一種基于檢測(cè)P57^kip2和TGF-β1判斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型涉及一種基于檢測(cè)P57kip2和TGF?β1判斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，包括盒體及設(shè)置在盒體開口處的盒蓋，盒體內(nèi)垂直設(shè)置有四根伸縮套桿Ⅱ，伸縮套桿Ⅱ內(nèi)套設(shè)有伸縮套桿Ⅰ，盒體內(nèi)穿過四根伸縮套桿Ⅱ設(shè)置有隔板，四根伸縮套桿Ⅰ的自由端均與滑塊固定連接，滑塊設(shè)置在滑槽內(nèi)，滑槽開設(shè)在上盒體Ⅰ和上盒體Ⅱ的前后兩側(cè)，上盒體Ⅰ和上盒體Ⅱ的上端面以及隔板上均開設(shè)有容納孔。本實(shí)用新型能將上下層試劑盒分離，且無需將上層試劑盒移至實(shí)驗(yàn)臺(tái)，不占據(jù)較多的實(shí)驗(yàn)空間，對(duì)試劑管取放方便；固定效果好，避免試劑管晃動(dòng)。通過試劑能進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)P57kip2和TGF?β1的表達(dá)，從而判斷食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展情況。
【專利說明】
一種基于檢測(cè)P57kip2和TGF-βΙ判斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本實(shí)用新型屬于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于檢測(cè)P57kip2和TGF-βΙ判斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]作為全球范圍內(nèi)第八大最常見癌癥的食管癌，其死亡率位于癌癥致死率的第六位，全球每一年約有300000人死于食管癌。其中發(fā)展中國家占80%以上；中國男性食管癌發(fā)病率約為31.66/100000，女性約為15.93/100000，僅次于胃癌，位列各系統(tǒng)癌癥死亡的第二位。據(jù)報(bào)道，食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率每年已高達(dá)100/100000;據(jù)美國國家癌癥研究所在2013年報(bào)道:食管癌的新病例接近18000例，因食管癌死亡的人數(shù)超過15000，食管癌的形成是一個(gè)多因素、多基因、多階段的復(fù)雜的發(fā)展過程。
[0003]p57kip2基因作為細(xì)胞周期調(diào)控因子細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)家族的新成員，是細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，其抑癌機(jī)理可能是因其產(chǎn)物P57kip2蛋白與cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合阻止細(xì)胞增殖，從而使細(xì)胞周期停滯在Gl期。作為腫瘤抑制基因，p57kip2表達(dá)下調(diào)能夠引起腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲，p57kip2基因甲基化、基因印記缺失、印記錯(cuò)誤等引起p57kip2mRNA的表達(dá)降低均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TGF-βΙ是一種具有多種功能的細(xì)胞因子，TGF-βΙ可以促進(jìn)細(xì)胞分化和增殖，促使其轉(zhuǎn)化，并且TGF-βΙ還能夠促進(jìn)新生血管的生成，TGF-βΙ對(duì)于人體免疫會(huì)產(chǎn)生抑制作用，在人體腫瘤疾病中，TGF-m發(fā)揮著雙向調(diào)控作用，一方面，TGF-m會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制，另一方面，TGF-βΙ又可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化、增殖和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。將P57kip2、TGF-131和食管鱗癌聯(lián)系起來，運(yùn)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)了 p57kip2、TGF-m在食管鱗癌中的表達(dá)，聯(lián)合檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)食管鱗癌的惡性程度及預(yù)后有指導(dǎo)意義，并有助于臨床治療。
[0004]在臨床上，免疫組織化學(xué)染色已經(jīng)在腫瘤病理診斷中得到了廣泛應(yīng)用，涉及領(lǐng)域包括腫瘤組織起源的鑒別、未分化惡性腫瘤性質(zhì)的判定、各種形態(tài)系統(tǒng)腫瘤鑒別、確定腫瘤原發(fā)部位等。其原理是用標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)，經(jīng)過組織化學(xué)的呈色反應(yīng)而呈現(xiàn)醒目的陽性色彩，再用光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察。但傳統(tǒng)的免疫組化試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，將試劑歸類分層擺放，但分層取放試劑較為繁瑣，且占用實(shí)驗(yàn)空間，不方便規(guī)整;對(duì)試劑管的固定不穩(wěn)，容易造成試劑管的晃動(dòng)。而且尚未有檢測(cè)P57kip2和TGF-βΙ的免疫組織化學(xué)染色試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服【背景技術(shù)】中存在的問題，本實(shí)用新型提供了一種基于檢測(cè)P57kip2和TGF-βΙ 判斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的試劑盒 ，能利用試劑通過免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè) P57kip2和TGF-βΙ的表達(dá)，從而判斷食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展情況;試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，能將上下層試劑盒分離，且不占據(jù)較多的實(shí)驗(yàn)空間，對(duì)試劑管的取放方便;對(duì)試劑管的固定效果較好，避免試劑管晃動(dòng)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]所述的基于檢測(cè)P57kip2和TGF-βΙ判斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的試劑盒為長(zhǎng)方體硬質(zhì)塑料盒，包括盒體及設(shè)置在盒體開口處的盒蓋，所述的盒蓋邊緣設(shè)有密封墊，所述盒體內(nèi)垂直設(shè)置有四根伸縮套桿π，伸縮套桿Π內(nèi)套設(shè)有伸縮套桿I，盒體內(nèi)穿過四根伸縮套桿π設(shè)置有隔板，四根伸縮套桿I的自由端均與滑塊固定連接，滑塊設(shè)置在滑槽內(nèi)，所述的滑槽開設(shè)在上盒體I和上盒體Π的前后兩側(cè)，上盒體I和上盒體Π的上端面以及隔板上均開設(shè)有容納孔，且容納孔上設(shè)有定位圈，上盒體I和上盒體π的上端面兩側(cè)設(shè)有拉環(huán)，盒體底部以及上盒體I和上盒體π的底部均設(shè)有泡沫墊，泡沫墊上設(shè)有弧形的凹槽，凹槽與容納孔對(duì)應(yīng)設(shè)置。
[0008]進(jìn)一步地，所述的盒體與伸縮套桿Π—體成型，盒體的尺寸設(shè)置滿足上盒體I和上盒體π完全容納在盒體內(nèi)的要求。
[0009]進(jìn)一步地，所述的定位圈為錐形彈性圈。
[0010]進(jìn)一步地，所述上盒體I的容納孔內(nèi)設(shè)置有一抗試劑管、正常兔血清封閉液試劑管、生物素標(biāo)記二抗試劑管、鏈酶親和素-過氧化物酶復(fù)合物試劑管、對(duì)照一抗試劑管;所述上盒體π的容納孔內(nèi)設(shè)置有DAB稀釋液試劑管、DAB底物儲(chǔ)存液試劑管、穩(wěn)定的過氧化物酶試劑管、DAB增色液試劑管;所述隔板上的容納孔內(nèi)設(shè)置有檸檬酸鈉修復(fù)粉劑試劑管、PBS片劑試劑管、即用型蘇木素染色液、30%H202試劑管、甲醇試劑管、鹽酸乙醇試劑管。
[0011]進(jìn)一步地，所述的一抗試劑管內(nèi)的一抗為羊抗人HIWI多克隆抗體及鼠單克隆抗體，對(duì)照一抗試劑管內(nèi)的對(duì)照一抗是未免疫的山羊血清。
[0012]本實(shí)用新型的有益效果:本實(shí)用新型在試劑盒的結(jié)構(gòu)上進(jìn)行改進(jìn)，能將上下層試劑盒分離，且無需將上層試劑盒移至實(shí)驗(yàn)臺(tái)，不占據(jù)較多的實(shí)驗(yàn)空間，對(duì)試劑管的取放方便;通過彈性定位圈使試劑管的固定效果更好，避免試劑管晃動(dòng)。使用本實(shí)用新型試劑盒內(nèi)的試劑能進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)P57kip2和TGF-βΙ的表達(dá)，從而判斷食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展情況。
【附圖說明】
[0013]圖1為本實(shí)用新型(未裝試劑管)的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0014]圖2為本實(shí)用新型(未裝試劑管)使用狀態(tài)下盒體的俯視圖；
[0015]圖3為本實(shí)用新型(裝有試劑管)未使用狀態(tài)下盒體的解剖圖。
[0016]圖中，1-盒體、2-盒蓋、3-密封墊、4-上盒體1、5-上盒體Π、6_隔板、7_泡沫墊、8-滑槽、9-滑塊、I O-伸縮套桿1、11 -伸縮套桿Π、12-容納孔、13-定位圈、14-拉環(huán)、15-凹槽。
【具體實(shí)施方式】
[0017]為了使本實(shí)用新型的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，下面將結(jié)合附圖，對(duì)本實(shí)用新型的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的說明，以方便技術(shù)人員理解。
[0018]如圖1-3所示，所述的基于檢測(cè)P57kip2和TGF-βΙ判斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的試劑盒為長(zhǎng)方體硬質(zhì)塑料盒，包括盒體I及設(shè)置在盒體I開口處的盒蓋2，所述的盒蓋2邊緣設(shè)有密封墊3，能使盒體I與盒蓋2閉合更加緊密。所述盒體I內(nèi)垂直設(shè)置有四根伸縮套桿Π 11，伸縮套桿Π 11內(nèi)套設(shè)有伸縮套桿110，盒體I內(nèi)穿過四根伸縮套桿Π 11設(shè)置有隔板6，四根伸縮套桿IlO的自由端均與滑塊9固定連接，滑塊9設(shè)置在滑槽8內(nèi)，滑槽8開設(shè)在上盒體14和上盒體Π 5的前后兩側(cè)，上盒體14上的滑槽8位于其右部，上盒體Π 5上的滑槽8位于其左部，滑槽8的長(zhǎng)度根據(jù)上盒體14和上盒體Π 5的位移范圍設(shè)置。上盒體14和上盒體Π 5的上端面兩側(cè)設(shè)有拉環(huán)14，盒體I與伸縮套桿Π 11—體成型，盒體I的尺寸設(shè)置滿足上盒體14和上盒體Π5完全容納在盒體I內(nèi)的要求。伸縮套桿IlO和伸縮套桿Π 11的設(shè)置確保了上盒體14和上盒體Π5能上下移動(dòng)，滑槽8與滑塊9間配合，能使上盒體14和上盒體Π 5左右移動(dòng)。在未使用時(shí)，上盒體14和上盒體Π5收納在盒體I內(nèi)，且置于隔板6上方，由隔板6上設(shè)置的試劑管支撐;使用時(shí)，通過拉環(huán)14將上盒體14和上盒體Π 5拉起，再分別朝兩邊拉出，其拉出范圍經(jīng)過合理設(shè)計(jì)，確保整個(gè)試劑盒的平衡，最后置于盒體I邊緣上即可將全部試劑管展現(xiàn)，方便試劑管的取放，且不占據(jù)較多的實(shí)驗(yàn)空間。
[0019]上盒體14和上盒體Π5的上端面以及隔板6上均開設(shè)有容納孔12，容納孔12大小不一，容納孔12上設(shè)有與之匹配的定位圈13，定位圈13為錐形彈性圈，盒體I底部以及上盒體I4和上盒體Π 5的底部均設(shè)有泡沫墊7，泡沫墊7上設(shè)有弧形的凹槽15，凹槽15與容納孔12對(duì)應(yīng)設(shè)置。定位圈13具有彈性，能與試劑管緊密貼合，對(duì)試劑管起到固定作用，防止試劑管晃動(dòng)，同時(shí)通過凹槽15的配合，增加了試劑管的固定效果。
[0020]所述上盒體14的容納孔12內(nèi)設(shè)置有一抗試劑管、正常兔血清封閉液試劑管、生物素標(biāo)記二抗試劑管、鏈酶親和素-過氧化物酶復(fù)合物試劑管、對(duì)照一抗試劑管;所述上盒體Π 5的容納孔12內(nèi)設(shè)置有DAB稀釋液試劑管、DAB底物儲(chǔ)存液試劑管、穩(wěn)定的過氧化物酶試劑管、DAB增色液試劑管;所述隔板6上的容納孔12內(nèi)設(shè)置有檸檬酸鈉修復(fù)粉劑試劑管、PBS片劑試劑管、即用型蘇木素染色液、30%Η202試劑管、甲醇試劑管、鹽酸乙醇試劑管;一抗試劑管內(nèi)的一抗為羊抗人HIWI多克隆抗體及鼠單克隆抗體，對(duì)照一抗試劑管內(nèi)的對(duì)照一抗是未免疫的山羊血清。
[0021 ]采用本實(shí)用新型進(jìn)行檢測(cè)的操作步驟為:
[0022]將上盒體14和上盒體Π 5移出盒體I，并置于盒體I的邊緣上，展現(xiàn)全部試劑管。
[0023]I)組織片預(yù)處理:脫蠟前將組織芯片在62°C烤箱內(nèi)烘烤30分鐘或過夜；
[0024]2)脫蠟:放入二甲苯1、二甲苯Π中各浸泡10分鐘；
[0025]3)再水化:將步驟2)中的脫蠟組織片依次置于無水乙醇I中作用10分鐘、無水乙醇Π中作用1分鐘、95%乙醇中作用5分鐘、80%乙醇中作用5分鐘；
[0026]4)用三蒸水浸泡清洗，除去酒精，操作兩次，每次5分鐘；
[0027]5)取適量檸檬酸鈉修復(fù)粉劑溶于超純水中，調(diào)節(jié)pH為6.0，在高壓鍋中加熱至沸騰，把組織芯片插在耐高溫的塑料切片架上，安放在高壓鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，關(guān)閉壓力閥，待壓力上升至開始噴氣后，計(jì)時(shí)2分鐘，把壓力鍋移離熱源，緩慢冷卻至室溫；
[0028]6)冷卻后取出組織芯片，用I3BS溶液(將I片I3BS片劑溶于10ml超純水中，得到I XPBS溶液)沖洗兩次，每次5分鐘；
[0029 ] 7 )用3%的H2O2 (一份30%的H202+9份純甲醇，現(xiàn)配現(xiàn)用)封閉1分鐘；
[0030]8)用PBS沖洗兩次，每次5分鐘，然后用正常兔血清封閉20分鐘，用濾紙吸干，不需沖洗；
[0031 ] 9)用PBS稀釋抗體(HIW1.1: 200)，濕盒加入適量一抗，4°C過夜；
[0032]10)室溫平衡30分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘；
[0033]11)在濕盒內(nèi)滴加生物素標(biāo)記二抗，溫室撫育15分鐘；
[0034]12)用PBS沖洗3次，每次5分鐘，然后向濕盒內(nèi)滴加鏈酶親和素-過氧化物酶復(fù)合物，溫室撫育15分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘；
[0035]13)DAB(DAB稀釋液:DAB底物儲(chǔ)存液:穩(wěn)定的過氧化物酶:DAB增色液=17:1:1:1的比例配制得到新鮮的DAB顯色液)顯色:室溫顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)成功后自來水下沖洗；
[0036]14)用即用型蘇木素染色液染核4分鐘后，再用鹽酸乙醇分化20秒，最后在自來水下沖洗干凈；
[0037]15)PBS 反藍(lán) 3 分鐘；
[0038]16)梯度酒精脫水，依次在75%酒精、80%酒精、95%酒精、100%酒精、100%酒精中各浸泡5分鐘，然后依次在二甲苯(透明)、二甲苯1、二甲苯Π各浸泡10分鐘；
[0039]17)中心樹膠封片后在顯微鏡下進(jìn)行圖像采集。
[0040]陰性對(duì)照是以未免疫的山羊血清代替一抗，染色與上述免疫組化步驟同步進(jìn)行，觀察和對(duì)照切片的染色結(jié)果。
[0041]基因TGF-βΙ表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，基因p57kip2呈低水平表達(dá)狀態(tài)，二者可以作為食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的重要指標(biāo)，能夠據(jù)此得出與食管鱗癌的惡性程度和預(yù)后相關(guān)的多個(gè)指標(biāo)，為臨床治療提供重要依據(jù)。
[0042]本實(shí)用新型在試劑盒的結(jié)構(gòu)上進(jìn)行改進(jìn)，能將上下層試劑盒分離，且無需將上層試劑盒移至實(shí)驗(yàn)臺(tái)，不占據(jù)較多的實(shí)驗(yàn)空間，對(duì)試劑管的取放方便;通過彈性定位圈使試劑管的固定效果更好，避免試劑管晃動(dòng)。使用本實(shí)用新型試劑盒內(nèi)的試劑能進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)P57kip2和TGF-βΙ的表達(dá)，從而判斷食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展情況。
[0043]最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本實(shí)用新型的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本實(shí)用新型權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于檢測(cè)P57kip2和TGF-m判斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的試劑盒，其特征在于:所述的基于檢測(cè)P57kip2和TGF-βΙ判斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的試劑盒為長(zhǎng)方體硬質(zhì)塑料盒，包括盒體及設(shè)置在盒體開口處的盒蓋，所述的盒蓋邊緣設(shè)有密封墊，所述盒體內(nèi)垂直設(shè)置有四根伸縮套桿Π，伸縮套桿Π內(nèi)套設(shè)有伸縮套桿I，盒體內(nèi)穿過四根伸縮套桿Π設(shè)置有隔板，四根伸縮套桿I的自由端均與滑塊固定連接，滑塊設(shè)置在滑槽內(nèi)，所述的滑槽開設(shè)在上盒體I和上盒體Π的前后兩側(cè)，上盒體I和上盒體Π的上端面以及隔板上均開設(shè)有容納孔，且容納孔上設(shè)有定位圈，上盒體I和上盒體Π的上端面兩側(cè)設(shè)有拉環(huán)，盒體底部以及上盒體I和上盒體Π的底部均設(shè)有泡沫墊，泡沫墊上設(shè)有弧形的凹槽，凹槽與容納孔對(duì)應(yīng)設(shè)置。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于檢測(cè)P57kip2和TGF-βΙ判斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的試劑盒，其特征在于:所述的盒體與伸縮套桿Π —體成型，盒體的尺寸設(shè)置滿足上盒體I和上盒體Π完全容納在盒體內(nèi)的要求。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于檢測(cè)P57kip2和TGF-βΙ判斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的試劑盒，其特征在于:所述的定位圈為錐形彈性圈。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于檢測(cè)P57kip2和TGF-βΙ判斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的試劑盒，其特征在于:所述上盒體I的容納孔內(nèi)設(shè)置有一抗試劑管、正常兔血清封閉液試劑管、生物素標(biāo)記二抗試劑管、鏈酶親和素-過氧化物酶復(fù)合物試劑管、對(duì)照一抗試劑管;所述上盒體Π的容納孔內(nèi)設(shè)置有DAB稀釋液試劑管、DAB底物儲(chǔ)存液試劑管、穩(wěn)定的過氧化物酶試劑管、DAB增色液試劑管;所述隔板上的容納孔內(nèi)設(shè)置有檸檬酸鈉修復(fù)粉劑試劑管、PBS片劑試劑管、即用型蘇木素染色液、30%H202試劑管、甲醇試劑管、鹽酸乙醇試劑管。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于檢測(cè)P57kip2和TGF-βΙ判斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的試劑盒，其特征在于:所述的一抗試劑管內(nèi)的一抗為羊抗人HIWI多克隆抗體及鼠單克隆抗體，對(duì)照一抗試劑管內(nèi)的對(duì)照一抗是未免疫的山羊血清。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK205506840SQ201620272111
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月5日
【發(fā)明人】王延朋, 曹宛雅, 王栓鐸, 尹先哲, 劉麗娜
【申請(qǐng)人】南陽市第二人民醫(yī)院