專利名稱：一種煙草黑脛病抗性的苗期鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物抗病性鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及煙草黑脛病抗性的鑒定，特別是涉及一種對煙草黑脛病抗性進行苗期鑒定的方法。

背景技術(shù)：
煙草黑脛病，俗稱“腰爛”、“穿大褂”、“發(fā)瘟”、“地下癥”等，是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的煙草病害。1896年首次發(fā)現(xiàn)于印尼的爪哇，1924年以后，全世界溫帶、亞熱帶和熱帶的產(chǎn)煙區(qū)都有該病報道，至今只有津巴布韋尚無記載。1950年我國在黃淮煙區(qū)首次發(fā)現(xiàn)煙草黑脛病。目前，我國平均每年的發(fā)病作物面積高達76373hm2，直接經(jīng)濟損失超過1.23億元人民幣。因此，如何提高現(xiàn)有煙草品種的抗病能力，培育出具有高抗病能力的煙草品種，就成為目前該領(lǐng)域研究的熱點。
作為品種選育的關(guān)鍵，現(xiàn)有的煙草抗性鑒定方法主要有室內(nèi)離體葉片接種法和自然誘發(fā)抗性鑒定法。室內(nèi)離體葉片接種法雖然簡單易行，但是其鑒定的結(jié)果只能反映離體葉片對病害的抗擴展能力，無法反映品種的實際抗性，只能作為抗性劃分的參考指標(biāo)。自然誘發(fā)抗性鑒定方法雖然可以反映品種的自然抗病能力，但是該方法易受種植條件和氣候的影響，同一品種在不同煙區(qū)鑒定的結(jié)果會存在較大差異。同時，由于煙草黑脛病對溫濕度條件非常敏感，只有在高溫、高濕環(huán)境下(28～32℃、相對濕度80％以上)才能迅速蔓延。當(dāng)測試年份間的環(huán)境條件不利于病害發(fā)生時，該方法無法得到準(zhǔn)確地測定結(jié)果。
隨后出現(xiàn)的大田病圃人工誘發(fā)鑒定方法，雖然通過建立病圃，人工定量接種病原菌，模擬自然發(fā)病條件等手段提高了測試的準(zhǔn)確性，但是依然無法從根本上解決外部環(huán)境對鑒定結(jié)果的影響。同時，病原菌接種的量及接種時間等因素都會對最終的結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，該方法還存在鑒定品種及數(shù)量有限，鑒定結(jié)果易發(fā)生波動等問題。而且該方法從育苗到鑒定的完成需要將近195天，鑒定時間過長。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種煙草黑脛病抗性的苗期鑒定方法，用苗期鑒定結(jié)果替代傳統(tǒng)大田鑒定結(jié)果，避免外部環(huán)境對鑒定結(jié)果的影響，提高煙草黑脛病抗性鑒定的準(zhǔn)確性，縮短鑒定時間。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。
一種煙草黑脛病抗性的苗期鑒定方法，包括以下順序的步驟 1.病原菌分離 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入利福平原液，制成利福平培養(yǎng)基備用；采集煙草黑脛病癥狀典型的感病煙莖，取病莖表皮疑病組織數(shù)塊，切成長1～2cm的小塊，置于利福平培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)、純化后得到煙草黑脛病菌絲體，在室溫條件下，保存于滅菌蒸餾水中備用； 所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為燕麥培養(yǎng)基。
所述的利福平培養(yǎng)基中利福平原液的體積百分比含量為1.3％。
2.黑脛病接種體的制備 將煙草黑脛病菌絲體移入燕麥培養(yǎng)液中培養(yǎng)5～7天后，轉(zhuǎn)入菌谷培養(yǎng)基上培養(yǎng)18～20天得到黑脛病接種體； 所述的菌谷培養(yǎng)基的制作方法為將谷子浸泡6小時后用清水洗凈，淘盡干癟空殼谷粒，煮至谷粒炸開成半開花狀，冷卻晾至谷子含水量為50％～60％后分裝入三角瓶中，并在115℃下高壓滅菌1小時即得； 三角瓶中裝入的谷粒量以不超過3/4瓶為宜； 3.病圃設(shè)計及管理 將苗齡45～55天的待鑒定煙苗移栽至溫室病圃，煙苗在病圃內(nèi)隨機排列，設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)植煙10株，按常規(guī)溫室管理技術(shù)進行管理；以小黃金1025為感病對照，紅花大金元為感病輔助對照，金星6007為中抗對照，革新3號為抗病對照； 4.菌谷接種 煙苗移栽5～7天后，將經(jīng)步驟(2)培養(yǎng)得到的接種體接種至待測煙苗的莖基部，接種量為0.5g/株；接種后立即覆土并灌水15～20cm，保持24～48小時。
5.鑒定與分級 在溫室病圃中，分別于接種后的第5天、第7天和第10天各記錄一次病指，以三次病指的平均值作為測試品種的抗性指標(biāo)；進而按國家標(biāo)準(zhǔn)對鑒定品種進行分級。
本發(fā)明率先提出一種具有實用價值的煙草黑脛病苗期鑒定方法，實現(xiàn)了用苗期鑒定結(jié)果替代傳統(tǒng)大田鑒定結(jié)果，有效避免外部環(huán)境對鑒定結(jié)果的影響，提高了煙草黑脛病抗性鑒定的準(zhǔn)確性。試驗表明，從育苗到鑒定完成只需65天左右，大幅度地縮短了鑒定時間。該方法操作簡便，成本低廉，鑒定結(jié)果真實可靠，具有良好的市場應(yīng)用前景。



圖1為不同抗性品種接種黑脛病5、7、10天的病指變化趨勢圖。

具體實施例方式 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但他們不是對本發(fā)明的限定。
實施例1 取醫(yī)用利福平膠囊21粒加95％乙醇100ml，并加入1NNaOH數(shù)滴至溶解，制成3000ug/ml(利福平含量)的利福平原液，置于4℃冰箱中保存。在每150ml燕麥培養(yǎng)基中加入2ml利福平原液混合均勻，制成利福平培養(yǎng)基備用。采集煙草黑脛病癥狀典型的感病煙莖，取病莖表皮疑病組織數(shù)塊，切成長1cm的小塊，置于利福平培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)、純化后得到煙草黑脛病菌絲體，在室溫條件下，保存于滅菌蒸餾水中備用。將谷子浸泡6小時后用清水洗凈，淘盡干癟空殼谷粒，煮至谷粒炸開成半開花狀，冷卻晾至谷子含水量為50％后分裝入500ml三角瓶中，裝入的谷粒量以不超過500ml刻度線為宜，在115℃下高壓滅菌1小時制得菌谷培養(yǎng)基備用。將煙草黑脛病菌絲體移入燕麥培養(yǎng)液中培養(yǎng)5天后，再轉(zhuǎn)入菌谷培養(yǎng)基上培養(yǎng)18天得到黑脛病接種體。將苗齡50天的待鑒定煙苗移栽至溫室病圃，煙苗在病圃內(nèi)隨機排列，設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)植煙10株，按常規(guī)溫室管理技術(shù)進行管理。以小黃金1025為感病對照，紅花大金元為感病輔助對照，金星6007為中護對照，革新3號為抗病對照。煙苗移栽5天后，將接種體接種至待測煙苗的莖基部，接種量為0.5g/株。接種后立即覆土并灌水15cm，保持24小時。在溫室病圃中，分別于接種后的第5天、第7天和第10天各記錄一次病指，以三次病指的平均值作為測試品種的抗性指標(biāo)。按國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T39-1996將鑒定品種抗性劃分為四級抗病(R)病指25以下；中抗(MR)；病指在25.1-50.0；中感(MS)病指在50.1-75.0；感病(S)病指75以上。
實施例2 重復(fù)實施例1，有以下不同點煙草黑脛病菌絲體在燕麥培養(yǎng)液中培養(yǎng)6天。
實施例3 重復(fù)實施例1，有以下不同點煙草黑脛病菌絲體在燕麥培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天。
實施例4 重復(fù)實施例1，有以下不同點煙草黑脛病菌絲體在菌谷培養(yǎng)基中培養(yǎng)19天。
實施例5 重復(fù)實施例1，有以下不同點煙草黑脛病菌絲體在菌谷培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天。
實施例6 重復(fù)實施例1，有以下不同點將苗齡45天的待鑒定煙苗移栽至溫室病圃。
實施例7 重復(fù)實施例1，有以下不同點將苗齡55天的待鑒定煙苗移栽至溫室病圃。
實施例8 重復(fù)實施例1，有以下不同點煙苗移栽6天后，將接種體接種至待測煙苗的莖基部。
實施例9 重復(fù)實施例1，有以下不同點煙苗移栽7天后，將接種體接種至待測煙苗的莖基部。
實施例10 重復(fù)實施例1，有以下不同點煮好的谷子冷卻晾至含水量為55％。
實施例11 重復(fù)實施例1，有以下不同點煮好的谷子冷卻晾至含水量為60％。
實施例12 重復(fù)實施例1，有以下不同點接種后立即覆土并灌水18cm，保持36小時。
實施例13 重復(fù)實施例1，有以下不同點接種后立即覆土并灌水20cm，保持48小時。
實驗例1 1.實驗條件 ①參試品種全國區(qū)試、云南省區(qū)試的27份品種，詳見表1。以小黃金1025為感病對照，紅花大金元為感病輔助對照，金星6007為中抗對照，革新3號為抗病對照。
②實驗地點云南煙草科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)研究所基地溫室黑脛病病圃。
③黑脛病接種體的制備將分離純化的煙草黑脛病菌株(編號為P0402)移入燕麥培養(yǎng)液中搖床培養(yǎng)，7天后轉(zhuǎn)入菌谷培養(yǎng)基上培養(yǎng)18天備用。菌谷的制作將谷子浸泡6小時后用清水洗凈，煮至谷粒炸開成半開花狀，冷卻晾至半干，分裝入500ml三角瓶中高壓滅菌1小時(115℃)。裝入的谷粒量以不超過三角瓶500ml刻度線為宜。
④黑脛病溫室病圃實驗設(shè)計及管理各鑒定品種在溫室病圃隨機排列，3次重復(fù)，每重復(fù)植煙10株，按常規(guī)技術(shù)進行溫室管理。
⑤黑脛病接種將苗齡50天的煙苗移栽至溫室病圃，移栽后5天后接種菌谷，將培養(yǎng)18天的菌谷接種至煙株的莖基部，接種量為0.5g/株。接種后立即覆土并保濕，使病圃內(nèi)土壤處于飽和或過飽和狀態(tài)。
⑥鑒定于接種后5、7、10天各調(diào)查一次病情，以三次病指的平均值作為測試品種的抗性指標(biāo)。
⑦分級按國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T39-1996將品種的抗性劃分為四級抗病(R)病指25以下；中抗(MR)；病指在25.1-50.0；中感(MS)病指在50.1-75.0；感病(S)病指75以上。
⑧對比實驗組采用人工誘導(dǎo)大田成株期抗性鑒定方法，菌谷接種量為5g/株，且分別在兩塊病圃田內(nèi)進行創(chuàng)傷和不創(chuàng)傷接種試驗，鑒定結(jié)果與苗期鑒定對比，詳見表1。其中創(chuàng)傷試驗是指接種時用無菌小刀刺傷莖基表皮。
表1 黑脛病苗期與大田成株期抗性鑒定結(jié)果對比 續(xù)表1 2.結(jié)果分析溫室鑒定結(jié)果與大田不創(chuàng)傷接種的鑒定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為R2＝0.9609，溫室鑒定結(jié)果與大田創(chuàng)傷接種的鑒定結(jié)果之間的相關(guān)系數(shù)為R3＝0.8148，查相關(guān)系數(shù)顯著性測驗表，R1、R2、R3在1％水平上均達顯著正相關(guān)，且相關(guān)性非常顯著。
從以上鑒定結(jié)果可以看出，當(dāng)苗期接種量為0.5g/株時與大田接種量為5g/株時的鑒定結(jié)果趨于一致，完全可以用苗期鑒定結(jié)果代替大田鑒定結(jié)果。
實驗例2 1.實驗條件 ①參試品種本項目組提供的50份種質(zhì)資源，品種名稱見表2。
②試驗時間與地點2004～2005年在云南省煙草科學(xué)研究所基地溫室黑脛病病圃。
③抗病性鑒定方法 各品種均設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)10株，隨機排列。以小黃1025為感病對照，紅花大金元為感病輔助對照，金星6007為中抗對照，革新3號為抗性對照。鑒定時采用莖基部菌谷接種法，將苗齡50天的煙苗移栽至溫室病圃內(nèi)，移栽后5天接種，將培養(yǎng)18天的菌谷按0.5g/株的接種量接種于煙苗的莖基部，并及時覆土保濕，接種后分別于第5天、第7天和第10天調(diào)查病情，以5、7、10天調(diào)查的平均病指作為抗性劃分標(biāo)準(zhǔn)。
④病害及抗性分級標(biāo)準(zhǔn) 病害調(diào)查時，病情嚴(yán)重度分級按國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T39-1996規(guī)定執(zhí)行；根據(jù)病害嚴(yán)重度及對照品種的發(fā)病情況，按最后確定的病指，一般將病害分為以下四級抗病(R)病指25以下；中抗(MR)；病指在25.1-50.0；中感(MS)病指在50.1-75.0；感病(S)病指75以上。
2.結(jié)果與分析 ①種質(zhì)資源抗黑脛病鑒定結(jié)果 鑒定結(jié)果表明抗黑脛病(R)種質(zhì)有13份，中抗黑脛病(MR)種質(zhì)有25份；50份材料中，有76％的種質(zhì)資源對黑脛病的抗性水平表現(xiàn)為中抗以上；有10份種質(zhì)對該病表現(xiàn)為中感(MS)，2份種質(zhì)表現(xiàn)為感病(S)，感病品種占的比例較少。鑒定結(jié)果詳見表2及表3。
表2 種質(zhì)資源抗黑脛病鑒定結(jié)果 續(xù)表2 表3 供試的種質(zhì)資源對煙草黑脛病病害的抗病性鑒定結(jié)果統(tǒng)計表 ②不同抗性品種接種黑脛病5天、7天、10天后的病指變化。
對第5、7、10天的病指進行比較分析發(fā)現(xiàn)用第7天的病指與第5天的病指相減時，兩者的病指差值在10以下的品種占參試品種的66％，其中抗病品種(R)有13份，占抗病品種總數(shù)的100％；中抗品種(MR)有16份，占中抗品種總數(shù)的64％；中感品種(MS)有2份，占中感品種總數(shù)的20％，感病品種(S)有2份，占感病品種總數(shù)的100％。差值在10以上的品種占參試品種的34％，且均為中抗、中感品種，其中中抗品種(MR)有9份，占中抗品種總數(shù)的36％；中感品種(MS)有8份，占中感品種總數(shù)的80％。
全部的抗病品種(R)及感病品種(S)在第5～7天的病指差值均在10以下；而差值在10以上的中抗及中感品種中，雖然中抗及中感品種相當(dāng)，但有80％的中感品種在本次鑒定中病指差值在10以上，說明中感品種對黑脛病的反應(yīng)比較敏感，在接種該病后的第5～7天之間的病指變化較大。結(jié)果詳見表4。表4 不同抗性品種接種黑脛病后5d的病指與7d的病指變化分析 續(xù)表4 用10天的病指與7天的病指相減時兩者的病指差值在10以下的品種占參試品種的64％，其中抗病品種(R)有13份，占抗病品種總數(shù)的100％；中抗品種(MR)有11份，占中抗品種總數(shù)的44％；中感品種(MS)有7份，占中感品種總數(shù)的70％；感病品種(S)有1份，占感病品種總數(shù)的50％。差值在10以上的品種占參試品種的36％，且均為中抗、中感及感病品種，其中中抗品種(MR)有14份；占中抗品種總數(shù)的56％；中感品種(MS)有3份，占中感品種總數(shù)的30％；感病品種(S)有1份，占感病品種總數(shù)的50％。
全部的抗病品種及70％的感病品種在第7～10天的病指差值在10以下，中抗及感病品種的比例較低；而差值在10以上的品種中，有56％的中抗品種，且份數(shù)也最多，達14份；雖然有50％的感病品種病指差值在10以上，但僅有1份感病品種，份數(shù)相比較少。結(jié)果詳見表5。 表5 不同抗性品種接種黑脛病后7d的病指與10d的病指變化分析 續(xù)表5 用10天的病指與5天的病指相減時兩者的病指差值在10以下的品種占參試品種的64％，其中抗病品種(R)有13份，占抗病品種總數(shù)的100％；中抗品種(MR)有15份，占中抗品種總數(shù)的60％；中感品種(MS)有2份，占中感品種總數(shù)的20％；感病品種(S)有2份，占感病品種的100％。差值在10以上的品種占參試品種的36％，且均為中抗、中感品種，其中中抗品種(MR)有10份，占中抗品種總數(shù)的40％；中感品種(MS)有8份，占中感品種總數(shù)的80％。
全部的抗病品種(R)及感病品種(S)在第5～10天的病指差值均在10以下；而差值在10以上的中抗及中感品種中，80％的中感品種在本次鑒定中病指差值在10以上，說明中感品種對黑脛病的反應(yīng)比較敏感，在接種該病后的第5～10天之間的病指變化仍然較大。結(jié)果詳見表6。
表6 不同抗性品種接種黑脛病后5d的病指與10d的病指變化分析 續(xù)表6 綜合分析，三次差值均在10以下的有24份，占參試品種的48％，其中抗病品種(R)有13份，中抗品種(MR)有8份，中感品種(MS)有2份，感病品種(S)有1份；三次差值均在10以上的有9份，占參試品種的18％，且均為中抗、中感品種，其中中抗(MR)有6份，中感品種(MS)有3份。
7天的病指與5天的病指相減時病指差值沒有變化的有2份Cokertobacco和COM煙，均為抗病品種(R)，病指差值變化最大的是H8，為中感品種(MS)；10天的病指與7天的病指相減時病指變化最小的有2份中感品種TN86，抗病品種Coker tobacco。變化最大的是中感品種H1；10天的病指與5天的病指相減時差值變化最小的是仍是抗病品種Coker tobacco，差值變化最大的是中感品種H8。結(jié)果如圖1所示。
權(quán)利要求
1、一種煙草黑脛病抗性的苗期鑒定方法，包括以下順序的步驟
①病原菌分離
在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入利福平原液，制成利福平培養(yǎng)基備用；采集煙草黑脛病癥狀典型的感病煙莖，取病莖表皮疑病組織數(shù)塊，切成長1～2cm的小塊，置于利福平培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)、純化后得到煙草黑脛病菌絲體，在室溫條件下，保存于滅菌蒸餾水中備用；
②黑脛病接種體的制備
將煙草黑脛病菌絲體移入燕麥培養(yǎng)液中培養(yǎng)5～7天后，轉(zhuǎn)入菌谷培養(yǎng)基上培養(yǎng)18～20天得到黑脛病接種體；
③病圃設(shè)計及管理
將苗齡45～55天的待鑒定煙苗移栽至溫室病圃，煙苗在病圃內(nèi)隨機排列，設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)植煙10株，按常規(guī)溫室管理技術(shù)進行管理；以小黃金1025為感病對照，紅花大金元為感病輔助對照，金星6007為中抗對照，革新3號為抗病對照；
④菌谷接種
煙苗移栽5～7天后，將經(jīng)步驟(2)培養(yǎng)得到的接種體接種至待測煙苗的莖基部，接種量為0.5g/株；接種后立即覆土并并灌水15～20cm，保持24～48小時；
⑤鑒定與分級
在溫室病圃中，分別于接種后的第5天、第7天和第10天各記錄一次病指，以三次病指的平均值作為測試品種的抗性指標(biāo)；進而按國家標(biāo)準(zhǔn)對鑒定品種進行分級。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗性鑒定方法，其特征在于步驟(1)所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為燕麥培養(yǎng)基。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗性鑒定方法，其特征在于步驟(1)所述的利福平培養(yǎng)基中利福平原液的體積百分比含量為1.3％。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗性鑒定方法，其特征在于步驟(2)所述的菌谷培養(yǎng)基由下述方法制成將谷子浸泡6小時后用清水洗凈，淘盡干癟空殼谷粒，煮至谷粒炸開成半開花狀，冷卻晾至谷子含水量50％～60％后分裝入三角瓶中，并在115℃下高壓滅菌1小時即得。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗性鑒定方法，其特征在于三角瓶中裝入的谷粒量不超過3/4瓶。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗性鑒定方法，其特征在于步驟(4)所述的接種為創(chuàng)傷或不創(chuàng)傷接種。
7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗性鑒定方法，其特征在于步驟(4)所述的接種優(yōu)選為不創(chuàng)傷接種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙草黑脛病抗性的苗期鑒定方法，從感病煙莖上分離病原菌，經(jīng)純化、培養(yǎng)后得到黑脛病接種體。將接種體接種至待測煙苗的莖基部，并分別于接種后的第5天、第7天和第10天各記錄一次病指，以三次病指的平均值作為測試品種的抗性指標(biāo)。本發(fā)明率先實現(xiàn)了用苗期鑒定結(jié)果替代傳統(tǒng)大田鑒定結(jié)果，有效避免外部環(huán)境對鑒定結(jié)果的影響，提高了煙草黑脛病抗性鑒定的準(zhǔn)確性。該方法從育苗到鑒定完成只需65天左右，大幅度地縮短了鑒定時間。其操作簡便，成本低廉，鑒定結(jié)果真實可靠，具有良好的市場應(yīng)用前景。
文檔編號A01G7/00GK1922965SQ200610048658
公開日2007年3月7日 申請日期2006年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月5日
發(fā)明者盧秀萍, 李永平, 白永富, 肖炳光, 李德團 申請人:云南省煙草科學(xué)研究所