí)[32P]標(biāo)記的人HBV DNA聚合酶的量明顯低于對(duì)照試驗(yàn)(缺乏任何核苷酸類似物)的，從而說(shuō)明它們的抗引發(fā)活性。與之對(duì)比，未發(fā)現(xiàn)ddTTP或ddATP的抗引發(fā)活性。
本發(fā)明的基礎(chǔ)是對(duì)人HBV DNA聚合酶的簡(jiǎn)化的活性試驗(yàn)。該發(fā)明使得有可能對(duì)血清樣品中人HBV DNA聚合酶的活性進(jìn)行直接快速測(cè)定，而無(wú)需目前所要求的克隆。因此它可快速評(píng)估并監(jiān)控主要表面抗原有突變的HBV變體的數(shù)量增長(zhǎng)。該發(fā)明還使得有可能對(duì)抗病毒試劑之抑制效應(yīng)進(jìn)行簡(jiǎn)易分析，這些試劑針對(duì)上述HBV變體，尤其經(jīng)疫苗接種后誘導(dǎo)的相關(guān)于肝臟疾病的那些(即‘S’145)以及將逐漸導(dǎo)致肝臟疾病的無(wú)癥狀個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的那些。
序列表<110>新加坡共和政府<120>人類乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶的體外活性試驗(yàn)，及其在HBVDNA聚合酶抑制劑的篩選中的應(yīng)用<130>JAS/TW/PSC/A.2911/980<140>PCT/SG99/00017<141>1999-03-13<150>PCT/SG98/00077<151>1998-09-29<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>23<212>DNA<213>鼠傷寒沙門菌噬菌體SP6<220><221>啟動(dòng)子<222>(1)..(23)<400>1atttaggtga cactatagaa ctc 23<210>2<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>啟動(dòng)子<222>(1)..(23)<220><223>人工序列的描述核苷酸1-23為SP6啟動(dòng)子；核苷酸23-48來(lái)自乙型肝炎病毒<400>2aaatttagt gacactatag aatatgcccc tatcttatca acacttcc48<210>3<211>30<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>3acagtagctc caaattcttt ataagggtca 30
權(quán)利要求
1．一種人乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶的體外活性試驗(yàn)，其包括用一種已摻入SP6病毒聚合酶啟動(dòng)子的寡核苷酸作為5’寡核苷酸在血清樣品中進(jìn)行HBV DNA聚合酶的PCR擴(kuò)增，直接在真核細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞裂解物中轉(zhuǎn)錄和翻譯該P(yáng)CR產(chǎn)物，并測(cè)定HBV DNA聚合酶在有放射性標(biāo)記試劑存在時(shí)的引發(fā)。
2．權(quán)利要求1的試驗(yàn)，其中所述放射性標(biāo)記試劑是放射性標(biāo)記的核苷三磷酸。
3．權(quán)利要求2的試驗(yàn)，其中所述放射性標(biāo)記的核苷三磷酸是dTTP或其一種類似物。
4．權(quán)利要求1,2或3的試驗(yàn)，其中所述放射性標(biāo)記試劑存在于一種試驗(yàn)緩沖液中。
5．權(quán)利要求4的試驗(yàn)，其中所述復(fù)合物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳從所述試驗(yàn)緩沖液中分離。
6．權(quán)利要求4的試驗(yàn)，其中所述復(fù)合物通過過濾從所述試驗(yàn)緩沖液中分離。
7．在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)的試驗(yàn)，其中所述樣品是一種血清樣品。
8．權(quán)利要求7的試驗(yàn)，其中所述血清樣品包含人HBV野生型病毒或其表面抗原突變株，例如衍生自疫苗逃避，正常人群，以及有乙型肝炎病的病人的病毒。
9．在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)的試驗(yàn)在各種血清樣品的活性試驗(yàn)中的應(yīng)用。
10．權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的試驗(yàn)在HBV DNA聚合酶抑制劑的篩選中的應(yīng)用。
11．權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的試驗(yàn)的應(yīng)用，其用于檢驗(yàn)和/或篩選潛在的抗HBV藥物對(duì)人HBV DNA聚合酶之DNA引發(fā)活性的抑制能力。
12．權(quán)利要求11的應(yīng)用，包括以下步驟a)在指定體積的試驗(yàn)緩沖液中制備至少一份樣品，每份樣品包含在真核細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中用線性PCR產(chǎn)物為模板體外翻譯的人HBV DNA聚合酶蛋白，以及含有能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)之序列的HBV負(fù)鏈合成所需的RNA模板，b)在等體積試驗(yàn)緩沖液中制備對(duì)照樣品，該對(duì)照樣品包含用線性PCR產(chǎn)物為模板體外翻譯的人HBV DNA聚合酶蛋白和HBV負(fù)鏈合成所需的包括能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)之序列的RNA模板，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)為人HBV DNA聚合酶的結(jié)合和引發(fā)所必需，c)保溫所述樣品以獲得含有DNA聚合酶和放射性標(biāo)記試劑的復(fù)合物，d)從所述試驗(yàn)緩沖液中分離所述復(fù)合物，和e)測(cè)量每份分離的復(fù)合物中放射性標(biāo)記試劑的量，此量可指示人HBVDNA聚合酶的DNA引發(fā)活性。
13．權(quán)利要求12的應(yīng)用，其包括比較各復(fù)合物中放射性標(biāo)記試劑的量。
14．權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中步驟c),d)和e)用以下步驟代替c)在適于上述人HBV DNA聚合酶的DNA引發(fā)活性的指定條件下，使上述每一試驗(yàn)管及上述每一對(duì)照管與等量的放射性標(biāo)記之核苷三磷酸一起保溫，導(dǎo)致形成一種復(fù)合物，其中所述核苷三磷酸包括已插入上述HBV負(fù)鏈DNA中的第一個(gè)核苷酸，所述復(fù)合物含有上述DNA聚合酶和上述放射性標(biāo)記的核苷三磷酸；d)通過硝酸纖維素膜過濾將上述復(fù)合物從上述每一試驗(yàn)管和上述每一對(duì)照管的試驗(yàn)緩沖液中分離出來(lái)；e)測(cè)定上述每份分離的復(fù)合物中放射性標(biāo)記的核苷三磷酸的量，該量可以指示上述人HBV DNA聚合酶的DNA引發(fā)活性；f)比較上述每一試驗(yàn)管和上述每一對(duì)照管中仍結(jié)合在硝酸纖維素膜上的上述分離的復(fù)合物中放射性標(biāo)記的核苷三磷酸的各自含量，試驗(yàn)管中分離的復(fù)合物中的放射性標(biāo)記之核苷三磷酸的含量低于對(duì)照管，則說(shuō)明上述人HBV DNA聚合酶的DNA引發(fā)活性被上述潛在的抗HBV藥物抑制。
15．一種方法，其用線性PCR產(chǎn)物為模板直接從線性DNA片段產(chǎn)生HBV DNA聚合酶。
16．權(quán)利要求15的方法，其中所述方法包括將SP病毒聚合酶啟動(dòng)子摻入5’有義寡核苷酸。
17．權(quán)利要求16的方法，其中所述5’有義寡核苷酸包括人HBV DNA聚合酶基因編碼區(qū)的頭30個(gè)核苷酸，SP6啟動(dòng)子位于所述寡核苷酸中HBV序列的上游。
18．權(quán)利要求15的方法，其中該方法包括3’反義寡核苷酸的合成，所述3’反義寡核苷酸位于人HBV DNA聚合酶基因終止密碼子下游300堿基對(duì)處。
全文摘要
本發(fā)明提供人類乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶的體外活性試驗(yàn),其包括利用已摻入了SP6病毒啟動(dòng)子的寡核苷酸作為5’寡核苷酸從樣品中經(jīng)PCR擴(kuò)增HBV DNA聚合酶,在有放射性標(biāo)記試劑存在的情況下直接轉(zhuǎn)錄和翻譯所述PCR產(chǎn)物,并測(cè)定HBV DNA聚合酶的引發(fā)。本發(fā)明還提供這樣一種試驗(yàn)在各種血清樣品的活性測(cè)試中的應(yīng)用,在HBVDNA聚合酶抑制劑的篩選中的應(yīng)用,以及在檢測(cè)和/或篩選潛在的抗HBV藥物對(duì)人類HBV DNA聚合酶的DNA引發(fā)活性的抑制能力方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/15GK1320167SQ9981152
公開日2001年10月31日 申請(qǐng)日期1999年3月13日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月29日
發(fā)明者溫崇仁, 陳維寧, 林玉嬌, 梁愛玲 申請(qǐng)人:新加坡共和國(guó)政府