專利名稱：赤松(Pinus densiflora)組織培養(yǎng)增殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是指赤松組織培養(yǎng)增殖方法。
背景技術(shù)：
松屬(尸/wm)是針葉樹各屬中最大也是最重要的一個屬，大約有116個種以及變種和雜 種，在世界上分布、種植極為廣泛，不僅在世界木材、松脂及造紙等方面有突出貢獻(xiàn)，而且 在生態(tài)系統(tǒng)中具有非常重要的地位。由于受各種病蟲害的危害，每年均有大量松樹枯死，其 中，受松材線蟲病(Sw^a/^e/^c/u^矽/o/^z7z^)危害最為嚴(yán)重。該病目前已導(dǎo)致日本松林總 面積266萬hm2中的45萬hm2發(fā)病，損失十分慘重。在我國，因松材線蟲病造成枯死的松樹 累計已達(dá)5000萬余株，直接經(jīng)濟(jì)損失25億元，間接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)250億元，且還在以每年6000 hi^的速度擴(kuò)散蔓延，對林業(yè)生產(chǎn)、森林資源和生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的破壞。
赤松為松屬的一個種，分布于我國華東及北部沿海地區(qū)以及日本、朝鮮、蘇聯(lián)。通常被 栽植為建筑用材、制槳用材或庭蔭樹、行道樹、防潮林、風(fēng)景林。該樹種是最容易感染松材 線蟲病的樹種之一。在日本，由于受松材線蟲的嚴(yán)重危害，赤松大量枯死。在中國、韓國， 赤松同樣受到松材線蟲病的嚴(yán)重威脅。為了挽救瀕危的鄉(xiāng)土樹種，日本林業(yè)工作者通過在病 害嚴(yán)重發(fā)生地選育抗病單株等方式建立了赤松抗病種子園。然而，抗病種子產(chǎn)量非常有限， 難以滿足大規(guī)模林業(yè)生產(chǎn)的需要。為此，迫切需要尋求能夠快速、大量繁殖現(xiàn)有抗病材料的 有效途徑。
植物組織培養(yǎng)作為一種可替代的無性繁殖方法，在農(nóng)作物、花卉及速生樹種例如桉樹的 良種繁育中得到了廣泛的應(yīng)用，在許多針葉樹中亦被證明是可行的。據(jù)初步統(tǒng)計，到目前為 止，各國學(xué)者已對松屬的60多個種或變種、雜種進(jìn)行了組織培養(yǎng)，近40個獲得了再生成植 株，其中我國學(xué)者沈熙環(huán)、黃健秋等對松屬的15個種進(jìn)行了研究，8個種獲得了再生植株。 盡管松屬樹種的組織培養(yǎng)倍受各國學(xué)者重視，但是由于難度較大，現(xiàn)有的組織培養(yǎng)方法中存 在增殖系數(shù)低、玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重、難以長期繼代培養(yǎng)等問題，使眾多研究僅停留于植株再生 過程的完成，而對中間繁殖體的長期繼代、大量增殖少有研究，造成能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的樹 種鳳毛麟角。
有關(guān)赤松組織培養(yǎng)的報道較少。Isikawa (1987)研究了赤松下胚軸和幼苗根尖的器官分 化情況，僅在胚軸上發(fā)現(xiàn)有不定根的形成；Choi等(1993)對赤松幼苗器官發(fā)生進(jìn)行了研究， 獲得少量完整植株；Maruyama等(2005)、 Shoji等(2006)分別用未成熟胚誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚 胎，并獲得再生植株，但存在胚性愈傷誘導(dǎo)率、體胚轉(zhuǎn)化率極低等問題。目前國內(nèi)尚未有關(guān) 于赤松組織培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生的報道
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明主要針對抗松材線蟲病赤松成熟種子珍貴而稀少、且赤松組織培養(yǎng)增 殖系數(shù)低、大量擴(kuò)繁難的問題，研究發(fā)明一種赤松組織培養(yǎng)增殖方法，以滿足社會生產(chǎn)需要。
技術(shù)方案 一種赤松組織培養(yǎng)增殖方法，包括以下步驟
1、 將赤松無菌萌發(fā)3 4周的幼苗子葉節(jié)(含子葉及剛萌動的上胚軸和6 8mm下胚軸) 接種于含有6-芐基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)的基本培養(yǎng)基GD(Gresshoff and Doy medium, 1972)上，誘導(dǎo)子葉基部產(chǎn)生叢生芽；
2、 將外植體連同已分化的叢生芽轉(zhuǎn)入含有活性炭(AC)或NAA的基本培養(yǎng)基DCR( Gupta andDurzanmedium, 1985)中，促進(jìn)叢生芽伸長；
3、 選取生長健壯、長1.5 2.0cm的叢生芽單個切割下來，切去莖尖生長點(diǎn)并將其切割成 長5 8mm的小段，接種至含有6-BA和NAA的基本培養(yǎng)基GD中，誘導(dǎo)叢生芽增殖。
步驟3增殖產(chǎn)生的叢生芽再轉(zhuǎn)入步驟2所述的培養(yǎng)基中促進(jìn)其伸長，然后重復(fù)步驟3， 循環(huán)往復(fù)，可獲得大量叢生芽，從而實現(xiàn)叢生芽的大量增殖。步驟2、步驟3繼代周期各為 4~5周。
以上各步驟培養(yǎng)條件為溫度23 25 °C，光照強(qiáng)度2000 Lux，每日光照16 h。
其中，在步驟1中所述誘導(dǎo)子葉基部產(chǎn)生叢生芽的培養(yǎng)基中6-BA的濃度為3.0-5.0 mg/L， NAA的濃度為0.1~0.3 mg/L。
在步驟2中當(dāng)將外植體連同已分化的叢生芽接入含有AC的DCR培養(yǎng)基上時，AC的濃 度為0.5~1.5 g/L;接入含有NAA的DCR培養(yǎng)基上時，NAA的濃度為0.1-0.3 mg/L。
在步驟3中所述誘導(dǎo)叢生芽增殖的培養(yǎng)基中6-BA的濃度為1.5-2.5 mg/L， NAA的濃度 為0.25 mg/L。
有益效果本發(fā)明以赤松無菌幼苗的子葉節(jié)為外植體，誘導(dǎo)子葉基部產(chǎn)生叢生芽，叢生
芽伸長后將其莖尖生長點(diǎn)摘除，進(jìn)而切割成5-8 mm長的小段，使腋芽從頂端優(yōu)勢的抑制下 釋放出來，形成叢生芽；增殖培養(yǎng)與伸長培養(yǎng)交替進(jìn)行的繼代方式克服了組織培養(yǎng)過程中的 玻璃化現(xiàn)象，使得材料能夠長期繼代，從而能夠大量增殖。與選用子葉、成熟胚等外植體誘 導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽相比，本發(fā)明誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽更健壯、生長更迅速，縮短了培養(yǎng)周期，而 且遺傳性狀穩(wěn)定，不易產(chǎn)生變異。通過本方法，叢生芽每8 10周可增殖一次，且增殖系數(shù)始 終保持在3.5~4.6， 一粒種子2年后可增殖出2 3萬株可用于生根的組培苗，為實現(xiàn)抗病材料 的大規(guī)模、短周期、高繁殖率的工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
具體實施例方式
下面的實施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1:
選取從日本引進(jìn)的抗松材線蟲病赤松1#、 /優(yōu)樹成熟種子，置于4 r低溫下處理4周，
4取出用0.1%高錳酸鉀預(yù)處理12 h，流水沖洗lh，沖洗完畢后，在無菌條件下剝除種殼，經(jīng) 70%乙醇表面消毒30 s后置于0.1%升汞浸泡2 min，用無菌水沖洗4~5次后，移入培養(yǎng)基中 培養(yǎng)成無菌苗備用。
挑選萌發(fā)3 4周的無菌幼苗，在子葉下6~8 mm處將下胚軸切去，子葉節(jié)(含子葉及剛 萌動的上胚軸和6-8 mm下胚軸)作為外植體，接種于GD+6-BA3.0-5.0 mg/L+NAA0.1~0.3 mg/L培養(yǎng)基中，4 5周后，將外植體連同已分化的叢生芽轉(zhuǎn)入DCR+AC 0.5~1.5 g/L培養(yǎng)基中， 促進(jìn)芽的伸長，供增殖試驗使用。
將上述長1.5-2.0 cm的叢生芽分別單個切下，切去莖尖生長點(diǎn)后將其切割為5~8 mm小 段，接種于GD+6-BA1.5 2.5 mg/L+NAA0.25 mg/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽增殖；4~5周后，將 增殖產(chǎn)生的叢生芽再轉(zhuǎn)入DCR+AC 0.5-1.5 g/L培養(yǎng)基中促進(jìn)芽的伸長。叢生芽伸長后再進(jìn)行 新一輪增殖。
以上叢生芽增殖、伸長的繼代周期分別為4~5周，循環(huán)往復(fù)，每8 10周叢生芽增殖一次， 2年后，平均一粒種子增殖出可用于生根的組培苗20000~30000株。
培養(yǎng)條件溫度23 25 。C，光照強(qiáng)度2000 Lux，每日光照16 h。
實施例2:
選取從日本引進(jìn)的抗松材線蟲病赤松5#、 16#優(yōu)樹成熟種子，在實施例l的基礎(chǔ)上，將 促進(jìn)叢生芽伸長的培養(yǎng)基更換為DCR+NAA0.1-0.3 mg/L，其余步驟同實施例1，也取得了與 實施例l相當(dāng)?shù)男Ч?br> 下面一些具體的實驗情況將有助于說明本發(fā)明所述赤松組織培養(yǎng)增殖方法所用的配方、 外植體切割方式及繼代方式的有效性，所有試驗至少重復(fù)3次。
第一，激素對赤松叢生芽增殖的影響
以GD為基本培養(yǎng)基，添加6-BA0.5~2.5 mg/L+NAA0.25 mg/L或者激動素(KT) 0.5~2.5 mg/L+NAA0.25 mg/L，比較不同激素組合對叢生芽增殖的影響。結(jié)果表明(表l)， 6-BA對 赤松叢生芽的增殖效果明顯，在添加6-BA1.5~2.5 mg/L的培養(yǎng)基中，增殖系數(shù)達(dá)3.5~4.6; 而在0.5 2.5mg/L濃度下，KT對叢生芽的增殖幾乎無效，響應(yīng)的外植體極少。
表1激素對赤松叢生芽增殖的影響
激素種類及濃度(mg/L)接種外植體數(shù)響應(yīng)外植體數(shù)(比例％)增殖系數(shù)
6-BAKTNAA0.5-0.25306 (20.0)0.3
1.5-0.253021 (70.0)3.5
2.5-0.253025 (83.3)4.6
-0.50.25300 (0)0
-1.50.25332 (6.1)0.06
-2.50.25304 (13.3)0.13
5第二，外植體切割方式對赤松叢生芽增殖和生長的影響
將未經(jīng)切割的完整單芽或?qū)窝壳懈畛? 8 mm小段，接種于GD+6-BA2.5 mg/L+NAA 0.25mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖。4-5周后結(jié)果表明(表2)，外植體切割方式對赤松叢生芽增殖 有一定的影響 一個長1.5-2.0 cm的芽未經(jīng)切割可獲得3~4倍的增長量，而如果將其切割成 2~3段，則增殖系數(shù)提高2 3倍，切割得太小則會導(dǎo)致玻璃化。
表2外植體切割方式對赤松叢生芽增殖和生長的影響
切割方式叢生芽增殖情況生長情況
完整單芽通常增殖3~4個芽單芽頂梢繼續(xù)生長，新增芽細(xì)弱
切割成4段(3~4mm)每段通常增殖3 4個芽，增殖系數(shù)提高4倍外植體及新增芽玻璃化嚴(yán)重
切割成3段(5~6mm)每段通常增殖3 4個芽，增殖系數(shù)提高3倍新增芽生長健壯
切割成2段(6~8mm)每段通常增殖3 4個芽，增殖系數(shù)提高2倍新增芽生長健壯
第三，繼代方式對赤松叢生芽增殖和生長的影響
組培苗增殖通常是將外植體連續(xù)繼代于含有6-BA的增殖培養(yǎng)基中，這種方式常常導(dǎo)致 組培苗的玻璃化，因此比較了不同繼代方式對赤松叢生芽增殖和生長的影響。首先將外植體 接種于所篩選出的叢生芽增殖培養(yǎng)基GD+6-BA2.5mg/L+NAA0.25mg/L (Ml)中，4~5周后 分別轉(zhuǎn)接到逐漸降低6-BA濃度的培養(yǎng)基(M2、 M3、 M4、 M5)或無任何激素但添加AC的 培養(yǎng)基(M6)中，4-5周后再轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基Ml中。結(jié)果顯示(表3):連續(xù)繼代于含有 較高濃度6-BA培養(yǎng)基中的叢生芽玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重；將增殖培養(yǎng)基中產(chǎn)生的叢生芽轉(zhuǎn)接于只 含NAA或AC的培養(yǎng)基中培養(yǎng)伸長后再進(jìn)行增殖的方式克服了玻璃化現(xiàn)象，即表3中的 M1-M5-M1或M1-M6-M1程序為適宜的繼代方式。
表3繼代方式對赤松叢生芽增殖和生長的影響
繼代方式增殖系數(shù)芽的長度(mm)芽的長勢
M卜M卜M17.32~380%的芽玻璃化(針葉墨綠、腫脹或細(xì)弱、皺縮巻曲)
M1-M2-M16.23~435%的芽玻璃化
M1-M3-M16.53~415。/。的芽玻璃化
M卜M4-M16.54~5叢生芽生長尚好，針葉粗短
M1-M5-M14.35~6叢生芽生長較好，針葉嫩綠挺拔
M1掘-M14,55~6叢生芽生長健壯，針葉嫩綠挺拔
注M2、 M3、 M4、 M5培養(yǎng)基中6-BA濃度分別為2.0、 1.0、 0.5、 Omg/L，其余與M1相同。
綜上所述，中間繁殖體的大量增殖是松屬樹種組織培養(yǎng)最重要的階段之一，往往成為規(guī) ?；a(chǎn)的主要瓶頸。本發(fā)明采用的增殖配方、外植體切割方式及增殖培養(yǎng)與伸長培養(yǎng)交替 進(jìn)行的繼代方式解決了赤松組織培養(yǎng)的長期繼代與增殖問題。
權(quán)利要求
1、一種赤松組織培養(yǎng)增殖方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)將赤松無菌萌發(fā)3～4周的幼苗子葉節(jié)(含子葉及剛萌動的上胚軸和6～8mm下胚軸)接種于含有6-芐基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)的基本培養(yǎng)基GD上，誘導(dǎo)子葉基部產(chǎn)生叢生芽；(2)將外植體連同已分化的叢生芽轉(zhuǎn)入含有活性炭(AC)或NAA的基本培養(yǎng)基DCR中，促進(jìn)叢生芽伸長；(3)選取生長健壯、長1.5～2.0cm的叢生芽單個切割下來，切去莖尖生長點(diǎn)并將其切割成5～8mm小段，接種至含有6-BA和NAA的基本培養(yǎng)基GD中，誘導(dǎo)叢生芽增殖。步驟(3)增殖產(chǎn)生的叢生芽再轉(zhuǎn)入步驟(2)所述的培養(yǎng)基中促進(jìn)其伸長，然后再重復(fù)步驟(3)，循環(huán)往復(fù)，可獲得大量叢生芽，從而實現(xiàn)叢生芽的大量增殖。步驟(2)、步驟(3)的繼代周期分別為4～5周。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的赤松組織培養(yǎng)增殖方法，其特征在于步驟(1)中所述誘導(dǎo)子 葉基部產(chǎn)生叢生芽的培養(yǎng)基中6-BA的濃度為3.0 5.0 mg/L， NAA的濃度為0.1-0.3 mg/L。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的赤松組織培養(yǎng)增殖方法，其特征在于步驟(2)中當(dāng)將外植體 連同已分化的叢生芽轉(zhuǎn)入含有AC的DCR培養(yǎng)基上時，AC的濃度為0.5-1.5 g/L。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的赤松組織培養(yǎng)增殖方法，其特征在于步驟(2)中當(dāng)將外植體 連同已分化的叢生芽轉(zhuǎn)入含有NAA的DCR培養(yǎng)基上時，NAA的濃度為0.1~0.3 mg/L。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的赤松組織培養(yǎng)增殖方法，其特征在于步驟(3)中所述誘導(dǎo)叢 生芽增殖的培養(yǎng)基中6-BA的濃度為1.5-2.5 mg/L， NAA的濃度為0.25 mg/L。
全文摘要
一種赤松組織培養(yǎng)增殖方法，該方法以赤松無菌幼苗子葉節(jié)(含子葉及剛萌動的上胚軸和6～8mm下胚軸)為外植體，接種于GD+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.1～0.3mg/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)子葉基部產(chǎn)生叢生芽；4～5周后將外植體連同已分化的叢生芽轉(zhuǎn)入添加活性炭或NAA的培養(yǎng)基中促進(jìn)芽的伸長；待叢生芽長達(dá)1.5～2.0cm時將其分別單個切下，并切割成5～8mm小段，接種于GD+6-BA1.5～2.5mg/L+NAA0.25mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)一步誘導(dǎo)叢生芽增殖。增殖的叢生芽經(jīng)過培養(yǎng)伸長后可再用于新一輪增殖。采用本發(fā)明，叢生芽增殖系數(shù)達(dá)3.5～4.6，一粒種子2年后可增殖出2～3萬株可用于生根的組培苗。
文檔編號A01H4/00GK101485291SQ200810019270
公開日2009年7月22日 申請日期2008年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日
發(fā)明者葉建仁, 吳小芹, 戴培培, 朱麗華 申請人:南京林業(yè)大學(xué)