專利名稱：：類黃酮的酶促脫甲基化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物雌激素和它們的制備以及包括這樣植物雌激素的藥物化合物和膳食補(bǔ)充劑。
背景技術(shù)：
：數(shù)世紀(jì)以來啤酒花(/^mw/w/w;^/m丄.)已經(jīng)被用作啤酒釀造的主要原料，提供啤酒的苦味和風(fēng)味。近幾年，該植物作為異戊二烯基類黃酮的一種來源越來越受到關(guān)注，異戊二烯基類黃酮是一種含有附著于苯酚環(huán)之一上的非極性異戊二烯基側(cè)鏈的類黃酮亞類。這些存在于蛇麻素腺中，發(fā)現(xiàn)于雌植株上啤酒花穗內(nèi)的小苞片基部。這些異戊二烯基類黃酮中，兩個(gè)查耳酮(黃腐酚(X)和去甲基黃腐酚(DMX))和三個(gè)黃垸酮(異黃腐酚(IX)，8-異戊二烯基柚皮素(8-PN)和6-異戊二烯基柚皮素(6-PN))圖2)，現(xiàn)在因其有潛在的促進(jìn)健康的特性而更受關(guān)注。X已被確定作為一種強(qiáng)的癌癥化學(xué)保護(hù)劑，而已被證明8-PN是迄今為止分離的最有效的植物雌激素之一，具有比已知的大豆植物雌激素顯著更高的活性。8-PN己被證明在體內(nèi)表現(xiàn)雌激素的活性，預(yù)防大鼠骨丟失，阻止血管生成和轉(zhuǎn)移以及顯示出抗雄性素活性。X作為一種存在于雌啤酒花穗中的主要異戊二烯基査耳酮濃度高達(dá)1%(w/w)，而DMX則以較低的濃度存在(DeKeukeleire等，(2003)J.ofAgric.andFoodChem.51，4436-4441)。不同的啤酒花品種間X/DMX的比率是不同的。通過異構(gòu)化，X被轉(zhuǎn)化成IX以及DMX被轉(zhuǎn)變?yōu)?-PN和6-PN。幾十年前已認(rèn)識到啤酒花的雌激素樣作用。常報(bào)道，用雌啤酒花果沐浴可用于治療婦科紊亂和婦科紊亂和月經(jīng)不調(diào)。在1999年，Milligan等[J.CHn.Endocrinol.Metab.84，2249-2252]在啤酒花中鑒定了一種新的植物雌激素，8-異戊二烯基柚皮素。盡管它比173-雌二醇更少(<1%)，它是迄今為止鑒定的最有效的植物雌激素之一，具有比其他植物雌激素如大豆源的化合物染料木素和大豆黃酮顯著更高的活性?，F(xiàn)在問題是，飲食和/或環(huán)境接觸植物雌激素能否產(chǎn)生健康危險(xiǎn)如內(nèi)分泌干擾。就啤酒花異戊二烯基類黃酮而言，啤酒是主要的飲食源。據(jù)計(jì)算，2001年美國每人每天大約平均消耗225ml啤酒(USDA，2003)。假如消費(fèi)的是該量的美國主流的貯陳啤酒/比爾森啤酒(500-1000ug異戊二烯基類黃酮/1啤酒)，日吸收異戊二烯基類黃酮的量將是大約0.14mg。然而，啤酒的檢測濃度(和因此的平均攝取量)強(qiáng)烈地取決于釀造過程，濃啤酒含有高達(dá)4mg異戊二烯基類黃酮/1。盡管X是啤酒花中主要的異戊二烯基類黃酮(干重的0.1-1%)，其大部分在持續(xù)地煮沸過程中被熱異構(gòu)化轉(zhuǎn)化成IX。因此IX是啤酒中主要的異戊二烯基類黃酮并且其濃度從500yg/l(貯陳啤酒/比爾森啤酒)直到4mg/l(濃啤酒)。類似地，DMX被轉(zhuǎn)變?yōu)?-PN，導(dǎo)致啤酒中的終濃度高達(dá)100wg8-PN/L。但是盡管8-PN具有高的活性，啤酒中總雌激素樣活性仍然比體內(nèi)有害活性濃度(100mg/l)低500至1000倍。(Milligan等，(2002)R印roduction123,235-242)。而且，現(xiàn)在許多啤酒是用啤酒花提取物制造而不是整個(gè)啤酒花，產(chǎn)生較低濃度的8-PN或者根本沒有8-PN。因此，基于現(xiàn)有的知識人們普遍認(rèn)為，適度的啤酒消費(fèi)沒有植物雌激素的不利健康影響。另一方面，現(xiàn)在許多數(shù)據(jù)顯示主動攝取植物雌激素對健康可能有益處(Magee&RowIand(2004)Br.J.Nutr.91，513-531)。除啤酒之外，基于啤酒花的膳食補(bǔ)充劑也被銷售，聲稱有增大乳房和降低熱潮紅的功效。植物雌激素的總體健康影響潛在地源自于許多個(gè)別的植物化學(xué)物質(zhì)與多種植物化學(xué)物質(zhì)的組合作用并且也許是助劑或干擾劑作用。到目前為止，在人類飲食中僅僅異黃酮和木酚素被認(rèn)為是相關(guān)的植物雌激素，特別是因?yàn)槠【浦?-PN的濃度對于正面的或負(fù)面的健康影響來說均被認(rèn)為是太低了幾個(gè)專利出版物描述了飲食類黃酮的有益健康影響，例如使用IX預(yù)防骨密度下降(W004089359)，藥物中使用啤酒花提取物具有雌激素樣特性(W002085393)，以及食品中使用IX或X聲稱具有消炎的或耐老化特性(專利WO03090555)。而且，也建議在用于皮表的化妝品中使用8-PN(CA2426467)。為了在體內(nèi)達(dá)到在體外所聲稱的功效，食用類黃酮需要從內(nèi)臟吸收并且無變化的到達(dá)耙部位。一般而言，單體類黃酮不修飾地通過胃進(jìn)入小腸，在此處從內(nèi)臟中吸收進(jìn)入腸系膜循環(huán)。體外研究顯示了X(Yilmazer等(2001a)FEBSLett.491，252-256)和8-PN(Nikolic等(2004)DrugMetabolismandDisposition32，272-279)吸收后大規(guī)模的肝臟生物轉(zhuǎn)化。然而，小腸中飲食多酚的吸收程度相當(dāng)有限(10-20%)，因此意味著類黃酮的大部分到達(dá)了結(jié)腸。一種8-PN的無異戊二烯化類似物，柚皮素(naringenin)在腸管中顯示增強(qiáng)的微生物所引起的生物轉(zhuǎn)化，包括環(huán)破裂和脫羥基作用(Rechner等，(2004)FreeRadic.Biol.Med.36，212-225)，隨后被吸收并經(jīng)尿排泄掉。很少知道關(guān)于異戊二烯基類黃酮的腸轉(zhuǎn)化。Nookandeh等(2004)Phytochemistry65，561-570，用X以1000mg/kg體重的劑量飼喂大鼠并且從糞便分離出22種代謝產(chǎn)物。然而，回收的類黃酮大部分(89%)是無變化的X。剩下部分由少量的不同代謝產(chǎn)物組成，包括一些IX。Avula等(2004)[J.Chromatogr.Sci.42:378-382]，用大鼠進(jìn)行了一個(gè)類似試驗(yàn)并檢測到大量的無變化X，其數(shù)量僅次于未確認(rèn)的代謝產(chǎn)物。Coldham等(2002)FoodAdditContam.19:1138-1147認(rèn)為IX可能作為一種前雌激素。這種設(shè)想基于肝臟的大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化能力，包括脫甲基化。然而，IX曝露于肝微體沒有引起雌激素樣活性的增加，據(jù)此推斷不會產(chǎn)生8-PN。相比之下，Nicolic等描述了肝微體能夠使IX脫甲基，但不會使X脫甲基(Nikolic等(2005)J.ofMassSpectrom.40，289-299)。然而已表明，除了脫甲基化外，微粒體也修飾了異戊二烯基側(cè)鏈，最后產(chǎn)生多種輕度降解產(chǎn)物。Schaefer等(2003)(J.SteroidBiochem.Mol.Biol.84，359-360)，兩個(gè)測試者口服IX后從尿中鑒定出低水平的8-PN并且由肝臟的脫甲基化促成的。除了肝臟，人體內(nèi)結(jié)腸也是重要的轉(zhuǎn)化場所。人類結(jié)腸含有1012個(gè)微生物/cm3(大約400個(gè)不同種)，具有巨大的催化和水解潛力。這些微生物群落在植物雌激素通常代謝中的重要性已被清楚地證實(shí)。Wang等(2000)Chem.Pharm.Bull.48，1606-1610鑒定了兩種轉(zhuǎn)化木酚素的細(xì)菌并且Decroos等(2005)Arch.Microbiol.183，45-55，最近分離一種微生物聚生體能夠?qū)⒅参锎萍に卮蠖裹S酮轉(zhuǎn)化為牛尿酚。而且，幾種大腸菌因?yàn)榫哂衑-葡糖苷酶，被揭示能夠增強(qiáng)植物雌激素的生物可用性，該酶對于植物雌激素糖苷的水解是需要的(Rowland等(2003)Br.J.Nutr89，S45-S58)。因此，對于植物雌激素生物可用性，內(nèi)臟的微生物群被認(rèn)為是重要的因素(Tumer等(2003)Nutr.Rev.61，204-213)。因?yàn)樵诖破【苹ㄋ胫兄挥芯秃蚢-酸作為重要的啤酒成分具有經(jīng)濟(jì)利益，現(xiàn)已形成的啤酒花不同提取方法目的在于僅僅具體地提取這些化合物。一方面，C02是當(dāng)前啤酒花提取物生產(chǎn)最為接受的溶劑(Palmer&Ting(1995)FoodChem.52，345-352)。與使用常規(guī)的有機(jī)溶劑(乙醇，己垸，甲醇，或二氯甲垸)的步驟相比較，二氧化碳提取提供了更好的可選擇的提取物用于啤酒生產(chǎn)，作為全啤酒花或顆粒酒花的替代。C02提取形成了大量進(jìn)一步衍化和純化產(chǎn)品的基礎(chǔ)，如異-a-酸類和還原的衍生物。另一方法用于更進(jìn)一步純化C02提取物，通過去除不必要的異戊二烯基類黃酮，公開于美國專利US3794744。另一方面，已開發(fā)不同的方法具體地回收和純化異戊二烯基類黃酮(主要為X)。這些提取法的實(shí)例公開于美國專利4121040和德國專利DE19939350。因?yàn)槔眠@些方法能夠容易地回收黃腐酚，很少有興趣去開發(fā)一套方法用于化學(xué)合成X。然而，由于8-PN以低濃度存在于啤酒花穗中，更難從天然提取物回收，因此，通過市場上可買到的柚皮素異戊二烯化來生產(chǎn)8-PN的合成策略已形成。首先，通過低產(chǎn)量的非選擇性直接的柚皮素的C-異戊二烯化或者從根皮乙酰苯開始，來生產(chǎn)8-PN。通過銪(lll)-催化的Claisen重排作用實(shí)現(xiàn)有效的小規(guī)?；瘜W(xué)合成(Gester等(2001)Tetrahedron57，1015-1018)。最近，基于這種方法的工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)已經(jīng)描述在歐洲專利EP1524269中。'盡管啤酒花和啤酒花提取物有廣泛的工業(yè)用途，沒有有效的方法用于生產(chǎn)有生物活性的異戊二烯化植物雌激素如來自天然來源的8-PN。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種從可得自自然資源的5-垸氧基類黃酮生產(chǎn)具有生物活性的異戊二烯化植物雌激素如8-PN的有效方法，以及采用這樣的生物活性異戊二烯化植物雌激素的藥物化合物和膳食補(bǔ)充劑。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有5-垸氧基-類黃酮-轉(zhuǎn)移酶(5-AO-FT)和/或6'-垸氧基-查耳酮-轉(zhuǎn)移酶(6'-AO-CT)活性的組合物。更特別地，本發(fā)明提供了具有5-甲氧基-類黃酮-甲基轉(zhuǎn)移酶(5-MO-FMT)和/或6'-甲氧基-査耳酮-甲基轉(zhuǎn)移酶(6'-MO-CMT)活性的組合物。本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施方式涉及能夠使異戊二烯化5-烷氧基-類黃酮和/或異戊二烯化6'-垸氧基-查耳酮脫垸基化的組合物。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式提供能夠使6'-烷氧基查耳酮黃腐酚(X)和/或5-烷氧基-類黃酮異黃腐酚(IX)脫垸基化的組合物。本發(fā)明的組合物因此能夠生產(chǎn)生物活性植物雌激素，尤其是異戊二烯化植物雌激素，尤其是8-PN。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式，具有5-垸氧基-類黃酮-和/或6'-垸氧基-查耳酮-脫烷基化活性的組合物是這樣的組合物，其包含或來源于非動物源的材料，更特別的是包含或來源于原核生物的材料。更特別地，本發(fā)明的組合物包含細(xì)菌細(xì)胞，或這種細(xì)菌細(xì)胞的提取物、上清液或其他純化或半純化的材料。本發(fā)明的具體實(shí)施方式涉及一種組合物，其包含一種同型乙酸菌，如真桿菌屬(五"Z^"e〃'"msp)或消化鏈球菌屬(尸e;^asfre尸tococcwssp.)，尤其是遲纟愛真木干菌(五w6a"en'w77/〖was^m)或產(chǎn)生f肖"[七鏈球菌(尸印to^"e;fococci^prao^"":y)，或者來自上述菌的提取物、上清液或其他純化的或半純化的材料。本發(fā)明另一具體實(shí)施方式包括細(xì)菌菌株和或包含細(xì)胞、它們的提取物、上清液或其他純化或半純化物質(zhì)的組合物，其中，5-烷氧基-類黃酮-轉(zhuǎn)移酶(5-AO-FT)和/或6'-垸氧基-査耳酮-轉(zhuǎn)移酶(6'-AO-CT)活性的產(chǎn)生被富化，更特別地，是通過用5-烷氧基類黃酮，例如5-甲氧基異戊二烯基類黃酮重復(fù)培養(yǎng)富化的。本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式包含組合物，其包含來自于同型乙酸菌菌株、特別是真桿菌屬、尤其是遲緩真桿菌(五Wac^"/"w//moram)的5-甲氧基(異戊二烯基)類黃酮甲基轉(zhuǎn)移酶和/或6'-甲氧基(異戊二烯基)查耳酮甲基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明的組合物一個(gè)具體實(shí)施方式包含富化的5-烷氧基-類黃酮-轉(zhuǎn)移酶(5-AO-FT)和/或6'-垸氧基-查耳酮-轉(zhuǎn)移酶(6，-AO-CT)活性，來源于其保藏于比利時(shí)微生物協(xié)作保藏中心(BCCM)BCCM/LMG中心的保藏編號LMGP-23546)的遲緩真桿菌(E^6a"m',/mos畫)菌株，。本發(fā)明還提供生產(chǎn)植物雌激素的方法，包括5-垸氧基-類黃酮上5位的脫垸基化或者6'-烷氧基查耳酮上6'位的脫烷基化，其特征在于，該方法是利用非動物的真核生物或原核生物材料體外進(jìn)行的。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，該方法用于生產(chǎn)8-PN。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式，本發(fā)明的方法中脫垸基化是脫甲基化并且用非動物的真核生物或原核生物材料進(jìn)行。更特別地是，所述非動物材料是細(xì)菌菌株或細(xì)菌菌株材料，最特別地是同型乙酸菌，或者它們的純化或部分純化的組份(fraction)或成分(component),例如部分純化或分離的酶，最特別地是，所述細(xì)菌為同型乙酸菌。一個(gè)具體實(shí)施方式涉及用源自于真桿菌屬或消化鏈球菌屬如遲緩真桿菌(五^fl"en'^7//mcw^z)的材料進(jìn)行脫烷基化。本發(fā)明的方法的具體實(shí)施方式還包括異戊二烯化5'-烷氧基-類黃酮和/或異戊二烯化6'-烷氧基-查耳酮的脫烷基化方法。根據(jù)另一具體實(shí)施方式，本發(fā)明提供用于植物來源，更具體的說是來源于啤酒花的5-烷氧基-類黃酮和/或6-垸氧基-査耳酮脫烷基化的方法。根據(jù)具體實(shí)施方式，提供的方法用于6'-烷氧基查耳酮、黃腐酚和/或5-垸氧基-類黃酮，異黃腐酚的脫烷基化。本發(fā)明還包括細(xì)菌細(xì)胞系用于5-烷氧基-類黃酮和/或6'-烷氧基-查耳酮體外脫垸基化的用途，更特別地是5-甲氧基-類黃酮和/或6'-甲氧基查耳酮的脫甲基化D更具體地，所述細(xì)菌細(xì)胞是來自于同型乙酸菌株的細(xì)胞，如來自遲緩真桿菌(五"^"en、M//mowm)的細(xì)胞。一個(gè)更進(jìn)一步的具體實(shí)施方式是細(xì)菌細(xì)胞的應(yīng)用，其中5-烷氧基-類黃酮-轉(zhuǎn)移酶(5-AO-FT)和/或6'-垸氧基-查耳酮-轉(zhuǎn)移酶(6'-AO-CT)活性的產(chǎn)生被提高，例如通過用5-垸氧基類黃酮如5-甲氧基異戊二烯基類黃酮重復(fù)培養(yǎng)來提高。本發(fā)明還提供體外生產(chǎn)植物雌激素的方法，包括以下步驟a)提供一種細(xì)菌菌株或其提取物，更特別地是，所述細(xì)菌為同型乙酸菌，和b)含有5-垸氧基-類黃酮(更特別地5-甲氧基-類黃酮)和域6，-烷氧基-査耳酮(更特別地6，-甲氧基-查耳酮)的組合物與該細(xì)菌菌株或其提取物接觸，由所述細(xì)菌菌株或其提取物將5-烷氧基-類黃酮和/或6'-垸氧基-查耳酮脫垸基化。任選的，該方法還可以包括鑒定和/或純化產(chǎn)出的脫垸基類黃酮。這些方法的具體實(shí)施方式包括提供細(xì)菌菌株提取物，還進(jìn)一步包括富化和純化(任選)細(xì)菌提取物的步驟，目的是具有富化的或純化的5-烷氧基-類黃酮-轉(zhuǎn)移酶(5-AO-FT)活性和/或富化的或純化的6'-烷氧基-查耳酮-轉(zhuǎn)移酶(6'-AO-CT)活性。在以上所述之外或與之不同，本發(fā)明的方法包括對細(xì)菌菌株的5-AO-FT和/或6'-AO-CT活性的產(chǎn)生的進(jìn)行富化的步驟，通過用5-烷氧基類黃酮如5-甲氧基異戊二烯基類黃酮重復(fù)培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還提供了來自于遲緩真桿菌(fiWa"en'wm/!7nowm)的5-甲氧基-異戊二烯基類黃酮甲基轉(zhuǎn)移酶或6'-甲氧基-異戊二烯基查耳酮甲基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明還提供了藥物組合物和膳食補(bǔ)充劑，其中包含了經(jīng)本發(fā)明方法獲得的生物活性植物雌激素。本發(fā)明還提供藥物組合物和食品添加劑，其包含兩種組分用于同時(shí)或依次施用，其中第一組分包含具有5-烷氧基-類黃酮-轉(zhuǎn)移酶(5-AO-FT)和/或6'-烷氧基-査耳酮-轉(zhuǎn)移酶(6'-AO-CT)活性的同型乙酸菌或其提取物或組分，第二組分包含5-垸氧基類黃酮或6'-烷氧基查耳酮或它們的源，如啤酒花提取物。根據(jù)具體實(shí)施方式，所述類黃酮是6'-烷氧基查耳酮黃腐酚或5-垸氧基-類黃酮異黃腐酚。更進(jìn)一步具體實(shí)施方式涉及本發(fā)明的藥物組合物和膳食補(bǔ)充劑，其中同型乙酸菌是遲緩真桿菌(五w^"en'"w/fmcwz^)。任選地，本發(fā)明的藥物組合物中的細(xì)菌是以結(jié)腸特異性給藥制劑的方式提供。本發(fā)明公開了IX能通過非動物的活體生物如人類或動物特別是脊椎動物或哺乳動物的腸道細(xì)菌脫甲基化成為8-PN，IX因此可作為雌激素前體。本發(fā)明進(jìn)一步鑒定了能夠?qū)X轉(zhuǎn)化為8-PN的微生物(例如用這樣微生物培養(yǎng)物體外生產(chǎn)8-PN)。另外，本發(fā)明提供了選擇能夠從IX大量生產(chǎn)8-PN的其它菌株的方法。本發(fā)明還證明了在體內(nèi)通過微生物群體對甲基化類黃酮植物雌激素前體的轉(zhuǎn)化是很不同的并且依賴于個(gè)體內(nèi)微生物群體的組成(個(gè)體間或相同個(gè)體內(nèi)不同時(shí)間都不同)。這可能對個(gè)體受到植物雌激素作用具有重要影響。實(shí)際上，在啤酒花提取物中、啤酒中以及食品或膳食補(bǔ)充劑中，雌激素活性較低的IX的含量比8-PN的濃度高得多通過提供生產(chǎn)活化的植物雌激素(體外或體內(nèi))的方法，本發(fā)明還為當(dāng)前的食用啤酒花提取物提供了有益的替代物或補(bǔ)充物。通過體外預(yù)轉(zhuǎn)化或體內(nèi)/原位脫烷基化能夠控制甲基化類黃酮植物雌激素前體(例如ix)轉(zhuǎn)化為它們的活性脫甲基化合物的不可預(yù)見的產(chǎn)率。這些使得在每個(gè)個(gè)體內(nèi)對與活性組分的接觸進(jìn)行控制成為可能，盡管腸內(nèi)微生物群落存在個(gè)體間差異，或者，使得將這些差異特別將慮在內(nèi)成為可能。這些圖用來圖解本發(fā)明，但不應(yīng)被認(rèn)為將本發(fā)明限制到所示實(shí)施方式。圖l:類黃酮的一般結(jié)構(gòu)。圖2:啤酒花異戊二烯基類黃酮的結(jié)構(gòu)和它們的轉(zhuǎn)化。圖3:糞便培養(yǎng)物(C)與IX共培養(yǎng)(培養(yǎng)0和8天)后的雌激素應(yīng)答(平均值+標(biāo)準(zhǔn)方差)0=3)。圖4:三天后，人類糞便培養(yǎng)物(E-L)將IX(25mg/l)轉(zhuǎn)化為8-PN[平均值+標(biāo)準(zhǔn)方差平均值(11=3)]。圖5:來自于51個(gè)不同人個(gè)體的腸到菌將異黃腐酚(IX)轉(zhuǎn)化為8-異戊二烯基柚皮素(8-PN)。所述個(gè)體按照8-PN產(chǎn)量從低到高排列，結(jié)果表示為IX轉(zhuǎn)化成8-PN的平均％(±標(biāo)準(zhǔn)方差)(11=3)。圖6:尸.,o^"m將IX(25mg/l)轉(zhuǎn)化為8-PN(三個(gè)培養(yǎng)物lnc1，lnc2和Inc3)。對IX的消散(實(shí)心符號)和8-PN產(chǎn)生(空心符號)進(jìn)行為期B天的監(jiān)測。圖7:向糞便培養(yǎng)物B中添加￡.//mowm后IX向8-PN的轉(zhuǎn)化(￡.//woswm培養(yǎng)物的百分比從0%(純糞便樣品)至100。/。(無外來菌的E.limosum培養(yǎng)物))(n-3)圖8:在人類腸微生物生態(tài)系統(tǒng)模擬器中，在允許甲基化甲基類黃酮活化的條件下，IX向8-PN的轉(zhuǎn)化。TWINSHIME中的PF+月空。圖9:在人類腸微生物生態(tài)系統(tǒng)模擬器中，在不允許活化甲基化甲基類黃酮的條件下，IX向8-PN的轉(zhuǎn)化。具體實(shí)施方式定義在整個(gè)本申請中，使用以下縮寫X:黃腐酚；DMX:去甲基黃腐酚；IX:異黃腐酚；8-PN:8-異戊二烯基柚皮素；6-PN:6-異戊二烯基柚皮素5-AO-FT:5-院氧基類黃酮烷基轉(zhuǎn)移酶5-MO-FMT:5-甲氧基-類黃酮甲基轉(zhuǎn)移酶6'-AO-CT:6'-烷氧基查耳酮烷基轉(zhuǎn)移酶6'-MO-CMT:6'-甲氧基-查耳酮甲基轉(zhuǎn)移酶術(shù)語"類黃酮"是指一組基于C,5骨架的有機(jī)分子，其具有一個(gè)色原垸環(huán)(chromane)，該環(huán)的2、3或4位上帶有第二個(gè)苯環(huán)B(圖1A)。圖1A表示在類黃酮上取代基的慣用編號，本發(fā)明亦照此編號。類黃酮的亞組是查耳酮、黃院酮、黃酮、黃垸醇和類異黃酮。查耳酮(圖1B)是黃垸酮(圖1C)的異構(gòu)體。圖1B和2顯示査耳酮上原子的慣用編號。黃烷酮與黃酮(圖1E)的區(qū)別在于它們沒有2、3位的雙鍵。黃酮(圖1E)屬于類黃酮，與黃垸醇(圖1E)相比沒有3-0H基團(tuán)。類異黃酮屬于類黃酮，其中苯環(huán)B位于3位(圖1F)。所有這些亞組都具有一個(gè)4位上的酮官能團(tuán)。本發(fā)明中，術(shù)語"異戊二烯基類黃酮"涉及這樣一類類黃酮，其含有一個(gè)非極性的異戊二烯基側(cè)鏈連接于其中一個(gè)酚樣環(huán)上。異戊二烯基鏈主要出現(xiàn)在8位但也可能在6位，或者既在6位又在8位[在查耳酮中，異戊二烯基鏈位于3'和/或5'位]。在啤酒花中，異戊二烯基類黃酮主要存在于于蛇麻素腺內(nèi)，存在于于雌株的啤酒花穗內(nèi)小苞片的基部。異戊二烯基類黃酮的其他天然源包括例如單節(jié)假木旦(Dencira/o6/應(yīng)/cmceotowm)、苦參(S。//zora/7flvesce—、毛苦參(Sop/zorafowewosa)、面包果(^WocflT/wscom/7zmw力禾口Marshalliagrandiflora。異戊二烯基類黃酮的實(shí)例是查耳酮(如黃腐酚(X)和去甲基黃腐酚(DMX)，脫氫環(huán)黃腐酚(dehydrocycloxanthohumol))和黃烷酮(如異黃腐酚(IX)，8-異戊二烯基柚皮素(8-PN)和6-異戊二烯基柚皮素(6-PN)。術(shù)語"香葉基類黃酮"涉及這樣一類類黃酮，其含有非極性的香葉基側(cè)鏈連接于其中一個(gè)酚樣環(huán)上。實(shí)例包括四羥基香葉基類黃酮，6-香葉基柚皮素，3'-香葉基查耳酮柚皮素和8-香葉基柚皮素。所有這些香葉基化的化合物都曾經(jīng)從啤酒花穗中分離獲得，并且，據(jù)稱，8-香葉基柚皮素具有雌激素樣活性(Milligan等，(2000)J.CHn.Endocrinol.Metab.85，4912-4915)。本發(fā)明中，術(shù)語"酶促脫烷基化或脫甲基化"是指用酶從化合物上去除垸基或甲基。本發(fā)明中，術(shù)語"5-垸氧基脫垸基化"或"5-甲氧基脫甲基化"分別指從類黃酮5位上的烷氧基中去除垸基或者從該位置上的甲氧基(-OCH3)中去除甲基(環(huán)原子編號見圖1A)。在本文中，"5-甲氧基"和"5-0-甲基-"具有相同意思。術(shù)語"5-烷氧基-(異戊二烯基)類黃酮轉(zhuǎn)移酶(5-AO-(P)FT)"指能夠保證5-垸氧基-(異戊二烯基)類黃酮發(fā)生5-垸氧基脫垸基化反應(yīng)的酶。一類特別的類黃酮是查耳酮，其環(huán)原子編號與別不同。因此，相對于査耳酮，本發(fā)明涉及從查耳酮化合物上去除烷基，更特別地是6'-烷氧基脫甲基化，即從查耳酮6'位上的垸氧基(例如甲氧基(-OCH3))中去除甲基(環(huán)原子編號參見圖1B)。在此，"6，-甲氧基"和"6'-0-甲基-"具有相同的意思。確保6'-垸氧基脫垸基化，尤其是6'-甲氧基-脫甲基化進(jìn)行的酶也稱為"6'-烷氧基-(異戊二烯基)查耳酮轉(zhuǎn)移酶(6，-AO-(P)CT)"和"6-甲氧基-(異戊二烯基)查耳酮甲基轉(zhuǎn)移酶(6'MO(P)CMT)"。本發(fā)明中，術(shù)語"微生物"包括細(xì)菌和真菌。它涉及單個(gè)微生物的菌株，微生物聚生體或微生物群落，如動物(包括人類)腸道或其它部分的微生物群落，或者例如來自于任何環(huán)境樣品的微生物群落。本發(fā)明中，術(shù)語"體外方法"指在多細(xì)胞生物體外進(jìn)行的方法，包括無活細(xì)胞參與的方法(使用例如裂解的細(xì)胞，蛋白提取物或重組蛋白質(zhì))和使用活細(xì)胞、尤其是分離細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)行的方法。當(dāng)提到體外方法時(shí)，它不包括例如完整啤酒花穗中或活體動物腸道中自然發(fā)生的過程。"'原位'脫垸基化"指在機(jī)體的一個(gè)或更多個(gè)特定器官內(nèi)的體內(nèi)脫甲基化活性。"細(xì)菌"包括好氣菌和厭氧菌。本文中，細(xì)菌"同型乙酸菌"是厭氧菌，它通過乙酰輔酶A途徑將C02還原成乙酸酯或氧化乙酸酯。例如，代表性的同型乙酸菌是，例如，厭氧乙酸菌(JcWoa"aeroZ^.Mw"orerae)，iE氏乙酸桿菌(JcWo6fl"en'wmwooc/")'威氏醋酸t(yī)干菌(」c"o6fl"m'麗w/e〃'"gae)，凱伍產(chǎn)酉昔菌(JcWoge"應(yīng)h'vw/)，爿c""麵acw/膽/or附/co(3ce"cww，東方脫硫腸4犬菌(Desw//c^owacw/wwor/e/7/7's)，5^onmz^a！paucivorans，消化鏈球菌屬(Peptostreococcussp.)禾口真桿菌屬(Eubacterriumsp.)。說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語"第一"、"第二"、"第三"等用于區(qū)別類似元素(件)而不一定具有排序例如時(shí)間排序的意思。應(yīng)當(dāng)理解，以上術(shù)語在合適的環(huán)境下是可以互換的，并且，本發(fā)明在此描述的具體實(shí)施方式也能夠不同于在此所述的次序操作。根據(jù)本發(fā)明，酶促脫烷基化，尤其是類黃酮的5-烷氧基脫垸基化能夠通過酶實(shí)現(xiàn)，所述酶通常指5-烷氧基-轉(zhuǎn)移酶，尤其是5-甲氧基類黃酮甲基轉(zhuǎn)移酶(5-M0-FMT)和/或6'-甲氧基查耳酮甲基轉(zhuǎn)移酶(6，-MO-CMT)，并且，可以通過能生產(chǎn)5-烷氧基-類黃酮院基轉(zhuǎn)移酶或者6'-烷氧基査耳酮垸基轉(zhuǎn)移酶的完整活體細(xì)胞或滅活細(xì)胞(或者細(xì)胞材料)，通過這種細(xì)胞的裂產(chǎn)物，這種細(xì)胞的溶解產(chǎn)物的部分(例如，膜或細(xì)胞質(zhì))，通過包含所述5-烷氧基-類黃酮垸基轉(zhuǎn)移酶和/或6'-烷氧基查耳酮烷基轉(zhuǎn)移酶的經(jīng)富集或純化的蛋白組份，或者通過重組表達(dá)的5-烷氧基-類黃酮垸基轉(zhuǎn)移酶和/或6'-烷氧基查耳酮垸基轉(zhuǎn)移酶來實(shí)現(xiàn)。其中，重組脫烷基化酶是柚細(xì)胞分泌的，可采用條件培養(yǎng)基。當(dāng)重組酶位于細(xì)胞質(zhì)時(shí)，可以向重組DNA中添加分泌信號來獲得可從其生長培養(yǎng)基收獲的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供烷氧基-去烷基酶，更具體地說是能夠從垸氧基類黃酮上除去烷基的酶。該垸基可以是直鏈或支鏈垸基。更特別地，該垸基是C,-C6烷基。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，該烷基是甲基。根據(jù)本發(fā)明，5-垸氧基-垸基轉(zhuǎn)移酶，尤其是5-烷氧基-類黃酮-垸基轉(zhuǎn)移酶來自非動物的原核生物或真核生物，包括源自植物細(xì)胞或微生物的5-烷氧基-烷基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明的第一方面涉及能夠?qū)?-垸氧基-類黃酮脫垸基化尤其是將5-甲氧基類黃酮和/或6'-甲氧基査耳酮脫甲基化的細(xì)胞，提取物，和富集的、半純化或純化的蛋白質(zhì)(也涉及包含一種或多種上述物質(zhì)的組合物)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式，包含5-AO-FMT(和/或6，-AO-CMT)活性的細(xì)胞、提取物和蛋白質(zhì)是細(xì)菌源的。最特別地，所述細(xì)菌是同型乙酸菌。本發(fā)明的更進(jìn)一步具體實(shí)施方式涉及選自真桿菌屬屬和消化鏈球菌屬的同型乙酸菌。同型乙酸菌可在厭氧條件下培養(yǎng)，用蔗糖、一碳化合物如甲酸酯，甲醇，CO和C02加H2培養(yǎng)以及用甲氧基化芳香族化合物作為碳源。具有增強(qiáng)的或富化的異戊二烯基類黃酮脫垸基或脫甲基活性的細(xì)菌菌株可通過用相關(guān)底物重復(fù)培養(yǎng)來選擇獲得，如此處實(shí)施例部分所述的。在此所述的活性富化指活性是原始菌株的約1.5至約10倍之間，更特別地是，活性原始菌株的約3倍。在此之外或與此不同，本發(fā)明的富化方法保證酶活性達(dá)到90-100。/。的底物(如25mg/lIX)轉(zhuǎn)化率。因此，本發(fā)明還涉及富化細(xì)菌菌株的5-烷氧基-類黃酮-轉(zhuǎn)移酶(5-AO-FT)和/或6'-垸氧基-査耳酮-轉(zhuǎn)移酶(6'-AO-CT)活性的方法，包括在含有5-烷氧基類黃酮如5-甲氧基異戊二烯基類黃酮(或6'-甲氧基查耳酮)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株的步驟，更具體地說，包括將細(xì)菌涂布在包含IX(或X)的培養(yǎng)基上，然后選擇最具生產(chǎn)能力的菌落。最特別地是，重復(fù)地將菌株涂布在包含底物的培養(yǎng)基上，如重復(fù)2-10次，更特別地是3或4次，隨后選擇具有最高5-垸氧基-類黃酮-轉(zhuǎn)移酶(5-AO-FT)和/或6'-烷氧基-查耳酮-轉(zhuǎn)移酶(6，-AO-CT)活性的菌落。所述活性能夠被測量，例如基于反應(yīng)終產(chǎn)物的產(chǎn)量。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式，富化方法在同型乙酸菌株上進(jìn)行，更特別地是真桿菌或消化鏈球菌菌株，最特別地是遲緩真桿菌(E//mwwm)或產(chǎn)生消化鏈球菌(尸/7ra^c^^)。在2006年3月15日，WillyVerstraete將一株經(jīng)富化的遲緩真桿菌CEw6a"er/wm///w(wwm)保藏于比利時(shí)微生物保藏協(xié)作中心(BCCM)的BCCM/LMG中心，保藏編號LMGP-23546，LaboratoriumvoorMicrobiologie，UniversiteitGent(UGent)，K丄.Ledeganckstraat35，B-9000Gent，比利時(shí)。因此，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)富化、半純化和/或純化的5-烷氧基類黃酮轉(zhuǎn)移酶的方法，更特別地，所述轉(zhuǎn)移酶是5-甲氧基異戊二烯基類黃酮甲基轉(zhuǎn)移酶，該方法包括獲得具有增強(qiáng)/富化5AO-FT活性(尤其是5MO-FMT活性)的細(xì)菌菌株(尤其是同型乙酸菌菌株，尤其是遲緩真桿菌(五"6ac&n'ww//mcm^)，使用經(jīng)典提純法富集、半純化或純化所述酶，包括采用硫酸銨沉淀，離子交換層析和凝膠過濾層析。本發(fā)明的細(xì)菌菌株提供了這樣的源材料，其中烷基或甲基轉(zhuǎn)移酶以高濃度存在和/或其中存在高活性的天然突變體。在這兩種情況下，菌株都稱為"經(jīng)富化的"菌株。根據(jù)本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式，包含5-垸氧基脫烷基活性、尤其是5-甲氧基類黃酮-脫甲基活性(和/或6'-甲氧基查耳酮-脫甲基活性)的細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，是通過將編碼5-烷氧基-垸基轉(zhuǎn)移酶尤其是5-MO-FMT(和/或6'-MO-CMT)的DNA序列導(dǎo)入微生物或植物細(xì)胞獲得的?？蓪⒔?jīng)遺傳改造具有增強(qiáng)的5-MO-FMT(和/或6'-MO-CMT)活性的植物細(xì)胞培植成具有增強(qiáng)的5-MO-FMT(和/或6'-MO-CMT)活性的植物，與天然的或人工誘導(dǎo)高烷氧基類黃酮(例如甲基類黃酮)水平相結(jié)合即可實(shí)現(xiàn)"在植物中"生產(chǎn)植物雌激素。因此，本發(fā)明提供了遺傳改造的、提高了植物雌激素含量的植物，例如但不限于啤酒花。根據(jù)另一具體實(shí)施方式，包含5-烷氧基脫垸基活性尤其是5-甲氧基脫甲基活性的細(xì)胞、提取物和蛋白質(zhì)是?？破【苹?/Zwmw/^/w/w〃^)或其他合成8-PN的植物例如Marshalliagrandiflora和毛苦參(So;/zo^owe"cwa)的植物細(xì)胞。為了更大規(guī)模的轉(zhuǎn)化，可篩選具有增強(qiáng)X或IX向8-PN自然轉(zhuǎn)化能力的植物，目的是找到5-MO-FMT(和/或6'-MO-CMT)自然突變體或5-MO-FMT(和/或6'-MO-CMT)過表達(dá)自然突變體?？梢允褂萌缦略囼?yàn)來分析細(xì)胞或組合物中的5-AO-FT(和/或6'-AO-CT)或5-MO-FMT(6，-MO-CMT)活性，用所述試驗(yàn)檢測5-0-甲基化類黃酮(6'-0-甲基化查耳酮)測試底物向其脫甲基形式的轉(zhuǎn)化。測試底物優(yōu)選異戊二烯化5-甲氧基類黃酮。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式，化合物IX用作底物，通過質(zhì)譜法、HPLC或其他分析法來分析其轉(zhuǎn)化為8-PN的情況。包含5-甲氧基脫甲基活性的細(xì)胞、提取物或組合物的酶特異性可用在其它位置上具有甲氧基的類黃酮底物進(jìn)行分析。例如，用于分析的合適底物是紅桔素(tangeretin)，它在4'、5、6、7和8上都有甲氧基。這一試驗(yàn)可以將細(xì)菌的5-AO-FT(和/或6'-AO-CT)脫烷基活性或者5-MO-FMT(和/或6'-MO-CMT)脫甲基活性與哺乳動物微粒體或植物細(xì)胞的脫甲基活性區(qū)分開來。保留了5-甲氧基脫甲基活性的細(xì)菌或植物細(xì)胞提取物可通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)提取方法獲得。具有5-MO-FMT(和/或6'-MO-CMT)活性的純化蛋白質(zhì)可通過蛋白質(zhì)提純法與純化組份的活性篩選相結(jié)合來獲得。本發(fā)明的第二方面涉及產(chǎn)生5-烷氧基類黃酮轉(zhuǎn)移酶(5-AO-FT)和/或6'-烷氧基査耳酮轉(zhuǎn)移酶(6'AO-CT)尤其是5-甲氧基類黃酮甲基轉(zhuǎn)移酶(5-MO-FMT)和/或6'-甲氧基査耳酮甲基轉(zhuǎn)移酶(6'-MO-CMT)的細(xì)菌，或者含該活性的它們的提取物或純化蛋白質(zhì)的用途，即用于天然和合成5-甲氧基類黃酮，包括異戊二烯化或香葉基化的5-甲氧基類黃酮的脫烷基化或脫甲基化。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，能夠?qū)?-甲基化類黃酮例如IX轉(zhuǎn)化為8-PN的細(xì)胞尤其是微生物被用于在體外生產(chǎn)8-PN和相關(guān)化合物，該方法具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。可設(shè)計(jì)不同的具體實(shí)施方式，例如，用啤酒花提取物或(部分)純化的提取自于啤酒花的化合物與例如脫甲基細(xì)菌菌株共培養(yǎng)；將脫甲基細(xì)菌菌株、細(xì)胞提取物或最終的條件培養(yǎng)基噴在啤酒花提取物或(部分)純化的源自啤酒花的化合物上；或者將后者浸沒在含有例如脫甲基細(xì)菌菌株或細(xì)胞提取物或最終條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，隨后，經(jīng)一定時(shí)間后，可以滅活菌株。因此，本發(fā)明也提供了用于大規(guī)模經(jīng)濟(jì)地體外生產(chǎn)植物雌激素的方法。根據(jù)本發(fā)明，含有5-AO-FT(和/或6'-MO-CT)活性的細(xì)菌、提取物和/或蛋白質(zhì)能被用于生產(chǎn)活性雌激素，更特別地是由5-烷氧基類黃酮生產(chǎn)植物雌激素。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式涉及5-MO-FMT禾n/或6'-MO-CMT活性在植物類黃酮尤其是從啤酒花(Hamuluslupulus)獲得的類黃酮的脫甲基化中的應(yīng)用。本發(fā)明的更進(jìn)一步具體實(shí)施方式涉及IX轉(zhuǎn)化成8-PN，或者IX衍生物脫甲基轉(zhuǎn)化為具有基本相同的生物活性的8-PN衍生物。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式，脫甲基異戊二烯基類黃酮衍生物例如8-PN可通過如下方法獲得首先對易獲得的甲基化前體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，隨后根據(jù)本發(fā)明所述進(jìn)行脫甲基化從而獲得脫甲基異戊二烯基類黃酮衍生物?？赡艿母膭影ɡ缣砑觽?cè)鏈或者鍵的飽和或去飽和。此外，含有5-AO-FT禾口/或6'-AO-CT尤其是5-MO-FMT和/或6'-MO-CMT活性的本發(fā)明細(xì)胞和提取物能被用于其他5-烷氧基類黃酮的脫垸基化。最特別地是，除IX(或X)之外的其他5-甲氧基類黃酮(或6'-甲氧基査耳酮)也可用作本發(fā)明所述的底物，例如如下所述的5-甲氧基類黃酮或6'-甲氧基查耳酮，它們在4、6、7、8、2'、3'、4'、5'和6'(按照類黃酮編號)位上具有取代基，所述取代基獨(dú)立地選自H、CVC6烷基、C「C6垸氧基和C廠C6?；?、鹵素、更長的碳鏈、芳香族基團(tuán)、一種或多種糖殘基或糖醇、醚、酯、磷酸酯、硫酸酯，胺等。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式，5-烷氧基類黃酮尤其是5-甲氧基類黃酮的特征在于在7位上有一個(gè)羥基和/或在2和3位有一雙鍵和/或在4'位上有一羥基。最特別地，本發(fā)明涉及用5-MO-FMT活性對在6禾口/或8位上具有異戊二烯基或香葉基的5-甲氧基類黃酮化合物進(jìn)行脫甲基化。任選地，所述異戊二烯基或香葉基可以是進(jìn)一步修飾過的，所述修飾例如但不限于對雙鍵的修飾，轉(zhuǎn)化為類異戊二烯和取代修飾。在某些實(shí)施方式中，這些5-甲氧基類黃酮是6'-甲氧基查耳酮或5-甲氧基黃烷酮，包括它們的異戊二烯化或香葉基化形式。在特別的實(shí)施方式中，它們選自由黃腐酚(X)(2',4,4'-三羥基-3-異戊二烯基-6'-甲氧基查耳酮)(查耳酮的原子編號顯示在圖1B和圖2中)和異黃腐酚(IX)(5-0-甲基-8-異戊二烯基柚皮素)，或者它們的具有基本相似生物活性的衍生物(或者，脫甲基產(chǎn)物化合物具有基本上相似生物活性的化合物)組成的組。本發(fā)明的另一實(shí)施方式涉及包含5-烷氧基類黃酮轉(zhuǎn)移酶(5AO-FT)和/或6'-垸氧基查耳酮轉(zhuǎn)移酶(6'AO-CT)活性的細(xì)菌或它們的提取物的在化合物脫垸基化中的應(yīng)用，所述化合物選自以下不僅含有5-甲氧基的分子組成的組4'-乙?；?7-異戊二烯基氧基柚皮素，(±)-(￡)-8-(4"-羥基異戊稀基)柚皮素(8^仏0印，(士)-(五)-8-(4"-氧基異戊稀基)柚皮素(8-PN:0)和6,8-雙異戊二稀基柚皮素。本發(fā)明提供了使用非動物真核生物或原核生物材料體外生產(chǎn)脫甲基異戊二烯基類黃酮的改進(jìn)方法。這對于那些具有商業(yè)價(jià)值的脫甲基異戊二烯基類黃酮例如8-PN來說特別有意義。如前所述，8-PN在體內(nèi)表現(xiàn)雌激素樣活性，預(yù)防骨質(zhì)流失，抑制血管生成和(腫瘤)轉(zhuǎn)移并顯示出抗雄性素活性。因此，通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的化合物可用于治療或預(yù)防例如骨質(zhì)疏松癥和癌癥等疾病。具有雌激素樣特性的脫甲基異戊二烯基類黃酮或脫甲基香葉基類黃酮，例如本發(fā)明方法所得的那些，能夠被用于人類或動物的食品或膳食補(bǔ)充劑，例如飲料(包括啤酒)，還可用于人用或動物用的化妝品中。因此，本發(fā)明更進(jìn)一步提供了生產(chǎn)這樣食品或膳食補(bǔ)充劑和藥劑的改進(jìn)方法。本發(fā)明的另一方面涉及甲基化類黃酮在人類或動物體的腸或任何其他部分中的原位活化，這是通過施用具有5-MO-FMT或6'-MO-CMT活性的細(xì)胞、細(xì)胞提取物或純化酶。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式，5-MO-FMT和/或6'-MO-CMT活性的施用與甲基化類黃酮或它們的來源的施用相結(jié)合，所述結(jié)合包括在不同或同一組合物中，同時(shí)或依次施用。包含所述酶活性的組合物和包含所述底物的組合物均可作為藥物組合物或膳食補(bǔ)充劑。甲基化類黃酮的來源包括但不局限于植物(例如啤酒花)部分或提取物或純化的甲基化類黃酮化合物。脫甲基異戊二烯基類黃酮尤其是8-PN的原位生產(chǎn)為治療和/或防止可用雌激素治療的疾病和病狀提供了新的選擇，所述疾病或病狀例如但不限于，骨質(zhì)流失，病理性血管生成，(癌)轉(zhuǎn)移病變，還可用作抗雄激素療法。任選地，針對具體靶向的垸基化類黃酮設(shè)計(jì)不同的策略對大腸給藥。這可以通過例如將組合物配制成在大腸中釋放的膠囊或通過與選自由葡糖苷酸，硫酸酯(鹽)，乙酸酯(酯)，丙酸酯(鹽)，糖苷，乙?；擒眨；擒找约八鼈兊幕旌衔锵嘟Y(jié)合來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的另一方面涉及藥物組合物和/或膳食補(bǔ)充劑，其包含具有5-MO-FMT禾口/或6，-MO-CMT)活性的細(xì)胞、它們的提取物或純化蛋白或由上述物質(zhì)組成。根據(jù)本發(fā)明的這方面的一個(gè)具體實(shí)施方式，細(xì)胞是微生物細(xì)胞，更特別的是同型乙酸菌細(xì)菌細(xì)胞，例如真桿菌屬和消化鏈球菌屬的同型乙酸菌。任選地，藥物組合物或膳食補(bǔ)充劑還包含甲基化異戊二烯基類黃酮或甲基化香葉基類黃酮的來源，當(dāng)它們成為脫甲基化合物將顯示出強(qiáng)的雌激素樣活性。這樣的來源可能是植物提取物(特別是啤酒花提取物)或其富化組份。它還可以是合成的甲基化異戊二烯基類黃酮。為了同時(shí)或依次給藥，微生物和甲基化類黃酮可以配制在分開的藥物載體內(nèi)或用分開的藥物載體來配制，或者，可以配制在同一藥物載體內(nèi)，均勻分散或不勻稱分散。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了藥物組合物的組合，多種藥物組合物與膳食補(bǔ)充劑的組合，以及多種膳食補(bǔ)充劑的組合。而且，本發(fā)明提供了治療的方法，包括依次或同時(shí)地對有需要的患者施用本發(fā)明的藥物組合物。同樣地，本發(fā)明提供了含有5-烷氧基-垸基轉(zhuǎn)移酶活性的組合物和/或包含所述5-垸氧基類黃酮的組合物用于生產(chǎn)藥物的用途。典型地，本發(fā)明的組合物用作雌激素補(bǔ)充劑和/或雌激素替代療法。甲基化IX或X(其將被脫甲基化成8-PN)的用量介于10至20000微克/天/75kg之間，介于50至10000微克/天/75kg之間或介于50至7000微克/天/75kg之間，例如大約5、10或20毫克/天/75千克。將脫甲基形式與8-PN就雌激素樣活性進(jìn)行比較后，較弱類黃酮的甲基化形式可相應(yīng)地以較高劑量使用。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種藥物組合物，包含具有本發(fā)明的5-烷氧基-烷基轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)菌或細(xì)菌提取物和藥用載體。為了達(dá)到最佳功效，藥用載體以能夠?qū)⑽⑸镝尫胖两Y(jié)腸的為佳。藥物的結(jié)腸定向給藥是大家熟知的，例如可參考Chourasia&Jain(2004)Drug.Deliv.11(2)，129-148。已知的結(jié)腸定向藥物釋放策略包括形成前藥，pH敏感性聚合物包衣，采用結(jié)腸特異性生物可降解聚合物，定時(shí)釋放系統(tǒng)，滲透系統(tǒng)，和壓力控制藥物遞送系統(tǒng)。在各種結(jié)腸定向給藥方法中，采用聚合物尤其是可由結(jié)腸細(xì)菌降解的可生物降解聚合物具有很好的前景。聚糖酶是細(xì)菌酶，可以獲得足量的該類酶用于開發(fā)結(jié)腸靶向藥物。基于該方法，已經(jīng)就許多多糖用于結(jié)腸特異性藥物釋放進(jìn)行了研究。這些多糖包括果膠，瓜耳豆膠，直鏈淀粉，菊糖，葡聚糖，脫乙酰殼多糖和硫酸軟骨素。該天然聚合物家族適用于藥物遞送是因?yàn)榻M成該家族的聚合物具有大量可轉(zhuǎn)化基團(tuán)，分子量分布廣，不同的化學(xué)組成，并且，大多數(shù)低毒、可生物降解而穩(wěn)定性高。這些材料最有利的特性是它們已被批準(zhǔn)可作為藥物賦形劑。為了防止不期望的本發(fā)明脫垸基細(xì)菌介導(dǎo)的降解，可先將細(xì)菌置于非細(xì)菌可降解藥物載體內(nèi)，然后用可被結(jié)腸內(nèi)微生物群降解的聚合物包衣。此后，該細(xì)菌能夠例如通過pH控制和時(shí)間控制藥物釋放機(jī)制釋放，或者利用(Leopold(1999)MedKlin.94Suppl1，6-11所述)強(qiáng)蠕動波產(chǎn)生的腔壓增強(qiáng)來釋放不依賴于腸微生物的酶活性的結(jié)腸定向遞送系統(tǒng)也是已知的。例如，歐洲專利EP0673645描述了一種結(jié)腸定向藥物遞送系統(tǒng)，包括三個(gè)部分(l)腸溶衣，用于阻止胃液滲透入該遞送系統(tǒng)，由此阻止藥物釋放至胃里；(2)易蝕聚合物層，穿過上部腸道期間該層暴露并逐漸被浸蝕，和(3)核，其是一個(gè)含有活性成分的常規(guī)片劑或者微型膠囊，該核易分解，在易蝕的聚合物層被浸蝕后，將藥物釋放至目標(biāo)地點(diǎn)，結(jié)腸。歐洲專利申請EP0453001描述了能夠定向控釋活性主要成分的藥物組合物，它能夠在腸道內(nèi)尤其是結(jié)腸內(nèi)和回腸末端部分起效。將活性主要成分配制成多顆粒多劑量形式并用至少兩層膜包被，一層具有pH依賴性溶解度，另一層不溶但能為腸液所透過。當(dāng)被包被的活性成分在胃和腸起始部分停留，也就是說在pH值小于5.5時(shí)，它不會被釋放。只有當(dāng)它到達(dá)pH值更高的環(huán)境(小腸或者結(jié)腸)時(shí)，pH值依賴性膜溶解并開始釋放活性成分。此時(shí)起，pH值依賴性的但能為腸液所透過的第二層膜開始降解并控制藥物在小腸至結(jié)腸的腸道內(nèi)溶解。EP0778778描述了一種組合物，具有一種或多種益生菌微生物例如真桿菌和運(yùn)送微生物至大腸的載體。載體是一種經(jīng)修飾的或未修飾的耐腐淀粉，特別是一種高直鏈淀粉，其在大腸中充當(dāng)微生物的生長或維持培養(yǎng)基。美國專利申請2004175389公開了一種制劑用于保護(hù)益生菌使其活性在通過胃時(shí)保留而不釋放，但可在腸中釋放，特別是在結(jié)腸內(nèi)釋放，并且，該制劑具有低的水活性和，相應(yīng)的，具有較長的儲存期。該制劑包含益生菌與單價(jià)藻酸鹽的基本無水混合物，形成的混合物被保持在基本無水的環(huán)境中。所述藻酸鹽包括海藻酸鈉和藻酸鉀，但不包括二價(jià)鹽如藻酸鎂或海藻酸鈣。通常，.該制劑具有腸溶包衣(例如，凝膠或纖維素膠囊)。要理解的是，盡管具體的實(shí)施方式、特定的結(jié)構(gòu)和構(gòu)造以及材料在以下的實(shí)例部分進(jìn)行了討論，但這僅是示例性的并且在沒有背離本發(fā)明的范圍和精神的前提下各種形式上和細(xì)節(jié)上的改變或修飾均是可以完成的。實(shí)施例實(shí)施例1:用人類糞便培養(yǎng)物進(jìn)行異黃腐酚(IX)的脫甲基化。糞便樣品來自于12個(gè)健康的人類受試者，年齡在20和35歲之間，用A至L表示。沒有受試者有胃腸疾病的歷史并且在采樣前的3個(gè)月里沒有服用抗生素。用含有l(wèi)g/1還原劑巰基乙酸鈉的磷酸鹽緩沖鹽水(0.1M，pH7)勻漿糞便，制備20。/。(w/v)的新鮮糞便樣品的糞便漿。通過離心(lmin，500xg)除去顆粒物。此上清液在下文稱之為"培養(yǎng)物"。通過在厭氧條件下在含有25mg/l的異黃腐酚的BrainHeartInfusion培養(yǎng)基(含有0.5g/1鹽酸半胱氨酸)中培養(yǎng)糞便培養(yǎng)物(10。/。(v/v))，培養(yǎng)8天，測試來自于糞便樣品A、B、C和D(后文記作培養(yǎng)物A-D)的培養(yǎng)物降解或轉(zhuǎn)化啤酒花異戊二烯基類黃酮IX的能力。根據(jù)DeBoever等(2001)Env.HealthPerspectives109，691-697，根據(jù)Routledge&Sumpter(1996)Environ.Toxicol.Chem.15，241-248，在第0和8天分析培養(yǎng)物提取物，利用酵母雌激素樣篩選(YeastEstrogenicScren)分析提取物者的IX生物活性轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。簡言之，用人類雌激素受體(ERa)基因，與含有應(yīng)答元件和lacZ報(bào)告基因(編碼e-半乳糖苷酶)的表達(dá)質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)化釀酒酵母OS^cc/zarawycwcerev/Wfle)。在540納米處通過顯色物質(zhì)氯酚紅-P-D-吡喃半乳糖轉(zhuǎn)化為氯酚紅來量化P-半乳糖苷酶活性。生物測試反應(yīng)記作540nm的吸光度與630nm的光密度的比值[(A540/A630)M]。樣品的雌激素樣活性用相對于10nM雌二醇(E2)的當(dāng)量百分?jǐn)?shù)來表示，所述lOnM雌二醇在雌激素受體生物測試中引起100%反應(yīng)。生物測試在96孔板中進(jìn)行，其中測試lOtxL的測試化合物，將其與240uL的遺傳修飾的酵母(在610nm的光密度為0.25)共培養(yǎng)。在二甲基亞砜中連續(xù)稀釋測試化合物，這可產(chǎn)生劑量(縱座標(biāo))對活性(橫坐標(biāo))的量效曲線。利用Marquardt-Levenberg算法(Sigmaplot4.0，SPSS公司，芝加哥，伊利諾斯州，美國)(DeBoever等(2001)Env.HealthPerspectives109，69卜697)通過4參數(shù)邏輯模型擬合數(shù)據(jù)。結(jié)果提供于圖3中。在第0天，沒有培養(yǎng)物顯示雌激素樣反應(yīng)。8天后，在培養(yǎng)物C中觀察到雌激素樣特性急劇地提高(圖3)，但在培養(yǎng)物A、B或D中卻不是(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果說明糞便培養(yǎng)物C能夠?qū)X轉(zhuǎn)化為雌激素樣特性更強(qiáng)的化合物。為了更進(jìn)一步測試該轉(zhuǎn)化，在厭氧條件下，在含有25mg/lX或IX的BrainHeartInfusion肉湯(含0.5g/1cystein-HCl)中培養(yǎng)培養(yǎng)物A-D(10%(v/v))培養(yǎng)8天，并且通過HPLC檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(表1)。在培養(yǎng)物A、B和D中，IX被證明不被轉(zhuǎn)化，這與酵母雌激素樣篩選的結(jié)果相一致。然而，在培養(yǎng)物C中，回收到幾乎40%的8-PN，這說明了培養(yǎng)物C雌激素樣特性提高的原因。所有樣品中都檢測到X被少量轉(zhuǎn)化為IX，但是，因?yàn)楫?dāng)X與經(jīng)熱壓處理的培養(yǎng)物共培養(yǎng)時(shí)也檢測到這樣的轉(zhuǎn)化，表明這是一非酶促異構(gòu)化。在培養(yǎng)物C中，再次檢測到少量8-PN，其來自于人糞中細(xì)菌對IX的轉(zhuǎn)化。表1:用糞便樣品A、B、C和D培養(yǎng)后X和IX的微生物轉(zhuǎn)化。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*結(jié)果表示為相對于類黃酮所給予量的X、IX或8-PN的平均(stdev)摩爾百分比回收率。an.d.:低于檢測水平結(jié)果顯示腸道細(xì)菌能夠通過對組分5位上甲氧基的O-脫甲基化酶反應(yīng)將X和IX轉(zhuǎn)化為8-PN。但不是所有的培養(yǎng)物均能夠完成該反應(yīng)。因此，在厭氧條件下，在BrainHeartInfusion培養(yǎng)基(含0.5g/1鹽酸半胱氨酸)中，將其余培養(yǎng)物E-L(10。/。(v/v))與25mg/1IX共培養(yǎng)3天(圖4)。僅僅在樣品E、J和K中檢測到IX的微生物介導(dǎo)的O-脫甲基化。本實(shí)施例表明，甲基化異戊二烯基類黃酮在攝取后不是代謝惰性的，它們能夠被活化成生物學(xué)上具有(更高)活性的脫甲基衍生物。然而，該轉(zhuǎn)化能力顯著依賴于腸內(nèi)微生物群落的組成和活性，因?yàn)镮X的活化僅僅發(fā)生在三分之一的測試樣品中。為了更進(jìn)一步調(diào)查這些個(gè)體間的差異，在厭氧條件下，在含有25mg/lIX的BrainHeartInfusion培養(yǎng)基(含有0.5g/1cystein-HCI)中培養(yǎng)共51個(gè)糞便樣品，培養(yǎng)3天(圖5)。所示結(jié)果為相對于培養(yǎng)所用IX濃度的8-PN生產(chǎn)百分率，并且樣品按照增強(qiáng)的8-PN生產(chǎn)能力來排序。通過兩步聚類分析(TwoStepCluster)來分析數(shù)據(jù)，聚成3組(記作a、b和c)，彼此的平均值具有顯著差異(PO.Ol，Kruskal-Wallis)這些數(shù)據(jù)表明，甲基化異戊二烯基類黃酮的活化依賴于腸內(nèi)微生物群落，據(jù)此可將個(gè)體分為高的(組C，16%)，中等的(組b，22。/。)和遲鈍的(組a，63%)8-PN生產(chǎn)者。通常，最終接觸到活性組分在相當(dāng)程度上取決于前體濃度和腸內(nèi)微生物群落轉(zhuǎn)化潛力。實(shí)施例2.微生物用來生產(chǎn)具有8-異戊二烯基柚皮素型雌激素樣特性的化合物的用途本實(shí)施例描述了兩種已知腸厭氧菌將IX轉(zhuǎn)化為8-PN的能力。遲緩真桿菌(五^fl"en'"m//moww)ATCC8486和產(chǎn)生消化鏈球菌(尸印^sfre/^ococowpro^"w"ATCC27340得自于德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCuItures)(DSMZ，Braunschweig,德國)。在厭氧條件下在BrainHeartInfusion培養(yǎng)基(含0.5g/1鹽酸半胱氨酸)中，五.//moww與25mg/1IX和8-PN共培養(yǎng)13天(表2)。該菌株能夠?qū)X轉(zhuǎn)化為8-PN。該菌株不會進(jìn)一步降解8-PN，因?yàn)榕囵B(yǎng)13天后所有作為底物加入的8-PN均能夠被回收。這些特征明顯不同于在肝微粒體內(nèi)觀察到的代謝途徑，在肝微粒體內(nèi)，8-PN被大量地進(jìn)一步代謝[Nikolic等(2005)J.ofMassSpectrom.40，289-299;Nikolic等(2004)DrugMetabolismandDisposition32，272-279]。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*結(jié)果為乂、IX、8-PN或6-PN的平均(stdev)摩爾百分比回收率。an.d.:未檢測到因?yàn)椤?//mowm具有將IX轉(zhuǎn)化成8-PN的能力，進(jìn)行了一次選擇過程來挑選出能夠大量生產(chǎn)8-PN的菌株。選擇過程包括平行地將6株￡./Zworam[各自為單菌落的培養(yǎng)物]與25mg/lIX共培養(yǎng)8天。接著，選出8-PN產(chǎn)量最高的培養(yǎng)物，將其用于下一輪的6株平行培養(yǎng)(表3)。雖然第一輪選擇中的最低產(chǎn)量僅僅是2%，經(jīng)三個(gè)選擇步驟后明顯提高到82%，并且，最有效的培養(yǎng)物將添加的所有IX都轉(zhuǎn)化成了8-PN。經(jīng)選擇，每輪全部6個(gè)培養(yǎng)物的平均產(chǎn)量從22.5%提高到90.5%，并且，標(biāo)準(zhǔn)偏差從20%下降至7%。這意味著，僅三輪選擇后就可選擇到一個(gè)幾乎能將IX全部轉(zhuǎn)化(高平均值)且保持穩(wěn)定的(低標(biāo)準(zhǔn)偏差)的菌株。表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>為了檢驗(yàn)P.yo*cto將IX轉(zhuǎn)化為8-PN的酶轉(zhuǎn)化能力，在厭氧條件下在BrainHeartInfusion培養(yǎng)基(含0.5g/1鹽酸半胱氨酸)中，該菌株與含有25mg/1的IX共培養(yǎng)13天，一式三份。每2天分析一次樣品，測定IX和8-PN的濃度((圖6)。隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，尸.將培養(yǎng)所用IX中的10%至50%轉(zhuǎn)化成8-PN。這表明，該菌株也適于用來生產(chǎn)8-PN。還可以參照以上就五./^a^m所述進(jìn)一步選擇具有更高脫甲基化活性的i3菌株。經(jīng)富化五z^a"eWwm〃woswot菌株的一具體實(shí)例已由WillyVerstraete于3月15日保藏于比利時(shí)微生物協(xié)作保藏中心(BCCM)的BCCM/LMG中心，保藏編號LMGP-23546。實(shí)施例3能夠轉(zhuǎn)化甲基化異戊二烯基類黃酮的微生物在發(fā)酵中的應(yīng)用。設(shè)計(jì)了一項(xiàng)分批加料發(fā)酵試驗(yàn)，使用一如上所述述選出的￡m^c^/^7"mosi^菌株在發(fā)酵條件下轉(zhuǎn)化甲基化異戊二烯基類黃酮。發(fā)酵在BraunBiostatM發(fā)酵罐(2L的容器)中進(jìn)行，向其中加入1.5LBrainHeartlnfusion培養(yǎng)基(含0.5g/l鹽酸半胱氨酸)。隨后，發(fā)酵罐在12rC下高壓滅菌30min。在接種前，發(fā)酵罐用氮?dú)鉀_洗系統(tǒng)沖洗1h制造厭氧環(huán)境。此后，在發(fā)酵罐中，向培養(yǎng)液中接入2天齡的￡./〖mosw7i培養(yǎng)物，并加入25mg/L的IX。發(fā)酵在37'C下進(jìn)行2周，沒有pH控制。從第1天開始，每天3次以10ml/min的速度向發(fā)酵罐中添加含有25mg/LIX的無氧BrainHeartInfusion培養(yǎng)基(含0.5g/1鹽酸半胱氨酸)200ml，同時(shí)以200ml/mhi速度從系統(tǒng)中放出發(fā)酵物。從放料中取10ml樣品，進(jìn)行化學(xué)分析。在第0、1、2天進(jìn)行如是采用分析，此后每2天做一次。數(shù)據(jù)為％轉(zhuǎn)化率(8-PN/(IX+8-PN))。結(jié)果，IX轉(zhuǎn)化成8-PN的轉(zhuǎn)化率為0%(第0天)，43%(第1天)和100%(自第2天起)。該實(shí)施例表明，選出的菌株能夠在基于發(fā)酵的方法中將IX轉(zhuǎn)化成高雌激素樣活性的8-PN，由此可實(shí)現(xiàn)例如由前體生產(chǎn)具有雌激素樣特性的產(chǎn)物之類的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)純化目標(biāo)化合物以在其他用途中用作組分或者活化啤酒花提取物或包含甲基化異戊二烯基類黃酮的其它蔬菜提取物中前體的目的。實(shí)施例4:菌株添加劑引發(fā)IX向8-PN的非體內(nèi)轉(zhuǎn)化。將實(shí)施例2選擇試驗(yàn)中獲得的最有效尺//mowm菌株加入到原先在實(shí)施例1表現(xiàn)為無轉(zhuǎn)化能力的培養(yǎng)物B中，檢測該菌株在糞便懸液的復(fù)雜環(huán)境中引發(fā)8-PN生產(chǎn)的能力。向培養(yǎng)物中加入菌株的比例為0%到100%(v/v)。在厭氧條件下在BrainHeartInfusion培養(yǎng)基(含有0.5g/l鹽酸半胱氨酸)中，該混合物與10%(v/v)的25mg/L的IX的共培養(yǎng)七天。8-PN的濃度每兩天檢測一次(圖7)。結(jié)果表明，8-PN的產(chǎn)量隨著五.//mowm的加量逐漸增加而提高。等量的￡./z'mcwwm培養(yǎng)物和糞便樣品(在圖7中100%)將IX完全轉(zhuǎn)化為8-PN，即使菌株加量為1%，僅在一天后，半數(shù)IX已經(jīng)被轉(zhuǎn)化成8-PN。值得注意地是，所有培養(yǎng)的8-PN均在第一天達(dá)到了最高濃度，這表明所有可用IX被立即轉(zhuǎn)化。沒有檢測到8-PN的繼續(xù)轉(zhuǎn)化，因?yàn)榈谝惶旌偷谄咛斓?-PN濃度沒有顯著差異(StudentT-test，p>0.05)。這個(gè)實(shí)施例表明，所選菌株能夠在糞便培養(yǎng)物這樣的復(fù)雜環(huán)境中將IX轉(zhuǎn)化成高雌激素樣活性的8-PN，由此可實(shí)現(xiàn)的應(yīng)用例如在諸如啤酒花提取物或含有甲基化異戊二烯基類黃酮的其他蔬菜提取物等不同介質(zhì)中將前體原位轉(zhuǎn)化為具有雌激素樣特性的產(chǎn)物。實(shí)施例5.在腸道的體外動態(tài)模型中甲基化異戊二烯基類黃酮的轉(zhuǎn)化在下一步驟中，為了證明前體如IX原位轉(zhuǎn)化成具有雌激素樣特性的產(chǎn)物如8-PN，使用腸道的體外動態(tài)模型(人類腸微生物生態(tài)系統(tǒng)模擬器(SHIME))，(Molly等(1993)A卯1.Microbiol.Biotechnol.39，254-258)。SHIME由5個(gè)依次串聯(lián)的反應(yīng)器組成，各自代表人類胃腸道的不同部分。前兩個(gè)反應(yīng)器(胃[反應(yīng)器l]和小腸[反應(yīng)器2])是基于充填和排空原理來模擬食物攝取和消化過程中的不同步驟，用蠕動泵向胃和十二指腸腔添加限量的SHIME進(jìn)料(3次/天)和胰液和膽汁液，并在指定時(shí)間間隔后排空相應(yīng)的反應(yīng)器。后三個(gè)腔(對應(yīng)于升結(jié)腸[反應(yīng)器3]，橫結(jié)腸[反應(yīng)器4]以及降結(jié)腸[反應(yīng)器5])是具有恒定體積和pH值控制的持續(xù)攪拌反應(yīng)器。選擇不同容器內(nèi)的保留時(shí)間和pH值，目的是模擬胃腸道不同部分的體內(nèi)環(huán)境。在反應(yīng)器2中添加60ml人造胰液和膽汁液、胰酶和NaHC03來模擬食物在小腸中的通過。用恒溫箱將系統(tǒng)溫度保持在37°C，并且，通過每天進(jìn)行15min的N2吹洗將系統(tǒng)維持在缺氧條件下。按DeBoever等(2000)J.Nutrition130，2599-2606中所述從糞便中制備接種物。在反應(yīng)器3、4、和5中加入營養(yǎng)培養(yǎng)基，并將pH值調(diào)節(jié)至相應(yīng)的pH值范圍。最后，向后三個(gè)反應(yīng)器中添加50ml的接種液。為了此項(xiàng)試驗(yàn)，將兩個(gè)上述的系統(tǒng)組合為由同一泵驅(qū)動(具有兩個(gè)泵頭的泵，能夠精確地向兩個(gè)系統(tǒng)提供相同劑量的液體)，具有相同的pH值和溫度控制并且接受相同的液體食品的兩套完全彼此獨(dú)立的反應(yīng)器。這樣，所有參數(shù)被完全受控并且相同，只有這2個(gè)系統(tǒng)中腸微生物群落是分別導(dǎo)入的。本例中，我們分別導(dǎo)入一種能夠活化甲基化異戊二烯基類黃酮(PF+)的菌群和一種無此活化能力的菌群(PF-)。經(jīng)兩個(gè)星期的穩(wěn)定期后(穩(wěn)定期中飼以普通SHIME進(jìn)料)，向SHIME進(jìn)料中加入25mg/L的IX，持續(xù)4周(第15-44天)。在后兩周，還將實(shí)施例2選出的￡Wac^/wm//mow,"菌株加入第一個(gè)結(jié)腸腔，將這一菌株接入模擬為自有益生菌(probiotic)(第30-44天)。圖7和8顯示PF+和PF-菌群系統(tǒng)中升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸中的IX和8-PN的濃度。在PF+腔中，當(dāng)僅給予IX時(shí)，在結(jié)腸末端部分觀察到甲氧基化異戊二烯基類黃酮的活化(第15-30天)，而在PF-腔中則沒有發(fā)生轉(zhuǎn)化。補(bǔ)充菌株后(從第30天開始)，在PF+腔和PF-腔中的活化能力都增加，并且在結(jié)腸的末端部分檢測到了具有雌激素樣活性的8-PN的產(chǎn)生。本實(shí)施例表明，實(shí)施例2所選菌株能夠在模擬的人類腸道條件下活化甲基化異戊二烯基類黃酮。實(shí)施例6:實(shí)施例2選出的菌株在體內(nèi)將5-烷氧基異戊二烯基類黃酮脫甲基化的能力。用原生(axenic)大鼠和人類菌群相關(guān)(HFA)大鼠進(jìn)行試驗(yàn)，測定實(shí)施例2選出的菌株在體內(nèi)活化甲基化異戊二烯基類黃酮的能力。共12個(gè)原生大鼠用于該研究。當(dāng)大鼠5周齡時(shí)，用剛排出的經(jīng)勻質(zhì)的具有異戊二烯基類黃酮脫甲基活性的糞便培養(yǎng)物經(jīng)口管詞3個(gè)大鼠成為HFA大鼠。這些HFA大鼠標(biāo)記為PF+大鼠。同時(shí)，用剛排出的經(jīng)勻質(zhì)的沒有異戊二烯基類黃酮脫甲基活性的糞便培養(yǎng)物經(jīng)口管飼3個(gè)大鼠成為HFA大鼠。這些HFA大鼠標(biāo)記為PF-大鼠。余下大鼠控制在無菌條件下。在實(shí)驗(yàn)開始前，所有的大鼠置于分開的，封閉的集體籠子中。微生物培養(yǎng)物在大鼠腸內(nèi)穩(wěn)定3周后，開始第一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。將大鼠移至單獨(dú)的代謝籠中，每個(gè)大鼠每日給藥2mglX/kg體重，持續(xù)5天，匯集每天24h的尿。3天后，定量測定尿中的IX和8-PN排泄。轉(zhuǎn)化[8-PN/(IX+8-PN)]列于表4。此后，在實(shí)驗(yàn)的第二部分開始之前，將大鼠送回到集體籠中過2周。在此，對6個(gè)原生大鼠每日經(jīng)口管飼實(shí)施例2中選出的五.//mo5^n菌株的Iog9細(xì)菌懸液共7天，使之成為人類菌群相關(guān)鼠。在第2天，將大鼠移至單獨(dú)代謝籠中收集24h總尿。從第2天至第7天，給大鼠經(jīng)口管飼2mglX/kg體重。在第7天，定量測定尿中的IX和8-PN排泄。轉(zhuǎn)化[8-PN/(IX+8-PN)]列于表4。表4:24h總尿的％8-PN/(IX+8-PN)排泄平均值與Stdev。<table>complextableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>本實(shí)施例表明，甲基化異戊二烯基類黃酮的活化是一個(gè)純粹的微生物現(xiàn)象，因?yàn)樵笫蟛划a(chǎn)生8-PN。而且，腸的轉(zhuǎn)化能力的差異導(dǎo)致8-PN排泄的差異，因?yàn)榕cPF-大鼠相比PF+大鼠的尿具有更高的8-PN比率。最后，本實(shí)施例表明，所選￡.//mwt^菌株能夠在體內(nèi)活化甲基化異戊二烯基類黃酮，因?yàn)樵笫笤诒唤尤胨x菌后開始產(chǎn)生8-PN。權(quán)利要求1.一種體外生產(chǎn)一種或多種植物雌激素的方法，所述方法包括a)提供同型乙酸菌的細(xì)菌菌株或其提取物的第一組合物，b)包含5-烷氧基-類黃酮和/或6’-烷氧基查耳酮的第二組合物與所述包含細(xì)菌菌株或其提取物的第一組合物接觸，從而由所述細(xì)菌菌株或提取物將所述5-烷氧基-類黃酮和/或6’-甲氧基查耳酮脫烷基化。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述5-烷氧基-類黃酮和/或6'-烷氧基査耳酮是5-甲氧基類黃酮和/或6'-甲氧基查耳酮。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述植物雌激素是8-PN。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，還包括通過用5-甲氧基異戊二烯基類黃酮重復(fù)培養(yǎng)來富化所述細(xì)菌菌株的脫烷基活性。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一組合物是所述菌株的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物。6.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述菌株是真桿菌(EMa"en^m^.)或消化鏈球菌(尸一o欲e/tococci^S/7.)。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述5-垸氧基-類黃酮是IX。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述5-烷氧基-類黃酮和/或6'-垸氧基查耳酮是植物來源的。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述植物是啤酒花。10.細(xì)菌細(xì)胞系用于5-甲氧基-類黃酮或6'-甲氧基查耳酮體外脫甲基化的用途。11.來自遲緩真桿菌(^/^^7'"附/^0^附)的5-甲氧基-類黃酮甲基轉(zhuǎn)移酶。12.用于同時(shí)或依次施用的一種或多種藥物組合物和/或一種或多種膳食補(bǔ)充劑的組合，包括含有具有5-烷氧基類黃酮脫烷基活性的同型乙酸菌、其提取物、半純化或純化組分的第一藥物組合物和/或膳食補(bǔ)充劑以及含有5-烷氧基類黃酮源或6'-烷氧基-査耳酮源的第二藥物組合物和/或膳食補(bǔ)充劑。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合，其中所述5-烷氧基類黃酮源是啤酒花提取物。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的組合，其中所述6'-垸氧基-査耳酮是黃腐酚，并且/或者，所述5'-垸氧基類黃酮是異黃腐酚。15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所述的組合，其中所述的同型乙酸菌是遲緩真桿菌(五w6o"m',//mos訓(xùn))。16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的組合，其中所述的同型乙酸菌、其提取物、半純化或純化組分以結(jié)腸特異性遞送制劑形式提供。17.—種富化同型乙酸菌株的5-烷氧基-烷基轉(zhuǎn)移酶活性的方法，所述方法包括將所述菌株涂布在含有5-垸氧基-類黃酮的培養(yǎng)基上和選擇具有最高5-烷氧基-烷基轉(zhuǎn)移酶活性的菌落。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的步驟重復(fù)至少兩次。19.包含細(xì)菌來源的5-烷氧基-垸基轉(zhuǎn)移酶活性的組合物。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其是一種同型乙酸菌提取物。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述同型乙酸菌是真桿菌(^^"m'畫)或消化鏈球菌(尸印to欲一ococcwssp.)。22.根據(jù)權(quán)利要求19至21中任一項(xiàng)所述的組合物，其能夠?qū)X(25mg/1)100%地轉(zhuǎn)化為8-PN。全文摘要本發(fā)明公開了用細(xì)菌酶進(jìn)行5-甲氧基類黃酮的脫甲基化，這些酶類在體外生產(chǎn)植物雌激素，還公開了其與甲基化的5-甲氧基異戊二烯基類黃酮源結(jié)合在藥物組合物中的應(yīng)用。文檔編號C12P17/02GK101208436SQ200680009379公開日2008年6月25日申請日期2006年3月27日優(yōu)先權(quán)日2005年3月25日發(fā)明者A·海瑞克,D·德庫克勒伊爾,S·普斯賽米爾斯,W·韋斯特雷特申請人:根特大學(xué)