專利名稱：腐胺n-甲基轉(zhuǎn)移酶，編碼腐胺n-甲基轉(zhuǎn)移酶的重組dna分子，生物堿含量減少的轉(zhuǎn)基因煙 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高度純化的腐胺N—甲基轉(zhuǎn)移酶，其純化的新方法和其反義和有義基因。特別是本發(fā)明涉及使用有意義和反義腐胺N—甲基轉(zhuǎn)移酶基因生產(chǎn)煙堿水平在遺傳上被改變的轉(zhuǎn)基因煙草植物。該轉(zhuǎn)基因植物在用于煙草工業(yè)的烤煙產(chǎn)品中是有用的。
本發(fā)明的背景為了從煙草中去掉煙堿使用了各種各樣的方法。然而這些方法中，大多數(shù)對煙堿沒有足夠的選擇性。它們從煙草中去掉了其它成份，從而對其風味和香味產(chǎn)生了不利影響。而且，這些方法典型地較復(fù)雜和昂貴。
煙堿和生物合成的化合物一般通過一系列生化反應(yīng)形成，其中每步反應(yīng)由一種不同的酶催化。產(chǎn)生給定化合物的特定反應(yīng)系列稱作途徑。抑制一種途徑運轉(zhuǎn)并因此抑制其終產(chǎn)物產(chǎn)量的一種方法是減少該途徑中一種所需酶的量。如果該酶的豐度相對于該途徑中的其它酶而言在正常情況下低得足以使該途徑運轉(zhuǎn)中的酶速度受到限制，那么該酶豐度的任何減少將以終產(chǎn)物的產(chǎn)量降低而反映出來。如果酶的相對豐度在正常情況下不限制速度，為了減少該途徑的產(chǎn)量，可能必須減少它在細胞中的豐度使足以產(chǎn)生速度限制。同樣地，如果酶的相對豐度限制速度，那么其豐度的任何增加將導(dǎo)致途徑中終產(chǎn)物產(chǎn)量的增加。
煙堿首先在煙草植物的根部形成，隨后運輸?shù)饺~中，并在那里貯存起來(Tso，Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants，PP，233—234，Dowden，Hutchinson & Ross，Stroudsburg，PA(1972)。煙堿分子包含2個雜環(huán)吡啶部分和吡咯烷部分，每個雜環(huán)來自不同的生化途徑。煙堿的吡啶部分來自煙酸。煙堿的吡咯烷部分通過從腐胺到N—甲基腐胺然后到N—甲基二氫吡咯的途徑來提供。在煙堿生物合成中必經(jīng)的步驟是從腐胺形成N—甲基腐胺(Goodwin and Mercer，Introduction to Plant Biochemistry，PP.488—491，Pergamon Press，New York，(1983))。
腐胺向N—甲基腐胺的轉(zhuǎn)化由腐胺N—甲基轉(zhuǎn)移酶(“PMT”)催化，以S—腺苷甲硫氨酸作為甲基供體。在煙草中為煙堿合成提供N—甲基二氫吡咯的途徑中PMT表現(xiàn)為限速酶(Feth et al，“Regulation in Tobacco Callus of Enzyme Actiuities of theNicotine Pathway”，Planta，168，PP.402—407(1986)；Wagner etal.，“The Regulaton of Enzyme Acttvitives of the NicotinePathway in Tobacco”，Physiol，Plant，68，PP.667—672(1986))。
對PMT的相當粗糙的制品(純化30倍)已進行了有限的鑒定(Mizusaki et al.，“Phytochemical studies on Tobacco AlkaloidsXIV.The Occurrence and Proertes of Putrescine N—Methyltransferase in Tobacco Plants”，Plant Cell Physiol，12，PP.633—40(1971))。得到該制品的純化步驟局限于從最初的提取物中進行硫酸銨沉淀和凝膠過濾色譜同上。
反義RNA技術(shù)使產(chǎn)生的植物特征為酶(或其它蛋白質(zhì))的水平比由該植物正常情況下所含的水平明顯要低。通常情況下，編碼靶酶的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單鏈mRNA，然后由核糖體翻譯產(chǎn)生靶酶。反義RNA分子是一種其核苷酸序列與靶mRNA分子某部分互補的RNA分子。因此，反義RNA分子與靶mRNA分子將進行互補堿基配對(雜交)，導(dǎo)致靶mRNA分子不能翻譯，更易于降解，或兩種情況都發(fā)生。從而使細胞對于由靶mRNA編碼的特異性酶的生產(chǎn)能力受到抑制。
反義技術(shù)在一些實驗室中已用于產(chǎn)生特征為特異性酶量比正常值低的轉(zhuǎn)基因植物。例如，將苯基苯乙烯酮合成酶(一種花色素生物合成途徑的酶)反義基因插入煙草和短牽牛屬植物基因組中已產(chǎn)生了苯基苯乙烯酮合成酶水平降低的植物。這些轉(zhuǎn)基因煙草和短牽牛屬植物開出比正常顏色淺的花(Van der Krol et al，“An Anti—sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants InhibitsFlower PTgmentaion”，Nature，333，PP.866—69(1988))。反義RNA技術(shù)在西紅柿中也成功地用于抑制多聚半乳糖醛酸酶的產(chǎn)生(Smith et al，“Antisense RNA Inhibitkn of Polygala cturonaseGene Expression in Transgenic Tomatoes”，Nature，334，PP.724—26(1988)；Sheehy et al，“Reduction of PolygalacturonaseActivity in Tomato Fruitby Antisense RNA”，Proc.natl Acad.sci.USA，85，PP.8805—09(1988))，在煙草中已成功地用于抑制核酮糖雙磷酸羧化酶小亞基的產(chǎn)生(Rodermel et al，“Nuclear—organelle InteractionsNuclear Antisense Gene InhibitsRibulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme levels inTransformed Tobacco Plants”，Cell，55，PP.673—81(1988))。作為選擇，用給定酶的基因以有意義(即正常的)取向轉(zhuǎn)化植物可產(chǎn)生其特征為該酶量高于正常值的轉(zhuǎn)基因植物。
通過改變PMT水平來降低或升高煙堿水平的煙草植物遺傳工程尚未成為可能，因為不知道不經(jīng)過PMT酶的預(yù)先純化來克隆PMT基因的方法，而且在本發(fā)明之前也不知道PMT酶的純化方法。
附圖的簡要描述

圖1是12.5％銀染的SDS—聚丙烯酰胺凝膠照片的翻版，顯示了在煙草PMT純化方法的連續(xù)階段獲得的蛋白質(zhì)圖譜。泳道1和6分子量標準蛋白質(zhì)(磷酸化酶B，95.5KD；谷氨酸脫氫酶，55.0KD；卵清蛋白，43.0KD；乳酸脫氫酶，36.0KD；磷酸酐酶29.0KD；乳球蛋白，18.4KD；細胞色素C，12.4KD)。泳道240—65％硫酸銨分離物。泳道3從疏水反應(yīng)柱收集的PMT活性峰餾分。泳道4來自陰離子交換柱濃縮的腐胺洗脫物。泳道5來自陰離子交換柱經(jīng)自由流動等電聚焦的濃縮物的PMT活性峰餾分。
圖2描繪了在12.5％未變性的聚丙烯酰胺凝膠3mm系列切片上加上來自陰離子交換柱的濃縮的腐胺洗脫物后的PMT活性。PMT酶活性以作為產(chǎn)物回收的每分種14c的蛻變(高出背景的)來表示，并稱為“相對活性”。
圖3是銀染的12.5％SDS—聚丙烯酰胺凝膠照片的翻版。對該凝膠PMT活性帶和周圍的未變性電泳凝膠連續(xù)的3mm切片(圖2)進行了純度和表觀分子量分析。命名為“sm”的泳道含有起始材料(即用于未變性凝膠的材料)。命名為“std”的泳道含有分子量標準蛋白質(zhì)(磷酸化酶B，95.5KD；谷氨酸脫氫酶，55.0KD；卵清蛋白，43.0KD；乳酸脫氫酶，36.0KD，碳酸酐酶，29.0DK；乳球蛋白18.4KD；細胞色素C、12.4KD)。
圖4描繪了經(jīng)硫酸銨分級分離，疏水反應(yīng)層折和從陰離子交換柱上進行腐胺洗脫，接著濃縮樣品純化的煙草PMT經(jīng)等電聚焦所得餾分的相對PMT活性和pH。PMT酶活性以作為產(chǎn)物回收的每分鐘14c的蛻變(高出背景的)來表示，并命名為“相對活性”。
圖5是12.5％銀染的SDS一聚丙烯酰胺凝膠照片的翻版。顯示的PMT蛋白質(zhì)帶(“a1”和“a2”)被切下(電印跡到惰性膜上后)并用于氨基酸序列測定。加到凝膠上的樣品是從陰離子交換柱以腐胺洗脫的物質(zhì)等電聚焦餾分的等公試樣。用于序列分析的實際帶來自與用本圖凝膠分析中相同物質(zhì)的等份試樣加樣的聚丙烯酰胺凝膠不同(但相似)的凝膠。
本發(fā)明綜述本發(fā)明首次提供了高度純化的腐胺N—甲基轉(zhuǎn)移酶(“PMT”)，和其純化的新方法。
本發(fā)明的純化方法包含將煙草植物提取物加到陰離子交換介質(zhì)的步驟，其中所用的溫度，pH值和提取物成份使PMT能被陰離子交換介質(zhì)滯留。然后用含有有效量多胺的洗脫緩沖液從陰離子交換介質(zhì)中洗脫PMT，其中洗脫溫度、洗脫緩沖液的pH值和化學(xué)成份使除多胺外，PMT能被陰離子交換介質(zhì)滯留。
在優(yōu)選的實施例中，陰離子交換介質(zhì)洗脫物在陰離子交換介質(zhì)洗脫緩沖液存在的條件下直接將洗脫物加到對PMT具有親合力的色譜介質(zhì)上，然后洗脫結(jié)合的物質(zhì)來濃縮。最優(yōu)選的是，陰離子交換柱的出口與W—氨基已基瓊脂糖柱的進口相連，其中從陰離子交換柱上收集的稀釋的PMT接著以更濃縮的形式洗脫。
本發(fā)明的PMT分子量在大約55和65千道爾頓之間，天然等電點大約在pH5.0和6.0之間，對腐胺的Km大約在300μm和500μm之間，對S—腺苷甲硫氨酸的Km在大約100μm和150μm之間。在優(yōu)選的實施例中，PMT包含一個17氫基酸的序列，它選自在序列描述中定義為SEQ ID NO1，SEQ ID NO2和SEQ IDNO3的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了編碼腐胺N—甲基轉(zhuǎn)移酶的有意義和反義重組DNA分子，包含這些重組DNA分子的載體以及用這些DNA分子和載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草細胞和植物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因煙草細胞和植物特征為煙堿含量比未轉(zhuǎn)化的對照煙草細胞和植物更低或更高。
本發(fā)明的詳細描述PMT的純化用于PMT純化的起始材料由煙草根組成。優(yōu)選的是根從水載法生長的煙草植物收獲。水載培養(yǎng)在高度控制能再現(xiàn)的條件下促進植物的生長，并能以干凈的完整的狀態(tài)有效收獲大批的絲狀根系統(tǒng)。
煙草種子在潮濕的植物盆栽混合物表面或接近表面處發(fā)芽。最優(yōu)選的條件是大約80°F和60％相對濕度。種子發(fā)芽大約2周后，間苗(去掉多余的幼苗)便剩下的幼苗有足夠的空間進行無遮蔽的生長，以便長到大約6英寸高并有大約6片葉的狀態(tài)。幼苗達到大約6英寸時，一般將它們連同根系統(tǒng)和完整的盆栽物質(zhì)小團一起移植到含有合適的營養(yǎng)液和營養(yǎng)液通氣(通氧)裝置的水栽裝置中。水栽裝置還應(yīng)提供溶解性營養(yǎng)物的補充且大小應(yīng)足以容納煙草植物的充分生長。
去掉花頭(去頂)(商品煙草培養(yǎng)的典型操作)促進根的生長并增加葉的煙堿含量為本領(lǐng)域所熟知。因此，用作PMT純化起始材料的植物一般在發(fā)育的適當階段去頂。種植和去頂之間的適當間隔取決于一些因素，特別包括植物品種，光照強度，光周期，土壤和空氣溫度，土壤濕度和礦物質(zhì)營養(yǎng)。然而，典型地在去頂3至7天后收獲根。在給定的一套生長條件下對給定煙草品種的最佳去頂時間可被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員很容易地確定。
優(yōu)選的是用冷水洗滌收獲的根，然后用Buchner漏斗抽吸除去殘余的水。洗凈的根可立即使用或收獲后立即冷凍于-80℃。冷凍的根貯存于-80℃直至使用。
對于典型的PMT純化程序，每升提取緩沖液內(nèi)含大約400到600g冷凍的根組織，放在高速搗碎器內(nèi)勻漿。典型地提取緩沖液含有效量的一種或多種緩沖劑，一種或多種還原劑，一種或多種重金屬螫合劑，一種或多種水活度調(diào)節(jié)劑，一種或多種蛋白酶抑制劑。優(yōu)選的提取緩沖液還含有效量的一種或多種酚化合物吸附劑。這些試劑的有效量取決于所用的特定試劑；而且所用的量一般可從在植物蛋白質(zhì)純化過程中所用的典型量中選出。因此，試劑和其有效量的選擇是普通技術(shù)人員所熟知的。
提取緩沖液的pH值應(yīng)在大約7.2和8.3之間，優(yōu)選大約7.5?？梢允褂萌我辉谒鑠H值下提供有效pH緩沖能力的具有一定解離常數(shù)(PKa)的水溶性化合物。優(yōu)選的緩沖試劑還必須是可為紫外光所透射的。合適的緩沖劑特別包括三(羥甲基)氨基甲烷(“Tris”)，咪唑，磷酸鹽，N—嗎啉代丙烷磺酸(“MOPS”)，N—三(羥甲基)甲基—2—氨基乙烷磺酸(“TES”)，三乙醇胺，和N—三(羥甲基)—甲基—甘氨酸(“Tricine”)。優(yōu)選Tris緩沖液。
為了抑制可能出現(xiàn)的蛋白質(zhì)巰基氧化和植物酚類化合物向反應(yīng)性自由基的氧化(兩者都可能使PMT失活)，向提取緩沖液中加入還原劑。合適的還原劑特別包括二硫蘇糖醇(“DTT”)，二硫赤蘚糖醇，2—巰基乙醇，疏基乙酸鹽，谷脫甘肽，半脫氨酸、和抗壞血酸。優(yōu)選DTT和抗壞血酸。
為了防止由重金屬引起的蛋白酶的活化和PMT的可能失活(它們通過直接與PMT反應(yīng)或通過金屬促進酚類化合物氧化成可滅活PMT的種類)，向提取緩沖液中加入重金屬合劑。優(yōu)選的重金屬螫合劑是乙二胺四乙酸(“EDTA”)，但其它常規(guī)螫合劑，如乙二醇雙(B—氨基乙醚)—N，N，N′，N′—四乙酸(“EGTA”)和檸檬酸都可使用。
為了穩(wěn)定PMT抵抗可能導(dǎo)致PMT失活的可能變性和其它更敏感的構(gòu)象改變，向提取緩沖液中加入水活度調(diào)節(jié)劑。這種水活度調(diào)節(jié)劑是降低它們所加入的水溶液的水活性的非離子親水化合物。優(yōu)選甘油、乙二醇、和低分子量的聚乙二醇(例如“PEG400”)，但葡萄糖、蔗糖、果糖和山梨醇是作為水活度調(diào)節(jié)劑的其它有用的化合物的例子。
為了防止在組織均化過程中可能釋放的蛋白水解酶引起的蛋白水解裂解對PMT的滅活，通常向提取緩沖液中加入蛋酶抑制劑。有用的蛋白酶抑制劑特別包括苯基甲基磺酰氟化物(“PMSF”)，亮抑蛋白酶肽，抑蛋白酶肽，胰凝乳蛋白酶抑制劑和胃蛋白酶抑制劑。優(yōu)選PMF和亮抑蛋白酶肽。
優(yōu)選向提取緩沖液中加入酚類化合物吸附劑以去掉植物酚類化合物，如果這類化合物存在，當植物細胞破裂時它們氧化后會滅活或沉淀PMT。典型地，將不溶性聚乙烯吡咯烷酮(“PVPP”)和Amberlite XAD—4懸浮于提取緩沖液中以吸附酚類化合物。去掉或滅活酚類化合物而對PMT酶活性無明顯損害的其它物質(zhì)也可包括或替代PVPP或Amberlite XAD—4。
加入根組織前，將提取緩沖液冷卻到大約—15和—20°之間以形成冷凍懸浮液。在均化過程中，應(yīng)不使勻漿溫度升高到大約3到5℃之上。
正如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所預(yù)料的，在該方法中所用的根組織量可改變，但應(yīng)測量所用組織的近似重量，相應(yīng)地調(diào)整所用的其它成份的量。
均化后，優(yōu)選將不溶性物質(zhì)(包括PVPP和所吸附的酚類)從勻漿中去掉。這一步驟優(yōu)選在冷凍離心機中以大約10,000到20,000xg4℃沉淀大約30到90分鐘來完成。不溶性物質(zhì)沉淀后輕輕倒出可溶性提取物(即上清液)?？扇苄蕴崛∥锏淖罱K蛋白濃度一般是大約2.5到3.5mg/ml。
將可溶性提取物用硫酸銨分級分離，根據(jù)標準方法(Scopes，Protein Purification Principles and Practice，PP.48—52，Springer—Verlag，New York(1982))從可溶性提取物中收集40％到60％硫酸銨分離物(沉淀物)。然后將該分離物以每g根重大約0.1到0.4ml溶解緩沖液進行溶解。
用于溶解40％到65％硫酸分離物的優(yōu)選緩沖液含有有效量的緩沖劑，重金屬螫合劑，還原劑，水活度調(diào)節(jié)劑和蛋白酶抑制劑，最優(yōu)選的溶解緩沖液包含Tris緩沖劑(pH大約7.5)(大約10到20mM)，EDTA(大約1到10mM)，甘油(大約10到30％)，DTT(大約1到10mM)，PMSF(大約0.2到10.0mg/l)和亮抑蛋白酶肽(大約0.2到10.0mg/l)。用于上述目的的這些緩沖液成份包括提取緩沖液中的類似成份。技術(shù)人員可以預(yù)料這些成份可用功能相似的其它成份來替代。
然后可按標準方法對硫酸銨分離物脫鹽，例如透析或篩分層析。脫鹽部分按下面所述直接進行陰離子交換層析。然而在優(yōu)選的實施例中，硫酸銨沉淀部分選進行疏水反應(yīng)層析。
在對溶解的硫酸銨沉淀部分進行疏水反應(yīng)層析前，加入鹽使產(chǎn)生高鹽濃度是以保證PMT結(jié)合到疏水反應(yīng)介質(zhì)上。優(yōu)選的所加鹽濃度為1.5N。優(yōu)選的所加鹽是NaU。另一有用的鹽是硫酸銨。
優(yōu)選的疏水反應(yīng)介質(zhì)包含攜帶共價結(jié)合的苯基、大小適于層析的交聯(lián)瓊脂糖凝膠的近似球形顆粒。這種苯基瓊脂糖可作為“苯基瓊脂糖(phenyl—Sepharose)CL—4B”以商品的形式買到(Pharmacia—LKB，Inc.，Piscaaway，NJ，Cat.NO.17—0819—01)。
使用標準程序?qū)⑺媳交傊翘畛涞胶线m的層析柱上，用pH在大約7.2到8.3之間，優(yōu)選大約7.5的高鹽平衡緩沖液在大約4到8℃平衡。優(yōu)選的高鹽平衡緩沖液含有效量的緩沖劑，重金屬螫合劑，水活度調(diào)節(jié)劑，還原劑，且鹽液度在大約1.5到2.0M之間。最優(yōu)選的高鹽平衡緩沖液含大約10mM Tris(pH大約7.5)，大約1.5M NaU，大約1mMEDTA，大約2mMDFT，大約20％(v/v)甘油。
將鹽調(diào)節(jié)的可溶性提取物樣品(大約每ml苯基瓊脂糖填充床體積0.5到2.0ml提取物)加樣到平衡過的苯基瓊脂糖柱上，用平衡緩沖液洗柱，直到洗脫物基本上無蛋白質(zhì)物質(zhì)。如果緩沖劑是可為紫外光所透射的，則可經(jīng)測量大約280nm下的紫外光吸收率來確定。一般來說，用大約5到7倍柱體積的平衡緩沖液洗滌苯基瓊脂糖柱。PMT保持與疏水反應(yīng)介質(zhì)結(jié)合。
仍吸附于苯基瓊脂糖基質(zhì)上的蛋白質(zhì)(包含PMT)用大約4到6倍柱體積的洗脫緩沖液在4到8℃洗脫。洗脫緩沖液含從加樣鹽濃度(優(yōu)選大約1.5M)到大約0.0M逐漸減少的線型鹽梯度。接著用另外2到3倍柱體積的無鹽洗脫緩沖液洗脫。優(yōu)選的洗脫緩沖液包括Tris(大約10mM)(pH大約7.5)。DTT(大約2mM)，EDTA(大約1mM)和甘油(大約20％v/v)。
收集大約0.01到0.03柱體積的餾分并按下面所述分析PMT活性和280nm下的吸光率。典型地，匯集的洗脫餾分體積在大約1到2倍柱體積之間，且蛋白質(zhì)濃度在大約0.4到2.5mg/ml之間。
應(yīng)明白在前述緩沖液中除了優(yōu)選的NaU外，還可用其它的鹽，這些鹽包括氮化鉀和硫酸銨。
本發(fā)明純化方法的關(guān)鍵步驟是新的陰離子交換層析步驟，按下面所述進行。然而，為進行該步驟，加到柱上的煙草植物提取物(例如，優(yōu)選苯基瓊脂糖洗脫物)必須具有能使提取物中的PMT結(jié)合到陰離子交換介質(zhì)上的pH和化學(xué)組成。這就是說，提取物的pH應(yīng)在大約7.2到8.3之間，含有大約在0.0和10mM之間的鹽，優(yōu)選的應(yīng)進一步包含下列物質(zhì)緩沖劑在大約5到15mM之間，還原劑在大約1到10mM之間，水活度調(diào)節(jié)劑在大約10到30％(v/v)之間，重金屬螫合劑在大約1到5mM之間。最優(yōu)選的是煙草植物提取物包含10mM Tris/HCl，pH7.5，2mM DTT，1mM EDTA和20％(v/v)甘油。
當然，技術(shù)人員可預(yù)料到煙草植物提取物的pH和鹽濃度可根據(jù)上述的值而變化，產(chǎn)生的加樣條件仍能使PMT結(jié)合到陰離子交換介質(zhì)上。特別熟知的是鹽濃度的增加一般會降低蛋白質(zhì)與陰離子交換介質(zhì)的結(jié)合，pH值的上升一般會增強蛋白質(zhì)與陰離子交換介質(zhì)的結(jié)合。因此，除了上面列舉的那些外，技術(shù)人員很容易確定鹽濃度與pH的各種組合，在這些組合下PMT能與陰離子交換介質(zhì)結(jié)合。對pH/鹽濃度可能的組合的唯一限制是pH不能高到使PMT變性和失活。一般來說，PMT不應(yīng)在pH高于大約9的條件下放置較長時間。
從上面所述，很明顯當加樣到陰離子交換介質(zhì)上的煙草根提取物是硫酸銨沉淀部分或上述疏水反應(yīng)層析步驟的洗脫物時，必須用適當?shù)木彌_液脫鹽。這一步可用任一標準技術(shù)來完成。例如，用熟知的程序進行凝膠過濾層析(例如，使用Sephadex G—25)或透析。優(yōu)選的是用透析完成脫鹽。
在優(yōu)選的方法中，從上述疏水反應(yīng)層析步驟中匯合的洗脫物(或其它高鹽煙草根提取物)用透析緩沖液以每ml匯合洗脫物或提取物大約15到25ml透析緩沖液的比例在大約4到8℃透析大約8到20小時。優(yōu)選的是對透析緩沖液進行攪拌。優(yōu)選的透析膜截留分子量為10,000KD。透析緩沖液的化學(xué)組成和pH的選擇應(yīng)使透析后餾分中的PMT能按上面所述被陰離子交換介質(zhì)滯留。
陰離子交換介質(zhì)應(yīng)由大小適于層析，帶有一個或多個功能性陰離子交換部分，相當堅硬的顆粒(例如，交聯(lián)的瓊脂糖)組成。這些陰離子交換部分特別可選自由二乙氨乙基，聚乙烯亞氨基，叔氨基，季氨基，對氨基芐基和二乙基—(2—羥丙基)氨乙基組成的一組。這類介質(zhì)可以商品形式買到。優(yōu)選帶有二乙氨乙基(“DEAE”)部分的陰離子交換介質(zhì)。最優(yōu)選的是DEAE瓊脂糖(“DEAE—Sepharose，F(xiàn)ast Flow”，Pharmacia—LKB，Inc，Piscataway，NJ，Cat，NO.17—0709—01)。
根據(jù)標準程序?qū)㈥庪x子交換介質(zhì)平衡到平衡緩沖液的pH和鹽條件。
根據(jù)標準程序?qū)⑵胶獾年庪x子交換介質(zhì)填充到其底具有滯留介質(zhì)的裝置(例如，多孔玻璃盤)和輸出管的柱子(即，中空管)中。然后蓋上柱子的頂端并與輸入管聯(lián)接。優(yōu)選的是應(yīng)將平衡緩沖液過柱并監(jiān)測流過的pH和傳導(dǎo)性以確保介質(zhì)被適當平衡。
柱中應(yīng)含有足夠的陰離子交換介質(zhì)以便當加樣的煙草植物提取物中的蛋白質(zhì)全部結(jié)合時占據(jù)不超過大約50％的介質(zhì)容量。例如當加樣煙草植物提取物是上述透析的苯基瓊脂糖洗脫物時，柱內(nèi)對每ml透析苯基瓊脂糖洗脫物應(yīng)含大約0.04到0.10ml(填充床體積)DEAE—瓊脂糖。
優(yōu)選的是柱子的填充和介質(zhì)的平衡在與煙草植物提取物的加樣溫度相同的溫度下進行。如果洗滌或洗脫柱的溫度高于煙草植物提取物的加樣溫度，那么在填充柱前，含陰離子交換基質(zhì)的懸浮液可能會放氣。
按上面對加樣到陰離子交換介質(zhì)的煙草植物提取物所述，陰離子交換介質(zhì)平衡緩沖液的pH和化學(xué)組成必須使PMT能被介質(zhì)滯留。同樣地，技術(shù)人員可很容易地確定適當?shù)膒H/化合組成的組合。優(yōu)選的平衡緩沖液基本上不加鹽，其pH在大約7.2到8.3之間.最優(yōu)選7.5。更優(yōu)選的平衡緩沖液含有效量的緩沖劑，重金屬螫合劑，還原劑，和水活度調(diào)節(jié)劑。最優(yōu)選的平衡緩沖液含10mMTris/HCl(pH7.5)，1mMEDTA，2mMDTT，和20％(v/v)甘油。
在柱子的平衡，加樣和洗滌前和其過程中，煙草植物提取物，平衡緩沖液和陰離子交換介質(zhì)的溫度都優(yōu)選在大約2到10℃之間，最優(yōu)選的是在大約4到8℃之間。
用于煙草植物提取物的流速在大約0.1到0.3柱體積/分鐘之間。從煙草植物提取物柱上流出的實際上不含PMT的溶液被棄去。然后用平衡緩沖液洗柱直到洗脫的蛋白質(zhì)物質(zhì)穩(wěn)定在低水平。如果平衡緩沖液不含吸收280nm光的緩沖劑，用洗脫緩沖液洗柱直到280nm的UV吸光率穩(wěn)定在低水平。典型地，用5到12柱體積的含10mM NaCl的平衡緩沖液洗滌陰離子交換介質(zhì)，然后再用3到10柱體積的不含NaCl的平衡緩沖液洗滌。在洗滌步驟過程中PMT被陰離子交換介質(zhì)滯留。
洗滌后，用含有效量多胺的洗脫緩沖液從陰離子交換介質(zhì)中洗脫PMT，其中洗脫溫度，洗脫緩沖液的pH和化學(xué)組成應(yīng)除了多胺外，能使PMT被陰離子交換介質(zhì)滯留。
洗脫緩沖液中的多胺選自由腐胺，N—甲基腐胺，精胺，亞精胺，胍基丁胺，尸胺和其混合物組成的一組。腐胺是優(yōu)選的多胺，存在于洗脫緩沖液中的多胺濃度應(yīng)在大約0.5到50mM之間，優(yōu)選1到10mM，最優(yōu)選大約5mM。
洗脫緩沖優(yōu)選進一步包含有效量的緩沖劑，重金屬螫合劑，還原劑，水活度調(diào)節(jié)劑。這些成份與上面所述的提取緩沖液中的一樣。這些成份的有效量不需過多的實驗就能被技術(shù)人員確定。洗脫緩沖液的pH應(yīng)在大約7.2和8.3之間，優(yōu)選大約7.5。當陰離子交換介質(zhì)平衡緩沖液中加入多胺后是一種合適的洗脫緩沖液。優(yōu)選的洗脫緩沖液含10mM Tris/HCl(pH7.5)，1mM EDTA，20％(體積)甘油，2mM DTT，和5mM腐胺(1，4—丁二胺)(Sigma ChemicalCO，st.Louis，MO，Cat，NO.P7505)。
從陰離子交換柱中洗脫PMT優(yōu)選在大約18到26℃之間(即，室溫)進行。洗脫開始前，洗脫緩沖液和陰離子交換柱應(yīng)處于所選定的洗脫溫度。
為了從柱上洗脫PMT，所用的洗脫緩沖液流速應(yīng)在大約0.02到0.10柱體積/分之間并從柱底部收集餾分。洗脫物也可以收集到單個洗脫池中。在最優(yōu)選的洗脫方法中，將大約1柱體積的洗脫緩沖液加到柱上，然后停止流動。使陰離子交換介質(zhì)與洗脫緩沖液等份保持接觸時間在大約1到6小時之間，優(yōu)選大約1小時，然后重新開始使用洗脫緩沖液。
非常緩慢地從陰離子交換介質(zhì)中洗脫PMT。典型地，用大約40到70柱體積的洗脫緩沖液洗脫陰離子交換介質(zhì)，最優(yōu)選的用至少50柱體積的洗脫緩沖液。按下面所述分析洗脫餾分的PMT活性以監(jiān)測PMT的洗脫。
當以相當稀釋的形式和相當大的體積回收PMT時，必須濃縮陰離子交換洗脫物。例如，可將洗脫物加到在陰離子交換介質(zhì)洗脫緩沖液存在條件下對PMT具有親合力的任一層析介質(zhì)上，并能從中以相當濃縮的形式和良好的收率洗脫結(jié)合的物質(zhì)。作為選擇，可沉淀PMT。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，在洗脫過程中陰離子交換柱的出口與濃縮柱的入口相連。以這種方式，從陰離子交換柱流出的洗脫的PMT直接流到濃縮柱中并吸附于其中。陰離子交換柱的PMT洗脫完成后，從濃縮柱上取下陰離子交換柱的出口并從濃縮柱中洗脫PMT。
優(yōu)選的濃縮柱使用W—氨基已基瓊脂糖(“W—氨基已基瓊脂糖4B”，Sigma Chemical CO，st.Louis，MO，Cat，NO.A8894)(“AHS”)，床體積為陰離子交換柱的10到30％。用含相當高濃度的鹽，優(yōu)選1.5M NaCl的洗脫緩沖液從該柱洗脫PMT。優(yōu)選的是洗脫緩沖液進一步包含的效量的緩沖劑，重金屬螫合劑，還原劑，水活度調(diào)節(jié)劑。最優(yōu)選的洗脫緩沖液包含1.5M NaCl，10mMTris/HCl(pH7.5)，1mMEDTA，20％(v/v)甘油，和2mM DTT。濃縮柱優(yōu)選在4—8℃加樣和洗脫。
開始4到8柱體積的濃縮柱洗脫物含主要PMT活性。將這一餾分進一步濃縮，優(yōu)選在超濾裝置(如“Centricon 30”，從Amicon Cop，Danvers，MA可得到)中。超濾后，樣品典型的蛋白質(zhì)濃度在大約0.04和0.70mg/ml之間。典型地從幾個這類濃縮柱中匯集合PMT的餾分并進一步濃縮。
經(jīng)過陰離子交換和樣品濃縮步驟后得到的PMT以制備型等電聚焦進一步純化。等電聚焦包括將樣品混合物加入一個穩(wěn)定的pH梯度中，在其兩端旋加一定的電壓。每種蛋白質(zhì)向pH梯度中使該種類蛋白質(zhì)凈電荷為零處電泳遷移。使蛋白質(zhì)凈電荷為零的pH稱為該蛋白質(zhì)等電點。
可以使用各種各樣的pH梯度平衡介質(zhì)，特別包括蔗糖溶液和聚丙烯酰凝膠。同樣地等電聚焦后可使用各種各樣的分級分離pH梯度的方法來回收蛋白質(zhì)。pH梯度分級分離方法的選擇應(yīng)與梯度平衡介質(zhì)相一致。
優(yōu)選的pH梯度平衡介質(zhì)是裝于玻璃管中的的蔗糖溶液(密度梯度)。最優(yōu)選的蔗糖密度梯度包含的pH梯度范圍從大約pH5到大約pH6。優(yōu)選的梯度分級分離方法是通過一個活塞精確地控制液體流動。試驗收集的餾分的pH和PMT活性。用于等電聚焦的裝置，化學(xué)物質(zhì)和方案可從一些商品途徑獲得。
以本發(fā)明方法分離的PMT基本上不含其它煙草蛋白質(zhì)，其中PMT是制品中的優(yōu)勢蛋質(zhì)。制品中少量污染的煙草蛋白質(zhì)可根據(jù)標準技術(shù)以十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(“SDS—PAGE”)從PMT中分離。以這種方式獲得用于氨基酸序列分析的足夠純的PMT。PMT的鑒定煙草PMT的特征是以SDS—PAGE測定其分子量在大約55和65千道爾頓之間，以等電聚焦測量基天然等電點在大約pH5.0和6.0之間。
煙草PMT進一步的特征為具有將S—腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到腐胺δ—氨基上的催化能力和對腐胺具有高度底物專一性。
Michaelic—Menten常數(shù)(Km)定義為起始反應(yīng)速度等于最大反應(yīng)速度的一半時的底物濃度。Km值變化幅度較大，即使對催化相同反應(yīng)的不同酶種類。因此Km的測量是酶有用的“鑒定標記”。部分純化的煙草PMT特征為對腐胺的Km在大約300和500μM之間。本發(fā)明高度純化的煙草PMT特征為對S—腺苷甲硫氨酸的Km在大約100和150μm之間。PMT部分氨基酸序列的測定在用于氨基酸序列分析的制品中，使用SDS—PAGE標準技術(shù)從陰離子交換，樣品濃縮和等電聚焦步驟后仍滯留的少量污染蛋白質(zhì)中分離PMT。SDS—PAGE的詳細操作方案見文獻(Laemmli，“Cleavage of Structural Proteins During theAssembly of the head of Bacteriophage T4”，Nature，227，PP.680—85(1970)和電泳裝置廠家提供的操作手冊。以熟知技術(shù)，將含單個蛋白質(zhì)的帶電泳(電印跡)轉(zhuǎn)移到薄片或膜上，并在其上滯留和觀察。在一個熟知的方法中，蛋白質(zhì)帶被電印跡到覆蓋有疏水多聚陽離子(如多聚(4—乙烯基—N—甲基吡啶鎓)碘化物)的玻璃微纖維片上并以非陰離子試劑(如熒光胺)觀察。另一方法包括將蛋白質(zhì)電印跡到聚偏二氟乙烯膜(“Immobilon—P，”Miuipore，Bedford，MA)上并以陰離子染料(如酰胺黑)觀察帶(Bauw et al，“Alterations in the Phenotype of plant Cells Studiedby NH2--Terminal Amino Acid Sequence Analysis of ProteinsEleetroblotted From Two Dimensional Gel—Separated TotalExtracts”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，PP.4806—10(1987)；A Practical Guide to Protein and Peptide Purification forMicrosequencing，Paul T.Matsudaira(ed)，Academic Press，New YorK，(1989)。
優(yōu)選上述從電泳凝膠轉(zhuǎn)移分離的蛋白質(zhì)和觀察轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的技術(shù)。然而本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以預(yù)料到本發(fā)明不排除為進行序列分析制備電泳分離的蛋白質(zhì)所用的材料和方法的改變。
由純化PMT組成的帶以表現(xiàn)分子量(即，大約60KD)來鑒定。將蛋白質(zhì)帶從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到膜上并觀察轉(zhuǎn)移帶后，精確地切下帶有純化PMT單一帶的膜片以避免被任何相鄰蛋白質(zhì)帶的污染。
由純化煙草PMT構(gòu)成的蛋白質(zhì)帶(按上述分離)以標準自動方法進行氨基末端序列分析。煙草PMT蛋白質(zhì)包含選自SEQ IDNO1，SEQ ID NO2，和SEQ ID NO3的氨基酸序列。
SEQ ID NO1來自“a1”帶(圖5)。SEQ ID NO2來自“a2”帶(圖5)，SEQ ID NO3是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2共有序列。
來自緊密相鄰的純化蛋白質(zhì)帶的序列具有高度同源性表明煙草PMT蛋白質(zhì)存在多種形式。煙草PMT蛋白質(zhì)的多種形式可能來自于單個基因產(chǎn)物的翻譯后修飾或來自于PMT基因多種形式。PMT DNA序列的克隆本發(fā)明PMT蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列(SEQ ID NO1，SEQID NO2，SEQ ID NO3)用于設(shè)計一套寡核苷酸，其中的一個或多個與煙草根cDNA文庫中的PMT序列選擇地雜交。該選擇性雜交用于鑒定含編碼部分或全部PMT蛋白質(zhì)的序列的cDNA克隆。從氨基酸序列設(shè)計寡核苷酸探針的描述見Sambrook等的分子克隆—實驗手冊第11章(Cold Spring Harbor Press(1989))。
這類寡核苷酸探針的合成通常用可以商品形式買到的自動裝置來完成。
cDNA文庫的構(gòu)建現(xiàn)在是分子生物學(xué)實驗室的常規(guī)工作。通常見Sambrook等(出處同上)第8章。同樣地，用寡核苷酸探針篩選cDNA文庫以鑒定含感興趣的序列的克隆對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是平常的并完全是力所能及的。對篩選cDNA文庫的寡核苷酸的使用的描述見Aambrook等(出處同上)的實驗手冊第11章。根據(jù)寡核苷酸探針雜交選擇的cDNA克隆，對其大小，限制性位點的存在和核苷酸序列進行鑒定。這些DNA分析方法在文獻中已充分描述(特別是Sambrook et al，出處同上，和Ausubel etal，Short Protocols in Molecular Biology，Green PublishingAssociates and Wiley Intergcience，New York(1989))。以這種方式獲得的任一PMT cDNA克隆。本身可用作探針來鑒定其它的PMT cDNA克隆。
煙草(Nicotiana tabacum L.Var，NK326)基因組文庫可以商品的形式買到(clonetch Laboratories，Inc，Palo Alto，CA)。根據(jù)賣主提供的方法篩選這種基因組文庫以獲得編碼煙草PMT的染色體基因。
除了前面提到的方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用有利的聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)方法獲得所需的PMT cDNA克隆。PCR的基本原理是迅速擴增位于兩個已知序列區(qū)之間的DNA片段。已發(fā)展了各種各樣的PCR技術(shù)用于檢測，分析和構(gòu)建特定的DNA分子。PCR技術(shù)的大量應(yīng)用的裝置，化學(xué)物質(zhì)和方法可從商業(yè)途徑獲得。對PCR方法的一般討論見Sambrook等(出處同上)第14章。
實施本發(fā)明優(yōu)選的PCR方法稱為RNA PCR。RNA PCR有2個基本步驟(1)在反向引物存在的條件下使用RNA作模板反轉(zhuǎn)錄酶合成第一cDNA鏈，(2)Taq聚合酶合成互補的cDNA鏈，接著在正向和反向兩種引物存在的條件下用Taq聚合酶擴增兩條鏈。
應(yīng)用RNA PCR方法使用煙草根poly(A+)RNA作模板并使用根據(jù)已知PMT部分氨基酸序列的寡核苷酸作引物可獲得PMTcDNA分子。
因此，本發(fā)明提供編碼煙草PMT蛋白質(zhì)的重組DNA分子。用PMT DNA序列以有意義或反義取向穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草細胞和植物的生產(chǎn)本發(fā)明還提供了用與調(diào)節(jié)序列以可操作的形式連接的，編碼煙草PMT蛋白質(zhì)和編碼PMT反義RNA分子的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基困煙草細胞和植物。
為了生產(chǎn)比未轉(zhuǎn)化的對照煙草植物具有較低煙堿含量的煙草植物，用制備的PMT反義轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)化煙草細胞，該反義轉(zhuǎn)錄單位包含部分PMT cDNA序列，全長PMT DDNA序列，部分PMT染色體序列，或全長PMT染色體序列，將它以反義取向用合適的可操作連接的調(diào)節(jié)序列克隆。適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列包括轉(zhuǎn)錄起始序列(“啟動子”)和多聚腺苷化/轉(zhuǎn)錄終止序列。
反義序列在轉(zhuǎn)基因煙草植物中的表達典型地使用花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子。(例如見Cornelissen et al，“BothRNA Level and Translation Efficiency are Reduced by Anti—sense RNA in Transgenic Tobacco”，Nucleic Acids Res.17.PP.833—43(1989)；Rezaian et al，“Anti—Sense RNAs of CucumberMosaic Virus in Transgenic Piants Assesed for conter of theVirus”，Plaut Molecular Biology 11，PP.463—71(1988)；Rodermel et al，“Nuclear—organelle InteractionsNuclearAntisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate CarboxylaseEnzyme Levels in Transformed Tobacco Plants”，Cell55，PP673—81(1988)；Smith et al，“Antisense RNA Inhibition ofPolygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes”，Nature344，PP.724—26(1988)；Van der Krol et al，“An Anti—Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants InhibitsFlower Pigmentation”，Nature333，PP.866—69(1988))。在本發(fā)明轉(zhuǎn)化的煙草細胞和植物中PMT的表達優(yōu)選使用CaMV35S啟動子。在煙草根內(nèi)其它重組基困的表達中使用CaMV啟動子已被充分描述(Lam et al，“Site—Specific Mutations Alter In VitroFactor Binding ang change Promoter Expression Pattern inTransgenic Plants”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86.PP.7890—94(1989)；Poulsen et al，“Dissection of 5′Upstream Sequencesfor Selective Expression of the Nicotiana Plumbaginifolia rbcS—8B Gene”，Mol.gen.Genet.214，PP.16—23(1988))。
盡管優(yōu)選使用CaMV35S啟動子，應(yīng)預(yù)料到其它的啟動子也可成功地用于煙草植物外源基因表達，且除CaMV35S啟動子外的其它啟動子的使用也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
已知各種各樣的轉(zhuǎn)錄終止序列。轉(zhuǎn)錄終止序列的來源和鑒定是其利用的先決條件。例如，胭脂氨酸合成酶(“NOS”)，章魚堿合成酶(“OCS”)和CaMV多聚腺苷化/轉(zhuǎn)錄終止序列用于轉(zhuǎn)基因煙草植物外源基因的表達并對PMT序列的表達有用。(例如，見Rezian et al，出處同上，和Rodermel et al，出處同上)。
然后應(yīng)用標準技術(shù)(例如限制性圖譜，Southern印跡雜交和核苷酸序列分析)鑒定攜帶以反義取向與可操作的調(diào)節(jié)序列(即，啟動子和多聚腺苷化/轉(zhuǎn)錄終止序列)相連的PMT序列的克隆。
有相當發(fā)達的技術(shù)用于將外源性DNA導(dǎo)入煙草細胞基因組以生產(chǎn)被外源性DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草細胞。可用大量已知的煙草細胞轉(zhuǎn)化方法中的任何一種來實施本發(fā)明。通常煙草細胞轉(zhuǎn)化方法的分類根據(jù)其是否使用土壤桿菌(Agrobacteriun)系統(tǒng)的成份。
根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefasciens)是含有稱為“FDNA”(用于轉(zhuǎn)移的DNA)核昔酸序列之質(zhì)粒的革蘭氏陰性細菌，T—DNA能有效地轉(zhuǎn)移并整合到天然雙子葉植物(包括煙草)的染色體中，引起感染的植物腫瘤生長。這種天然存在的用于將外源DNA整合到植物染色體的載體系統(tǒng)已被廣泛地研究、修飾并在植物遺傳工程中利用。(Deblaere et al，“Efficient Octopine TiPlasmid—Derived VeCtors for Agrobacteriun—Mediated GeneTransfer to Plants”，Nucleic Acids Research13，PP.4777—88(1985)。用常規(guī)方法將含PMT DNA序列并以有意義或反義取向與可操作的調(diào)節(jié)序列相連的裸露的重組DNA分子連接到合適的T—DNA序列上。用聚乙二醇技術(shù)或電穿孔技術(shù)(兩者都是標準技術(shù))將它們導(dǎo)入煙草原生質(zhì)體中。作為選擇，將這種包含編碼PMT的重組DNA分子的載體導(dǎo)入活的土壤桿菌細胞，然后將DNA轉(zhuǎn)移到煙草植物細胞中(Rogers et al，“Gene Transfer in PlantsProduction of Transformed Plants Using Ti Plasmid Vectors”，Methods in Enzymology118，PP.627—40(1986))。
盡管土壤桿菌技術(shù)在本領(lǐng)域中廣泛使用，但它并非本發(fā)明的必須內(nèi)容?？山?jīng)過將煙草原生質(zhì)體與含DNA的脂質(zhì)體融合或經(jīng)電穿孔來完成以不含T—DNA載體序列的裸露DNA進行轉(zhuǎn)化。(Shillito et al，“Direct Gene Transfer to Protoplasts ofDicotyledonous and Monocotyledonus Plants by a Number ofMethods，Including Electroporation”，Methods in Enzymology153，PP.313—36(1987))。不含T—DNA載體序列的裸露DNA也可經(jīng)過惰性高速顯微投影用于轉(zhuǎn)化煙草細胞(BIOLISTICTMParticle Delivery System，Du Pont，Wilmington，DE)。
用于生產(chǎn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的煙草細胞和植物的PMT重組DNA分子和載體優(yōu)選進一步包含一個顯性選擇性標記基因。適用于煙草的顯性選擇性標記特別包括編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶的抗生素抗性基因。另一適用于煙草的熟知的顯性選擇性標記是編碼氨甲喋抗性二氫葉酸還原酶的突變的二氫葉酸還原酶基因(Deblaere et al，出處同上)。含合適的抗生素性基因的DNA載體和相應(yīng)的抗生素可以商品形式買到。
經(jīng)過將混合的細胞群落放入含有適當濃度的所選定的顯性選擇性標記基因產(chǎn)物對其提供抗性的抗生素(或正常情況下對煙草細胞有毒的其它化合物)之培養(yǎng)基中，從周圍未轉(zhuǎn)化的細胞群落中選出轉(zhuǎn)化的煙草細胞。因此，只有那些被轉(zhuǎn)化的煙草細胞能存活和繁殖。
通過應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的煙草細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的細胞再生完整的，可結(jié)實的煙草植物。植物再生方法的選擇應(yīng)與轉(zhuǎn)化方法相適應(yīng)。用按人工雜交所得后代的DNA分析標準方法所揭示的PMT序列的孟德爾遺傳來證實推斷的轉(zhuǎn)基因煙草植物基因組中PMT序列的穩(wěn)定存在和取向。
從轉(zhuǎn)化的細胞再生出轉(zhuǎn)基因煙草植物后，通過常規(guī)植物育種方法且不需過多的實驗就能很容易地將導(dǎo)入的PMT序列轉(zhuǎn)移到其它煙草變種中。
經(jīng)標準煙堿試驗檢測PMT反義轉(zhuǎn)基因煙草植物中煙堿水平的減少。
熟悉上述重組DNA方法的人員將認識到可使用全長PMTcDNA分子或全長PMT染色體基因以有意義取向與合適的可操作連接的調(diào)節(jié)序列相連來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因煙草細胞和植物。(本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將認識到用于有意義取向的基因表達的合適的調(diào)節(jié)序列包括任一已知的真核翻譯起始序列，還包括上述啟動子和多聚腺苷化/轉(zhuǎn)錄終止序列)。這種轉(zhuǎn)化的煙草植物特征為PMT蛋白質(zhì)水平升高，因而其煙堿含量比未轉(zhuǎn)化的對照煙草植物含量更高。
因此應(yīng)明白使用PMT DNA序列降低或升高PMT蛋白質(zhì)水平并以此降低或升高煙草植物煙堿含量都落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
為了更好地理解本發(fā)明，提供了下述實施例。這些實施例僅用于解釋本發(fā)明而不能以任何理由當作是對本發(fā)明范圍的限制。
實施例緩沖液組成緩沖液A50mM Tris/HCl，pH7.55mM EDTA(游離酸)20％(v/v)甘油2mM DTT0.5(w/v)抗壞血酸鈉2％(w/v)PEG4000.4mg/l PMSF(取自1mg/ml貯液)0.4mg/l亮抑蛋白酶肽(取自1mg/ml貯液)100g/l PVPP40g/l Amberlite XAD—4緩沖液B10mM Tris/HCl，pH7.51mMEDTA(游離酸)20％(v/v)甘油，2mM DTT0.4mg/l PMSF(取自1mg/ml貯液)0.4mg/l亮抑蛋白酶肽(取自1mg/ml貯液)緩沖液C10mM Tris/HCl，pH7.5
1mM EDTA(游離酸)20％(v/v)甘油2mM DTT蛋白酶抑制劑貯液將PMSF(1mg/ml)溶于二甲基甲酰胺中并以2.1ml的等份試樣貯存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 將亮抑蛋白酶肽(1mg/ml)溶于蒸餾水并以2.1ml的等份試樣貯存于-20℃?zhèn)溆?。粗提物的制備從水栽法生長的煙草(Nicotiana tabacum L.Var.Burleg21)植物去頂3天后收集大約1kg根。用冷水洗滌收獲的根并放在Buchner漏斗上，吸出其中的水。洗滌后的根冷凍貯存于-80℃。將冷凍的根加入2.5l凍成冷凍懸浮液并裝在1加侖韋林氏攪切器的緩沖液A中。用大藥匙將根混合入緩沖懸浮液中，攪切器開始在低速檔，接著以培養(yǎng)基速度檔進一步勻漿。小心操作，避免勻漿溫度上升到超過3—5℃。
將提取物分裝到離心瓶中，以13,680xg 4℃離心70分鐘沉淀不溶碎片。
倒出上清液，其體積為2.37l。向提取物中加入大約0.77gDTT。硫酸銨分級分離以每100ml提取物22.6g的量向提取物中緩慢加入結(jié)晶硫酸銨，使提取物達到含40％硫酸銨的飽和狀態(tài)。4℃下攪拌含硫酸銨的提取物2小時。
在4℃下以27,500Xg離心30分鐘除去40％硫酸銨沉淀。每升提取物中再加入0.33g DTT。以每100ml提取物15.3g的量向提取物中緩慢加入結(jié)晶硫酸銨，使硫酸銨濃度從40％增加到65％的飽和狀態(tài)。含65％硫酸銨的提取物在4℃下攪拌過夜。在4℃以27，500xg離心70分鐘沉淀40—65％硫酸銨沉淀部分并棄去上清液。
將40—65％硫酸銨沉淀溶于緩沖液B中使總體積為200ml，然后加入17.53g NaCl并在冰溶中攪拌使溶解。含NaCl的溶解的40—65％沉淀部分在4℃下以47，800Xg離心30分鐘并棄去沉淀。
基本上按上面所述進行粗提物的制備和硫酸銨的分級分離3次，并將4次所得的40—65％硫酸銨沉淀部分(每次200ml)合并。該800ml合并液來自總共5.239kg的根組織。疏水反應(yīng)色譜用含1.5M NaCl的緩沖液C平衡苯基—瓊脂糖CL 4B(Pharmacia Inc，Piscataway，N，J，Cat.No.17—0810—01)疏水反應(yīng)柱(5cm×20cm)。然后將來自5.239kg根組織的，40—65％澄清的硫酸銨分離物合并的800ml溶液加樣到平衡的苯基瓊脂糖柱上。用加有1.5M NaCl的緩沖液C洗柱直到獲得280nm吸光率的穩(wěn)定基線，聲明所有未結(jié)合的蛋白質(zhì)實際上已被全部洗掉。然后用2l在緩沖液C中NaCl從1.5M到0.0M遞減的線性梯度溶液洗脫PMT。再用1l緩沖液C進一步洗柱。每個餾分收集12ml，按下面所述依次分析餾分(在PMT活性峰上和周圍的每第三個餾分，在梯度的其它部分的每第10個餾分)的PMT活性。在4℃下以4.7ml/分的流速進行疏水反應(yīng)色譜。
合并從#86至#116含PMT活性的苯基瓊脂糖餾分，合并液在9l緩沖液C中持續(xù)攪拌透析大約18小時。透析樣品分成各為100ml的4個等份試樣并貯存于-80℃。PMT活性分析每個反應(yīng)管含下列成份12.5μmol Tris/HCl pH8.30.25μmol EDTA1.25μmol 2—疏基乙醇0.9μmol腐胺0.15μmol未標記的S—腺苷甲硫氨酸0.18μmol〔14C—甲基〕S—腺苷甲硫氨酸(57nci/nmol)酶樣品總體積＝0.25ml加入酶樣品開始反應(yīng)，30℃下反應(yīng)進行30分鐘。經(jīng)加入用NaCl飽和的10％(w/v)NaOH 0.5ml終止反應(yīng)。
經(jīng)溶劑提取到氯仿中從底物分離出放射性產(chǎn)物N—〔14C—甲基〕腐胺。將終止的反應(yīng)混合物與1ml氯仿混合轉(zhuǎn)動90秒后，以1600Xgav離心5分鐘分離有機相和水相。然后分析有機相的0.5ml等份試樣。將0.5ml有機相的等份試樣加入9.5ml液丙混合物(Beckman Instrument，Columbia，MD)中，用液閃計數(shù)器按標準程序測量放射性。
1單位的PMT活性定義為30℃下每30分鐘形成1毫微摩爾的產(chǎn)物。
所有的PMT試驗都包括陰性對照。陰性對照由無酶的反應(yīng)混合物組成，或在零時以NaOH終止反應(yīng)。陰離子交換色譜2個100ml苯基—瓊脂糖純化樣品的等份試樣解凍后，在4℃以1.5ml/分的流速加樣到用緩沖液C在4℃下平衡的DEAE—瓊脂糖“Fast Flow”(Pharmacia—LKB，Piscataway，NJ，Cat.No.17—0709—01，Lot No.OB—05854)柱(1cm×14.5cm)上。
然后，用70ml含10mM NaCl的緩沖液C以1.5/分的流速洗滌DEAE—瓊脂糖柱，直到獲得穩(wěn)定的280nm基線。然后用50ml不含NaCl的緩沖液C重新平衡柱。將柱溫度升高到室溫(24℃)，用含5mM腐胺(Sigma Chemical Co，St，Louis，MO，Cat.No.P7505，Lot No.39F0039)的緩沖液C補充柱的空體積。柱在24℃下不流動保持大約1小時，然后在24℃下用632ml含5mM腐胺的緩沖液C以0.7ml/分的流速洗脫PMT(15小時)。經(jīng)吸附濃縮PMT從DEAE—瓊脂糖柱上洗脫的PMT直接收集到維持在4℃的W—氨基已基瓊脂糖4B(“AHS”)(Sigma Chemical Co，st.Louis，MO，Cat.No.A8894)柱(1cm×3cm)上。用含1.5M NaCl的緩沖液C以1.6ml/分的流速從AHS柱上洗脫PMT。收集各為12—15ml的4個餾分并按上面所述分析PMT活性。第一個餾分(14.7ml)含有超過80％的從AHS濃縮柱中回收的總PMT活性。超濾為了進一步濃縮，將13.7ml的第一AHS餾分分成6個等分并放入“Centricon 30”(Amicon，Danvers，MA)超濾裝置中濃縮大約25倍。合并來自6個該裝置的濃縮物，用不加鹽的緩沖液C稀釋大約80倍并在單個“Centricon 30”中進行第二輪超濾，直到總體積為大約150μl。將150μl濃縮物貯存于-80℃。制備性等電聚焦通過DEAE/AHS階段(包括超濾濃縮)純化的PMT進一步用等電聚焦純化。用能以商品形式買到的兩性電解質(zhì)(Pharmacia—LKB，Piscataway，NJ)在蔗糖密度梯度(1.6cm×21cm)中進行制備型等電聚焦。根據(jù)兩性電解質(zhì)賣主的說明書制備pH梯度，pH跨度范圍從大約5.3到大約6.3。使用從1000到4000優(yōu)特(功率在1和4瓦特之間)的電壓進行聚焦大約3小時。聚焦后收集各為1ml的餾分，測定各餾分的pH和PMT活性。在4℃下進行聚焦和餾分收集。
圖4是等電聚焦后，相對PMT活性和pH對餾分號(即，在蔗糖密度梯度中的位置)的二元標繪圖。描繪于圖4中的實驗數(shù)據(jù)表明煙草PMT的等電點大約為5.7。在其它等電聚焦實驗中，煙草PMT的pI表現(xiàn)為低達5.0和高達5.8。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到在實施過程中有許多因素影響表觀pI，因此pI的測量一般出現(xiàn)一些變化。PMT相對純度的測定經(jīng)過測量比活性來測定在純化程序的連續(xù)步驟中PMT的相對純度(表1)。表1所示的純化(倍)值低估了從煙草根粗提物的實際純化程度，因為在活性產(chǎn)率計算時將40—65％硫酸銨分離物當作100％。
表1
*從4個分離的粗提物合并的40—6％硫酸銨分離物**僅代表一半的來自苯基瓊脂糖柱的物質(zhì)。
以SDS—PAGE標準程序還測定了本方法連續(xù)的步驟中PMT的相對純度。圖1顯示了在PMT純化方法各步驟的樣品表現(xiàn)出的(經(jīng)銀染后)SDS—PAGE蛋白質(zhì)帶型。凝膠中的樣品如下泳道1和6，分子量標準蛋白質(zhì)(在上面附圖簡要描述中已列出)；泳道2，40—65％硫酸銨分離物；泳道3，來自苯基—瓊脂糖柱PMT活性峰的餾分；泳道4，DEAE/AHS步驟的濃縮物；泳道5，DEAE/AHS步驟濃縮物經(jīng)等電聚焦后的PMT活性峰餾分。應(yīng)該注意在DEAE/AHS純化物(泳道4)中占優(yōu)勢的PMT帶(箭頭所示)在前面的疏水反應(yīng)步驟(泳道3)的物質(zhì)中幾乎看不見。煙草PMT分子量將通過硫酸銨、苯基瓊脂糖，DEAE/AHS/超濾純化階段的PMT物質(zhì)加樣到非變性電泳凝膠上分離PMT，用包含這一程序的實驗測量煙草PMT的表觀分子量。非變性的堆積凝膠緩沖液含有0.27M Tris/HCl(pH6.8)，10％(v/v)甘油和20mM 2—巰基乙醇。非變性的12.5％聚丙烯酰胺分辨凝膠緩沖液含0.38M Tris/HCl(pH8.8)，10％(v/v)甘油，和12mM，2—巰基乙醇。
從非變性凝膠上切下單個泳道，沿其長度切成二半，然后切成3mm切片。將每個凝膠切片的一半直接放入標準PMT試驗混合物中，每個凝膠切片相應(yīng)的另一半進行SDS—PAGE。
表現(xiàn)出最高PMT活性的非變性凝膠切片(圖2)基本上含單一蛋白質(zhì)，其表觀分子量大約為60KD(圖3)。PMT的酶促活性用本發(fā)明高度純化的煙草PMT進行底物特異性試驗。比較了1，3—二氨基丙烷和1.5—二氨基戊烷(腐胺的化學(xué)類似物)，磷脂酰乙醇胺(甲基受體)，N—甲基腐胺(PMT的正常產(chǎn)物)與腐胺(1，4—二氨基丁烷)作為PMT底物的能力。在標準PMT試驗(如上面所述)中，當用1，3—二氨基丙烷，1.5—二氨基戊烷和磷脂酰乙醇胺代替腐胺時，未形成可檢測量的放射性產(chǎn)物。在PMT試驗中，當用N—甲基腐胺代替腐胺時，形成的放射性產(chǎn)物不超過在用腐胺的試驗中所觀察到的產(chǎn)物的6％。
當一種底物為不同的速度限制濃度而另一種底物過量時測量PMT活性(如上所述)來測定2種PMT底物(腐胺和S—腺苷甲硫氨酸)的表觀Km值。部分純化的煙草PMT對腐胺的Km大約為400gM。高度純化的煙草PMT對S—腺苷甲硫酸的Km大約為125μM。部分純化的煙草PMT對腐胺的Km值和高度純化的煙草PMT對S—腺苷甲硫酸的Km值與公開的PMT值(Mizusaki etal，出處同上；Feth et al，“Detrmination of Putrescine N—methyltransferase By High Performance LiquidChromatography”，Phytochemistry，24，PP，921—23(1985)緊密吻合。氨基末端氨基酸序列分析用于序列分析的煙草PMT是將進行過硫酸銨分級分離，苯基—瓊脂糖色譜，以腐胺洗脫的DEAE—瓊脂糖色譜(接著經(jīng)AHS和超濾濃縮)和自由流動的等電聚焦純化步驟后所得的物質(zhì)經(jīng)SDS—PAGE分離得到的。經(jīng)過對高度純化的PMT進行SDS—PAGE后，蛋白質(zhì)帶電印跡到聚偏二氟乙烯膜(“Immobilon—P”，Miuipore，Bedford，MA)上并以標準程序用酰胺黑觀察?！癮1”帶(見圖5)是高度純化的制品中僅有的表現(xiàn)出煙草PMT分子量特征(見圖3)的2條帶中的一條，將帶有“a1”帶的膜片切下來以便與相鄰的“a2”帶分離。將所分離的PMT根據(jù)廠商建議的程序在帶有線上120A分析儀的應(yīng)用生物系統(tǒng)477A型(脈沖液相測序儀)上進行氨基末端氨基酸序列分析。
煙草PMT“a1”帶的氨基末端前17個氨基酸的序列是(SEQID NO1)Leu Ser Xaa Asn Phe Leu Phe Gly Thr Ala Ser SerXaa Tyr Gln Tyr Glu。
“a2”帶(見圖5)是僅有的表現(xiàn)出煙草PMT分子量(見圖3)的兩條帶中的第二條。當制備“a2”帶(圖5)并以與“a1”帶相同的方式分析時，“a2”帶產(chǎn)生下列部分氨基酸序列(SEQ ID NO2)LeuSer Ser Asn Phe Leu Pne Gly Thr Ala Pro Tyr Tyr Gln Tyr Glu。60KD PMT蛋白質(zhì)氨基末端序列的確定制備更大量的60KD煙草PMT蛋白質(zhì)以進行進一步的氨基末端氨基酸序列分析。根據(jù)這種進一步的分析，發(fā)現(xiàn)“a1”帶前29個氨基酸的序列是(AEQ ID NO4)Leu Ser Ser Asn Phe LeuPhe Gly Thr Ala Ser Ser Tyr Tyr Gln Tyr Glu Gly Ala Phe LeuSer Asp Gly Val Gly Leu Ser Asn。CNBr片段的部分氨基酸序列為了獲得部分的(相對于氨基末端)PMT氨基酸序列，我們按上面所述分離了煙草PMT電泳帶并對純化的PMT進行溴化氰(“CNBr”)裂解(CNBr在甲硫氨酸殘基處特異性地裂解多肽)。我們用SDS—PAGE分析了CNBr反應(yīng)產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)CNBr片段的表觀分子量大約為15，6.2和3KD。我們從聚丙烯酰胺凝膠上切下含CNBr片段的電泳帶，從帶上電印跡蛋白質(zhì)并對片段進行氨基酸序列分析(如上所述)。
發(fā)現(xiàn)PMT 15KD CNBr片段的前13個氨基酸序列是(SEQID NO5)Phe Ile Thr Glu Asn Gly Phe Ala Gly Arg Ser GlyArg。
發(fā)現(xiàn)PMT 6.2KD CNBr片段的前15個氨基酸序列是(SEQID NO6)Asn Glu Pro Xaa Phe Val Ala Ile Ser Gly Tyr ArgAsp Xaa Thr。
發(fā)現(xiàn)PMT 3KD CNBr片段的前20個氨基酸序列是(SEQ IDNO7)Ala Asp Ile Glu His Tyr Ser Lys Leu Ile Asp Ala LeuXaa Ile Lys Gly Ile Gln Phe。PMT cDNA克隆的分離和鑒定用常規(guī)RNA PCR程序分離PMT cDNA克隆。RNA PCR程序中的模板是從煙草根分離的Poly(A+)RNA。poly(A+)RNA制備的起始材料由水載法生長的煙草植物(N.tabacum，Var.Burly21)根組成。制備poly(A+)RNA的第一步是制備總RNA。使用制備總RNA商品試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA，Cat.NO.200345)的試劑和說明書進行煙草根總RNA的分離。使用制備poly(A+)RNA商品試劑盒(Pharma Cia LKB，Piscataway，NJ，Cat，No.27—9258—01)分離Poly(A+)RNA。首先根據(jù)標準原理，使用從純化PMT蛋白質(zhì)獲得的部分氨基酸序列資料設(shè)計寡聚核昔酸PCR引物。在隨后的實驗中，從在先分離的cDNA克隆序列設(shè)計引物。PCR程序用商品試劑盒(“GeneAmp RNA PCR Kit”，Perkin ElmerCetus，Norwalk，CT)進行RNA PCR程序。程序基本上根據(jù)PCR試劑盒賣主的建議。對賣主的方案進行如下修改逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)(1)反向引物濃度為2.5μm；(2)poly(A+)RNA的量是每份逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液大約1μg。
(3)熱循環(huán)程序包括42℃60分鐘99℃10分鐘；4℃10分鐘，1個循環(huán)與4℃熱處理步驟相聯(lián)；聚合酶鏈反應(yīng)(1)引物濃度各為2.5μM；(2)經(jīng)過98℃cDNA變性步驟后，最后向反應(yīng)液中加入Taq聚合酶；(3)熱循環(huán)程序包括的循環(huán)步驟98℃1分鐘60℃10分鐘1次循環(huán)連接94℃1分鐘，50℃2分鐘，72℃3分鐘30次循環(huán)連接循環(huán)步驟72℃10分鐘連接熱處理步驟4℃。
經(jīng)過標準氯仿提取步驟后，20％(體積)的每個PCR樣品加樣到2％瓊脂糖凝膠上，電泳分析PCR產(chǎn)物?？寺〕绦蜻x作進一步分析的PCR產(chǎn)物克隆到商品載體pBluescript II(SK+)(stratagene)上。用Klenow酶處理PCR產(chǎn)物的一個等份試樣以產(chǎn)生平頭DNA。Klenow反應(yīng)混合物如下大約1μg PCR產(chǎn)生的DNA，四種脫氧核苷酸三磷酸終濃度各為80μM，2.5μl10x通用緩沖液(Stratagene)，5單位的Klenow酶(Stratagene)，加水至總體積為25μl。Klenow反應(yīng)在室溫進行30分鐘，經(jīng)75℃加熱滅活10分鐘終止反應(yīng)。
然后將PCR產(chǎn)生的DNA片段與用限制性酶SmaI消化的pBluescriptII(SK+)相連。連接反應(yīng)混合物如下大約1μg的平頭DNA，大約0.2μg的SmaI消化的pBluescriptII，3μl10x連接緩沖液(Stratagene)，12單位的T4DNA連接酶，加水至總體積為30μl。在4℃連接酶反應(yīng)過夜，75℃加熱滅活10分鐘終止反應(yīng)。
在每次連接反應(yīng)后，進行下一步細菌轉(zhuǎn)化程序。商品感受態(tài)E.coli細胞(“XL1—Blu”細胞，Stratagene)懸液在冰上冷凍。向也經(jīng)過上冷凍的DNA樣品(按上述連接過的)中加入大約30μl懸液。在連接DNA存在的條件下，將感受態(tài)細胞在冰上放置30分鐘。然后使用42℃水浴在DNA存在條件下使細胞熱休克2分鐘。熱休克后，細胞和DNA放回冰浴中處理5分鐘，加入1ml LB培養(yǎng)基后，細胞在37℃劇列搖動培養(yǎng)1小時，然后將細胞涂布到選擇性培養(yǎng)基上。培養(yǎng)過夜后，檢查平板上轉(zhuǎn)化細胞的集落。為選擇轉(zhuǎn)化體，使用含100mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。
用從單個轉(zhuǎn)化體集落培養(yǎng)物制備的DNA進行PvuII限制性分析來篩選選擇的轉(zhuǎn)化體。該篩選方法根據(jù)的事實是具有所需PCR產(chǎn)物作為插入序列的克隆應(yīng)產(chǎn)生比PCR產(chǎn)物大約大0.5Kb的PvuII片段。這是因為在核苷酸位置529和977(位于克隆入PCR產(chǎn)物的pBluescriptII多克隆位點(MCS)的兩側(cè))有PvuII限制性位點。(見商品賣主產(chǎn)品說明書的質(zhì)粒pBluescriptII圖譜。)用DNA序列分析進一步分析在PvuII篩選中選擇的克隆。克隆PMT1.2按上面所述經(jīng)RNA PCR和克隆獲得克隆PMT1.2(大約1.2Kb)。模板是煙草根poly(A+)RNA，正向和反向引物分別是P—20(SEQ ID NO8)和P—22(SEQ ID NO9)。引物P—20的序列設(shè)計是根據(jù)60KD PMT蛋白質(zhì)的氨基酸13—20。引物P—22的序列設(shè)計是根據(jù)PMT蛋白質(zhì)15KD CNBr片段的1—7個氨基酸序列。
對克隆PM1.2進行初步的DNA序列分析。由PMT1.2的一個讀碼編碼的推定氨基酸序列與60KD PMT蛋白質(zhì)的N—末端區(qū)域顯示出極高的同源性(94％)。由PMT1.2編碼的推定氨基酸序列也與代表60KD PMT蛋白質(zhì)內(nèi)部區(qū)域的3KD CNBr片段(如上所述)顯示出極大的同源性(95％)。克隆PMT—26按上面所述經(jīng)RNA PCR和克隆獲得克隆PMT—26(大約1.2Kb)。模板是煙草根poly(A+)RNA，正向和反向引物分別是P—24(SEQ ID NO10)和P—21(AEQ ID NO11)。P—24引物序列是根據(jù)完整60KD PMT蛋白質(zhì)的氨基酸4—10并包括其5′端的BamHT位點。引物P—21序列是根據(jù)60KD PMT蛋白質(zhì)15KDCNBr片段的N末端甲硫氨酸和氨基酸1—6。另外，引物P—21包括其5′端的EcoRI位點。因此，設(shè)計的實驗是為了獲得編碼從靠近60KD PMT蛋白質(zhì)N末端的第4號氨基酸到該蛋白質(zhì)15KDCNBR片段的第6號氨基酸區(qū)域的cDNA克隆。
對PMT—26cDNA克隆進行初步DNA序列分析。PMT—26克隆編碼60KDPMT蛋白質(zhì)的大約三分之二。由PMT—26一個讀碼編碼的推定氨基酸序列的N末端區(qū)域與60KD蛋白質(zhì)N末端區(qū)域顯示出極強的同源性。推定氨基酸序列的C末端區(qū)域與代表60KDPMT蛋白質(zhì)內(nèi)部區(qū)域的3KDCNBr片段(如上所述)顯示出極大的同源性。克隆Q7按上面所述經(jīng)RNA PCR和克隆獲得克隆Q7(大約0.4Kb)。PCR模板是煙草根poly(A+)RNA，正向和反向引物分別是P—18(SEQ ID NO12)和P—23(SEQ ID NO13)。引物P—18的序列是根據(jù)N末端甲硫氨酸加上上述純化的60KD蛋白質(zhì)產(chǎn)生的15KD溴化氰片段的氨基酸1到7。反向引物P—23的序列由一個多聚(dt)區(qū)(20個脫氧胸苷)，一個EcoRI位點和在5′端的3個額外的脫氧胸苷組成?？寺MT2—5結(jié)合部分克隆(PMT—26)的序列信息，使用RNA PCR和克隆技術(shù)(基本上如上所述)獲得克隆PMT2—5(大約1.5Kb)在(RNA PCR程序中，引物濃度為1.0μM而不是2.5μM。另外，第一步循環(huán)溫度限定為50℃而不是55℃，最后一步循環(huán)限定為30分鐘，而不是10分鐘)。模板是煙草根poly(A+)RNA，正向和反向引物分別是P—38(SEQ ID NO14)和P—36(SEQ ID NO15)。引物P—38序列是根據(jù)編碼60KD PMT蛋白質(zhì)N端區(qū)域氨基酸4—11(SEQ ID NO4)的克隆PMT—26(如上所述)51區(qū)的DNA序列。引物P—36由DNA克隆Q73′區(qū)設(shè)計。引物P—38和P—36都與其靶序列100％同源。
對克隆的PMT—5DNA插入序列進行DNA序列分析。與預(yù)期的一樣，PMT2—5DNA序列與PMT1.2和Q7DNA序列相匹配。這一結(jié)果證實了克隆PMT1.2和Q7代表單個轉(zhuǎn)錄子的區(qū)域，因此編碼單一蛋白質(zhì)的區(qū)域。克隆PMT2—5編碼除N端甲硫氨酸和氨基酸1—3(即，Leu—ser—ser)外的全部60KDPMT蛋白質(zhì)。除PMT2—5外；還獲得與克隆PMT2—5或Q7部分同源的其它克隆(資料未顯示)。克隆PMT14—3為了在克隆PMT2—55′端加入一個NCOI限制性位點和N—端甲硫氨酸，丙氨酸和PMT氨基酸1—3的密碼子，合成了一個正向引物P—37。以標準DNA PCR技術(shù)將引物P—37的序列摻入PMT2—5DNA。PMT2—5DNA作為聚合酶鏈反應(yīng)的模板正向引物分別是P—37(SEQ ID NO16)和P—36(SEQ ID NO15)。按上面所述克隆PCR的DNA產(chǎn)物。用這種方法獲得克隆PMT14—3。預(yù)期克隆PMT14—3編碼在緊靠N端甲硫氨酸后插入一個附加的丙氨酸殘基的完整60KD PMT蛋白質(zhì)。經(jīng)常規(guī)序列分析證實了克隆PMT14—3的這種預(yù)期結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)克隆PMT14—3的序列是(SEQ ID NO17)。經(jīng)過對攜帶有意義取向PMT14—3DNA插入片段的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞中產(chǎn)生的重組PMT蛋白質(zhì)的序列分析可檢測插入的丙氨酸殘基對N端甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)錄后加工的可能影響(如果有的話)。
以本文所述方法制備的重組DNA序列由保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，Maryland)的培養(yǎng)物來例證。該培養(yǎng)物鑒定為大腸桿菌(Escherichia coli)，PMT14—3，于1993年3月11日保藏，給定的ATCC標號為69253。
用含有如下5′到3′取向或3′到5′取向SEQ ID NO17 DNA序列的根癌土壤桿菌接種煙草(Nicotiana tabacum)葉pBI121對照質(zhì)粒，Kan′(能以商品形式買到)1.2A3—3B用PMT基因1.2Kb片段以反義取向轉(zhuǎn)化的植物。
1.2A2—40用PMT基因1.2Kb片段以反義取向轉(zhuǎn)化的植物。
1.2S3—15用PMT基因1.2Kb片段以有意義取向轉(zhuǎn)化的植物。
1.2S4—16周PMT基因1.2Kb片段以有意義取向轉(zhuǎn)化的植物。
愈傷組織長成植物，在植物去頂前和去頂后取葉片樣品。用含內(nèi)在標準的甲醇氫氧化鉀從轉(zhuǎn)化葉片和對照葉片中提取葉片樣品中的生物堿。過濾上清液并使用分析煙堿的氮磷檢測器(NPD)進行氣相色譜分析。得到下面結(jié)果
正如所預(yù)料的，植物去頂后的煙堿水平地去頂前明顯要高。然而，根據(jù)本發(fā)明處理的材料長成的植物與對照植物相比，由去頂引起的煙堿水平增長大幅度下降。序列描述(1)一般資料(i)申請人Wahab.Samir Z.
Malik.vedpal S.
(ii)發(fā)明題目腐胺N—甲基轉(zhuǎn)移酶、編碼腐胺、N—甲基轉(zhuǎn)移酶的重組DNA分子，和生物堿含量減少的轉(zhuǎn)基因煙草植物(iii)序列數(shù)17(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Burns.Doane，Swecker and Mathis(B)街道P.O.BOX1404(C)城市Alexandria(D)州VA(E)國家USA(F)郵編22314(V)計算機可讀形式(A)媒體類型Floppy disk(B)計算機IBM PC兼容性(C)操作系統(tǒng)PC—DOS/MS—DOS(D)軟件Patent In Release#1.0Version#1.25
(vi)最近申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(vii)優(yōu)先權(quán)申請資料(A)申請?zhí)朥S07/613，160(B)申請日14—NOV—1990(Vii)優(yōu)先權(quán)申請資料(A)申請?zhí)朥S08/076,681(B)申請日1993年6月1日(viii)代理人/代理資料(A)姓名Sharon E.Crane—Fenry(B)登記號36，113(C)資料/文摘號PM—16961021238—072(ix)電訊資料(A)電話703—836—6620(B)電傳703—836—2021(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特征
(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假定的非(iv)反義非(v)片段類型N—末端(vi)原始來源(A)生物Nicotiana tabacum(B)品種Burley21(xi)序列描述SEQ ID NO1Leu Ser Xaa Asn Phe Leu Phe Gly Thr Ala Ser Ser Xaa Tyr Gln Tyr1 5 10 15Glu(2)SEQ ID NO2資料(i)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型
(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假定的非(iv)反義非(v)片段類型N—末端(vi)原始來源(A)生物Nicotiana tabacum(B)品種Burley21(xi)序列描述SEQ ID NO2Leu Ser Ser Asn Phe Leu Phe GLy Thr Ala Ala pro Tyr Tyr Gln Tyrl 5 10 15Glu(2)SEQ ID NO3資料(i)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假定的非(iv)反義非(v)片段類型N—末端
(vi)原始來源(A)生物Nicotiana tabacum(B)品種Burley21(xi)序列描述SEQ ID NO3Leu Ser Xaa Asn Phe Leu Phe Gly Thr Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Gln Tyrl 5 10 15Glu(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特征(A)長度29個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假定的非(iv)反義非(v)片段類型N—末端(vi)原始來源(A)生物Nicotiana tabacum(B)品種Burley21(xi)序列描述SEQ ID NO4Leu ser ser Asn Phe Leu Phe Gly Thr Ala ser ser Tyr Tyr Gln Tyr1 5 10 15Glu Gly Ala Phe Leu ser Asp Gly Val Gly Leu ser Asn20 25(2)SEQ ID NO5資料(i)序列特征(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假定的非(iv)反義非(v)片段類型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO5Phe Ile Thr Glu Asn Gly phe Ala Gly Arg ser Gly Arg1 5 10(2)SEQ ID NO6資料(i)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型
(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假定的非(iv)反義非(v)片段類型內(nèi)部的(vi)原始來源(A)生物Nicotiana tabacum(B)品種Burley21(xi)序列描述SEQ ID NO6Asn Glu Pro Xaa Phe val Ala Ile Sar Gly Tyr Arg Asp Xaa Thr1 5 10 15(2)SEQ ID NO7資料(i)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假定的非(iv)反義非(v)片段類型內(nèi)部的(vi)原始來源
(A)生物Nicotiana tabacum(B)品種Burley21(xi)序列描述SEQ ID NO7Ala Asp Ile Glu His Tyr Ser Lys Leu Ile Asp Ala Leu Xaa Ile Lys1 5 10 15Gly Ile Gln Phe20(2)SEQ ID NO8資料(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定的是(iv)反義非(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置18(D)其它資料/注二“在該位置用脫氧次黃苷代替混合的核苷酸”
(ix)特征(A)名稱/鍵misc—特征(B)位置21(D)其它資料/注二“在該位置用脫氧次黃苷代替混合的核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8TAYTAYCART AYGARGGNGC NTT(2)SEQ ID NO9資料(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定的是(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO9AANCCRTTYT CNGTDATRAA CAT(2)SEQ ID NO10資料
(i)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定的是(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO10ATCGGATCCA AYTTYTTGTT YGGNACHGC(2)SEQ ID NO11資料(i)序列特征(A)長度28堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定的是(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO11ATGGAATTCC RTTY TCNGTD ATRAACAT(2)SEQ ID NO12資料(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定的是(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO12ATGTTYATHA CNGARAAYGG NTT(2)SEQ ID NO13資料(i)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定的是
(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO13TTTGAATTCT TTTTTTTTTT TTTTTTTTT(2)SEQ ID NO14資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定的是(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO14AATTTCTTGT TCGGGACAGC CTCT(2)SEQ ID NO15資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型
(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定的是(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO15AGGCTGAACA ATTATAGTAT GATT(2)SEQ ID NO16資料(i)序列特征(A)長度45個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假定的是(xi)序列描述SEQ ID NO16CATGCCATGG CTCTTTCTTC TAATTTCTTG TTCGGGACAG CCTCT(2)SEQ ID NO17資料(i)序列特征(A)長度1545個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型cDNA(iii)假定的非(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO17ATGGCTCTTT CTTCTAATTT CTTGTTCGGG ACAGCCTCTT CATATTACCA GTATGAAGGA60GCTTTCCTCA GTGATGGGAA AGGCCTCAGC AACTGGGACG TTTTTACCCA TGAAGCTGGT 120CATGTTAAGG ATGGAAGCAA TGGAGATGTG GCTGTTGATC ACTACCATCG TTATTTGGAG 180GACATCAAAC TCATGGCAGA TATGGGTGTG AATAGCTTTC GTTTCTCTAT CTCATGGGCA 240AGAATTCTGC CCAAGGGAAT ATTTGGAGAA GTTAATATGG CCGGAATTGA GCACTACAGT 300AAGCTCATTG ATGCACTCCT ACAGAAAGGG ATCCAGCCGT TTGTCACATT AACACATTTT 360GACATACCAC AAGAACTTGA GGACAGATAT GGTGGTTGGC TAAGTTCACA GATACGGGAT 420GATTTCAGCT ATTTCGCAAA CATATGCTTC AAATACTTGG GAGATAGAGT TAAATACTGG 480GTAACGATGA ATGAGGCTAA CTTCGTGGCC ATTAGTGGCT ATAGAGATGG GACTTGCCCT 540CCAACTCGAT GCTCTGGTAT ATTTGGGAAT TGTAGTGCTG GGGATTCAGA AAGGGAACCC 600TTCATTGCAG CTCACAATAT GATCCTATCT CATGCAGATG CTGTCAGCAT TTACCGCACC 660AGATATCAGA AAAGTCAAGG AGGCATGATT GGCATTACTA TGGGTTTCGA ATGGTATGAA 720CCGTTAAGCA ATTCCTCAGA AGACATAGCT GCAACTCATA GAGCTCGATC ATTCTATGAC 780AGTTGGTTTT TAGACCCTAT TATATTAGGA AGATATCCTG AAGAAATGGC ACAAATTTTG 840GGATCTAATC TTCCAGAATT TTCAGTGAGT GATTTGAGAA TGTTGAGTTA TGGCCTAGAT 900TTCATTGGCA TCAATCATTA TTCAGCTGTT TATATCAAAG ATTGCTTATA TTCTGCCTGT 960GAACATGGAA ACTCTTGGTC AGAGGGTTCT TATTTAACGA CTACACAAAG AGACGGTGTC 1020TACATCGGGG AACCTGGGGA AGTGGACTGG CAATTTGTGT ATCCACAAGG GATTGAAAAA 1080GTTGTGATGT ATATAAAGGA CAGATTCAAC AATACTCCTA TGTTTATCAC TGAAAATGGC 1140TTTGCTGGGA ACAGTTCTTC TATAGAGGAT GCCTTGAACG ATGTTCATAG AGTGAAATAC 1200ATGCATAGCT ACTTAAATTC ATTGGCAAAT GCAATCAGGA AAGGTGCAGA TGTAAGGGGG 1260TACTTTGCTT GGTCCCTTCT TGATAACTTT GAGTGGCTAG ATGGATATAC CATAAGATTT 1320GGACTTTACT ATGTCAACTA CACAAATCTC CAGAGAACTC CAAAACTATC AGCCACTAAG 1380TATCCAGAGC TCATGTGTAA CTTTCACATA GAGCTTGAAG CACATACTGC CCAGAAATAG 1440CGTAAGAAGA CGGTGCATAT GTGGAGGCTT GTTGAAGATT TTTTTATTTA GTTCTCTATT 1500GTTGGAAGGC AATTACTGAG CAATCATACT ATAATTGTTC AGCCT 154權(quán)利要求
1.一種編碼煙草蛋白質(zhì)的重組DNA分子，其特征為具有催化S—腺苷甲硫氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移到腐胺δ氨基上的能力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組DNA分子，編碼的腐胺N—甲基轉(zhuǎn)移酶具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的重組DNA分子，包含質(zhì)粒PMT14—3CDNA插入片段的核苷酸序列，或包含與所述DNA插入片段雜交的核苷酸序列或與所述核苷酸序列的任一種簡并的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的重組DNA分子，包含SEQ ID NO17的核苷酸序列或能與該核苷酸序列雜交的DNA序列。
5.一種載體，包含與能指導(dǎo)分離的DNA分子所編碼的MRNA進行轉(zhuǎn)錄的序列以可操作的形式相連的根據(jù)權(quán)利要求2，3或4的DNA分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的載體，其特征為編碼與反義mRNA互補的DNA序列與能指導(dǎo)該反義mRNA進行轉(zhuǎn)錄的序列相連接。
7.以根據(jù)權(quán)利要求5或6的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因煙草細胞。
8.以根據(jù)權(quán)利要求5或6的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因煙草植物。
9.由SEQ ID NO17編碼的腐胺N—甲基轉(zhuǎn)移酶。
10.由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2或SEQ ID NO3編碼的腐胺N—甲基轉(zhuǎn)移酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了高度純化的煙草腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶，其純化方法，以及PMT DNA序列的產(chǎn)生。純化方法包括將煙草根提取物加樣到陰離子交換介質(zhì)上并用含腐胺的洗脫緩沖液特異性地洗脫腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶的步驟。
文檔編號C12N5/10GK1127530SQ94192879
公開日1996年7月24日 申請日期1994年6月1日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月1日
發(fā)明者S·Z·瓦赫, V·S·邁克 申請人:菲利普莫里斯生產(chǎn)公司