一種對(duì)乙型肝炎病毒易感的人胎肝細(xì)胞分離、凍存與復(fù)蘇的方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)乙型肝炎病毒易感的人胎肝細(xì)胞分離、凍存與復(fù)蘇的方法及應(yīng)用，步驟為：將新鮮的肝組織經(jīng)暴露的血管用灌注溶液沖洗干凈，直至消化完全；然后將新鮮分離的肝細(xì)胞置于含有細(xì)胞洗液的培養(yǎng)皿中過(guò)細(xì)胞篩得到單細(xì)胞懸液；清洗后沉淀單細(xì)胞并重懸，用漸進(jìn)凍存的方法，保存于液氮；復(fù)蘇的胎肝細(xì)胞通過(guò)優(yōu)化高活力胎肝細(xì)胞的鋪板密度、Percoll離心介質(zhì)純化低活力胎肝細(xì)胞以及后續(xù)培養(yǎng)程序，建立緊密的細(xì)胞單層培養(yǎng)。本發(fā)明可大量分離、保存及高效率復(fù)蘇胎肝細(xì)胞，復(fù)蘇的胎肝細(xì)胞能保持良好的肝細(xì)胞特性、分化狀態(tài)及對(duì)乙型肝炎病毒易感性，從而緩解原代肝細(xì)胞資源稀缺問(wèn)題，并建立了穩(wěn)定的體外抗乙型肝炎病毒篩藥平臺(tái)。
【專利說(shuō)明】一種對(duì)乙型肝炎病毒易感的人胎肝細(xì)胞分離、凍存與復(fù)蘇的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種對(duì)乙型肝炎病毒易感的人胎肝細(xì)胞分離、凍存與復(fù)蘇的方法及應(yīng)用，該方法可大量分離、凍存與復(fù)蘇人胎肝細(xì)胞，復(fù)蘇后的胎肝細(xì)胞保持良好的肝細(xì)胞功能以及對(duì)乙型肝炎病毒易感性。
【背景技術(shù)】
[0002]人原代肝細(xì)胞(英文縮寫(xiě)為PHHs)目前被認(rèn)為是最理想的體外肝特異性病理研究的細(xì)胞模型，例如，運(yùn)用這種細(xì)胞可建立對(duì)乙型肝炎病毒(英文縮寫(xiě)為HBV)的體外感染。PHHs也被公認(rèn)為是一種很有價(jià)值的肝細(xì)胞移植的細(xì)胞來(lái)源，為肝功能衰竭患者帶來(lái)了重生的希望。然而，新鮮肝組織資源稀缺，肝細(xì)胞數(shù)量有限，批次間肝細(xì)胞差異等問(wèn)題，極大地限制了其大規(guī)模應(yīng)用。細(xì)胞凍存被認(rèn)為是一個(gè)很有前途的解決方案。目前，關(guān)于原代成人肝細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇方法的工作已經(jīng)有很多文獻(xiàn)報(bào)道，但迄今報(bào)道的復(fù)蘇效率相對(duì)較低且不穩(wěn)定。另一個(gè)PHHs重要來(lái)源是人胎肝細(xì)胞(英文縮寫(xiě)為HFHs)，它是人成熟肝細(xì)胞的早期階段，具有相對(duì)較高的細(xì)胞活力和增殖能力，這些特性賦予它們即使在惡劣的凍存過(guò)程后仍然可以被復(fù)蘇并形成致密單層細(xì)胞的潛力。此外，原代成人肝細(xì)胞通常分離自肝病患者的病變肝活檢組織，細(xì)胞數(shù)目少且細(xì)胞活力低；而HFHs通常分離于已死胎兒的新鮮肝組織，可以提供更大量的高活力肝細(xì)胞。目前為止，還沒(méi)有如何凍存和復(fù)蘇HFHs的研究報(bào)告及專利。
[0003]乙型肝炎病毒(英文縮寫(xiě)為HBV)感染及其相關(guān)疾病是中國(guó)的重大疾病之一，中國(guó)約有1.7億的乙肝攜帶者，每年死于相關(guān)疾病的病人約一百萬(wàn)。由于長(zhǎng)期缺乏支持完整HBV感染與復(fù)制的藥物篩選與評(píng)價(jià)平臺(tái)，HBV的治療策略與方法相對(duì)滯后。人原代肝細(xì)胞是HBV研究最為理想的細(xì)胞感染模型，能夠支持HBV完整的感染與復(fù)制循環(huán)，能夠在體外最為真實(shí)地反映藥效及藥代動(dòng)力學(xué)。由于上述PHHs局限性問(wèn)題使得實(shí)驗(yàn)很難大規(guī)模進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。本專利利用優(yōu)化的凍存與復(fù)蘇條件，證明凍存復(fù)蘇后的HFHs仍然具有HBV易感性，在很大程度上解決了上述PHHs局限性。
[0004]大量的研究表明，原代肝細(xì)胞移植對(duì)肝功能衰竭病人的治療效果卓著，可以極大緩解病人對(duì)供肝的需求，是一種很有應(yīng)用前景的治療策略。肝細(xì)胞的數(shù)量及質(zhì)量決定了該治療策略的可行性。本專利利用優(yōu)化的凍存與復(fù)蘇條件，可以大量?jī)龃鍴FHs，復(fù)蘇后的HFHs具有良好的細(xì)胞活力及肝細(xì)胞功能，具有極大的臨床應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種對(duì)乙型肝炎病毒易感的人胎肝細(xì)胞分離、凍存與復(fù)蘇的方法，包括:利用兩步膠原酶灌注法，從已死胎兒新鮮肝組織中分離得到大量的高活力胎肝細(xì)胞，經(jīng)過(guò)漸進(jìn)冷凍的方法長(zhǎng)期低溫保存原代胎肝細(xì)胞，再通過(guò)優(yōu)化復(fù)蘇條件，Per coll離心介質(zhì)純化低活力胎肝細(xì)胞以及后續(xù)培養(yǎng)程序，建立的單層細(xì)胞保持良好的原代胎肝細(xì)胞形態(tài)特征、肝細(xì)胞特異的蛋白表達(dá)、良好的細(xì)胞增殖活力以及對(duì)乙型肝炎病毒的易感性。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種乙型肝炎病毒易感的人胎肝細(xì)胞分離、凍存與復(fù)蘇的方法在構(gòu)建抗HBV入侵藥物篩選與評(píng)價(jià)的體外細(xì)胞模型中的應(yīng)用。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施:
[0008]一種人胎肝細(xì)胞分離、凍存與復(fù)蘇的方法，包括以下步驟:
[0009]I)已死胎兒新鮮肝組織經(jīng)暴露的血管用灌注溶液I灌注，直至肝組織中血液被沖洗干凈；
[0010]2)用37°C預(yù)熱的灌注溶液II灌注步驟I)中沖洗干凈的肝組織，直至肝組織失去彈性消化完全；
[0011]3)將步驟2)消化完全的肝組織轉(zhuǎn)移至含有細(xì)胞洗液的培養(yǎng)皿中，抖落消化好的細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液；
[0012]4)將步驟3)中細(xì)胞懸液通過(guò)70 μ m的細(xì)胞篩，得到單細(xì)胞懸液；
[0013]5)將步驟4)獲得的單細(xì)胞懸液在800轉(zhuǎn)/分鐘和4°C條件下，離心5分鐘沉降，
用細(xì)胞洗液重懸，重復(fù)離心二次；
[0014]6)利用臺(tái)酚藍(lán)染色法計(jì)算步驟5)中重懸細(xì)胞的細(xì)胞密度與細(xì)胞活力，細(xì)胞活力為60%~95%時(shí)凍存；
[0015]7)將步驟6)中單細(xì)胞`懸液重復(fù)離心一次，細(xì)胞沉淀利用細(xì)胞凍存液以IO7個(gè)活細(xì)胞/ml的密度重懸細(xì)胞。將重懸的細(xì)胞以I支凍存管I毫升的量分裝細(xì)胞懸液，再將凍存管轉(zhuǎn)移到凍存盒(購(gòu)自美國(guó)NALGENETM，降溫速度為每I分鐘1°C )，盛有細(xì)胞的細(xì)胞凍存盒放于-80°C冰箱10-14小時(shí)，經(jīng)過(guò)該漸進(jìn)冷凍后，凍存管轉(zhuǎn)移到液氮罐中長(zhǎng)期保存，最長(zhǎng)保存記錄為24個(gè)月；
[0016]8)取出需要復(fù)蘇的細(xì)胞，置于37~40°C的水浴鍋中I~2分鐘，800轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，去掉細(xì)胞凍存液，利用鋪板培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺(tái)酚藍(lán)染色法計(jì)算重懸細(xì)胞的細(xì)胞密度與細(xì)胞活力；
[0017]9)將獲得的肝細(xì)胞且細(xì)胞活力大于70%以3~4X IO5活細(xì)胞/cm2的密度接種到膠原包被的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，搖勻后培養(yǎng)4~6小時(shí)將培養(yǎng)液換成生長(zhǎng)培養(yǎng)液,培養(yǎng)24小時(shí)后，再將生長(zhǎng)培養(yǎng)液換成維持培養(yǎng)液；
[0018]10)步驟8)中細(xì)胞活力為40%~70%時(shí)，復(fù)蘇胎肝細(xì)胞用PBS洗2次，利用密度梯度為70%、50%、30%的Percoll離心介質(zhì)純化得到高活力胎肝細(xì)胞，離心條件為350Xg，4°C離心30分鐘；取Percoll密度70%與Percoll密度50%之間的細(xì)胞層，PBS清洗2次，臺(tái)酚藍(lán)染色法計(jì)算重懸細(xì)胞的細(xì)胞密度與細(xì)胞活力，后續(xù)鋪板與培養(yǎng)過(guò)程同步驟9)。
[0019]所述灌注溶液I配方為:8.00g/L氯化鈉、0.40g/L氯化鉀、3.57g/L羥乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L 二水磷酸氫二鈉、0.06g/L磷酸二氫鉀、lg/L葡萄糖、ImM丙酮酸鈉和2mM乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸，調(diào)pH至7.4 ;
[0020]所述灌注溶液II配方為:8.00g/L氯化鈉、0.40g/L氯化鉀、3.57g/L羥乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L 二水磷酸氫二鈉、0.06g/L磷酸二氫鉀、lg/L葡萄糖、ImM丙酮酸鈉、5mM氯化鈣和0.3g/L IV型膠原酶，調(diào)pH至7.4 ;
[0021]所述細(xì)胞洗液的配方為:DMEM培養(yǎng)液使用前加入10%v/v胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素；
[0022]所述細(xì)胞凍存液為=William氏E培養(yǎng)基使用前加入45%v/v胎牛血清和10%v/v 二甲亞砜(英文縮寫(xiě)為DMSO)。
[0023]所述鋪板培養(yǎng)液的配方為=William氏E培養(yǎng)基使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM輕乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氫鈉、550mg/L丙酮酸鈉、0.2mM抗壞血酸-2-磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、KT7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和5%v/v胎牛血清;其中，ITS+premix含有6.25 u g/ml胰島素、6.25 u g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25ng/ml亞硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 u g/ml亞油酸；
[0024]所述生長(zhǎng)培養(yǎng)液的配方為=William氏E培養(yǎng)基使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM輕乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氫鈉、550mg/L丙酮酸鈉、0.2mM抗壞血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、I(T7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子；其中，ITS+premix含有6.25 u g/ml胰島素、6.25 u g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25ng/ml亞硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 u g/ml亞油酸；
[0025]所述維持培養(yǎng)液的配方為=William氏E培養(yǎng)基使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM輕乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氫鈉、550mg/L丙酮酸鈉、0.2mM抗壞血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、KT7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和2%v/V DMSO ;其中，ITS+premix 含有 6.25 u g/ml 胰島素、6.25 u g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25ng/ml 亞砸酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 u g/ml亞油酸。
[0026]作為優(yōu)選方案，所述步驟6)或8)中，確定細(xì)胞密度與細(xì)胞活力的方法為:將細(xì)胞懸液與0.4%m/v臺(tái)酚藍(lán)染色液以1:1的體積比混勻，迅速將20 u I混合液加入到計(jì)數(shù)板中且將該計(jì)數(shù)板插入相應(yīng)的計(jì)數(shù)儀中，儀器讀出相應(yīng)的細(xì)胞密度與細(xì)胞活力，0.4%臺(tái)酚藍(lán)染色液具體配制方法為:0.4g臺(tái)酚藍(lán)固體完全溶解到100ml的磷酸緩沖液溶液(英文縮寫(xiě)為PBS)中，具體配方為:8.0g/L氯化鈉、0.2g/L氯化鉀、3.58g/L十二水磷酸氫二鈉和0.24g/L磷酸二氫鉀，pH7.2至7.4，高壓蒸汽滅菌，4°C保存?zhèn)溆谩?br> `[0027]作為優(yōu)選方案，所述膠原包被的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板的制備方法:將172 ill冰醋酸加入到100ml去離子水中，再加入終濃度為50 ii g/ml的IV型鼠尾膠原，在無(wú)菌條件下，
0.22 um濾膜過(guò)濾除菌后，4°C保存待用；將該工作液以5 u g/cm2的包被量加入到需要包被處理的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，常溫孵育；1小時(shí)后，將膠原工作液吸出，自然晾干后封口 4°C保存；使用前，將膠原包被的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板需用PBS清洗一次，以去除殘留的醋酸。
[0028]一種乙型肝炎病毒易感的人胎肝細(xì)胞分離、凍存與復(fù)蘇的方法在構(gòu)建抗HBV入侵藥物篩選與評(píng)價(jià)的體外細(xì)胞模型中的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程如下:
[0029]I)培養(yǎng)的細(xì)胞在鋪板后6天內(nèi)進(jìn)行乙型肝炎病毒感染。感染液的配制方法為:WE中加入2%v/v DMS0、4%m/v (質(zhì)量體積比)聚乙二醇8000和10%v/v高病毒滴度的病人血清(病毒滴度為2X109拷貝/ml)。配制好的感染液加入到待感染的細(xì)胞中，孵育16至24小時(shí)。感染結(jié)束后去掉感染液，用PBS清洗3次，加入新鮮含2%DMS0的維持培養(yǎng)液，2天換I次新鮮的培養(yǎng)液；收集舊培養(yǎng)液用作酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，分析乙型肝炎病毒表面抗原(英文縮寫(xiě)為HBsAg)的分泌水平。在培養(yǎng)的后期，細(xì)胞固定后用免疫熒光的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)核心抗原(英文縮寫(xiě)為HBcAg)的表達(dá)；或者，將細(xì)胞裂解利用Hirt法抽提細(xì)胞內(nèi)乙型肝炎病毒脫氧核酸，再通過(guò)DNA印跡(Southern blot)的方法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)乙型肝炎病毒復(fù)制中間體的產(chǎn)生。
[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0031]其一，本發(fā)明利用常規(guī)的肝細(xì)胞分離技術(shù)，分離得到大量的高活力人原代胎肝細(xì)胞，肝細(xì)胞數(shù)可達(dá)109，活力60%~95% ；
[0032]其二，本發(fā)明利用漸進(jìn)冷凍的方法，通過(guò)優(yōu)化的復(fù)蘇條件，可以將復(fù)蘇后高活力(大于70%)原代肝細(xì)胞形成致密單層，該致密單層保持良好的肝細(xì)胞形態(tài)特征、肝細(xì)胞功能與細(xì)胞增殖活力；
[0033]其三，復(fù)蘇后低活力(40%~70%)原代肝細(xì)胞經(jīng)Percoll離心介質(zhì)純化得到高活力胎肝細(xì)胞，純化后胎肝細(xì)胞通過(guò)優(yōu)化的復(fù)蘇條件形成致密單層，該致密單層保持良好的肝細(xì)胞形態(tài)特征、肝細(xì)胞功能與細(xì)胞增殖活力；
[0034]其四，通過(guò)該方法復(fù)蘇的原代肝細(xì)胞在鋪板后6天內(nèi)具有HBV易感性，極大地提高了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，建立了穩(wěn)定的抗HBV入侵藥物篩選與評(píng)價(jià)的體外細(xì)胞模型；
[0035]其五，本發(fā)明得到的凍存原代胎肝細(xì)胞具有數(shù)量大，保存時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞復(fù)蘇后活力高且保持了完好的肝細(xì)胞功能，解決了肝細(xì)胞移植的細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題，有望應(yīng)用于臨床。 【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1為復(fù)蘇后原代胎肝細(xì)胞的形態(tài)特征示意圖。
[0037]圖2為復(fù)蘇后原代胎肝細(xì)胞的肝細(xì)胞特異蛋白的表達(dá)示意圖。
[0038]圖3為復(fù)蘇后原代胎肝細(xì)胞的增殖活力示意圖。
[0039]圖4為復(fù)蘇后原代胎肝細(xì)胞對(duì)乙型肝炎病毒的易感性示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040]為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。在下文中，如果未特別說(shuō)明，本發(fā)明所用材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的。
[0041]實(shí)施例1:
[0042]一種對(duì)乙型肝炎病毒乙肝的人胎肝細(xì)胞分離、凍存與復(fù)蘇的方法，其步驟如下:
[0043]1.兩步膠原酶灌注法分離人原代胎肝細(xì)胞:
[0044]兩步膠原酶灌注法第一步:新鮮的肝組織材料經(jīng)暴露的血管用灌注溶液I灌注約30分鐘，直至肝組織中血液被沖洗干凈。灌注溶液I的具體配方為:8.00g/L氯化鈉、0.40g/L氯化鉀、3.57g/L羥乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L 二水磷酸氫二鈉、0.06g/L磷酸二氫鉀、Ig/L葡萄糖、ImM丙酮酸鈉和2mM乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸，調(diào)pH至7.4，用0.22 μ m微孔濾器過(guò)濾除菌，4°C保存。
[0045]兩步膠原酶灌注法第二步:用37°C預(yù)熱的灌注溶液II灌注直至肝組織失去彈性。灌注溶液II的具體配方為:8.00g/L氯化鈉、0.40g/L氯化鉀、3.57g/L羥乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L 二水磷酸氫二鈉、0.06g/L磷酸二氫鉀、lg/L葡萄糖、ImM丙酮酸鈉、5mM氯化鈣和0.3g/L IV型膠原酶(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司),調(diào)pH至7.4,用0.22 μ m微孔濾器過(guò)濾除菌,4°C保存。
[0046]將消化好的肝組織轉(zhuǎn)移到含有細(xì)胞洗液的培養(yǎng)皿中，小心抖落消化好的細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。細(xì)胞洗液為商業(yè)化購(gòu)買的DMEM培養(yǎng)液(購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司)，使用前加入10%v/v胎牛血清(購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司)，100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素。再將該細(xì)胞懸液通過(guò)70 μ m的細(xì)胞篩，以獲得單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中離心以沉降肝細(xì)胞與肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，離心條件為:50Xg，4°C，5分鐘。用細(xì)胞洗液重懸，重復(fù)以上離心三次。
[0047]2.細(xì)胞濃度與細(xì)胞活力的檢測(cè):
[0048]將I中最后一次離心前細(xì)胞懸液與0.4%m/g臺(tái)酚藍(lán)染色液以1:1的體積比混勻，迅速將20 μ I混合液加入到計(jì)數(shù)板(購(gòu)自美國(guó)Counterstar公司)中且將該計(jì)數(shù)板插入相應(yīng)的計(jì)數(shù)儀中，儀器讀出相應(yīng)的細(xì)胞密度與細(xì)胞活力。0.4%臺(tái)酚藍(lán)染色液具體配制方法為0.4g臺(tái)酚藍(lán)固體溶解到100ml的磷酸緩沖液溶液(英文縮寫(xiě)為PBS，具體配方為:8.0g/L氯化鈉、0.2g/L氯化鉀、3.58g/L十二水磷酸氫二鈉和0.24g/L磷酸二氫鉀，pH7.2至7.4，高壓蒸汽滅菌，4°C保存?zhèn)溆?中。一般情況下每次分離的活細(xì)胞數(shù)為IO9個(gè)，細(xì)胞活力介于60%~95%之間。
[0049]3.人原代胎肝細(xì)胞的凍存:
[0050]經(jīng)方法I分離得到的細(xì)胞沉淀，利用細(xì)胞凍存液以IO7個(gè)活細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度重懸細(xì)胞。細(xì)胞凍存液為:在商業(yè)化購(gòu)買的William氏E培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱WE，購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司)中使用前加入45%v/v胎牛血清，10%v/v 二甲亞砜(英文縮寫(xiě)為DMS0)。將重懸的細(xì)胞以I支凍存管I毫升的量分裝細(xì)胞懸液，再將凍存管轉(zhuǎn)移到凍存盒(購(gòu)自美國(guó)NALGE NETMCryol0C，降溫速度為每I分鐘1°C )，盛有細(xì)胞的細(xì)胞凍存盒放于_80°C冰箱過(guò)夜，經(jīng)過(guò)該漸進(jìn)冷凍后，凍存管轉(zhuǎn)移到液氮罐中長(zhǎng)期保存，最長(zhǎng)保存記錄為24個(gè)月。
[0051]4.人原代胎肝細(xì)胞的復(fù)蘇:
[0052]取出需要復(fù)蘇的細(xì)胞，置于37~40°C的水浴鍋中快速解凍I~2分鐘，800轉(zhuǎn)/分鐘離心去掉細(xì)胞凍存液，利用鋪板培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺(tái)酚藍(lán)染色法計(jì)算重懸細(xì)胞的細(xì)胞密度與細(xì)胞活力。重懸細(xì)胞的鋪板培養(yǎng)液為商業(yè)化購(gòu)買的William氏E培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱WE，購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司)，使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM羥乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氫鈉、550mg/L丙酮酸鈉、0.2mM抗壞血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、10-7Μ地塞米松、ITS+premix (含有 6.25 μ g/ml 胰島素、6.25 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25ng/ml 亞硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 μ g/ml亞油酸)、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和5%v/v胎牛血清(購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司)。
[0053]復(fù)蘇獲得的肝細(xì)胞細(xì)胞活力大于70%，以3~4X IO5活細(xì)胞/cm2的密度接種到膠原包被的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，搖勻后培養(yǎng)4~6小時(shí)將培養(yǎng)液換成生長(zhǎng)培養(yǎng)液。生長(zhǎng)培養(yǎng)液為商業(yè)化購(gòu)買的WE，使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM羥乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氫鈉、550mg/L丙酮酸鈉、0.2mM抗壞血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、10-7Μ地塞米松、ITS+premix(含有 6.25 μ g/ml 胰島素、6.25 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25ng/ml 亞砸酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白、5.35 μ g/ml亞油酸)、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(購(gòu)自美國(guó)BD公司)。細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成維持培養(yǎng)液，2~3天換一次培養(yǎng)液。維持培養(yǎng)液為商業(yè)化購(gòu)買的WE，使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM輕乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氫鈉、550mg/L丙酮酸鈉、0.2mM抗壞血酸-2-磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、I(T7M地塞米松、ITS+premix (含有6.25 μ g/ml胰島素、6.25 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25ng/ml亞硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 u g/ml亞油酸)、100U/ml青霉素、100mg/ml 鏈霉素和 2%v/v DMSO。
[0054]復(fù)蘇獲得的肝細(xì)胞細(xì)胞活力為40%~70%時(shí)，胎肝細(xì)胞用PBS洗2次，利用密度梯度為70%、50%、30%的Percoll離心介質(zhì)純化得到高活力胎肝細(xì)胞，離心條件為350Xg，4°C離心30分鐘；取Percoll密度70%與Percoll密度50%之間的細(xì)胞層，PBS清洗2次，臺(tái)酚藍(lán)染色法計(jì)算重懸細(xì)胞的細(xì)胞密度與細(xì)胞活力，一般情況下細(xì)胞活力大于70%。獲得的肝細(xì)胞以3~4X IO5活細(xì)胞/cm2的密度接種到膠原包被的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，搖勻后培養(yǎng)4~6小時(shí)將培養(yǎng)液換成生長(zhǎng)培養(yǎng)液。生長(zhǎng)培養(yǎng)液為商業(yè)化購(gòu)買的WE，使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM輕乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氫鈉、550mg/L丙酮酸鈉、0.2mM抗壞血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、ICT7M地塞米松、ITS+premix(含有6.25 u g/ml胰島素、6.25 u g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25ng/ml亞硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白、5.35 u g/ml亞油酸)、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(購(gòu)自美國(guó)BD公司)。細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)后,將細(xì)胞培養(yǎng)液換成維持培養(yǎng)液,2~3天換一次培養(yǎng)液。維持培養(yǎng)液為商業(yè)化購(gòu)買的WE，使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM羥乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氫鈉、550mg/L丙酮酸鈉、0.2mM抗壞血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、KT7M地塞米松、ITS+premix (含有 6.25 u g/ml 胰島素、6.25 u g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25ng/ml 亞硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 u g/ml亞油酸)、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和2%v/v DMSO。
[0055]檢測(cè)與分析
[0056]1.凍存后胎肝細(xì)胞的最佳復(fù)蘇條件的確定
[0057]一方面，利用同一批次的凍存肝細(xì)胞，以不同細(xì)胞密度接種到培養(yǎng)皿中，觀察其形成細(xì)胞單層情況；另一方面，在最佳鋪板密度下利用不同細(xì)胞活力的凍存復(fù)蘇胎肝細(xì)胞，鋪板六小時(shí)，觀察其形成單層的情況。
[0058]利用高活力的復(fù)蘇胎肝細(xì)胞(細(xì)胞活力大于80%)，分別以I X IO5個(gè)活細(xì)胞/cm2、
2X IO5個(gè)活細(xì)胞/cm2、3X IO5個(gè)活細(xì)胞/cm2、3.5 X IO5個(gè)活細(xì)胞/cm2、4X IO5個(gè)活細(xì)胞/cm2接種到膠原包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)6小時(shí)后，將鋪板培養(yǎng)基換成維持培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第3天時(shí)利用相差顯微鏡觀察細(xì)胞單層的融合度與細(xì)胞間的緊密度。
[0059]利用不同細(xì)胞活力(40%~80%)的復(fù)蘇胎肝細(xì)胞，以上述確定的最佳密度鋪板接種到膠原包被的培養(yǎng)皿中，在鋪板培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時(shí),將未貼壁的胎肝細(xì)胞輕輕洗掉后利用相差顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁情況。
[0060]結(jié)果分析
[0061]a.鋪板密度對(duì)形成單層(成功復(fù)蘇)至關(guān)重要:原代胎肝細(xì)胞鋪板后，很快進(jìn)入去分化狀態(tài)，丟失其分化特性，但致密的單層培養(yǎng)有助于其分化特性的維持。如表1所示，能形成致密單層的細(xì)胞密度為3X IO5個(gè)活細(xì)胞/平方厘米、3.5X IO5個(gè)活細(xì)胞/平方厘米以及4X IO5個(gè)活細(xì)胞/平方厘米。2X IO5個(gè)活細(xì)胞/平方厘米和2.5X IO5個(gè)活細(xì)胞/平方厘米也能形成單層，但細(xì)胞并不緊密，后續(xù)培養(yǎng)也表現(xiàn)為分化特性相對(duì)于緊密單層更早退化。而IX IO5個(gè)活細(xì)胞/平方厘米的密度不能形成單層，細(xì)胞很快去分化。
[0062]b.高的細(xì)胞活力是成功復(fù)蘇的必要條件:由于培養(yǎng)皿有限的接觸面積，死細(xì)胞跟活細(xì)胞相互競(jìng)爭(zhēng)這些位置。如表1 所示，鋪板6小時(shí)后只有細(xì)胞活力大于70%才能較好地形成細(xì)胞單層。對(duì)于40%~70%的細(xì)胞活力可以通過(guò)Percoll離心介質(zhì)純化得到高活力胎肝細(xì)胞，該方法可以較好地形成細(xì)胞單層。不同Percoll離心介質(zhì)純化條件及效果見(jiàn)表2。經(jīng)優(yōu)化確定條件I為最優(yōu)純化條件，其活細(xì)胞回收率約為34%，回收的高活力肝細(xì)胞利用上述優(yōu)化鋪板條件可以較好地形成致密單層。
[0063]表1
[0064]
【權(quán)利要求】
1.一種人胎肝細(xì)胞分離、凍存與復(fù)蘇的方法，包括以下步驟: 1)已死胎兒新鮮肝組織經(jīng)暴露的血管用灌注溶液I灌注，直至肝組織中血液被沖洗干凈; 2)用37°C預(yù)熱的灌注溶液II灌注步驟I)中沖洗干凈的肝組織，直至肝組織失去彈性消化完全； 3)將步驟2)消化完全的肝組織轉(zhuǎn)移至含有細(xì)胞洗液的培養(yǎng)皿中，抖落消化好的細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液； 4)將步驟3)中細(xì)胞懸液通過(guò)70ii m的細(xì)胞篩，得到單細(xì)胞懸液； 5)將步驟4)獲得的單細(xì)胞懸液在800轉(zhuǎn)/分鐘和4°C條件下，離心5分鐘沉降，用細(xì)胞洗液重懸，重復(fù)離心二次； 6)利用臺(tái)酚藍(lán)染色法 計(jì)算步驟5)中重懸細(xì)胞的細(xì)胞密度與細(xì)胞活力，細(xì)胞活力為60%~95%時(shí)凍存； 7)將步驟6)中單細(xì)胞懸液重復(fù)離心一次，細(xì)胞沉淀利用細(xì)胞凍存液以IO7個(gè)活細(xì)胞/ml的密度重懸細(xì)胞；將重懸的細(xì)胞以I支凍存管I毫升的量分裝細(xì)胞懸液，再將凍存管轉(zhuǎn)移到凍存盒，盛有細(xì)胞的細(xì)胞凍存盒放于-80°C冰箱10-14小時(shí)，經(jīng)過(guò)該漸進(jìn)冷凍后，凍存管轉(zhuǎn)移到液氮罐中長(zhǎng)期保存，最長(zhǎng)保存記錄為24個(gè)月； 8)取出需要復(fù)蘇的細(xì)胞，置于37~4(TC的水浴鍋中廣2分鐘，800轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，去掉細(xì)胞凍存液，利用鋪板培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺(tái)酚藍(lán)染色法計(jì)算重懸細(xì)胞的細(xì)胞密度與細(xì)胞活力； 9)將獲得的肝細(xì)胞且細(xì)胞活力大于70%以3~4XIO5活細(xì)胞/cm2的密度接種到膠原包被的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，搖勻后培養(yǎng)4~6小時(shí)將培養(yǎng)液換成生長(zhǎng)培養(yǎng)液,培養(yǎng)24小時(shí)后,再將生長(zhǎng)培養(yǎng)液換成維持培養(yǎng)液； 10)步驟8)中細(xì)胞活力為409^70%時(shí)，復(fù)蘇胎肝細(xì)胞用PBS洗2次，利用密度梯度為70%、50%、30%的Percoll離心介質(zhì)純化得到高活力胎肝細(xì)胞，離心條件為350Xg，4°C離心30分鐘；取Percoll密度70%與Percoll密度50%之間的細(xì)胞層，PBS清洗2次，臺(tái)酚藍(lán)染色法計(jì)算重懸細(xì)胞的細(xì)胞密度與細(xì)胞活力，后續(xù)鋪板與培養(yǎng)過(guò)程同步驟9)； 所述灌注溶液I配方為:8.00g/L氯化鈉、0.40g/L氯化鉀、3.57g/L羥乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L 二水磷酸氫二鈉、0.06g/L磷酸二氫鉀、lg/L葡萄糖、ImM丙酮酸鈉和2mM乙二醇雙四乙酸，調(diào)pH至7.4 ; 所述灌注溶液II配方為:8.00g/L氯化鈉、0.40g/L氯化鉀、3.57g/L羥乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L 二水磷酸氫二鈉、0.06g/L磷酸二氫鉀、lg/L葡萄糖、ImM丙酮酸鈉、5mM氯化鈣和0.3g/L IV型膠原酶，調(diào)pH至7.4 ; 所述細(xì)胞洗液的配方為:DMEM培養(yǎng)液使用前加入10% v/v胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素； 所述細(xì)胞凍存液為:William氏E培養(yǎng)基使用前加入45% v/v胎牛血清和10% v/v 二甲亞砜； 所述鋪板培養(yǎng)液的配方為=William氏E培養(yǎng)基使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM羥乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氫鈉、550mg/L丙酮酸鈉、0.2mM抗壞血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、KT7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和5% v/v胎牛血清;其中，ITS+premix含有6.25 μ g/ml胰島素、6.25 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25ng/ml亞硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 μ g/ml亞油酸； 所述生長(zhǎng)培養(yǎng)液的配方為=William氏E培養(yǎng)基使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM羥乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氫鈉、550mg/L丙酮酸鈉、0.2mM抗壞血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、KT7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子;其中，ITS+premix含有6.25 μ g/ml胰島素、6.25 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25ng/ml亞硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 μ g/ml亞油酸； 所述維持培養(yǎng)液的配方為=William氏E培養(yǎng)基使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM羥乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氫鈉、550mg/L丙酮酸鈉、0.2mM抗壞血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、I(T7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和2% v/V DMSO ;其中，ITS+premix 含有 6.25 μ g/ml 胰島素、6.25 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25ng/ml 亞砸酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 μ g/ml亞油酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，確定細(xì)胞密度與細(xì)胞活力的方法為:將細(xì)胞懸液與0.4% m/v臺(tái)酚藍(lán)染色液以1:1的體積比混勻，將20 μ I混合液加入到計(jì)數(shù)板中且將該計(jì)數(shù)板插入相應(yīng)的計(jì)數(shù)儀中，儀器讀出相應(yīng)的細(xì)胞密度與細(xì)胞活力，0.4%臺(tái)酚藍(lán)染色液具體配制方法為:0.4g臺(tái)酚藍(lán)固體完全溶解到100ml的磷酸緩沖液溶液中，具體配方為:8.0g/L氯化鈉、0.2g/L氯化鉀、3.58g/L十二水磷酸氫二鈉和0.24g/L磷酸二氫鉀，pH7.2至7.4，高壓蒸汽滅菌，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述膠原包被的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板的制備方法:將172 μ I冰醋酸加入到100ml去離子水中，再加入終濃度為50 μ g/ml的IV型鼠尾膠原，在無(wú)菌條件下，0.22 μ m濾膜過(guò)濾除菌后，4°C保存待用；將該工作液以5 μ g/cm2的包被量加入到需要包被處理的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，常溫孵育；1小時(shí)后，將膠原工作液吸出，自然晾干后封口 4°C保存；使用前，將膠原包被的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板需用PBS清洗一次。
4.權(quán)利要求1所述的方法在構(gòu)建抗HBV入侵藥物篩選與評(píng)價(jià)的體外細(xì)胞模型中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK103740637SQ201410009255
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】胡康洪, 周明, 祁燕, 李家福, 成細(xì)瑤 申請(qǐng)人:康珞生物科技（武漢）有限公司