熒光增敏劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于化學(xué)分析領(lǐng)域，具體涉及一種用于黃曲霉毒素Mi熒光分析的熒光增敏劑。
【背景技術(shù)】
[0002]黃曲霉毒素MjAflatoxin MbAFM!)是哺乳動(dòng)物攝入黃曲霉毒素BjAflatoxin Βι,AFBi)污染的食物后，經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450等相關(guān)酶代謝，發(fā)生II相反應(yīng)形成的羥基化代謝產(chǎn)物，毒性僅次于AFBi。1993年，六?11被世界衛(wèi)生組織(WT0)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為2B類致癌物質(zhì)，2002年被提至I類致癌物，其嚴(yán)重威脅到人體的健康。AFMi主要存在于哺乳動(dòng)物的乳汁、尿液等排泄物中，通常動(dòng)物在攝入AFBd2?24小時(shí)后即可檢測出AFMi AFMr污染主要存在于乳及乳制品中，而人類尤其是嬰幼兒對乳制品的接觸率極高，危害極大，因此世界各國對AFMi的限量標(biāo)準(zhǔn)一直非常嚴(yán)格。CAC國際標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定牛奶中的AFMi限量為0.5yg/kg，我國、美國和日本等很多國家也規(guī)定乳及乳制品中AFMi限量標(biāo)準(zhǔn)為0.5yg/kg，歐盟制定的標(biāo)準(zhǔn)更為嚴(yán)格，乳及乳制品中限量為0.05yg/kg，嬰幼兒配方奶以及改進(jìn)配方奶中限量為
0.025yg/kg，具有特殊醫(yī)療目的的嬰幼兒食品中限量為0.025yg/kg。為保障乳品安全，AFMi檢測技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性一直要求極高。
[0003]目前對于黃曲霉毒素的熒光增敏主要是對AFB^AFGi等黃曲霉毒素借助光化學(xué)等衍生設(shè)備或三氟乙酸等強(qiáng)酸、鹵族元素等強(qiáng)氧化劑、環(huán)糊精(CDs)等增強(qiáng)AFB^AFGd^熒光強(qiáng)度或降低基質(zhì)屏蔽、干擾作用達(dá)到提高靈敏度的目的，同時(shí)兼顧準(zhǔn)確定量和快速檢測，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室或者現(xiàn)場實(shí)地可以進(jìn)行應(yīng)用推廣。其中，三氟乙酸通常作為高效液相色譜法柱前衍生試劑，具有毒性、強(qiáng)腐蝕性和極易揮發(fā)性，需要較嚴(yán)格的衍生條件和操作技術(shù)(如避光、高溫等)；鹵族元素等強(qiáng)氧化劑(飽和碘溶液、溴水、過溴化吡啶溴等)和光化學(xué)在線衍生的設(shè)備，通過衍生設(shè)備和一定的衍生條件將AFB^AFGi這兩種黃曲霉毒素的不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成飽和結(jié)構(gòu)(AFBi轉(zhuǎn)化成AFB2a，AFG1轉(zhuǎn)化成AFG2a)，衍生物富含大量羥基，且電子云與芳環(huán)上的η軌道平行，擴(kuò)大了共軛雙鍵體系，增強(qiáng)了 AFs的天然熒光值，提高了檢測的靈敏度，用于高效液相色譜在線檢測或柱后衍生技術(shù)。AFMi本身性質(zhì)和結(jié)構(gòu)與AFB^AFGi存在較大差異，缺少雙鍵不飽和結(jié)構(gòu)，這些技術(shù)無法對AFMi實(shí)現(xiàn)衍生和熒光增敏效應(yīng)。
[0004]環(huán)糊精具有巨大的空穴尺寸和內(nèi)腔的疏水性，可對AFs客體分子進(jìn)行分子識別，形成超分子復(fù)合物，避免熒光分子與水性溶劑接觸發(fā)生淬滅的特性，具有熒光增強(qiáng)作用，檢測靈敏度被大大提高。近幾年有一些此類報(bào)道對AFMi進(jìn)行熒光增強(qiáng)和基質(zhì)屏蔽繼而增強(qiáng)分析的靈敏度的應(yīng)用研究報(bào)道。劉雪芬等(Liu X.F..ffu'han,Chinese Academy ofAgricultural Sciences(武漢:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院),2011.)得出2，6-二甲基-β-環(huán)糊精使AFMi的焚光強(qiáng)度增加0.5倍，C.Cucci等(Cucci C.,Mignani A.G.，Dal 1 ’ Asta C , etal.Chem.,2007,126(2) ,467-472)將丁二?；?β-環(huán)糊精(β-CD-SU)應(yīng)用于測定微量的AFMi，結(jié)果顯示熒光強(qiáng)度可增強(qiáng)1.5倍，但應(yīng)用過程和測定速度受到溫度和待測介質(zhì)的影響，不能穩(wěn)定應(yīng)用，且測定時(shí)間常隨溫度的變化而變化。因此，有必要對AFMi的熒光分析方法進(jìn)行改進(jìn)完善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種黃曲霉毒素見的熒光增敏劑，所述熒光增敏劑能夠顯著提高AFMi熒光檢測的強(qiáng)度。
[0006]本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下:
[0007]1、黃曲霉毒素施熒光增敏劑，由甲基-β_環(huán)糊精和含Hg2+的溶液組成，甲基-β-環(huán)糊精^?]?1摩爾比為5.8\105:1，取2+:六?]\11的摩爾比為6.6\104:1。
[0008]優(yōu)選的，所述熒光增敏劑的加入順序?yàn)橄燃尤際g2+，混勻后再加入甲基-β_環(huán)糊精。[0009 ] 2、含有黃曲霉毒素施的熒光增敏劑的黃曲霉素施待測溶液。
[0010]優(yōu)選的，所述黃曲霉毒素Μι待測溶液為含有黃曲霉毒素施的熒光增敏劑的甲醇/水溶液，所述甲醇/水溶液中甲醇的體積百分?jǐn)?shù)為20 %。
[0011]3、檢測黃曲霉素見待測溶液體系熒光強(qiáng)度的方法，將所述黃曲霉毒素施待測溶液在激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為410nm的條件下測量熒光強(qiáng)度，并計(jì)算黃曲霉毒素見的含量。
[0012]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的AFMi熒光增敏劑是β-環(huán)糊精及其衍生物與金屬離子共同作用于AFMiB成三元絡(luò)合物，不受AFB^AFGj^雙鍵不飽和結(jié)構(gòu)制約和限制，且不受溫度等影響，可以快速靈敏、準(zhǔn)確穩(wěn)定的增強(qiáng)AFMi的熒光強(qiáng)度。
[0013]本發(fā)明所述Hg2+-M-13_CD熒光增敏劑對黃曲霉毒素施熒光增強(qiáng)的效果顯著，且反應(yīng)快速。AFM^測溶液體系在0.01?2yg/L濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)R可達(dá)至1」0.999以上，檢出限為
0.0026yg/L，這低于一般衍生方法的檢出限。本發(fā)明所述一種快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)的熒光增強(qiáng)劑有望直接用于檢測奶制品中的AFMi，為AFMi的快速檢測提供了新思路和新途徑。本試驗(yàn)建立了一種針對AFMi檢測的新型衍生方法，與以前的衍生方法相比，該衍生試劑具有壽命長、腐蝕性低、不揮發(fā)、反應(yīng)迅速、熒光增強(qiáng)效果好等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0014]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0015]圖1不同β-CD對黃曲霉毒素施待測溶液熒光體系的影響；
[0016]圖2Μ-β-⑶、HgCl2與AFM^質(zhì)的量比對體系熒光強(qiáng)度的影響；
[0017]圖3不同甲醇/水比例對體系熒光強(qiáng)度的影響；
[0018]圖4衍生順序?qū)FMi體系熒光強(qiáng)度的影響；
[0019]圖5AFMi標(biāo)準(zhǔn)曲線與熒光增強(qiáng)后的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0021 ] 1、儀器與試劑
[0022]F-2500熒光分光光度儀(日本日立公司)；分析天平(精度0.0OOlg，上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠)；超純水發(fā)生器(Mill1-QAlOSystem Millipore公司，法國)。
[0023]AFMi標(biāo)準(zhǔn)品(sigma);甲醇(色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)；乙腈(色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司);β-環(huán)糊精(β-⑶)、甲基-β-環(huán)糊精(Μ-β-⑶)、羥丙基-β-環(huán)糊精(ΗΡ-β-CD)、羥乙基-β-環(huán)糊精(ΗΕ-β-CD)、磺丁基-β-環(huán)糊精(SBE-13-CD)、羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-13-CD)、聚合-β-環(huán)糊精(β-CDP)(分析純，山東智源生物科技有限公司)。
[0024]氯化汞(HgCl2，分析純，貴州銅仁汞試劑公司)；氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KC1)、氯化鎂(MgCl2)、氯化鈣(CaCl2)、氯化鐵(FeCl3)(分析純，成都市科龍化工有限公司)。
[0025]2、溶液的配置
[0026]AFMiS液配制:將lmg AFM^lmL乙腈溶解，配制成質(zhì)量濃度為lOtg/L的AFM^液，再取10yL 106yg/L AFMi溶液，加甲醇到lmL，配成lOtg/l的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封后于4°C下避光保存。使用時(shí)，準(zhǔn)確移取lOOyL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于25mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為40yg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
[0027]3、熒光光譜掃描方法
[0028]取lmL混合均勻的AFMi樣液，用1.0cm熒光石英比色皿放置在熒光分光光度計(jì)中進(jìn)行熒光發(fā)射光譜、激發(fā)光譜的掃描(激發(fā)光源為150W氙弧燈；響應(yīng)時(shí)間自動(dòng)