一種用于熒光法測定葉綠素含量的藻液的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于熒光法測定葉綠素含量 的藻液的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 葉綠素 a含量在一定程度上反應(yīng)水體中藻類數(shù)量和水質(zhì)狀況，是水體水質(zhì)環(huán)境監(jiān) 測中的常規(guī)監(jiān)測項(xiàng)目、是水體富營養(yǎng)化指標(biāo)之一。
[0003] 實(shí)驗(yàn)室分光光度法[1 2]、熒光分光光度法[3]是實(shí)驗(yàn)室測定葉綠素 a實(shí)現(xiàn)對浮游植 物的定量測定的最為常用的方法。采用熒光光度法測定水體中的葉綠素 a，靈敏度比分光光 度法高10倍，不需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理，操作簡單，可連續(xù)監(jiān)測，隨著熒光法葉綠素在線分 析儀的開發(fā)與研究，實(shí)現(xiàn)水體中葉綠素的實(shí)時原位分析。
[0004] 實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)熒光檢測法直接測定藻液時，藻細(xì)胞沉降明顯、測量值 隨時間變化較大得到的數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，無法正確判斷出水質(zhì)環(huán)境。準(zhǔn)確、完整的監(jiān)測數(shù)據(jù)是環(huán) 境管理工作的基礎(chǔ)和依托，一個錯誤的數(shù)據(jù)可能導(dǎo)致錯誤的決策與行動，因此正確測量水 質(zhì)環(huán)境至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中熒光法測定藻液時，容易沉降，無法獲得準(zhǔn)確的藻液濃 度數(shù)據(jù)，提供了一種用于熒光法測定葉綠素含量的藻液的制備方法。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)其目的 采用的技術(shù)方案是：
[0006] -種用于熒光法測定葉綠素含量的藻液的制備方法，選取蛋白核小球藻藻種，配 制BG-Il培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)基滅菌、冷卻，于無菌條件下進(jìn)行藻種接種，接種完成，置于恒 溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)基滅菌之前，向所述的BG-Il培養(yǎng)基中添加瓊脂粉來培養(yǎng)蛋 白核小球藻。
[0007] 所述的BG-Il培養(yǎng)基放入滅菌鍋于121°C下滅菌30min，取出后放入超凈臺冷卻。
[0008] 所述的BG-Il培養(yǎng)基在接種之前，置于紫外燈下照射30min以上。
[0009] 所述恒溫光照培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)條件是：光照度為20001x，溫度為25°C，濕度為 75% RH，光暗周期為12h :12h，靜置培養(yǎng)，每日搖瓶2-3次，同時更換錐形瓶的位置，以免引 起光照不足。
[0010] BG-Il培養(yǎng)基中瓊脂粉的添加量為0· 08-0. 10g/100mL。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明根據(jù)瓊脂粉的凝膠性、穩(wěn)定性提出了一種藻液的制 備方法、向BG-Il培養(yǎng)基中添加瓊脂粉（0. 08-0. 10g/100ml)作為助懸劑培養(yǎng)蛋白核小球 藻，培養(yǎng)的蛋白核小球藻作為制備藻液，提高了藻液的懸浮性、穩(wěn)定性，減少藻體沉降對測 定結(jié)果的影響，進(jìn)而確保了利用熒光法測定葉綠素含量的結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0012] 圖1是蛋白核小球藻葉綠素 a的激發(fā)光譜和發(fā)射光圖譜。橫坐標(biāo)為掃描波長，縱 坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，左邊為激發(fā)圖譜，右邊為發(fā)射圖譜。
[0013] 圖2是測量間隔時間與1號原藻液熒光值間的關(guān)系曲線。橫坐標(biāo)為測量間隔時間， 縱坐標(biāo)為熒光值的變化率，圖中Λ F/F。= -9. 96%表示當(dāng)T = Imin時，Λ F/F。= -9. 96%。
[0014] 圖3是測量間隔時間與1-6號熒光值相對變化率間的關(guān)系曲線。橫坐標(biāo)為測量間 隔時間，縱坐標(biāo)為熒光值的變化率。
[0015] 圖4是測量間隔時間與光密度值相對變化率間的關(guān)系曲線。橫坐標(biāo)為測量間隔時 間，縱坐標(biāo)為光密度值的變化率。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中熒光法測定藻液時，藻容易沉降，無法獲得準(zhǔn)確的藻液 濃度數(shù)據(jù)，提供了一種用于熒光法測定葉綠素含量的藻液的制備方法。下面結(jié)合具體實(shí)施 例為本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0017] 1、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
[0018] 儀器：光照培養(yǎng)箱（Ε-30Β0美國Percival);可見分光光度計(jì)（722型上海光譜 儀器有限公司）；紫外分光光度計(jì)（UV-2600上海天美科學(xué)儀器有限公司）；熒光分光光度 計(jì)（RF-5301日本島津公司）；離心機(jī)（Ζ323德國HERMLE - Ζ323);循環(huán)水式多用真空栗 (SHB - III鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。
[0019] 試劑：鹽酸（分析純石家莊市華迪化工工貿(mào)有限公司）；氫氧化鈉（分析純天津市 大陸化學(xué)試劑廠）；葉綠素 a標(biāo)準(zhǔn)品（日本wako公司，IOmg裝）；蛋白核小球藻（藻種購自 中國科學(xué)院野生生物質(zhì)庫一一淡水藻種庫，培養(yǎng)基為滅菌BG-Il培養(yǎng)液）；瓊脂粉（Japan Mff :3000-9000)〇
[0020] 2、添加不同濃度瓊脂粉配置BG-Il培養(yǎng)基
[0021] 選取6個規(guī)格為250ml的錐形瓶，每個錐形瓶中配置100mLBG-Il培養(yǎng)基，并向每 個錐形瓶中添加不同量的瓊脂粉。
[0022] BG-Il培養(yǎng)基的配方為：
[0023]
[0027] 其中，
[0028] 1號培養(yǎng)基：添加瓊脂粉0g/100mL。
[0029] 2號培養(yǎng)基：添加瓊脂粉0· 02g/100mL。
[0030] 3號培養(yǎng)基：添加瓊脂粉0· 04g/100mL。
[0031] 4號培養(yǎng)基：添加瓊脂粉0· 06g/100mL。
[0032] 5號培養(yǎng)基：添加瓊脂粉(λ 08g/100mL。
[0033] 6號培養(yǎng)基：添加瓊脂粉0. lg/100mL。
[0034] 3、制備蛋白核小球藻藻液
[0035] 選取的蛋白核小球藻購買自中國科學(xué)院野生生物質(zhì)庫一一淡水藻種庫，選擇一瓶 處于對數(shù)增長期且生長狀態(tài)良好的蛋白核小球藻120ml，搖勻，平均分成6份，每份20ml，將 六份蛋白核小球藻分別接種于1-6號培養(yǎng)基中作為出發(fā)藻，然后將接種有出發(fā)藻的錐形瓶 置于E-30B0光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25°C，光照條件20001x，時間設(shè)置為 12h晝/12h夜，濕度條件75% RH。藻種靜置培養(yǎng)，每日搖動錐形瓶2次同時更改錐形瓶位 置，七日后同時取出即得用于熒光法測定葉綠素含量的藻液。
[0036] 4、對制備的用于焚光法測定葉綠素的藻液懸浮穩(wěn)定性的檢測試驗(yàn)
[0037] 4. 1確定葉綠素 a的最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長
[0038] 提取1號培養(yǎng)基中培養(yǎng)的蛋白核小球藻中的葉綠素 a，使用島津RF5301熒光分 光光度計(jì)分別對葉綠素 a進(jìn)行光譜掃描。掃描條件：設(shè)定激發(fā)波長掃描范圍為400nm~ 50