Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法。本發(fā)明首先將酶切線性化后的攜帶目的基因OVA-HBsAg的表達載體，采用原核顯微注射法，靶向性地導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，制備得到Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠。該方法在國內(nèi)外率先建立了一種新型可誘導(dǎo)型非免疫耐受的乙肝疾病模型，即Cre重組酶調(diào)控表達的OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠，可針對性的應(yīng)用于乙肝相關(guān)研究領(lǐng)域中，能夠真實、全面地反映臨床乙肝發(fā)生、發(fā)展過程，填補了國內(nèi)外此類動物模型的空白。
【專利說明】Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動物模型構(gòu)建領(lǐng)域。更具體地，涉及一種Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是全球范圍內(nèi)影響人類健康的重大問題。由HBV感染導(dǎo)致的慢性進行性肝臟炎癥病變，常常發(fā)展為肝硬化、肝癌并最終導(dǎo)致死亡。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染者，每年因此死亡的人數(shù)約為100萬~200萬。我國一直是HBV感染的高發(fā)區(qū)，最新的資料表明，我國現(xiàn)有的慢性HBV感染者約為9300萬例，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例，占慢性HBV感染者的1/5強。慢性HBV感染者和慢性乙型肝炎患者由于攜帶有大量HBV，是HBV的最主要傳染源。我國每年都投入大量的經(jīng)費和人力物質(zhì)資源用于該類人群的治療和阻止HBV在人群中的進一步傳播，給我國帶來了非常嚴(yán)重的經(jīng)濟和社會負擔(dān)，使本已十分有限的醫(yī)療資源更加緊張。為此，開展深入和多層次的HBV感染尤其是慢性HBV感染和慢性乙型肝炎的相關(guān)研究，對于攻克這一影響我國近I億人口身體健康的疾病，維護我國人口的身體健康具有重要意義。
[0003]在乙型肝炎的相關(guān)研究中，乙型肝炎動物模型具有舉足輕重的地位，乙型肝炎動物模型應(yīng)用于從HBV感染機制、被感染機體的免疫狀態(tài)改變、HBV在被感染機體內(nèi)的免疫逃逸機制、HBV的基因治療以及HBV治療藥物的療效評價等的各個層次和各個方面。因而合適的動物模型的建立與選 擇往往成為HBV研究工作的關(guān)鍵，對研究工作起到事半功倍的作用。為此，許多學(xué)者都曾致力于建立各種類型的乙型肝炎動物模型。然而由于人類HBV屬于嗜肝DNA病毒科，有較強的種屬特異性，自然條件下只感染人和非人靈長類(如黑猩猩等)，所以建立起能廣泛應(yīng)用的動物模型并非易事。黑猩猩模型因其體積較大、成本高以及受倫理道德約束等限制了其應(yīng)用；而樹駒模型則由于其感染效率低，僅能導(dǎo)致短暫的輕度感染，病毒滴度很低，而難以推廣應(yīng)用；鴨乙型肝炎的動物模型，則存在其藥代動力學(xué)和免疫學(xué)遺傳背景與人類有很大的不同的缺陷、土撥鼠僅產(chǎn)于北美，運輸困難且價格昂貴，從而限制了這些動物模型的廣泛應(yīng)用，進而限制了對乙型肝炎發(fā)病機制、免疫病理、治療藥物以及免疫治療的相關(guān)研究。
[0004]近年來，由于遺傳和免疫背景清楚、易于飼養(yǎng)等優(yōu)點，小鼠逐漸受到研究人員的關(guān)注，成為構(gòu)建HBV動物模型的最佳選擇。研究人員建立了人-鼠肝嵌合體HBV小鼠模型、基因轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型和HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
[0005]但是，盡管人-鼠肝嵌合體HBV小鼠模型可以說是目前最好的HBV感染復(fù)制模型，但是由于該模型沒有免疫機能，因而不能進行免疫介導(dǎo)的病毒清除和肝炎免疫致病機制的研究?；蜣D(zhuǎn)染HBV小鼠模型由于是一過性的HBV復(fù)制模型，因而只能用于急性HBV感染的研究，不適用于慢性HBV感染和慢性乙型肝炎研究。此外，由于注射劑量太大(相當(dāng)于小鼠全身體液的總量)，對小鼠肝臟和其他器官造成的損傷也不能忽視。目前已有的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠也存在著明顯的缺陷。首先，目前已有的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠由于并非通過被HBV感染的途徑建立，因此無法用來進行HBV進入被感染機體和HBV在機體內(nèi)的散布研究；其次，目前已有的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對HBV病毒抗原處于免疫耐受狀態(tài)，機體不能產(chǎn)生對HBV的免疫反應(yīng)，也不產(chǎn)生乙型肝炎病變。以上原因?qū)е铝丝捎糜诼訦BV感染和慢性乙型肝炎非免疫耐受的動物模型的缺失，客觀上影響了相關(guān)研究的深入開展。因此建立可控、支持HBV體內(nèi)感染并能導(dǎo)致類似于臨床乙肝病變的，非免疫耐受的HBV小鼠模型成為深入了解乙肝發(fā)病機制，肝臟病變的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸機制，抗乙肝藥物的研發(fā)及評價新的乙肝免疫療法的重要關(guān)鍵因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有制備乙肝研究用動物模型存在的缺陷，提供一種新型可誘導(dǎo)型的、非免疫耐受的乙肝疾病動物模型的構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明的目的是提供OVA-HBsAg基因在構(gòu)建Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠方面的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的另一個目的是提供一種Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法。
[0009]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
本發(fā)明提供了 OVA-HBsAg基因在構(gòu)建Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠方面的應(yīng)用。
[0010]所述的OVA為卵清蛋白(ovalbumin，OVA)基因。
[0011]本發(fā)明還提供了一種Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟:
51.攜帶目的基因OVA-HBsAg的表達載體pCCALL2-Anton進行酶切線性化；
52.將酶切線性化后的攜帶目的基因OVA-HBsAg的表達載體pCCALL2_Anton，采用原核顯微注射法，靶向性地導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，制備得到Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0012]其中，步驟 SI所述的攜帶目的基因OVA-HBsAg的表達載體pCCALL2-Anton由中科院生物物理所王盛典教授惠贈；表達載體pCCALL2-Anton的全長序列如SEQ ID NO:1所示。表達載體pCCALL2-Anton的結(jié)構(gòu)示意圖如附圖1所示,表達載體pCCALL2_Anton的質(zhì)粒圖譜如附圖2所示。
[0013]步驟SI所述酶切的反應(yīng)體系酶切反應(yīng)體系如下:
【權(quán)利要求】
1.0VA-HBsAg基因在構(gòu)建Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠方面的應(yīng)用。
2.—種Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: S1.攜帶目的基因OVA-HBsAg的表達載體pCCALL2-Anton進行酶切線性化； S2.將酶切線性化后的攜帶目的基因OVA-HBsAg的表達載體pCCALL2_Anton，采用原核顯微注射法，靶向性地導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，制備得到Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟SI所述酶切的步驟如下: S11.利用內(nèi)切酶如3/，371:，酶切311; S12.酶切后電泳鑒定； S13.酶切產(chǎn)物純化回收； S14.回收產(chǎn)物濃度調(diào)至5ng/uL，_20°C保存，用于后續(xù)顯微注射。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S2所述顯微注射法的具體步驟如下: 521.選6~8周齡發(fā)育良好的C57BL/6JXDBA母鼠，腹腔注射孕馬血清促性腺激素，48h后注射人絨毛膜促性腺激素； 522.所述C57BL/6JXDBA母鼠經(jīng)過步驟S21的激素超排處理后，與C57BL/6J公鼠按1:1合籠，次日清晨挑選陰栓陽性母鼠，從陰栓陽性母鼠得到單細胞受精卵； 523.將結(jié)扎KM公鼠與正常KM母鼠按1:2合籠，選取有陰栓且陰門腫脹、紅潤的母鼠，即為假孕KM母鼠； 524.將酶切回收后的線性化pCCALL2-Anton的溶液利用原核顯微注射方法直接注入單細胞受精卵的雄性原核內(nèi)； 525.取注射后存活的受精卵移植到假孕KM母鼠的輸卵管內(nèi)，待KM母鼠產(chǎn)仔，經(jīng)PCR鑒定陽性的小鼠即為Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠。
5.一種按照權(quán)利要求2所述構(gòu)建方法構(gòu)建的Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于，所述Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠在應(yīng)用于研究之前，需要用Cre重組酶誘導(dǎo)目的基因OVA-HBsAg表達。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)的方法為:將Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因母鼠與Cre陽性公鼠進行雜交。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，所述雜交的方法為將Cre重組酶調(diào)控的非免疫耐受型OVA-HBsAg轉(zhuǎn)基因母鼠與Cre陽性公鼠按照2:1的數(shù)量比例合籠隨機交配，獲得子代小鼠。
【文檔編號】A01K67/027GK103952442SQ201410013417
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】李秀梅, 劉光澤, 佟明華, 易學(xué)瑞, 孔祥平 申請人:中國人民解放軍第四五八醫(yī)院