專利名稱：植物多聚adp核糖聚合酶抑制劑在改善植物性狀中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物學(xué)和農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及植物多聚ADP核糖聚合酶抑制劑在改善植物性狀中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱是我國主要的自然災(zāi)害之一，干旱往往導(dǎo)致農(nóng)作物的大規(guī)模減產(chǎn)，是限制農(nóng)作物糧食產(chǎn)量的重要環(huán)境因素之一。為了減小干旱年份作物產(chǎn)量的損失，有效地利用有限的水資源，提高作物的抗旱性一直是農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究的主要目標(biāo)之一?？购涤N目前主要是通過雜交育種或者轉(zhuǎn)基因育種培養(yǎng)抗旱品系來達(dá)到，目前我國在這方面已經(jīng)投入大量資金，但見效較慢，而且對(duì)于每一個(gè)物種來說，由于植物生理形態(tài)差異以及種植條件差異， 都需要投入相應(yīng)的研究力量來展開研究，較為耗時(shí)耗力，因此發(fā)展抗旱育種上的新思路和新方法很重要(liu et al.，2006)。強(qiáng)壯發(fā)達(dá)的根系可提高作物的吸水能力，降低干旱的危害，因此根系發(fā)達(dá)程度常作為抗旱性鑒定指標(biāo)。根系發(fā)達(dá)程度如胚根數(shù)、根數(shù)、根干重、根長、根粗、根重、根的分布、 密度、根冠比等可作為抗旱指標(biāo)(景蕊蓮等，1995;張愛良等，1997)。除了吸收水分與營養(yǎng)外，根系還具有合成及分泌功能等。根系能分泌有機(jī)酸、酶、生物堿等物質(zhì)，對(duì)土壤中礦物質(zhì)、肥料的有效性產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響；能影響根際微生物的種類和數(shù)量；還能對(duì)土壤的重金屬離子以及其它有機(jī)污染物進(jìn)行環(huán)境修復(fù)。本發(fā)明提供了一類可以促進(jìn)植物根系生長并增強(qiáng)抗旱能力的新物質(zhì)3-AB及其類似物，它們是植物多聚ADP核糖化聚合酶[Poly (ADP ribosyl) Polymerase]的抑制劑，3_AB 處理后植物的冠根和側(cè)根生長旺盛，總根數(shù)增加，不僅如此，植株的生物量(鮮重)也同時(shí)增加了。對(duì)植物進(jìn)行抗干旱能力測定還發(fā)現(xiàn)3-AB幫助植物提高了抗旱能力。3-AB的結(jié)構(gòu)類似物具有相似活性。本發(fā)明可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上促進(jìn)植物根系生長以及增強(qiáng)植物抗旱性，使用方便、效果明顯，應(yīng)用前景廣闊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供植物多聚ADP核糖聚合酶抑制劑在改善植物性狀中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的植物多聚ADP核糖聚合酶的抑制劑，包括3-AB，BA等，所述改善植物性狀是指能夠促進(jìn)植物根系生長并能提高植物對(duì)干旱逆境耐受性等。本發(fā)明首先提供了一種小分子化學(xué)物質(zhì)，它具有刺激植物側(cè)根生長的作用，其中文名為3-氨基苯甲酰胺，英文名為d-aminobenzamide，分子量為136. 15，該物質(zhì)又可被簡稱為3-AB。本發(fā)明提供這種物質(zhì)處理植物的方法為將所述抑制劑(如3-AB)配制成水溶液， 在植物苗期時(shí)將所述抑制劑(如3-AB)加在培養(yǎng)液或培養(yǎng)基中，終濃度0. 5mM-2mM，或者滴灌在植物根部周圍的土壤中，濃度約lmM-3mM，每隔4一6天滴灌一次，一段時(shí)間后O0-30 天)觀察植物的根系，可以發(fā)現(xiàn)處理過的植物有明顯發(fā)達(dá)的根系(圖1，圖3，圖4)，不僅如此，苗期植物的地上部分以及地下部分的鮮重也有所增加(圖1，圖2)。本發(fā)明還提供所述抑制劑(如3-AB)在提高植物抗干旱能力上的應(yīng)用。具體如下 將植物(如擬南芥等)生長在土壤中，在植物移栽后施用所述抑制劑(如3-AB)的水溶液， 濃度1. 5-2. 5mM,每隔4一6天施用一次，共3_5次，待植物長到一個(gè)月以后進(jìn)行干旱實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)所述抑制劑(如3-AR)處理過的植物耐旱性明顯增強(qiáng)，干旱三周后未處理的植物幾乎已死亡，而處理的植物仍然存活?；謴?fù)澆水后，經(jīng)處理的植物能很好恢復(fù)，而對(duì)照植物已經(jīng)死亡(圖5)。采用上述類似的處理方法，本發(fā)明還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)3-AB的類似物BA(中文名苯甲酰胺)等具有與3-AB相類似的促進(jìn)側(cè)根生長的活性，這些類似物都為植物多聚ADP核糖聚合酶(PARP)的抑制劑，它們可能通過抑制PARP的活性來促進(jìn)植物的根系生長(圖2)。本發(fā)明所述3-AB溶液處理不同植物包括擬南芥、煙草、玉米等有最佳施用濃度， 如擬南芥為ImM，煙草為2mM，玉米為ImM。本發(fā)明中所采用的試驗(yàn)植物僅為代表和應(yīng)用舉例，本發(fā)明內(nèi)容并不限于只應(yīng)用于這些植物。還應(yīng)注意，本發(fā)明所聲明的具有促根抗旱作用的物質(zhì)包括一類可以抑制植物 PARP活性的物質(zhì)，無論這種抑制劑是目前已知的還是未知的。使用者可以利用3-AB及其衍生物或者類似物來處理植物，獲得促側(cè)根增多和抗旱的效果，或者合成一種新的比現(xiàn)有物質(zhì)成本更為低廉但結(jié)構(gòu)或功能類似的物質(zhì)來行使作用。在使用此物質(zhì)時(shí)使用濃度和處理時(shí)期特別重要，如果濃度過高，可能有抑制生長的負(fù)作用，對(duì)于不同植物，最佳使用濃度會(huì)有差別；在對(duì)植物施用時(shí)應(yīng)注意，使用時(shí)期不能已超過植物側(cè)根發(fā)育的最佳時(shí)期。


圖1 :3-AB促進(jìn)擬南芥的側(cè)根生長對(duì)比圖示。其中，A.擬南芥消毒后撒種到不含或含有ImM 3-AB的1/2MS培養(yǎng)基上，生長20天后拍照。由圖中可看出ImM 3-AB明顯促進(jìn)了擬南芥?zhèn)雀纳L和發(fā)育。B. 3-AB處理和未處理的擬南芥在1/2MS培養(yǎng)基上生長20天后的根葉數(shù)目統(tǒng)計(jì)比較。C. 3-AB處理和未處理的擬南芥苗、根及地上部分鮮重統(tǒng)計(jì)對(duì)比。圖2 :BA促進(jìn)擬南芥的側(cè)根發(fā)育對(duì)比圖示。其中，A.擬南芥在不含以及含有2mM 的BA的1/2MS培養(yǎng)基上生長20天后拍照。B. BA處理和未處理的擬南芥在1/2MS培養(yǎng)基上生長20天后的根葉數(shù)目統(tǒng)計(jì)比較。C. BA處理和未處理的擬南芥苗、根及地上部分鮮重統(tǒng)計(jì)對(duì)比。圖3 :3-AB促進(jìn)煙草的側(cè)根生長對(duì)比圖示。其中，A.煙草在不含以及含有2mM的 3-AB的V2MS培養(yǎng)基上六周后拍照。B.煙草在不含以及含有2mM的3-AB的V2MS培養(yǎng)基上六周后，側(cè)根數(shù)目統(tǒng)計(jì)比較。圖4 :3-AB及BA促進(jìn)玉米的側(cè)根生長圖示。其中，A.玉米在OmM/lmM 3-AB以及 2mMBA水溶液中處理一周拍照。B.玉米在OmM/lmM 3-AB以及2mM BA水溶液中處理一周后側(cè)根數(shù)目統(tǒng)計(jì)。圖5 :3-AB處理提高擬南芥的耐旱能力圖示。其中，A.擬南芥停止?jié)菜芎?，未處理?duì)照幾乎干枯，經(jīng)3-AB處理過的植物葉片仍保持較高的含水量。B.經(jīng)3-AB處理過的植物后復(fù)水后能恢復(fù)，而未處理對(duì)照則不能。C.正常條件生長植物、干旱三周后的對(duì)照植物、3-AB處理過的植物葉片中的含水量比較。圖6 :3-AB處理后調(diào)節(jié)植物根中生長素的分布。將DR5:⑶S轉(zhuǎn)基因陽性種子消毒后種植到不含以及含有ImM 3-AB的1/2MS培養(yǎng)基上生長一周后染色，發(fā)現(xiàn)用ImM 3-AB 處理后在下胚軸與基根連接處以及側(cè)根原基位置藍(lán)色信號(hào)增強(qiáng)，說明生長素分布發(fā)生了變化，生長素在這些部位富集。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)方法或本領(lǐng)域研究人員所熟知的方法，或者按照試劑銷售商所建議的條件。應(yīng)特別注意，下述實(shí)施例中所提到的植物僅用于舉例，3-AB及其類似物的應(yīng)用并不限于這些植物。實(shí)施例1擬南芥、煙草、玉米等種子的處理方法擬南芥以及煙草種子先用70%乙醇消毒lOmin，再用100%乙醇+0.01% Triton 振蕩數(shù)次后傾倒于已滅菌的干凈濾紙上，用牙簽點(diǎn)種在1/2MS培養(yǎng)基上，放至光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以不含3-AB的培養(yǎng)基作為對(duì)照，觀察含有l(wèi)-2mM 3-AB或BA的培養(yǎng)基上植物的生長情況。玉米種子用3%的雙氧水消毒30min后漂洗數(shù)次以洗凈雙氧水，換上干凈的純水浸種48h，37度催芽Mh，然后將紗布置于長試管中為支持物，將發(fā)芽的苗置紗布上，每管1 棵，十管一組，試管中不含或含有3-AB或BA水溶液，于光照培養(yǎng)箱中生長一周后拍照。實(shí)施例2側(cè)根數(shù)以及植物各部分鮮重測定擬南芥在生長20天后，取苗15株以上，計(jì)數(shù)從基部發(fā)出的根數(shù)以及整個(gè)根系的側(cè)根數(shù)；將苗分成根和根以上部分，以精密天平分別稱取鮮重，比較處理和不處理植物的側(cè)根數(shù)以及各部分鮮重。煙草生長六周后計(jì)數(shù)各株植物整個(gè)根系的側(cè)根數(shù)，玉米則在生長一周后計(jì)數(shù)從基根發(fā)出的須根上生長出的側(cè)根數(shù)目。實(shí)施例3植物抗干旱能力的觀察和測定待擬南芥萌發(fā)至第一片真葉長出時(shí)，選取健壯、生長一致的苗移栽到事先滅菌的培養(yǎng)土中(土先稱重，以保證干旱時(shí)每個(gè)小盆中的土壤份量一致，含水量也一致)。擬南芥移栽5天后，將3-AB配制成2mM的水溶液，對(duì)擬南芥根部進(jìn)行滴灌，以根部濕潤為度，每個(gè)苗盡量用同等體積的溶液處理。以用水滴溉作為3-AB處理的對(duì)照。隔5天重復(fù)一次，共處理3次。待植株生長30天后先讓每個(gè)小盆吸飽水分，然后停止?jié)菜?，停止?jié)菜叭匀环Q每個(gè)小盆重量，以保證每個(gè)缽里的土壤含水量一致，處理約20天后，對(duì)照植物開始干枯，測量此時(shí)對(duì)照植物以及處理植物中葉片的相對(duì)含水量。復(fù)水，5天后觀察擬南芥復(fù)活情況。實(shí)施例4葉片含水量測定選取同時(shí)生長的對(duì)照與處理的擬南芥第三片葉子，用自來水沖去葉片表面雜物， 再用去離子水洗凈。剪取后馬上稱重得到植物葉片鮮重(Fresh weight, FW)；將植物葉片浸入水中4小時(shí)后取出，用草紙吸干葉子表面的水分后立即稱重，得到植物葉片的濕重 (Turgid weight, Tff)；將稱過的葉片放入80度烘箱中完全烘干，直至葉片重量不再變化時(shí)為止，稱取植物干重(Dry weight，DW)。以下面公式計(jì)算植物的相對(duì)含水量(Relativewater content, RffC)。
RffC = (Fff-Dff)/(Tff-Dff) X 100%實(shí)施例5 3-AB與內(nèi)源生長素之間的關(guān)系側(cè)根的形成依賴于植物生長激素中的一種一生長素。前人研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)外源生長素類似物(IAAJ引哚-3-乙酸，NAA，萘乙酸；2，4-D，二氯苯氧基乙酸)會(huì)增加側(cè)根的數(shù)量(Blakely，1988 ；Laskowski, 1995)。相反地，用生長素運(yùn)輸抑制劑如NPA會(huì)減少側(cè)根的數(shù)量(Casimiro et al. ,2001 =Reed et al.，1998)。總而言之，生長素在側(cè)根的形成過程中起著重要的作用。為了觀察3-AB促進(jìn)側(cè)根生長是否與內(nèi)源生長素之間存在關(guān)系，用生長素響應(yīng)基因DR5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)篩選獲得純合轉(zhuǎn)基因植株。在轉(zhuǎn)基因植物中，含有生長素的組織，GUS染色后將會(huì)有藍(lán)色信號(hào)的出現(xiàn)，藍(lán)色信號(hào)強(qiáng)弱與生長素濃度直接相關(guān)。將DR5:⑶S轉(zhuǎn)基因株種子種到含有ImM 3-AB的1/2MS培養(yǎng)基上。生長十天后將整個(gè)植株進(jìn)行⑶S染色，與未用3-AB處理的對(duì)照組相比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)ImM 3-AB處理后的植株下胚軸與基根連接處以及側(cè)根原基位置藍(lán)色信號(hào)明顯增強(qiáng)。據(jù)此推測，3-AB促進(jìn)了生長素的原位合成或者向根部運(yùn)輸，從而促進(jìn)擬南芥的側(cè)根發(fā)育。綜上所述，本發(fā)明專利提供了一類新的促根抗旱劑，該物質(zhì)使用濃度低，使用方便，使用后植物側(cè)根生長發(fā)達(dá)，整體上保水能力增強(qiáng)，對(duì)干旱的耐受能力增強(qiáng)。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要意義。
權(quán)利要求
1.植物多聚ADP核糖聚合酶抑制劑在改善植物性狀中的應(yīng)用，其特征在于所述改善植物性狀是指促進(jìn)植物根系生長和提高植物對(duì)干旱逆境的耐受性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)的應(yīng)用，其特征在于所述植物多聚ADP核糖聚合酶的抑制劑為3-氨基苯甲酰胺，縮寫3-AB，或者為苯甲酰胺，縮寫B(tài)A。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于將所述抑制劑配制成水溶液，在植物苗期時(shí)將抑制劑加在培養(yǎng)液或培養(yǎng)基中，終濃度0. 5mM-2mM，或者滴灌在植物根部周圍的土壤中，濃度為lmM-3mM，每隔4_6天滴灌一次，共3_4次。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于對(duì)生長在土壤中的植物施用所述抑制劑配制成水溶液，濃度1. 5-2. 5mM，每隔4—6天施用一次，共3_5次。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物學(xué)與農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及植物多聚ADP核糖聚合酶抑制劑在改善植物性狀中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的多聚ADP核糖聚合酶抑制劑，包括3-AB，BA等，所述改善植物性狀是指能夠促進(jìn)植物根系生長并能提高植物對(duì)干旱逆境耐受性等。植物施用這些抑制劑后，根系生長更為發(fā)達(dá)，表現(xiàn)為根系增多，苗期鮮重增加；不僅如此，植物也表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐干旱能力。本發(fā)明可用于促進(jìn)植物根系生長并增強(qiáng)其耐旱能力。
文檔編號(hào)A01P21/00GK102283198SQ20101020234
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2010年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月17日
發(fā)明者劉偉偉, 劉財(cái)豐, 張海磊, 葛曉春 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)