專利名稱：編碼木脂素甲基化酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的酶的基因、利用該甲基化酶使木脂素組成改變的植物等。更加具體地說，本發(fā)明涉及具有合成甲基化木脂素活性的酶的基因，優(yōu)選來自芝麻的具有合成甲基化木脂素活性的酶的基因及其利用。
背景技術(shù)：
胡麻屬芝麻(Sesamum indicum)，是屬于胡麻科(Pedaliaceae)的1年生草本植物。據(jù)說芝麻的原產(chǎn)地在中非，芝麻是大約有6000年歷史的最古老的栽培油料作物，并已在世界范圍內(nèi)栽培。自古以來芝麻就是珍貴的食品，被認(rèn)為是健康食品的代表。特別是芝麻種子、從芝麻種子中得到的油、芝麻種子的提取物均在被利用(例如參照《芝麻其科學(xué)和功能性》日語原名「-ι O科學(xué)i機(jī)能性」、并木滿夫編丸善planet公司(1998))。芝麻種子內(nèi)含有的成分中約50%是脂質(zhì)，約20%是蛋白質(zhì)。芝麻中含有的脂質(zhì)的主要成分是以油酸和亞油酸為主體的甘油三酯，并且芝麻中還含有維生素B1、B2、E等。除上述成分之外，芝麻中還含有被統(tǒng)稱為木脂素的植物的二次代謝物(例如芝麻素和芝麻林素等)，這些物質(zhì)具有強(qiáng)抗氧化性(例如參照Biochemical Systematics and Ecology 13,133-139(1985))。關(guān)于木脂素的生物合成，例如在Lignans :biosynthes is and function, Comprehensive natural products chemistry,1 :640-713 (1999) ；Phytochemistry Rev. 2257-288(2003)等中有記載。例如在Phytochemistry Rev. 2257-288(2003)中，表示由松柏醇聚合合成的松脂醇是首次生物合成的木脂素，并且利用松脂醇，在各植物種內(nèi)經(jīng)過特有的生物合成途徑可合成多種木脂素。有報(bào)告指出有助于該松脂醇合成的dirigent protein存在于連翹等中(例如參照kience 275，362-366 (1997)等)。并且還報(bào)導(dǎo)了連翹的松脂醇-落葉松脂素還原酶基因(例如參照J(rèn).Biol. Chem.，271 :29473 (1996)、日本特表2001-507931號(hào)公報(bào)等)，Thuja plicata的松脂醇-落葉松脂素還原酶基因(例如參照J(rèn). Biol. Chem.， 274:618(1999)等)，以及閉聯(lián)異落葉松脂素脫氫酶及其使用方法(例如參照J(rèn).Biol. Chem. ,276(16) :12614-23(2001),日本特表 2002-512790 號(hào)公報(bào)等)。并且從 Larrea tridentata 中克隆到 Larreatricin 氫氧化酶基因(例如參照 Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 100 :10641(2003)等)。關(guān)于芝麻木脂素的生物合成，一般認(rèn)為是通過胡椒醇合成酶作用于松脂醇而合成胡椒醇，接著，通過芝麻素合成酶作用于此胡椒醇而合成芝麻素。但已證明，從芝麻中克隆到的細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì)CYP81Q1，單獨(dú)由松脂醇經(jīng)過胡椒醇而合成芝麻素(國際公開公報(bào) W02005/030944 ；參照?qǐng)D 1)。近年來，不僅是木脂素，而且木脂素糖苷也正受到關(guān)注。已知上述木脂素分子中有幾種以糖苷的形式存在于植物中。例如，芝麻種子中存在芝麻素酚糖苷(sesaminol 2' _0_ β -D-Glucopyranoside ；sesaminol 2，_0_ β -D-glucopyranosyl(1-2) _0_ β -D-Gluc opyranoside ；及 sesaminol 2，-0_ β -D-glucopyranosyl (1-2) _0_ (- β -D-glucopyranosyl (1-6))-β-D-Glucopyranoside))；及松月旨醇糖苷(Pinoresinol 4，_0_β-D-glucopyranos yl (1-6)- β -D-Glucopyranoside ；Pinoresinol 4，_0_ β -D-glucopyranosyl(1-2)- β -D-G Iucopyranoside ；Pinoresinol 4，_0_ β -D-glucopyranosyl (1-6)_0_(β -D-glucopyranos yl (1-6)) β -D-Glucopyranoside ；及 Pinoresinoldi-O-β-D-Glucopyranoside))等。連S 中存在(+)-Pinoresinol-4，-O- β -D Glucoside 及(_)-羅漢松樹脂酚-4-0-Glucoside。 亞麻中存在Secoisolariciresinol DiGlucoside禾口Pinoresinol DiGlucoside等(例如參考「生藥學(xué)雜志」日語原名「生薬學(xué)雑誌」、第32卷、第194頁(1978) ；Tetrahedr on, 14 649(2003) ；Phytochemistry, 58 :587(2001)等)。芝麻中含有的松脂醇糖苷和芝麻素酚糖苷(例如參照Katsuzaki，H.等、Biosci. Biotech. Biochem. 56,2087-2088(1992)等)，因?yàn)樵谒苄詤^(qū)域顯示強(qiáng)抗氧化性，所以期待其有與脂溶性抗氧化劑(例如生育酚)不同的應(yīng)用。此外，對(duì)于木脂素糖苷主張其有如下所述作用機(jī)理，即、木脂素糖苷的具有抗氧化性的官能團(tuán)酚羥基被自身具有的糖保護(hù)，但攝入體內(nèi)后在腸內(nèi)細(xì)菌具有的葡萄糖苷酶的作用下發(fā)生水解，生成作為葡糖苷配基部分的脂溶性木脂素。該葡糖苷配基在腸內(nèi)吸收通過血液被運(yùn)送到各臟器內(nèi)，防止臟器生物膜等的氧化障礙。依據(jù)這種作用機(jī)理，期待將木脂素糖苷作為動(dòng)脈硬化預(yù)防食品而應(yīng)用(例如參照 Τ. O saw a :Anticarcinogenesis and radiation protection 2 :p. 327，Plenum Press，New Yo) 0作為木脂素糖苷以外的木脂素衍生物已知有甲基化木脂素。甲基化木脂素與木脂素糖苷相同，具有抗氧化性的官能團(tuán)酚羥基受甲基保護(hù)，因此是具有甲氧基結(jié)構(gòu)的木脂素。報(bào)導(dǎo)了呋喃駢呋喃類的芝麻木脂素中胡椒醇的4位羥基被甲基化的Kobusine及芝麻素酚的 2，位羥基被甲基化的 Sesangolin (參照 Pytochemistry 47，583-591 (1998)；及 J. O rg. Chem. 27，3232-3235 (1962))(圖1)。但還不明確催化這些合成反應(yīng)的酶，并且到目前為止還沒有精制、分離使呋喃駢呋喃類木脂素甲基化的酶及編碼該酶的基因的報(bào)告。已知具有催化甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)這種特定功能的蛋白質(zhì)，在不同的植物種中其氨基酸序列類似(例如參照 Plant Cell 14, 505-519 (2002))

發(fā)明內(nèi)容
通過改變植物的二次代謝物等的生物合成途徑，能夠進(jìn)行有用物質(zhì)的生成及/或有用植物的育種，將這種技術(shù)稱為代謝工程。如果利用這種技術(shù)，能夠大量生產(chǎn)任意的化合物及/或抑制不需要的物質(zhì)的生產(chǎn)。因此，鑒于上述這些物質(zhì)的有用性，使用與木脂素代謝途徑相關(guān)的基因，采用基因工程合成木脂素及其代謝物在工業(yè)上有用。但是，有關(guān)木脂素、 特別是與以芝麻木脂素為代表的呋喃駢呋喃類木脂素的生物合成相關(guān)的基因的知識(shí)，如上所述還很有限，并且仍未發(fā)現(xiàn)催化甲基化呋喃駢呋喃類木脂素生成的甲基化酶，更期望得到其基因。本發(fā)明鑒于上述狀況，提供如下所示的具有木脂素甲基轉(zhuǎn)移活性的酶、編碼該酶的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體·細(xì)胞·轉(zhuǎn)化體等。
(1)多核苷酸，其為下述(a) (d)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，(a)多核苷酸，其含有具有序列號(hào)1或3的堿基序列的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有編碼具有序列號(hào)2或4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(c)多核苷酸，其為與具有序列號(hào)1或3的堿基序列的部分或全部互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，且編碼具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(d)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有在序列號(hào)2或4的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，且具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性。(2)如上述(1)所述的多核苷酸，其編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有序列號(hào)2或4的氨基酸序列，或者具有在該氨基酸序列中添加、缺失1個(gè)或多個(gè)氨基酸及/或被其他氨基酸替換修飾的氨基酸序列，且具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性。(3)如上述(1)所述的多核苷酸，其與具有序列號(hào)1或3的堿基序列的部分或全部互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在高嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，且編碼具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的蛋白質(zhì)。(4)如上述(1)所述的多核苷酸，其與具有序列號(hào)1或3的堿基序列的部分或全部互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在hSSC、50°C的條件下進(jìn)行雜交，且編碼具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的蛋白質(zhì)。(5)如上述(1)所述的多核苷酸，其含有具有序列號(hào)1或3的堿基序列的多核苷酸。(6)如上述(1)所述的多核苷酸，其含有編碼具有序列號(hào)2或4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸。(7)如上述(1) (6)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其為DNA。(8)如上述⑴ (7)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其編碼對(duì)于呋喃駢呋喃類木脂素具有轉(zhuǎn)移甲基活性的蛋白質(zhì)。(9)如上述(8)所述的多核苷酸，其編碼對(duì)于松脂醇及/或胡椒醇具有轉(zhuǎn)移甲基活性的蛋白質(zhì)。(10)蛋白質(zhì)，其是被上述(1) (9)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。(11)載體，其含有上述⑴ (9)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。(12)宿主細(xì)胞，其為被上述(11)所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。(13)該蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)或繁殖權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，從該宿主細(xì)胞中提取具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的蛋白質(zhì)。(14)植物體(例如，芝麻、連翹或亞麻)或具有與該植物體相同性質(zhì)的該植物體的后代植物體、或這些植物體的組織，其中導(dǎo)入上述(1) (9)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。(15)方法，其使用上述(1) (9)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上。(16)該植物體或具有與該植物體相同性質(zhì)的該植物體的后代植物體，其中，將上述(1) (9)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸導(dǎo)入植物體內(nèi)，通過表達(dá)使產(chǎn)生的木脂素組成改變。(17)多核苷酸，其具有上述(1) (9)中所述的多核苷酸的片段或其互補(bǔ)序列。
如果利用本發(fā)明的多肽(木脂素甲基化酶)，產(chǎn)生的效果是例如能夠在生物(特別是植物)中人為地調(diào)節(jié)木脂素及甲基化木脂素的量。此外，通過使用這些重組酶使木脂素甲基化，可以改變體外和體內(nèi)的物性(溶解度、動(dòng)物的吸收效率等)。此外，通過利用本發(fā)明的多核苷酸，可人工生產(chǎn)目前為止自然界中未鑒定的甲基化木脂素。此外，利用本發(fā)明的多肽合成的甲基化木脂素，能夠作為新型生理功能物質(zhì)的初始物質(zhì)或中間體有效利用。通過使用基因重組技術(shù)使本發(fā)明的木脂素甲基化酶在所期望的生物內(nèi)表達(dá)，可由松脂醇人工生產(chǎn)單甲基化松脂醇及/或由胡椒醇人工生產(chǎn)Kobusine。此外，通過使用基因重組技術(shù)使本發(fā)明的木脂素甲基化酶在所期望的生物內(nèi)表達(dá)，能夠制造人為控制木脂素和甲基化木脂素的量的植物及/或微生物。在生產(chǎn)Kobusine或甲基化松脂醇的植物中，通過抑制本發(fā)明的木脂素甲基化酶的表達(dá)，能夠使葡糖苷配基游離，使木脂素(特別是胡椒醇及/或松脂醇)的量增加。如果使用本發(fā)明的木脂素甲基化酶，能夠由松脂醇人工生產(chǎn)新型甲基化木脂素單甲基化松脂醇。


圖1是芝麻木脂素的結(jié)構(gòu)和代謝途徑圖。圖 2-2A 是通過 RT-PCR 的 SiOMTl 及 Si0MT2 在芝麻(S. indicum cv.真瀨金)不同器官的基因表達(dá)分析的結(jié)果圖。圖2-2B是通過RT-PCR的SrOMTl在芝麻(S. radiatum) 不同器官的基因表達(dá)分析的結(jié)果圖。圖3-3A是大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的SiOMTl和松脂醇的酶反應(yīng)液在A280nm處的色譜圖。 圖3- 是大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的SiOMTl和胡椒醇的酶反應(yīng)液在A280nm處的色譜圖。圖4-3C是大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的Si0MT2和松脂醇的酶反應(yīng)液在A280nm處的色譜圖。 圖4-3D是大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的Si0MT2和胡椒醇的酶反應(yīng)液在A280nm處的色譜圖。圖5-3E是大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的SrOMTl和松脂醇的酶反應(yīng)液在A280nm處的色譜圖。 圖5-3F是大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的SrOMTl和胡椒醇的酶反應(yīng)液在A280nm處的色譜圖。圖6-4A是由SiOMTl生成的甲基化松脂醇的LC-MS的色譜圖。圖7-4B是由SiOMTl生成的甲基化胡椒醇(Kobusine)的LC-MS的色譜圖。圖8是使用SiOMTl基因全長(zhǎng)探針的Genomic Southern雜交的結(jié)果。圖9-6A是標(biāo)準(zhǔn)品咖啡酸在A280nm處的色譜圖。圖9-6B是大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的 SiOMTl和咖啡酸的酶反應(yīng)液在A280nm處的色譜圖。圖9-6C是大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的SrOMTl 和松脂醇的酶反應(yīng)液在A280nm處的色譜圖。圖10-6D是由SiOMTl生成的甲基化咖啡酸(阿魏酸)的LC-MS的色譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了以木脂素特別是以松脂醇及/或胡椒醇為主要基質(zhì)的新型甲基化酶，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該甲基化酶可使松脂醇甲基化。到目前為止雖然已鑒定出二甲基化松脂醇桉脂素，但仍未發(fā)現(xiàn)單甲基化松脂醇。本發(fā)明者通過同源性檢索，從包括來自芝麻種子的5000個(gè)克隆體的EST數(shù)據(jù)庫中查找芝麻甲基化酶樣基因的部分序列，其結(jié)果得到2種甲基化酶樣基因(下述SiOMTl和Si0MT2)。這些SiOMT基因在種子內(nèi)表達(dá)強(qiáng)烈。采用RACE法取得這些基因的全長(zhǎng)堿基序列，使其在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)。使得到的重組蛋白質(zhì)與芝麻素酚或松脂醇反應(yīng)后，利用HPLC 分析、LC-MS分析、及T0F-MS/MS分析，測(cè)定酶活性。其結(jié)果證明SiOMTl具有催化使胡椒醇甲基化生成Kobusine的反應(yīng)的活性。并且證明SiOMTl具有催化使松脂醇甲基化生成單甲基化松脂醇的反應(yīng)的活性。認(rèn)為該甲基化木脂素是松脂醇的衍生物桉脂素的中間體。通過 PCR從非洲芝麻ksamum radiatum中克隆SiOMTl的同源基因SrOMTl，確認(rèn)SrOMTl具有與 SiOMTl同樣的甲基化活性?！澳局亍笔蔷哂蠧6-C3骨架的2分子phenylpropanoid化合物主要通過這些 8-8’位聚合(8-8’鍵)的化合物。一般認(rèn)為木脂素對(duì)植物的生物體防御機(jī)構(gòu)有用(參照 Phytochemistry Rev. 2，371—390(2,003))。作為代表性的木脂素，可以為芝麻中含有的(+)_芝麻素、(+)_芝麻素酚、(+)_芝麻林素、(+)_松脂醇、(+)_胡椒醇及(+)_芝麻素酚；連翹(Forsythia intermedia) 中含有的(+)_松脂醇、(-)_牛蒡子苷配基及(-)_羅漢松樹脂酚；甘肅瑞香(Daphne t angutica)中含有的(_)_松脂醇和(_)_落葉松脂素；亞麻(Linum usitatissimum)中含有的(+)_閉聯(lián)異落葉松脂素等。這些木脂素有多種分子結(jié)構(gòu)(參照Wood Research 90， 27-110(2,003)等)。以(+)_松脂醇為代表的芝麻木脂素類被分類為在范圍最廣的植物種中已被鑒定的呋喃駢呋喃類木脂素。作為芝麻木脂素之一的芝麻素，具有多種生理活性作用，對(duì)膽固醇代謝、肝功能及免疫功能的改善有效(例如參照《芝麻其科學(xué)和功能性》日語原名「-'7 Ο科學(xué)i効能性」、并木滿夫編；丸善planet公司(1998))。從芝麻種子或芝麻粕中分離精制芝麻素的方法已經(jīng)實(shí)用化(例如、日本特開2001-139579公報(bào)、日本特開平 10-7676號(hào)公報(bào)等)，以芝麻素為主要成分的具有促進(jìn)乙醇分解作用的肝功能改善/增強(qiáng)劑已有市售(商品名「力寸$ >」(芝麻素)，總經(jīng)銷三得利株式會(huì)社)。此外，有報(bào)告指出， 除芝麻素之外，其它木脂素(例如芝麻素酚、芝麻林素等)也具有生理活性(例如參照「日本農(nóng)藝化學(xué)會(huì)志」日語原名「日本農(nóng)蕓化學(xué)會(huì)誌」、76 :805-813(2002)) 0因此，木脂素或其衍生物作為具有各種生理活性的生理活性物質(zhì)或其中間體有用。以下，對(duì)于本發(fā)明的編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸、被該多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)、及其利用進(jìn)行詳細(xì)說明。(1)多核苷酸首先，本發(fā)明提供下述(a) (d)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。(a)多核苷酸，其含有具有序列號(hào)1或3的堿基序列的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號(hào)2或4的氨基酸序列；(c)多核苷酸，其為與具有序列號(hào)1或3的堿基序列的部分或全部互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，且編碼具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(d)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有在序列號(hào)2或4的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，且具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性。在本發(fā)明書中，用語“多核苷酸”可與“基因”、“核酸”或“核酸分子”交換使用，是
7指核苷酸的聚合物。在本說明書中，用語“堿基序列”可與“核酸序列”或“核苷酸序列”交換使用，以脫氧核糖核苷酸(省略為A、G、C及T)的序列表示。本發(fā)明的多核苷酸可以RNA(例如mRNA)的形態(tài)、或DNA的形態(tài)(例如cDNA或基因組DNA)存在，DNA可以是雙鏈或單鏈，單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈(正義鏈)，或者也可以是非編碼鏈(反義鏈)。在本說明書中，用語“寡核苷酸”是指數(shù)個(gè) 數(shù)十個(gè)核苷酸(例如2 60個(gè))結(jié)合形成的寡核苷酸，可與“多核苷酸”交換使用。對(duì)于寡核苷酸，短的稱為二核苷酸(二聚體)、三核苷酸(三聚體)，長(zhǎng)的用30mer或IOOmer這種發(fā)生聚合的核苷酸的數(shù)量表示。寡核苷酸可以作為更長(zhǎng)的多核苷酸的片段而生成，也可以化學(xué)合成。在本說明書中，用語“部分多核苷酸”是指該多核苷酸的片段，例如是指至少 12nt (核苷酸)，優(yōu)選約15nt，更優(yōu)選至少約20nt，更進(jìn)一步優(yōu)選至少約30nt，最優(yōu)選至少約 40nt長(zhǎng)度的片段。“至少12nt長(zhǎng)度的片段”，例如是指含有序列號(hào)1所示的堿基序列中的12 以上連續(xù)堿基的片段。參照本說明書可提供序列號(hào)1所示的堿基序列，所以同領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地制作以序列號(hào)1為基礎(chǔ)的DNA片段。例如為了制作各種大小的片段可容易地使用限制內(nèi)切酶切割或超聲波切割?；蛘呖珊铣芍谱鬟@種片段。適當(dāng)?shù)钠?寡核苷酸)， 可通過 Applied Biosystems Incorporated(ABI, 850 Lincoln Center Dr. ,Foster City, CA94404) 392 型 Synthesizer 等合成。本發(fā)明的多核苷酸，編碼具有木脂素甲基化活性的多肽。這種多核苷酸，典型的是含有具有序列號(hào)1或3的堿基序列的多核苷酸的多核苷酸，或含有編碼具有序列號(hào)2或4 的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。本發(fā)明的優(yōu)選多核苷酸是具有序列號(hào)1或 3的堿基序列的多核苷酸、或編碼具有序列號(hào)2或4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸，只要其編碼的多肽具有木脂素甲基化活性，可以為在序列號(hào)1 或3的堿基序列中缺失、插入、替換及/或添加1個(gè)或多個(gè)(例如1 30個(gè)、1 20個(gè)、1 10個(gè)、1 數(shù)個(gè)(例如6個(gè))1 5個(gè)、1 3個(gè)、1 2個(gè)等)堿基后的突變體。突變體可在編碼區(qū)或非編碼，或在這兩個(gè)區(qū)突變。編碼區(qū)的突變，可生成保守性或非保守性氨基酸的缺失、插入、替換或添加。本發(fā)明的多核苷酸，是編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸，包括與具有序列號(hào)1或3的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。nj ^ M Sambrook Molecular Cloning, ALaboratory Manual, 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory(1989)中記載的方法的公知方法進(jìn)行雜交。通常情況下，溫度越高鹽濃度越低，嚴(yán)格度就越高(雜交越難)，能夠得到同源性更高的多核苷酸。適當(dāng)?shù)碾s交溫度，因堿基序列、該堿基序列的長(zhǎng)度的不同而不同，例如將由編碼6個(gè)氨基酸的18個(gè)堿基組成的DNA片段作為探針使用時(shí)，優(yōu)選50°C以下的溫度。在本說明書中，用語“嚴(yán)格的雜交條件”是指，在雜交溶液(含有50%甲酰胺、 5XSSC(150mM NaCl、15m M 枸櫞酸三鈉)、50mM 磷酸鈉(pH7. 6)、5 XDenhardt 液、10%硫酸葡聚糖、及20 μ g/ml變性剪切鮭精子DNA)中，42 °C孵育一夜后，約65 °C時(shí)在0. IXSSC中洗凈過濾器。與多核苷酸的“一部分”雜交的多核苷酸，是指與參照多核苷酸的至少約15個(gè)核苷酸(nt)，更優(yōu)選至少約20nt，更進(jìn)一步優(yōu)選至少約30nt，最優(yōu)選至少約30 70nt進(jìn)行雜交的多核苷酸(DNA或RNA的任一種)。
本發(fā)明提供具有與序列號(hào)1或3的堿基序列至少80%同一，更優(yōu)選至少85%、 90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一的堿基序列的多核苷酸。對(duì)于任意特定的核酸分子，其是否與例如序列號(hào)1或3所示的堿基序列至少 80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、或99%同一，使用公知的計(jì)算機(jī)程序(例如 Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix(注冊(cè)商標(biāo))，Genetics Computer Group, University Research Park, 575S cience Drive, Madison, WI 53711))可以決定。Bestfit是利用Smith和Waterman的局部同源性算法(Algorithm)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)序列間的最良好的同源區(qū)段(segment) (Advances in Applied Mathematics 2 :482 489 (1981))。使用Bestfit或任意的其他序列排列程序，決定特定的序列與本發(fā)明的參照序列例如是否95%同一時(shí)，用參照堿基序列的全長(zhǎng)計(jì)算同一性百分率，并且設(shè)定參數(shù)允許參照序列的核苷酸總數(shù)的5%以下的同源性的空位。在特定實(shí)施方式中，參照(QUERY)序列(本發(fā)明的序列)和對(duì)象序列之間的同一性(也稱為全體序列排列)，使用以Brutlag等的算法(Comp. App. Biosci. 6 :237 245(1990))為基礎(chǔ)的FASTDB計(jì)算機(jī)程序決定。為了計(jì)算同一性百分率，DNA序列的 FASTDB 排列中優(yōu)選使用的參數(shù)為Matrix = Unitary、k-tuple = 4、Mismatch Penalty =1、Joining Penalty = 30、Randomization Group Length = 0> Cutoff Score = 1> Gap Penalty = 5、Gap Size Penalty = 0. 05、Window Size = 500 或?qū)ο髩A基序列的長(zhǎng)度(更短一方)。此外，本發(fā)明包括上述多核苷酸的片段或具有其互補(bǔ)序列的寡核苷酸。即使在本發(fā)明的寡核苷酸不編碼木脂素甲基化多肽時(shí)，同領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易理解在制作本發(fā)明的多肽時(shí)，可將本發(fā)明的多核苷酸作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物使用。不編碼木脂素甲基化多肽的本發(fā)明的寡核苷酸的其他用途，可以為下述用途(l)cDNA文庫中的木脂素甲基化酶基因或其對(duì)立基因或剪切突變體的分離；(2)為了提供木脂素甲基化酶基因的正確的染色體位置，與分裂中期染色體Spread的原位雜交(例如“FISH”)(Verma等，Human Chromosomes :A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)中記載)；及C3)用于檢測(cè)特定組織的木脂素甲基化酶mRNA表達(dá)的Northern-blot分析。本發(fā)明的多核苷酸或寡核苷酸，可作為利用反義RNA作用原理的基因表達(dá)操作用的工具使用。利用反義RNA技術(shù)，可觀察到來自內(nèi)源性基因的基因產(chǎn)物的減少。通過導(dǎo)入本發(fā)明的寡核苷酸，可使具有木脂素甲基化活性的多肽的含量降低，其結(jié)果能夠控制(增加或減少)植物中的甲基化木脂素含量或含量比。本發(fā)明的多核苷酸或寡核苷酸，可以包括非翻譯區(qū)(UTO)的序列、載體序列(包括表達(dá)載體序列)等序列。取得本發(fā)明的多核苷酸或寡核苷酸的方法，可以為將含有本發(fā)明的多核苷酸或寡核苷酸的DNA片段進(jìn)行分離的各種公知的方法。例如制備與本發(fā)明的多核苷酸的堿基序列的一部分進(jìn)行特異雜交的探針，篩選基因組DNA文庫或cDNA文庫，能夠取得本發(fā)明的多核苷酸或寡核苷酸。作為這種探針，只要是與本發(fā)明的多核苷酸的堿基序列或其互補(bǔ)序列中的至少一部分進(jìn)行特異雜交的多核苷酸(寡核苷酸)即可。這種通過雜交選擇的多核苷酸，可以為天然的多核苷酸(例如來自胡麻科植物、 地衣類植物等植物的多核苷酸)，也可以為來自植物以外的多核苷酸。取得本發(fā)明的多核苷酸的其他方法，可以為使用PCR的方法。該P(yáng)CR擴(kuò)增方法的特征在于，包括例如利用本發(fā)明的多核苷酸的cDNA的5’側(cè)及/或3’側(cè)的序列(或其互補(bǔ)序列)制備引物的步驟、使用這些引物將基因組DNA (或cDNA)等作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。使用本發(fā)明的方法，能夠大量取得含有本發(fā)明的多核苷酸的DNA片段。作為取得本發(fā)明的多核苷酸的供給源，沒有特別限定，優(yōu)選含有胡椒醇或松脂醇的生物材料。在本說明書中，用語“生物材料”是指生物學(xué)樣品(從生物體中得到的組織樣品或細(xì)胞樣品)。在下述實(shí)施例中雖然使用芝麻，但并不限于此。使用本發(fā)明的多核苷酸，能夠在轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞中合成具有木脂素甲基化活性的多肽。使用本發(fā)明的多核苷酸，通過檢測(cè)雜交的多核苷酸，能夠容易地檢測(cè)出表達(dá)具有木脂素甲基化活性的多肽的生物。本發(fā)明的寡核苷酸，通過作為檢測(cè)編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的雜交探針或用于擴(kuò)增該多核苷酸的引物利用，能夠容易地檢測(cè)出表達(dá)具有木脂素甲基化活性的多肽的生物或組織。并且，將上述寡核苷酸作為反義寡核苷酸使用，能夠抑制上述生物體或組織或細(xì)胞的具有木脂素甲基化活性的多肽的表達(dá)。(2)多肽本發(fā)明還提供被上述本發(fā)明的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)(多肽)，這種多肽，典型的是具有序列號(hào)2或4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在本說明書中，用語“多肽”可與“肽”或“蛋白質(zhì)”交換使用。此外，多肽的“片段” 是指該多肽的部分片段。且本發(fā)明的多肽可從天然供給源中分離，也可化學(xué)合成。本發(fā)明的多肽，包括天然精制產(chǎn)物、化學(xué)合成產(chǎn)物、以及從原核生物宿主或真核生物宿主(例如包括細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、高等植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中通過重組技術(shù)產(chǎn)生的產(chǎn)物。依靠重組產(chǎn)生步驟中使用的宿主，可使本發(fā)明的多肽糖基化或非糖基化。并且，本發(fā)明的多肽在多種情況下，作為宿主介導(dǎo)過程的結(jié)果，可含有起始的突變蛋氨酸殘基。本發(fā)明還提供具有木脂素甲基化活性的多肽。在本說明書中，“木脂素甲基化活性”是指使木脂素甲基化的活性，即、將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性。也就是說，本說明書中的“甲基化酶”和“甲基轉(zhuǎn)移酶”可交換使用。通過使作為甲基供給體的SAM和作為基質(zhì)的木脂素與木脂素甲基化酶反應(yīng)，將其反應(yīng)生成物進(jìn)行HPLC或LC-MS分析，能夠測(cè)定或確認(rèn) “木脂素甲基化活性”。一般的甲基化酶活性測(cè)定法如公知文獻(xiàn)所記載(公知文獻(xiàn)Toquin， V.，et al. (2003)Plant Mol. Biol. 52，495—509.，Gang，D. R.，et al. (2002)Plant Cell 14， 505-519.)。此外，本發(fā)明的多肽是具有序列號(hào)2或4的氨基酸序列的多肽的突變體，且包括具有木脂素甲基化活性的多肽。這種突變體包括具有在序列號(hào)2或4的氨基酸序列中，缺失、替換、插入及/或添加1個(gè)或多個(gè)(例如1 30、1 20、1 10、1 數(shù)個(gè)(6個(gè))、1 3個(gè)、1 2個(gè)等)氨基酸(氨基酸殘基)后的氨基酸序列，且具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的蛋白質(zhì)。“缺失、替換、插入及/或添加”包括逆轉(zhuǎn)、重復(fù)及類型替換(例如將親水性殘基替換為其他殘基，但通常不能將強(qiáng)親水性殘基替換為強(qiáng)疏水性殘基)。特別是，多肽中的“中性”氨基酸的替換，一般來說幾乎不影響該多肽的活性?？扇菀椎馗淖兌嚯牡陌被嵝蛄兄械臄?shù)個(gè)氨基酸，而不顯著影響該多肽的結(jié)構(gòu)或
10功能，這在該領(lǐng)域是公知的。并且還知道不僅是人為地改變，天然蛋白質(zhì)中也存在不會(huì)使該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能顯著改變的突變體。同領(lǐng)域技術(shù)人員，使用公知技術(shù)，能夠容易地使多肽的氨基酸序列中1或多個(gè)氨基酸突變。例如，根據(jù)公知的定點(diǎn)誘變法，能夠使編碼多肽的多核苷酸的任意堿基突變。此外，設(shè)計(jì)與編碼多肽的多核苷酸的任意位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物，能夠制作缺失突變體或附加突變體。進(jìn)而，使用本發(fā)明書中記載的方法，可容易地決定制作的突變體是否具有所期望的活性。優(yōu)選的突變體具有保守性或非保守性氨基酸替換、缺失或添加。優(yōu)選沉默替換、添加及缺失，特別優(yōu)選保守性替換。這些不會(huì)改變本發(fā)明的多肽的活性。通常認(rèn)為的代表性保守性替換是，脂肪族氨基酸Ala、Val, Leu、及Ile中的1個(gè)氨基酸替換為其他的氨基酸； 羥基殘基Ser和Thr的交換，酸性殘基Asp和Glu的交換、酰胺殘基Asn和Gln之間的替換、堿性殘基Lys和Arg的交換、以及芳香族殘基I^he、Tyr之間的替換。如上詳述，有關(guān)哪個(gè)氨基酸的突變可能是表達(dá)沉默型(即是否對(duì)功能有顯著有害效果)的進(jìn)一步指導(dǎo)說明， 在Bowie,J. U.等"Deciphering the Message inProtein Sequences :Tolerance to Amino Acid Substitutions”，Science 247:1306-1310(1990)中有記載。如上所述，這種突變多肽并不限于利用公知的突變多肽的制作方法，具有人為地導(dǎo)入的突變的多肽，也可以為分離精制天然存在的多肽得到的突變多肽。本發(fā)明的多肽，可以為氨基酸形成肽鍵的多肽，但并不限于此，也可以為含有多肽以外的結(jié)構(gòu)的復(fù)合多肽。在本說明書中使用時(shí)，“多肽以外的結(jié)構(gòu)”可以為糖鏈、類異戊二烯(isoprenoid)基等，但未特定。本發(fā)明的多肽，也可以包括附加多肽。作為附加多肽，例如可以為His、Myc、Flag 等表位標(biāo)記的多肽。本發(fā)明的多肽，可以為將編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使該多肽在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的狀態(tài)，也可以從細(xì)胞、組織等中分離精制。本發(fā)明的多肽，可以如下所述重組生成，也可以化學(xué)合成(例如參照H oughten, R. A. , Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA 82:5131-5135(1985)；美國專利第 4，631，211 號(hào)等)。本發(fā)明的多肽，能夠催化木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)的甲基化反應(yīng)。(3)本發(fā)明的多肽或多核苷酸的利用本發(fā)明還提供通過使用本發(fā)明的多肽或多核苷酸，控制(增加或減少)生物(優(yōu)選植物)中的木脂素及甲基化木脂素的量的方法以及該經(jīng)控制后的生物(優(yōu)選植物)。(A)載體本發(fā)明提供用于生成具有木脂素甲基化活性的多肽時(shí)使用的載體。本發(fā)明的載體可以為體外翻譯時(shí)使用的載體，也可以為重組表達(dá)時(shí)使用的載體。本發(fā)明的載體，只要含有上述本發(fā)明的多核苷酸，沒有特別限定。例如可以為插入編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的cDNA的重組表達(dá)載體等。重組表達(dá)載體的制作方法可以為使用質(zhì)粒、噬菌體、或黏粒等的方法，沒有特別限定。載體的具體種類沒有特別限定，可適當(dāng)選擇在宿主細(xì)胞中可表達(dá)的載體。即根據(jù)宿主細(xì)胞的種類，為了使本發(fā)明的多核苷酸準(zhǔn)確地表達(dá)而選擇適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，可以將使其和本發(fā)明的多核苷酸整合到各種質(zhì)粒等中得到的載體作為表達(dá)載體使用。
本發(fā)明的表達(dá)載體，依賴于應(yīng)導(dǎo)入的宿主的種類，含有表達(dá)控制區(qū)(例如啟動(dòng)子、 終止子及/或復(fù)制起點(diǎn)等)。細(xì)菌用表達(dá)載體的啟動(dòng)子，可使用通常用的啟動(dòng)子(例如trc 啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、Iac啟動(dòng)子等)，酵母用啟動(dòng)子，例如可以為甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子、PH05啟動(dòng)子等，絲狀菌用啟動(dòng)子，例如可以為淀粉酶(Amylase)、trpC等。此外，動(dòng)物細(xì)胞宿主用啟動(dòng)子，可以為病毒性啟動(dòng)子(例如SV40初期啟動(dòng)子、SV40后期啟動(dòng)子等)。植物體轉(zhuǎn)化使用的重組表達(dá)載體，只要是在該植物體內(nèi)可使本發(fā)明的多核苷酸表達(dá)的載體， 沒有特別限定。作為這種載體，例如可以為具有在植物細(xì)胞內(nèi)使多核苷酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)表達(dá)的啟動(dòng)子(例如花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子)的載體，或者為具有通過外部刺激被誘導(dǎo)活化的啟動(dòng)子的載體?？筛鶕?jù)使用限制酶及/或連接酶等的通常方法進(jìn)行表達(dá)載體的制備。利用表達(dá)載體的宿主的轉(zhuǎn)化也可根據(jù)通常的方法進(jìn)行。將使用上述表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主進(jìn)行培養(yǎng)、栽培或飼養(yǎng)后，根據(jù)通常用的方法(例如過濾、離心分離、細(xì)胞破碎、凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法等)，可從培養(yǎng)物等中回收、精制目標(biāo)蛋白質(zhì)。表達(dá)載體，優(yōu)選至少含有1個(gè)選擇性標(biāo)記。作為這種標(biāo)記，在真核生物細(xì)胞培養(yǎng)中可以為二氫葉酸還原酶基因或新霉素抗性基因，以及在E. coli及其他細(xì)菌培養(yǎng)中可以為四環(huán)素抗性基因或氨芐青霉素抗性基因。使用上述選擇性標(biāo)記物，能夠確認(rèn)本發(fā)明的多核苷酸是否導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并且確認(rèn)在宿主細(xì)胞中是否準(zhǔn)確表達(dá)?；蛘?，將本發(fā)明的多肽作為融合多肽(例如與GFP的融合多肽)表達(dá)，可將GFP熒光作標(biāo)記物使用。(B)轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞本發(fā)明提供導(dǎo)入有編碼具有上述木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞。在本說明書中，用語“轉(zhuǎn)化體”不僅包括組織或器官，還包括生物個(gè)體。轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞的制作方法(生產(chǎn)方法)沒有特別限定，例如可以為將上述重組載體導(dǎo)入宿主內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法。這里使用的宿主細(xì)胞，沒有特別限定，可優(yōu)選使用以往公知的各種細(xì)胞。具體來說，例如可以為大腸桿菌(Escherichia coli)等細(xì)菌、酵母 (出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe)、線蟲 (Caenorhabditis elegans)、非洲爪蛙(Xenopus laevis)的卵母細(xì)胞等。上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基及條件在該領(lǐng)域是公知的。此外，對(duì)作為轉(zhuǎn)化的對(duì)象的生物沒有特別限定，可以為上述宿主細(xì)胞中例示的各種微生物、植物或動(dòng)物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞的特征在于，這些轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞使天然具有的木脂素及/ 或甲基化木脂素的組成發(fā)生改變。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞，優(yōu)選植物或其后代、或來自這些植物或其后代的組織，特別優(yōu)選芝麻、連翹或亞麻。這種轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞，通過使用本發(fā)明的控制甲基化木脂素含量的方法，能夠使產(chǎn)生木脂素的生物中的甲基化木脂素的含量增加或減少。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，可以為植物轉(zhuǎn)化體。本實(shí)施方式的植物轉(zhuǎn)化體可通過下述方式取得，即將含有本發(fā)明的多核苷酸的重組載體導(dǎo)入被該多核苷酸編碼的多肽可表達(dá)的植物中。使用重組表達(dá)載體時(shí)，植物體轉(zhuǎn)化時(shí)使用的重組表達(dá)載體，只要是在該植物體內(nèi)可使本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)行表達(dá)的載體，沒有特別限定。作為這種載體，例如可以為具有在植物細(xì)胞內(nèi)可使多核苷酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)表達(dá)的啟動(dòng)子(例如、花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子) 的載體，或具有通過外部刺激被誘導(dǎo)活化的啟動(dòng)子的載體。本發(fā)明中作為轉(zhuǎn)化的對(duì)象的植物，是指植物體整體、植物器官(例如葉、花瓣、莖、 根、種子等)、植物組織(例如表皮、韌皮部、柔軟組織、木質(zhì)部、維管束、柵狀組織、海綿狀組織等)或植物培養(yǎng)細(xì)胞、或各種形態(tài)的植物細(xì)胞(例如懸浮培養(yǎng)細(xì)胞)、原生質(zhì)體、葉子切片、愈傷組織等任何物質(zhì)。轉(zhuǎn)化使用的植物，沒有特別限定，可以為屬于單子葉植物綱或雙子葉植物綱植物中的任何植物。向植物內(nèi)導(dǎo)入基因時(shí)，使用同本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的轉(zhuǎn)化方法(例如農(nóng)桿菌法、 基因槍法、PEG法、電穿孔法等)。例如以農(nóng)桿菌為介質(zhì)的方法和直接向植物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入的方法是公知的。使用農(nóng)桿菌法時(shí)，將構(gòu)建的植物用表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)霓r(nóng)桿菌(例如 Agrobacterium tumefaciens)內(nèi)，根據(jù)葉盤法(內(nèi)宮博文著、「植物基因操作手冊(cè)」日語原名「植物遺伝子操作7 二 Λ 7 >」(1990)27 31頁、講談社科學(xué)技術(shù)、東京)等，使該株感染無菌培養(yǎng)葉片，可得到轉(zhuǎn)化體。此外，可使用Nagel等的方法(Micribiol.Lett.、 67,325(1990)) 0該方法首先例如將表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌內(nèi)，接著利用PlantMolecular Biology Manual (S. B. Gelvin 等、Academic Press Publishers)中所述的方法將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞或植物組織內(nèi)。這里，“植物組織”包括培養(yǎng)植物細(xì)胞得到的愈傷組織。 使用農(nóng)桿菌法進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，可使用雙元載體(binary vector) (pBI121或pPZP202等)。此外，作為將基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞或植物組織內(nèi)的方法，已知有電穿孔法、 基因槍法。使用基因槍時(shí)，可直接使用植物體、植物器官、植物組織本身，也可制備成切片后使用，還可以制備原生質(zhì)體使用?？蓪⑸鲜鲋苽涞脑嚵嫌没?qū)胙b置(例如 PDS-1000 (BI0-RAD公司)等)處理。處理?xiàng)l件因植物或試料的不同而不同，但通常在壓力約450 2000psi、距離約4 12cm的條件下進(jìn)行。已導(dǎo)入基因的細(xì)胞或植物組織，首先用潮霉素抗性等抗藥性選擇，接著利用通常方法使植物體再生。從轉(zhuǎn)化細(xì)胞到植物體的再生，可根據(jù)植物細(xì)胞的種類采用同領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。將植物培養(yǎng)細(xì)胞作為宿主使用時(shí)，轉(zhuǎn)化是利用基因槍法、電穿孔法等將重組載體導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化的結(jié)果得到的愈傷組織、芽、毛狀根等，可直接在細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)或器官培養(yǎng)中使用，并且使用以往公知的植物組織培養(yǎng)法，通過投入適當(dāng)濃度的植物激素 (生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯、油菜素留醇等)等，能夠使其再生為植物體?？赏ㄟ^PCR法、Southern雜交法、Northern雜交法等來確認(rèn)基因是否導(dǎo)入植物內(nèi)。 例如從轉(zhuǎn)化植物中制備DNA，設(shè)計(jì)DNA特異性引物進(jìn)行PCR。一旦取得本發(fā)明的多核苷酸整合到基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)化植物體，通過該植物體的有性生殖或無性生殖可得到其后代。此外，從該植物體或其后代、或從該植物體或其后代的克隆體中，例如得到種子、果實(shí)、切穗、塊莖、塊根、植株、愈傷組織、原生質(zhì)體等，以這些為基礎(chǔ)能夠量產(chǎn)該植物體。因此，本發(fā)明包括可表達(dá)地導(dǎo)入本發(fā)明的多核苷酸的植物體，或具有與該植物體相同性質(zhì)的該植物體的后代，或來自上述植物體或其后代的組織。對(duì)各種植物的轉(zhuǎn)化方法已有報(bào)導(dǎo)，作為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體植物，例如可以為芝麻、稻子、煙草、大麥、小麥、油菜籽、馬鈴薯、番茄、白楊、香蕉、有加利樹、甘薯、大豆、紫花苜蓿、羽扇豆、玉米、菜花、薔薇、菊花、康乃馨、金魚草、仙客來、蘭花、洋桔梗、洋水仙、大丁草、唐菖蒲、霞草、長(zhǎng)壽花、百合、天竺葵屬植物、天竺葵、矮牽牛、藍(lán)翅草、郁金香、連翹、擬南芥、亞麻及百脈根等，但不限于這些。在優(yōu)選實(shí)施方式中，可使用芝麻制作本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。芝麻的轉(zhuǎn)化體的制作方法， 例如可以為 T. Asamizu !Transformation of sesame plants using MAT vector system introduction of fatty acid desaturase genes. Sesame Newsletterl6 :22 25 (2002) 中記載的公知方法。使用如此得到的轉(zhuǎn)化芝麻，因?yàn)樵谠撝ヂ閮?nèi)生產(chǎn)甲基化木脂素，所以能夠用低成本且環(huán)境低負(fù)荷的生產(chǎn)工序生產(chǎn)甲基化木脂素(胡椒醇及/或松脂醇)。在其它優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可優(yōu)選使用煙草。煙草和矮牽牛都是容易轉(zhuǎn)化的代表性植物，由單個(gè)除去細(xì)胞壁的細(xì)胞(原生質(zhì)體)可再生單個(gè)植物個(gè)體。這種再生的單個(gè)植物個(gè)體與來自多細(xì)胞的單個(gè)個(gè)體不同，不會(huì)形成嵌合體狀，能夠高效制作轉(zhuǎn)化體。煙草轉(zhuǎn)化的優(yōu)選方法可為葉盤法。這種方法操作容易，可從1枚葉切片上得到數(shù)個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化的方法例如在“新生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)3核酸的分離、分析和基因試驗(yàn)法化學(xué)同人”日語原名『新生物化學(xué)実験O手引t 3核酸O分離 分析i遺伝子実験法化學(xué)同人」(1996年)中有記載。使用上述得到的轉(zhuǎn)化煙草，能夠用低成本且環(huán)境低負(fù)荷的生產(chǎn)工序生產(chǎn)木脂素甲
基化酶。在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可優(yōu)選使用稻子。使用轉(zhuǎn)化稻子，能夠用低成本且環(huán)境低負(fù)荷的生產(chǎn)工序在該稻子內(nèi)生產(chǎn)木脂素甲基化酶。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，只要是含有木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)的生物，不論是什么生物種類，只要導(dǎo)入上述多核苷酸就可生產(chǎn)該甲基化木脂素。使用導(dǎo)入含有編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體，能夠催化植物等生物中內(nèi)在的木脂素進(jìn)行甲基化的反應(yīng)，所以可用低成本且環(huán)境低負(fù)荷的生產(chǎn)工序大量制備甲基化木脂素。并且，本發(fā)明通過大量制備甲基化木脂素，能夠提供廉價(jià)的食品或工業(yè)制品。使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，能夠在低成本且環(huán)境低負(fù)荷的條件下提供催化木脂素甲基化反應(yīng)的多肽。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及的細(xì)胞可以為各種細(xì)菌宿主。本實(shí)施方式涉及的細(xì)胞，可通過下述方式取得，即將含有本發(fā)明涉及的多核苷酸的重組載體導(dǎo)入被該多核苷酸編碼的多肽可表達(dá)的細(xì)胞中。同領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)本說明書中的記載容易理解如果導(dǎo)入含有編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的重組表達(dá)載體，就能夠?qū)募?xì)菌到高等植物的廣泛范圍的生物賦予木脂素甲基化能力。本發(fā)明的細(xì)胞，只要是含有木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)的生物，不論是什么生物種類，只要導(dǎo)入上述多核苷酸就可生產(chǎn)該甲基化木脂素。使用導(dǎo)入含有編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的重組表達(dá)載體的細(xì)胞，能夠催化該細(xì)胞內(nèi)的木脂素甲基化反應(yīng)，所以可用低成本且環(huán)境低負(fù)荷的生產(chǎn)工序大量制備甲基化木
14脂素。并且本發(fā)明通過大量制備甲基化木脂素，能夠提供廉價(jià)的食品或工業(yè)制品。使用本發(fā)明的細(xì)胞，能夠在低成本且環(huán)境低負(fù)荷的條件下提供催化木脂素甲基化反應(yīng)的多肽。(C)多肽的生產(chǎn)方法本發(fā)明提供生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法。使用本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)方法，能夠在低成本且環(huán)境低負(fù)荷的條件下提供催化木脂素甲基化反應(yīng)的多肽。此外，使用本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)方法，可容易生產(chǎn)催化木脂素甲基化反應(yīng)的多肽。本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)方法，可使用含有編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的載體。本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)方法，優(yōu)選將上述載體用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系。使用無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系時(shí)，可使用各種市售的試劑盒。優(yōu)選本實(shí)施方式的多肽的生產(chǎn)方法包括孵育上述載體和無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成液的工序。本實(shí)施方式的多肽的生產(chǎn)方法，也可使用重組表達(dá)體系。使用重組表達(dá)體系時(shí)，可采用下述方法等，即將本發(fā)明的多核苷酸整合到重組表達(dá)載體內(nèi)后，利用公知的方法可表達(dá)地導(dǎo)入宿主內(nèi)，然后精制在宿主內(nèi)翻譯得到的上述多肽的方法。重組表達(dá)載體，可以是質(zhì)粒也可以不是質(zhì)粒，只要能夠?qū)⒛繕?biāo)多核苷酸導(dǎo)入宿主內(nèi)即可。優(yōu)選本實(shí)施方式的多肽的生產(chǎn)方法包括將上述載體導(dǎo)入宿主內(nèi)的工序。宿主可使用原核生物或真核生物，作為原核生物宿主，例如可使用屬于 hcherichia屬的細(xì)菌(例如大腸桿菌(Escherichia coli)等)、例如屬于Bacillus屬的細(xì)菌(例如、Bacillussubtilis)等。作為真核生物宿主，可使用低等真核生物(例如酵母或絲狀菌等真核生物微生物)。作為酵母，可以為Saccharomyces屬微生物(例如Saccharomyces cerevisiae等)，作為絲狀菌，可以為Aspergillus屬微生物(例如 Aspergillus oryzae、Aspergillus niger 等)、Penicillium 屬微生物。此夕卜，動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞可作為宿主使用。作為動(dòng)物細(xì)胞，可以為小鼠、大鼠、猴子、人體等的細(xì)胞。并且， 昆蟲細(xì)胞(例如蠶細(xì)胞、或蠶的成蟲)也可作為宿主使用。上述宿主細(xì)胞沒有特別限定，可優(yōu)選使用以往公知的各種細(xì)胞。具體來說，例如可以為大腸桿菌(Escherichia coli)等細(xì)菌、酵母(出芽酵母&iccharomyces cerevisiae、 分罾 _ 母 Schizosaccharomyces pombe)、線蟲(Caenorhabditis elegans)、φ yjfl JTl M (Xenopus laevis)的卵母細(xì)胞等，沒有特別限定。對(duì)上述宿主細(xì)胞而言合適的培養(yǎng)基以及條件，為同領(lǐng)域內(nèi)所公知。這樣在宿主內(nèi)導(dǎo)入外源多核苷酸時(shí)，關(guān)于表達(dá)載體，優(yōu)選以外源多核苷酸表達(dá)的方式整合在宿主內(nèi)發(fā)揮功能的啟動(dòng)子。精制重組產(chǎn)生的多肽的方法，因使用的宿主、多肽的性質(zhì)的不同而不同，可利用標(biāo)簽(tag)等比較容易地精制目標(biāo)多肽。本實(shí)施方式涉及的多肽的生產(chǎn)方法，優(yōu)選還包括從含有本發(fā)明的多肽的細(xì)胞或組織的提取液中精制該多肽的工序。精制多肽的工序，優(yōu)選利用公知的方法(例如破壞細(xì)胞或組織后進(jìn)行離心分離，回收可溶性組分的方法)，從細(xì)胞、組織中制備細(xì)胞提取液后，通過公知的方法(例如硫酸銨沉淀或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換色譜法、磷酸纖維素層析法、疏水相互作用色譜法、親和色譜法、羥基磷灰石色譜法、及凝集素層析法)從該細(xì)胞提取液中精制的工序，但并不限于此。最優(yōu)選使用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行精制。本發(fā)明的多肽，可以從天然表達(dá)本發(fā)明的多肽的細(xì)胞或組織中精制該多肽，也可以通過化學(xué)合成制備。制作突變多肽的方法，沒有特別限定，例如可以通過使用下述方法，制作突變多肽。即位點(diǎn)專一誘變法(例如參照 Hashimoto-Gotoh，Gene 152，271-275 (1995))，利用 PCR 法在堿基序列中導(dǎo)入點(diǎn)突變制作突變多肽的方法，或通過插入轉(zhuǎn)座子制作突變株的方法等公知的制作突變多肽的方法。制作突變多肽時(shí)也可利用市售的試劑盒。因此，本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)方法，只要至少根據(jù)具有木脂素甲基化活性的多肽的氨基酸序列、或編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的堿基序列，使用公知的常用技術(shù)即可。(D)甲基化木脂素生產(chǎn)方法到目前為止，木脂素及甲基化木脂素的生產(chǎn)是通過提取芝麻進(jìn)行的，因此存在無法大量生產(chǎn)等問題，但是，根據(jù)本發(fā)明能夠低成本大量生產(chǎn)木脂素及甲基化木脂素。本發(fā)明提供用表達(dá)本發(fā)明的多肽的生物體或細(xì)胞來生產(chǎn)甲基化木脂素的方法。上述生物體可以是天然的未改變的生物體，也可以是使用重組表達(dá)體系的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的甲基化木脂素生產(chǎn)方法，能夠高效生產(chǎn)木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的甲基化木脂素生產(chǎn)方法的特征在于，使用用編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的生物體或其組織，生產(chǎn)甲基化木脂素。優(yōu)選上述生物體是上述轉(zhuǎn)化體植物或細(xì)菌，特別優(yōu)選大腸桿菌、芝麻、連翹或亞麻。本發(fā)明的甲基化木脂素生產(chǎn)方法，包括將編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸導(dǎo)入上述生物體內(nèi)的工序。將多核苷酸導(dǎo)入上述生物體內(nèi)的工序，使用上述各種基因?qū)敕椒纯伞?本實(shí)施方式在該方面，上述生物體在轉(zhuǎn)化前產(chǎn)生的甲基化木脂素和轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的甲基化木脂素的組成不同。具體來說，從上述生物體中得到的木脂素和甲基化木脂素的含有率增力口。 本實(shí)施方式該方面涉及的甲基化木脂素生產(chǎn)方法，優(yōu)選還包括從上述生物體中提取甲基化木脂素的工序。本發(fā)明的甲基化木脂素生產(chǎn)方法，包括將本發(fā)明的寡核苷酸作為反義寡核苷酸導(dǎo)入天然表達(dá)本發(fā)明的多肽的生物體內(nèi)的工序。將寡核苷酸導(dǎo)入上述生物體內(nèi)的工序，使用上述反義RNA技術(shù)即可。本實(shí)施方式涉及的甲基化木脂素生產(chǎn)方法，優(yōu)選還包括下述工序， 即使用上述抗體或寡核苷酸來鑒定天然表達(dá)本發(fā)明的多肽的生物體的工序。本實(shí)施方式該方面涉及的甲基化木脂素生產(chǎn)方法，優(yōu)選還包括從上述生物體中提取甲基化木脂素的工序。在本實(shí)施方式中，上述生物體在導(dǎo)入上述寡核苷酸之前產(chǎn)生的甲基化木脂素和導(dǎo)入后產(chǎn)生的甲基化木脂素的組成不同。具體來說，從上述生物體得到的木脂素及甲基化木脂素的含有率降低。(E)食品和工業(yè)制品本發(fā)明提供使用根據(jù)上述甲基化木脂素生產(chǎn)方法得到的甲基化木脂素制造的食品及工業(yè)制品。本項(xiàng)中記載的食品，可以是上述轉(zhuǎn)化植物體的種子、果實(shí)、切穗、塊莖及/或塊根，也可以是使用從上述轉(zhuǎn)化植物體中提取的甲基化木脂素制造的食品(例如芝麻、連翹或亞麻、或其加工食品)。本發(fā)明涉及的食品或工業(yè)制品，可含有期望量的木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)。例如，可以將從上述甲基化木脂素含量增加的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物中提取的甲基化木脂素提取液，作為甲基化木脂素含量高的食品提供。此外，不僅限于提取的甲基化木脂素，還可以將上述轉(zhuǎn)化植物體的種子、果實(shí)、切穗、塊莖及/或塊根等作為含有大量甲基化木脂素的食品提供。使甲基化木脂素的組成改變的對(duì)象沒有特別限定，除植物之外，還可以將動(dòng)物、細(xì)菌或酵母等所有生物作為對(duì)象。此外，根據(jù)木脂素及甲基木脂素的獨(dú)特的物性，本發(fā)明的多肽或多核苷酸，可作為工業(yè)制品(例如薄膜、生物降解性塑料、功能性纖維、潤(rùn)滑油、或洗劑類工業(yè)制品)的原料使用。在本說明書中，雖然記載了芝麻的木脂素甲基化多肽的一個(gè)例子，但本發(fā)明并不限定于來自芝麻的多肽或多核苷酸，本發(fā)明涉及具有木脂素甲基化活性的全部多肽及其應(yīng)用，這一點(diǎn)為同領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉。木脂素甲基化酶可以來自植物、動(dòng)物或微生物中的任何生物，只要具有木脂素甲基化酶活性就能夠控制木脂素的量。并且，本發(fā)明還涉及通過導(dǎo)入編碼木脂素甲基化酶的多核苷酸而制作的木脂素的量得到調(diào)節(jié)的植物、其后代或它們的組織，其形態(tài)可以為切花。使用本發(fā)明的木脂素甲基化多肽，能夠促進(jìn)或抑制甲基化木脂素的生成。此外，使用通常方法，將上述多核苷酸導(dǎo)入植物內(nèi)，使該多核苷酸結(jié)構(gòu)或組織特異性表達(dá)，使目標(biāo)多肽的表達(dá)增加，以及通過使用反義法、共抑制法及RNAi法等，能夠抑制目標(biāo)多肽的表達(dá)，易為同領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。
實(shí)施例本發(fā)明根據(jù)以下的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明，但并不限于此。實(shí)施例中使用的分子生物學(xué)的方法，只要沒有另外詳述，均根據(jù)國際公開 W02004/018682 號(hào)公報(bào)(PCT/JP03/10500)或 Molecular Cloning (Sambrook 等、Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989)中i己載白勺方法。實(shí)施例1 芝麻種子的EST分析按照制造商推薦的方法，使用Rapid Excision試劑盒(Mratagene公司)，將公知文獻(xiàn)(國際公開公報(bào)W02005/030944)中記載的來自芝麻的cDNA噬菌體文庫剪切連接到 pBK-CMV噬菌粒(Mratagene社)上，使感染大腸桿菌。從含有來自該芝麻種子的EST的大腸桿菌菌落中隨機(jī)選擇5000克隆體，使用M13RV引物(序列號(hào)5)和M4(_20)引物(序列號(hào)6)，在下述條件下進(jìn)行菌落PCR。在含有IXEx-Taq buffer (TakaRa) ,0. 2mM dNTPs、引物各 0. 2pmol/μ 1、Ex-Taq polymerase 1. 25U的混合液中懸浮大腸桿菌菌落，94°C反應(yīng)5分鐘后，使94°C 1分鐘， 550C 1分鐘，72°C 2分鐘的反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，PCR擴(kuò)增后，72°C保持7分鐘。5 :M13RV 5' —caggaaacagcattgac6 :M4-20 5' -gtaaaacgacggccagt將這些PCR產(chǎn)物供給瓊脂糖凝膠電泳，通過溴化乙錠染色，確認(rèn)pBK-CMV中含有的EST被特異性擴(kuò)增。將這5000種PCR產(chǎn)物4 μ 1禾口 IOunit的ExonucleaseI (USB公司) 和 2unit 的 Shrimp Alkaline phosphatase (USB 公司)混合，37°C保持 30 分鐘，80°C保持 20分鐘結(jié)束酶反應(yīng)。使用該酶反應(yīng)液1 μ 1，在下述條件下進(jìn)行直接測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序反應(yīng)液含有Bl反應(yīng)液 1 U l、5x BigDyeSequencingBuffer ver. 3. 1 (Applied Biosystems) 3 μ 1、 BigDyeSequencing RRver. 3. !(Applied Biosystems) 2 μ 1U. 6p mol/μ 1M13RV 弓L 1 μ 1、
17滅菌水13 μ 1。測(cè)序反應(yīng)是在96°C反應(yīng)1分鐘后，使96°C 10秒、50°C 5秒、60°C 4分鐘的反應(yīng)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。測(cè)序反應(yīng)液利用DyeEx96 (QIAGEN公司)，根據(jù)制造商推薦的方法生成， 使用 Sequen cer model 3100 (Applied Biosystems 公司)決定堿基序列。得到的5000種堿基序列用Blastx進(jìn)行同源檢索，從其中鑒定出與甲基化酶基因具有同源性的2種芝麻甲基化酶(Sesamum indicum O-methyltransferase ；以下略為 SiOMT)的部分序列。Blastx分析的條件如下所述，程序Blastx ver. 2. 2. 9，數(shù)據(jù)庫 nr,遺傳密碼standard (1),過濾器:L0ff complexity> Expect :10, Word size :3, Matrix BLOSUM 62, Gap Costs !Existence 11, Extension 1。實(shí)施例2 芝麻甲基化酶基因的表達(dá)分析為了分析通過EST分析得到的二種SiOMTl和Si0MT2基因表達(dá)模式，對(duì)于公知文獻(xiàn)(國際公開公報(bào)W02005/030944)記載的芝麻的不同器官的cDNA，在以下條件下進(jìn)行 RT-PCR。PCR 反應(yīng)液含有 cDNA 1 μ UlXEx-Taq buffer(TakaRa) ,0. 2mM dNTPs、引物各 0. 2pmol/y 1,Ex-Taq polymerase 1. 25U。94°C反應(yīng) 5 分鐘后，使 94°C 1 分鐘、55°C 1 分鐘、 72°C 2分鐘的反應(yīng)進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，PCR擴(kuò)增后，72°C保持5分鐘。作為SiOMTl及Si0MT2 特異性引物，使用SiOMTl-FW(序列號(hào)7)和SiOMTl-RV (序列號(hào)8)以及Si0MT2_FW(序列號(hào) 9)和Si0MT2-RV(序列號(hào)10)。為了比較SiOMT基因的表達(dá)量和內(nèi)源性基因的表達(dá)量，同時(shí)進(jìn)行作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的基因的PCR反應(yīng)。具體來說，使用SilSSrRNA-F引物(序列號(hào)11)和 Sil8SrRNA-R引物(序列號(hào)12)，進(jìn)行芝麻的18S ribosomal RNA基因(登錄號(hào)AF169853) 的PCR反應(yīng)。序列號(hào) 7 :Si0MTl_FW :5 '-ttgccccatgtcattcaagatj^^lj-^· 8 :Si0MTl-RV 5 ‘-aaaattcagacttataacgataccaaa序歹Ij號(hào) 9 :Si0MT2_FW :5 ‘-ttagaaaaactcaattcgtctaat序列號(hào) 10 :Si0MT2_RV :5 '-cctacatccacgacggaatccaaa序列號(hào) 11 :Sil8SrRNA-FW 5' -tatgcttgtctcaaagattaa；！5歹Ij號(hào) 12 :Sil8SrRNA-RV 5' -aacatctaagggcatcacaga將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，進(jìn)行溴化乙錠染色的結(jié)果，確認(rèn)兩SiOMT基因(SiOMTl和 Si0MT2)均在種子內(nèi)強(qiáng)烈表達(dá)(圖2-2A)。即可確認(rèn)兩SiOMT基因表達(dá)區(qū)域和甲基化木脂素的蓄積區(qū)域一致。實(shí)施例3 芝麻甲基化酶基因的克隆因?yàn)閮蒃ST克隆未含推定ORF的5’區(qū)域，所以使用5’ RapidAmplification of cDNA End(以下稱5’ RACE)法，擴(kuò)增各SiOMT基因的5’區(qū)域。具體來說，根據(jù)制造商推薦的方法使用Gene Racer kit Qnvitrogen公司)，用以下引物(序列號(hào)13 16)，擴(kuò)增各5’ 區(qū)域。序歹丨J號(hào) 13 GR-SiOMTI-RV :5，-ccggcccactgttcgggtcctaacgggaaa；^歹Ij號(hào) 14 SiOMTI-NEST-RV 5' -gcaaatccacttcataaaaat序歹丨J號(hào) 15 :GR-Si0MT2-RV :5，-cctcgggttccgctctttctgctcccagaa序列號(hào) 16 :Si0MT2-NEST-RV :5，-atcaatttgggaaattacaaa對(duì)于Si0MT2，因?yàn)镋ST克隆未含推定ORF的3’末端，所以使用序列號(hào)17和18的引物進(jìn)行3，RACE。序列號(hào) 17 :GR-SiOMT2-FW 5' -gaagatcgccccatgagcatgaaacccttt序歹丨J號(hào) 18 :SiOMT2-NEST-FW :5，-aacgtcgttctgggagcagaaaga由RACE法得到的擴(kuò)增片段的堿基序列通過引物步移法決定，得到包括SiOMTl和 Si0MT2基因的全長(zhǎng)開放閱讀框的堿基序列信息(序列號(hào)1和序列號(hào)19)。SiOMTl和Si0MT2相互在氨基酸序列中顯示的序列同一性，對(duì)于序列同一性， 采用默認(rèn)值(default)設(shè)定，使用 Clustal W alignment 程序(Mac Vector ver. 7. 2. 2 (Sy manteccorporation))。通過Blastx分析得到的SiOMT基因的全長(zhǎng)cDNA序列(h ttp://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，檢索具有同源性的已知蛋白質(zhì)。Blastx分析的條件如下所述。程序Blastxver. 2. 2. 9，數(shù)據(jù)庫nr，遺傳密碼standard(l)，過濾器L0W complexity, Expect :10, Word size :3, Matrix :BL0SUM62, GapCosts :Existence 11, Extension 1。Blastx 分析結(jié)果 Il 示,SiOMTl 與 Catharanthsus roseus Caffeic acid-O-methyltransferase (COMT) (AAK20170)有 74 % 序列同一性，SiOMT2 與 Rosa hybrida (AAM23004)的 Orcinol-O-methyltransferase (00ΜΤ)有 57 % 的序列同一'性。由此可見，兩SiOMT與已知甲基化酶之間的序列同一性都不算高。因此，不能推定得到的兩 SiOMT基因的功能。即得到的兩SiOMT基因就是到目前為止仍未分離的木脂素甲基化酶的可能性非吊尚。實(shí)施例4 大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建對(duì)于SiOMTl，使用序列號(hào)20和21的引物對(duì)，將在cDNA的起始蛋氨酸密碼子(ATG) 的上游具有BglII位點(diǎn)、在終止密碼子的下游具有MlI位點(diǎn)的片段，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。另一方面，對(duì)于Si0MT2，使用序列號(hào)22和23的引物對(duì)，將在cDNA的起始蛋氨酸密碼子(ATG)的上游具有BamHI位點(diǎn)、在終止密碼子的下游具有B10I位點(diǎn)的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR使用的引物如下所示。j^^lJ^j 20 :Bgl2-Si0MTI-Fff 5' —aaaacatgtatggcggatcagtccgaggaagaagaggcttt序列號(hào) 21 SalI-SiOMTl-RV :5，-attgtcgacttatgaaattccatgatccaaatattj^^lJ^j 22 :BamHI-SiOMT2-Fff 5' —aaaggatccatggcgatggttaaccaaaagcaaaatctt23 :XhoI-Si0MT2-RV 5' —aaactcgagttaaggatatatctcgatgatagatctcaaPCR反應(yīng)液(25μ1)含有作為模板的芝麻種子cDNA、各引物0. 2p mol/μ U 1XK0D plus buffer (TOYOBO) ,0. 2m MdNTPsUmM MgSO4UU KOD plus polymerase 94°C 反應(yīng)5分鐘后，使94°C 1分鐘、55°C 1分鐘、72 °C 2分鐘的反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，PCR擴(kuò)增后， 72°C保持3分鐘。將得到的各PCR產(chǎn)物，根據(jù)制造商推薦的方法，插入pCR4 Blunt-TOPO vector (Invitrogen)的多克隆位點(diǎn)，得到 SiOMTl/pCR 4B lunt-ΤΟΡΟ(稱為 pSPB 2678)、 SiOM T2/pCR4 Blunt-ΤΟΡΟ (稱為 pSPB 2679)。分析pSPB^78和pSPB^79中含有的SiOMT堿基序列，確認(rèn)是否進(jìn)行了正確的 PCR0將這些質(zhì)粒在附加在PCR引物上的限制酶位點(diǎn)消化，得到全長(zhǎng)SiOMT，將含有該SiOMT 的約1. Ikb的DNA片段插入大腸桿菌表達(dá)載體PQE30載體OiIAGEN)的BamHI/MlI位點(diǎn)，得到 Si0MTl/pQE30 (稱為 pSPB2690)、Si0MT2/pQE30 (稱為 pSPB2686)。實(shí)施例5 重組蛋白質(zhì)的制備使用上述制作的大腸桿菌表達(dá)載體pSPB^90和PSPB2686，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株 JM109(T0Y0B0)，在含有最終濃度為20μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37°C前培養(yǎng)一夜。將一部分前培養(yǎng)液添加到含有氨芐青霉素50 μ g/ml、酸水解酪素0. 5%的M9培養(yǎng)基 (IOml)中，振蕩培養(yǎng)直到A6tltl = 0. 6 1. 0。接著，在培養(yǎng)液中加入最終濃度為0. 5mM的IPTG (Isopropyl-β -D-thiogalactopyranoside)，進(jìn)一步在 30°C振蕩培養(yǎng)一夜后，3000rpm、4°C 離心分離10分鐘，集菌。將菌體懸浮在IOml的緩沖液(30mM Tris-HCl (pH7. 5)、2mM MgCl2, 0. 5mM EDTA,50yM APSMF)中，然后進(jìn)行超聲波處理，破碎大腸桿菌，接著15，000rpm、4°C離心分離10分鐘，將得到的上清液作為粗酶液用于以下活性測(cè)定。實(shí)施例6 芝麻木脂素甲基化酶的生成物的分析將酶反應(yīng)的底物使用的芝麻木脂素溶解于少量的DMSO中，然后再溶解于 70%乙醇中，制備底物溶液(lmg/ml)。芝麻木脂素例如可根據(jù)公知的方法(日本農(nóng)藝化學(xué)會(huì)志67 :1693(1993))(日語原名日本農(nóng)蕓化學(xué)會(huì)誌)，從芝麻中提取和精制得到。將底物溶液10 μ 1、在大腸桿菌中表達(dá)的SiOMT的上述粗酶液200 μ 1及IOmM S-Adenosyl-L-Mathianine (SAM) 10 μ 1在反應(yīng)試管中混合，然后使其在30°C反應(yīng)2小時(shí)。在反應(yīng)試管內(nèi)添加含有0. 三氟乙酸(TFA)的100%乙腈Q50 μ 1)，結(jié)束酶反應(yīng)。用旋渦混合器(Vortex Mixer)劇烈攪拌反應(yīng)試管，然后15，000rpm、4°C離心分離5分鐘，將得到的上清液用過濾器(孔徑0. 45mm,4mm Millex-LH.Millipore)洗凈，然后使用高效液相色譜法(以下稱為HPLC)分析該上清液。木脂素及其甲基化木脂素的分析條件如下所示。使用C-30柱(野村化學(xué)C30-UG-5、4. 6mm X 150mm)，進(jìn)行液相色譜法 (Lc-2010c (島津制作所))。流動(dòng)相中，A液使用0. 1%1 八，8液使用含有0. 1%TFA的90% 乙腈。使用A液80% :B液20%的混合液平衡柱子(20分鐘)后，使用直線濃度梯度(A液 80% :B液20%—A液10% ；B液90% )，洗脫20分鐘(流速0. 6m 1/分)，進(jìn)一步使用A 液10% =B液90%洗脫7分鐘。測(cè)定^Onm處的吸收，檢測(cè)樣品中含有的化合物。對(duì)于化合物的各吸收峰，使用SPD-10AV (島津制作所)測(cè)定其在190nm 400nm處的光譜，分析具有木脂素的2個(gè)特征最大吸收峰O30nm和^Onm)的物質(zhì)。在該條件下，在約11. 8分鐘檢測(cè)出松脂醇標(biāo)準(zhǔn)品，在約15. 5分鐘檢測(cè)出胡椒醇標(biāo)準(zhǔn)品，在約16. 8分鐘檢測(cè)出芝麻素酚標(biāo)準(zhǔn)品。在SiOMTl重組蛋白質(zhì)和松脂醇的反應(yīng)液中，新得到具有木脂素光譜的保留時(shí)間為14. 0分鐘的吸收峰A(圖3-3A)。此外，在SiOMTl重組蛋白質(zhì)和胡椒醇的反應(yīng)液中，新得到具有木脂素光譜的保留時(shí)間約為17. 7分鐘的吸收峰B (圖3-3B)。在Si0MT2重組蛋白質(zhì)和松脂醇或胡椒醇的反應(yīng)液中，沒有發(fā)現(xiàn)新的生成物(圖 4-3C 3D)。并且發(fā)現(xiàn)，SiOMTl和Si0MT2對(duì)芝麻素酚沒有木脂素甲基化活性。接著，利用LC-MS分析，決定由SiOMTl生成的新型木脂素的分子量(液相色譜法 (LC) =Waters 2795 (Waters 公司)，質(zhì)量分析器QUATRO micro (Micro 公司))。用 50%丙酮5ml洗凈填充有Iml DIAION HP-20樹脂(三菱化學(xué))的色譜柱，然后用IOml水平衡。將含有由SiOMTl生成的甲基化木脂素的酶反應(yīng)液裝入色譜柱，用5ml水洗凈雜質(zhì)，然后使用80%丙酮2ml進(jìn)行洗脫。使用蒸發(fā)儀將洗脫液干燥固化后，再溶解于含甲酸的90%乙腈(ΙΟΟμΙ)中，作為L(zhǎng)C-MS分析樣品。LC條件如下所示。使用Develosil C30-UG-3柱(野村化學(xué)3. 0X 150mm)，對(duì)于流動(dòng)相，A液使用水， B液使用100%乙腈，C液使用1 %甲酸，D液使用100m M乙酸銨水溶液。使用10分鐘的直線濃度梯度(A液60% :B液30% :C液5% :D液A液10% :B液80% :C液5% =D 液5%)洗脫，然后使用A液10% :B液80% :C液5% :D液5%，洗脫5分鐘(流速通常 O.aiil/分)。作為銨加合離子檢測(cè)信號(hào)。在這種條件下，約8. 3分鐘檢測(cè)出吸收峰A，約11. 3分鐘檢測(cè)出吸收峰B (圖3 5)。使用離子模型(ion mode)ES+,Cone voltagel5V,Collision 2eV 的 MS 條件，在 100 800(m/z，30分)的范圍進(jìn)行MS掃描，在210 400nm(30分)的范圍測(cè)定PDA。上述條件下的LC-MS分析結(jié)果是，吸收峰A的銨加合離子分子量373 (m/z)，吸收峰 B的銨加合離子分子量371 (m/z)。(圖6-4A、圖7-4B)。因此，鑒定這些吸收峰分別是松脂醇(銨加合離子分子量359)的單甲基化物，及胡椒醇(銨加合離子分子量374)的單甲基化物。以上結(jié)果證明，SiOMTl是對(duì)芝麻木脂素松脂醇及胡椒醇具有單甲基化活性的酶。實(shí)施例7 芝麻木脂素甲基化酶同源基因的分離為了證明在芝麻種間是否功能性及結(jié)構(gòu)性地保存有具有木脂素甲基化活性的酶基因，嘗試從與栽培芝麻品種Sesamum indicum在細(xì)胞遺傳學(xué)上不同的非洲芝麻(Sesamum radiatum)中，分離 SiOMTl 的 Counterpart gene (SrOMTl)。S. radiatum是非洲現(xiàn)存的芝麻植物，根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)分析，確定染色體數(shù)為2n = 64，是與栽培芝麻品種S. indicum (2n = 26)在遺傳學(xué)上不同的系統(tǒng)(參考文獻(xiàn)、并木滿夫、小林貞作“芝麻的科學(xué)”朝倉書店)(日語原名『7 O科學(xué)」)。但是，已知S. radiatum種子中也蓄積有多種木脂素(參考文獻(xiàn)、Bedigian, D.等、Biochemical Systematics and Ecology 13:133-139(1985))。 因此，期望S. radiatum的基因組中含有與S. indicum的SiOMTl相對(duì)應(yīng)的基因。使用S. radiatum 種子的 cDNA，使用 Bgl2_Si0MTl_FW(序列號(hào) 20 及) &ilI-Si0MTl-RV(序列號(hào)21)的引物對(duì)，通過PCR嘗試SrOMTl的擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)液含有S. radiatum 種子的 cDNAl μ IUXEx-Taq buffer (TakaRa)、0· 2m MdNTPs、引物各 0· 2p mol/μ 1、Ex-Taq polymerase 1. 25U。94°C反應(yīng) 5 分鐘后，使 94°C 1 分鐘、55°C 1分鐘、72°C 2分鐘的反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，PCR擴(kuò)增后，72°C保持5分鐘。根據(jù)制造商推薦的方法，將得到的約1. Ik b的PCR產(chǎn)物插入pCR2-T0P0 vector Qnvitrogen公司)的多克隆位點(diǎn)內(nèi)，得到SrSi0MTl/pCR2-T0P0(pSPB^10)。根據(jù)引物步移法，決定pSPB^lO中含有的SrOMTl的堿基序列(及氨基酸序列)(序列號(hào)3和4)。SrOMTl與SiOMTl在氨基酸序列中有89%的序列同一性。對(duì)于序列同一性，設(shè)定默認(rèn)值(default)，使用Clustal W alignment程序(Mac Vector ver. 7. 2· 2 (Symanteccorporation))。這種高序列同一性強(qiáng)有力地支持 SrOMTl 是 SiOMTl 白勺 Counterpart gene。采用與實(shí)施例2同樣的方法進(jìn)行RT-PCR，確認(rèn)SrOMTl的種子特異性基因表達(dá)(圖 2-2B)。
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與實(shí)施例4相同，構(gòu)建SrOMTl的大腸桿菌表達(dá)載體Sr0MTl/pQE30 (pSPB2911)，與實(shí)施例5同樣制備重組蛋白質(zhì)，與實(shí)施例6同樣對(duì)其活性及生成物進(jìn)行分析。SrOMTl與SiOMTl相同，對(duì)松脂醇和胡椒醇顯示甲基化活性(圖5)。此外，SiOMTl 對(duì)芝麻素酚不顯示甲基化活性。上述結(jié)果表明，SrOMTl是SiOMTl的Counterpart gene，本酶基因保留在芝麻種間。實(shí)施例8 =SiOMTl的基因組Southern分析為了搞清楚芝麻基因組內(nèi)的SiOMTl基因的拷貝數(shù)，實(shí)施基因組Southern分析。根據(jù)制造商推薦的方法，使用Nucleon Phytopure for Plant Extraction Kit (Amersham^ 司)，從S. indicum(真瀨金品種)的葉子中提取出基因組DNA。將提取的基因組DNA20 μ g 用EC0RI、HindIII，)(h0I或^CbaI消化后，通過使用瓊脂糖凝膠的電泳進(jìn)行分離。使用0. 25M HCl使該瓊脂糖凝膠水解15分鐘后，使用1. 5M NaCl/0. 5M NaOH溶液使其變性(30分鐘)， 通過添加含1. 5M NaCl的Tris-HCl (pH7. 5)在變性溶液中進(jìn)行中和QO分鐘)。接著，將瓊脂糖凝膠內(nèi)的基因組DNA在20XSSC溶液中轉(zhuǎn)印到膜上(Hybribond-N、Amersham公司)。 通過UV照射使轉(zhuǎn)印到膜上的基因組DNA與膜結(jié)合，使用含有7% SDS、50%甲酰胺、5XSSC、 2%封閉試劑、0. 十二烷基肌氨鈉、50m M磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)的雜交緩沖液(高SDS 緩沖液羅氏公司)，在42°C下進(jìn)行1小時(shí)預(yù)雜交。將pSPB^78作為模板，分別使用序列號(hào)20 (Bg 12-SiOMTl-Fff)及序列號(hào) 21 (SalI-SiOMTl-RV)的引物對(duì)，通過PCR制作DIG標(biāo)記的雜交探針。PCR反應(yīng)液含有 PSPB2678 質(zhì)粒 lng、lX PCR 緩沖液(TaKaRa 生物公司)、2. 5mM DIG-dNTP mixture (PCR DIG labeling Mix、羅氏公司)、各引物對(duì) 0. 2pmol、IUrTaq polymerase (TaKaRa 生物公司)。 PCR反應(yīng)是95 °C 30秒、53°C 30秒、72°C 2分鐘的反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將用kphadex G-50 柱-FindBoehringer公司)精制的PCR產(chǎn)物作為雜交探針使用。使該探針進(jìn)行熱變性后， 在預(yù)雜交液中添加15 μ 1，42 °C孵育一夜。雜交之后，通過高嚴(yán)格度的條件(使用含有0. 2XSSC和0. 1 % SDS的溶液，65°C 30 分鐘進(jìn)行2次)洗凈膜。根據(jù)制造商的說明書，使用DIG標(biāo)記&檢測(cè)試劑盒(羅氏公司)， 檢測(cè)雜交信號(hào)。Southern分析的結(jié)果顯示，因?yàn)樵谌魏蜗拗泼赶慕M分中都檢測(cè)出2條以上的條帶，所以與SiOMTl同源性極高的基因至少有1個(gè)以上在芝麻基因組內(nèi)被編碼(圖8)。進(jìn)一步說，期望在芝麻基因組中存在多個(gè)與SiOMTl功能性重復(fù)或類似的酶基因。實(shí)施例9 芝麻木脂素甲基化酶的COMT活性測(cè)定如實(shí)施例3所示，通過數(shù)據(jù)庫檢索，顯示SiOMTl和SrOMTl在已知的蛋白質(zhì)中與 COMT具有最高序列同一性。這表明芝麻甲基化酶也具有COMT活性。討論在實(shí)施例5和實(shí)施例7中表達(dá)的SiOMTl和SrOMTl對(duì)咖啡酸的甲基化活性。 將0. 4m g/m 1咖啡酸10 μ 1、大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的SiOMT的粗酶液200 μ 1及IOmM SAM 10 μ 1 在反應(yīng)試管內(nèi)混合后，30°C反應(yīng)1小時(shí)，然后采用與實(shí)施例6同樣的方法供給HPLC分析。其結(jié)果，SiOMTl和SrOMTl均在與咖啡酸的反應(yīng)液中，生成與標(biāo)準(zhǔn)品阿魏酸的保留時(shí)間一致的吸收峰C (保留時(shí)間約7. 3分鐘(圖9-6A 6C))。在本HPLC分析條件下，咖啡酸在保留時(shí)間約為3. 9分鐘時(shí)被洗脫。在與實(shí)施例6同樣的條件下，進(jìn)行LC-MS分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸收峰C為銨加合離子分子量195 (m/z)(圖10-6D)。因此，確認(rèn)吸收峰C是咖啡酸單(銨加合離子分子量181 (m/z)) 甲基化生成的阿魏酸。因此證明兩種木脂素甲基化酶均具有COMT活性。如上所述，本發(fā)明的多肽和多核苷酸對(duì)甲基化木脂素的生產(chǎn)有用。此外，可表達(dá)地導(dǎo)入了本發(fā)明的多核苷酸的轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞，在食品領(lǐng)域、各種工業(yè)領(lǐng)域中，對(duì)生產(chǎn)甲基化木脂素或使用甲基化木脂素的制品極為有用。上述轉(zhuǎn)化體是植物體的情況下，能夠?qū)⒅参矬w自身作為食品使用，所以在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域等非常有用。通過將本發(fā)明的多肽和多核苷酸與本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的其他酶(合成胡椒醇和芝麻素的酶SiP189)組合，不僅是芝麻，而且可確立特定的木脂素分子種的生產(chǎn)體系，其結(jié)果能夠擴(kuò)大特定木脂素及甲基化木脂素的生產(chǎn)量。因此，本發(fā)明可在農(nóng)業(yè)、食品產(chǎn)業(yè)、醫(yī)藥品產(chǎn)業(yè)及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)廣泛利用。
權(quán)利要求
1.下述(a)或(b)所述的多核苷酸，(a)由序列號(hào)3的堿基序列組成的多核苷酸；(b)編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其為DNA。
3.如權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸，其編碼具有將甲基轉(zhuǎn)移至松脂醇及/或胡椒醇上的活性的蛋白質(zhì)。
4.被所述權(quán)利要求1 3中任一頂所述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。
5.含有所述權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的載體。
6.被權(quán)利要求5所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
7.具有將甲基轉(zhuǎn)移至松脂醇及/或胡椒醇上的活性的蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)或繁殖權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，從該宿主細(xì)胞中提取該蛋白質(zhì)。
8.使用權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，將甲基轉(zhuǎn)移至松脂醇及/或胡椒醇上的方法。
9.制造木脂素組成改變的植物體的方法，所述方法是將權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的多核苷酸導(dǎo)入植物體內(nèi)，通過表達(dá)使產(chǎn)生的木脂素組成改變。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的酶的基因、利用該甲基化酶使木脂素組成改變的植物等。更加具體地說，本發(fā)明涉及具有合成甲基化木脂素活性的酶的基因，優(yōu)選來自芝麻的具有合成甲基化木脂素活性的酶的基因及其利用。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102304535SQ20111015775
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2007年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月29日
發(fā)明者小埜榮一郎 申請(qǐng)人:三得利控股株式會(huì)社