一種基于離子液體-超聲輔助-hplc的昆明山海棠活性成分檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種中藥材的色譜檢測(cè)方法，更加具體的說涉及一種基于離子液 體-超聲輔助-HPLC的昆明山海棠活性成分檢測(cè)方法。 技術(shù)背景
[0002] 昆明山海棠是衛(wèi)矛科雷公藤屬植物昆明山海棠Tripterygium hypoglaucum(Levl. )Hutch.的干燥根，性辛味苦，微溫，有大毒，具有祛風(fēng)除濕，祛瘀通絡(luò)， 續(xù)筋接骨的功效。又名火把花、斷腸草、紫金皮等，火把花一名始載于《本草綱目》草部毒草 類鉤吻條，"生滇南者花紅，呼為火把花"，是藥典品種"昆明山海棠片"的原料藥材，也是雷 公藤類對(duì)人和動(dòng)物效高毒小的藥用植物，應(yīng)用范圍廣，具有抗炎、免疫抑制，抗腫瘤，改善腎 臟功能等作用，自古中醫(yī)用于殺蟲、舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)除濕等，使之成為世界矚目的藥用植物 資源。化學(xué)成分主要為生物堿及萜類化合物等，其中雷公藤甲素、雷酚內(nèi)酯、雷公藤醌A等 二萜類成分和雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲等三萜類成分被認(rèn)為是特征性活性成分。昆明山 海棠素（如昆明山海棠素A、D、K等，山海棠素又名雷酚內(nèi)酯）是昆明山海棠中的特有化學(xué) 成分。
[0003] 離子液體一般是指由結(jié)構(gòu)不對(duì)稱的陰陽(yáng)離子所構(gòu)成，具有揮發(fā)性極低、無(wú)毒、無(wú)污 染、溶解能力強(qiáng)、熱穩(wěn)定性高、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)，離子液體萃取技術(shù)在中藥研究領(lǐng)域 的引入越來(lái)越受到關(guān)注。另外在《昆明山海棠一湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009)未見有含量測(cè) 定對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，本文首次采用離子液體對(duì)昆明山海棠進(jìn)行微萃取，同時(shí)測(cè)定昆明山 海棠中雷公藤晉堿、雷公藤堿庚、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿和雷公藤醌A，優(yōu)化了含量測(cè)定色譜 條件，微萃取中離子液體類型，濃度等，為昆明山海棠進(jìn)行多成分的質(zhì)量控制提供一定的參 考依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決昆明山海棠中活成成分多樣化檢測(cè)困難的問題，本發(fā)明提供了一種基于離 子液體-超聲輔助-HPLC的昆明山海棠活性成分檢測(cè)方法，其中技術(shù)關(guān)鍵為，在所述制備樣 品為采用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽的溶液作為提取液提取昆明山海棠藥材。
[0005] 其中所述提取液的為0. 2-1.Omol·L1 1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽甲醇溶 液。
[0006] 所述制備樣品為采用提取液與昆明山海棠藥材10:1的固液質(zhì)量比超聲提取 30min〇
[0007] 其中，所述制備HPLC樣品的前處理方法包括以下步驟：
[0008] 1)精密稱定過三號(hào)篩昆明山海棠粉末，置于具塞離心試管中；
[0009] 2)按照固液質(zhì)量比1:10的比例加入0. 6mol·L1 [BMIm]PF6甲醇溶液；
[0010] 3)超聲萃取30min，然后用12000r·min1離心5min，上清液微孔濾膜濾過，即得 供試樣品。
[0011] 所述HPLC檢測(cè)的條件為：
[0012] 色譜柱：Inertsil0DS-4 (3μm, 4. 6*250mm);
[0013] 流動(dòng)相：乙腈㈧-0. 1%磷酸溶液⑶；
[0014] 梯度洗脫條件：0 ~55min，37%A- 37%A;
[0015] 55 ~75min，37%A- 45%A;
[0016] 75 ~lOOmin，45 %A- 45 %A;
[0017] 100 ~105min，45 %A- 49 %A;
[0018] 105 ~125min，49%A- 49%A;
[0019] 檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm;
[0020] 柱溫：3(TC;流速：0· 75mL/min;
[0021] 進(jìn)樣量：5μ1。
[0022] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：采用本發(fā)明提供基于離子液體-超聲輔助-HPLC的昆 明山海棠活性成分檢測(cè)方法檢測(cè)效率明顯高于傳統(tǒng)單成分簡(jiǎn)稱方法，更重要的是本發(fā)明提 供過程中活性成分的轉(zhuǎn)移率明顯高于傳統(tǒng)的甲醇提取方法，有效的并避免了檢測(cè)誤差。
【附圖說明】
[0023] 圖1昆明山海棠藥材及對(duì)照品色譜圖；
[0024] 圖2離子液體對(duì)雷公藤晉堿提取率的影響；
[0025] 圖3離子液體對(duì)雷公藤堿庚提取率的影響；
[0026] 圖4離子液體對(duì)雷酚內(nèi)酯提取率的影響；
[0027] 圖5離子液體對(duì)雷公藤次堿提取率的影響；
[0028] 圖6離子液體對(duì).雷公藤醌A提取率的影響；
[0029] 圖7離子液體濃度對(duì)5種成分提取率的影響；
[0030] 圖8固液比對(duì)昆明山海棠中5中成分提取率的影響；
[0031 ] 圖9雷公藤晉堿對(duì)5種化合物提取率的影響；
[0032] 圖10雷公藤堿庚對(duì)5種化合物提取率的影響；
[0033] 圖11雷酚內(nèi)酯對(duì)5種化合物提取率的影響；
[0034] 圖12雷公藤次堿對(duì)5種化合物提取率的影響；
[0035] 圖13雷公藤醌A對(duì)5種化合物提取率的影響；
[0036] 圖14提取方式對(duì)雷公藤晉堿提取率的影響；
[0037] 圖15提取方式對(duì)雷公藤堿庚提取率的影響；
[0038] 圖16提取方式對(duì)雷酚內(nèi)酯提取率的影響；
[0039] 圖17提取方式對(duì)雷公藤次堿提取率的影響；
[0040] 圖18提取方式對(duì)雷公藤醌A提取率的影響；
[0041] 圖19超聲時(shí)間對(duì)雷公藤晉堿提取率的影響；
[0042] 圖20超聲時(shí)間對(duì)雷公藤堿庚提取率的影響；
[0043] 圖21超聲時(shí)間對(duì)雷酚內(nèi)酯提取率的影響；
[0044] 圖22超聲時(shí)間對(duì)雷公藤次堿提取率的影響；
[0045] 圖23超聲時(shí)間對(duì)雷公藤醌A提取率的影響；
[0046] 圖24粉碎度對(duì)雷公藤晉堿提取率的影響；
[0047] 圖25粉碎度對(duì)雷公藤堿庚提取率的影響；
[0048] 圖26粉碎度對(duì)雷酚內(nèi)酯提取率的影響；
[0049] 圖27粉碎度對(duì)雷公藤次堿提取率的影響；
[0050] 圖28粉碎度對(duì)雷公藤醌A提取率的影響；
[0051] 其中，附圖1中，A.昆明山海棠藥材；B.雷公藤晉堿、雷公藤堿庚、雷酚內(nèi)酯、雷公 藤次堿和雷公藤醌A的混合對(duì)照品；C.雷公藤晉堿對(duì)照品；D.雷公藤堿庚對(duì)照品；E.雷酚 內(nèi)酯對(duì)照品；F.雷公藤次堿對(duì)照品；G.雷公藤醌A對(duì)照品；色譜峰分別是：1.雷公藤晉堿； 2.雷公藤堿庚；3.雷酚內(nèi)酯；4.雷公藤次堿；5.雷公藤醌A。
【具體實(shí)施方式】
[0052] 實(shí)施例1HPLC的條件考察
[0053] 1.儀器與試藥
[0054] 島津HPLCLC-30A高效液相色譜儀，AEG-45SM電子天平（十萬(wàn)分之一，日本島津 公司），BP121S(萬(wàn)分之一）（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。KQ250DB型數(shù)控超聲波清 洗器（功率250W，頻率40kHz，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），BJ-100多功能粉碎機(jī)（德 清拜杰電器有限公司），
[0055] 1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽（[BMIm]Br，純度彡99% )，1_ 丁基-3-甲基咪唑四 氟硼酸鹽（[BMIm]BF4，純度彡99% )，1_ 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[BMIm]PF6，純度 彡99% )，1_己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[HMIm]BF4，純度彡99% )，1_己基-3-甲基咪 唑六氟磷酸鹽（[HMIm]PF4，純度彡99% )，1_辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[0MIm]BF4， 純度多99% )，均由中科院蘭州化學(xué)物理研究所提供。雷公藤晉堿（批號(hào)：140925,純度 彡98.0%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司），雷酚內(nèi)酯（批號(hào)：14102609,純度彡98.0%，南 京景竹生物科技有限公司），雷公藤次堿（批號(hào)：150623,純度多98. 0 %，成都普菲德生物技 術(shù)有限公司），雷公藤堿庚和雷公藤醌A(自制，純度多98. 0%，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研 究所提供），乙腈為色譜純；水為超純水；其它試劑均為分析純（重慶川東化工集團(tuán)有限公 司化學(xué)試劑廠）。
[0056] 2.方法學(xué)考察
[0057] 分別比較了甲醇-7K，乙腈-7K，乙腈-Ο. 1%甲酸，乙腈-Ο. 1%磷酸-0.2%三乙 胺溶液，乙腈-〇·lmol·L1磷酸二氫鉀溶液，乙腈-0·lmol·L1乙酸銨溶液等梯度洗脫對(duì)目 標(biāo)成分的分離效果，結(jié)果雷酚內(nèi)酯和雷公藤次堿不能有效地分離，分離度和對(duì)稱因子達(dá)不 到要求。用乙腈-0. 1 %磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫分離，能有效地分離昆明山海棠中的5種有 效成分。另對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)，柱溫和流速等進(jìn)行了考察，最后選擇檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，柱溫30°C，流 速為0. 75mL·min1能有效地分離昆明山海棠中的5中有效成分，5種成分的分離度均大于 1. 5,對(duì)稱因子均在0. 95~1. 05之間。
[0058] 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0· 5μL、1μL、2μL、5μL、10μL、15μL、20μL，注 入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。分別以雷公藤晉堿、雷公藤堿庚、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿和雷公 藤醌Α的含量（ug)為橫坐標(biāo)（X)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Υ)，進(jìn)行回歸，回歸方程及線性 關(guān)系見表1。
[0059] 表1回歸方程及線性關(guān)系
[0060] Tablel Regression equations and linear relation
[0061]
[0062] 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液（2. 2.
1項(xiàng)下）5μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì) 算RSD值。結(jié)果，昆明山海棠中雷公藤晉堿、雷公藤堿庚、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿和雷公藤醌 A的RSD依次為0. 71 %，1. 67%，1. 98%，0. 52%，0. 89%，表明儀器具有較好的精密度。
[0063] 因此確定HPLC的檢測(cè)條件為：色譜柱：Inertsil 0DS-4(3 μπι，4. 6*250mm);流動(dòng) 相：乙腈（Α)-0· 1%磷酸溶液⑶，梯度洗脫（0~55min，37%A -37%A ;55~75min，37% A - 45% A ;75~100min，45% A - 45% A ;100~105min，