相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2014年12月9日提交的美國臨時申請no.62/089,549以及2015年1月22日提交的美國臨時申請no.62/106,525的權(quán)益，這兩個美國臨時申請的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。

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背景技術(shù)：

盡管人們在自身免疫性、癌癥和傳染性疾病的治療方面取得了巨大進(jìn)展，但全球醫(yī)療保健行業(yè)仍然面臨重大挑戰(zhàn)。帶來這些重大挑戰(zhàn)的部分原因是，細(xì)胞能夠通過細(xì)胞表面多肽調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。細(xì)胞和微生物通過一些細(xì)胞表面多肽來篡奪信號通路，以減弱宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)控機(jī)制并抑制對其作出的免疫應(yīng)答，從而形成疾病表型。尚未開發(fā)體內(nèi)系統(tǒng)，以最佳地確定自身免疫性、癌癥和傳染性疾病的新靶向療法(這些新靶向療法被設(shè)計成調(diào)節(jié)對此類疾病病狀作出的免疫應(yīng)答)的治療潛力，并且確定在分子方面上這些細(xì)胞如何操縱免疫應(yīng)答。這些體內(nèi)系統(tǒng)提供用于評估治療效能和用于開發(fā)在將來治療自身免疫性、癌癥和傳染性疾病的候選試劑的測定來源。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涵蓋這樣的認(rèn)識：希望對非人動物進(jìn)行工程改造，以允許改進(jìn)的體內(nèi)系統(tǒng)，從而鑒別并開發(fā)可以用于治療自身免疫性、炎性疾病和癌癥的新治療劑，并且在一些實(shí)施例中鑒別并開發(fā)治療方案。本發(fā)明還涵蓋這樣的認(rèn)識：希望對非人動物進(jìn)行工程改造，以允許改進(jìn)的體內(nèi)系統(tǒng)，從而鑒別并開發(fā)可以用于治療傳染性疾病的新治療劑，并且在一些實(shí)施例中鑒別并開發(fā)治療方案。此外，本發(fā)明還涵蓋這樣的認(rèn)識：具有人源化cd274基因和/或以其他方式表達(dá)、包含或產(chǎn)生人或人源化pd-l1多肽的非人動物對用于例如鑒別并開發(fā)上調(diào)抗腫瘤和/或抗微生物免疫的治療劑是期望的。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物提供了用于鑒別和開發(fā)組合療法的改進(jìn)的體內(nèi)系統(tǒng)，這些組合療法包括靶向pd-l1，或間接地靶向pd-l1結(jié)合配偶體(例如，pd-1、b7-1)。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供基因組包含cd274基因的非人動物，該基因包含來自兩種不同物種(例如，人和非人)的遺傳物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，本文所述的非人動物的cd274基因編碼包含人和非人部分的pd-l1多肽，其中該人和非人部分連接在一起并形成功能性pd-l1多肽。在一些實(shí)施例中，非人部分包含內(nèi)源部分。在一些實(shí)施例中，本文所述的非人動物的cd274基因編碼pd-l1多肽，該多肽包含人pd-l1多肽的完整或部分的胞外結(jié)構(gòu)域。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供表達(dá)pd-l1多肽的非人動物，該pd-l1多肽包含人部分和內(nèi)源部分。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的pd-l1多肽在非人動物的細(xì)胞中翻譯，且具有非人信號肽；在一些特定實(shí)施例中，具有嚙齒動物信號肽。

在一些實(shí)施例中，內(nèi)源部分包含內(nèi)源pd-l1多肽的胞內(nèi)部分。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源部分還包含內(nèi)源pd-l1多肽的跨膜部分。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源部分的一氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的小鼠pd-l1多肽的對應(yīng)氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源部分的氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的小鼠pd-l1多肽的對應(yīng)氨基酸序列基本上相同。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源部分的氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的小鼠pd-l1多肽的對應(yīng)氨基酸序列相同。

在一些實(shí)施例中，人部分包含人pd-l1多肽的氨基酸19-238。在一些實(shí)施例中，人部分包含人pd-l1多肽的氨基酸19-277。在一些實(shí)施例中，人部分包含人pd-l1多肽的氨基酸19-131。在一些實(shí)施例中，人部分的一氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人pd-l1多肽的對應(yīng)氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些實(shí)施例中，人部分的一氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人pd-l1多肽的對應(yīng)氨基酸序列基本上相同。在一些實(shí)施例中，人部分的一氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人pd-l1多肽的對應(yīng)氨基酸序列相同。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的pd-l1多肽由包含內(nèi)源非人cd274序列和人cd274序列的cd274基因編碼。在一些特定實(shí)施例中，cd274基因包含內(nèi)源cd274外顯子1、2、6和7。在一些特定實(shí)施例中，cd274基因還包含完整或部分的內(nèi)源cd274外顯子5。在一些實(shí)施例中，包含內(nèi)源非人cd274序列和人cd274序列的cd274基因位于內(nèi)源cd274基因座處。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的cd274基因的一序列與seqidno:12、seqidno:13或seqidno:16具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的cd274基因的一序列與seqidno:12、seqidno:13或seqidno:16基本上相同。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的cd274基因的一序列與seqidno:12、seqidno:13或seqidno:16相同。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的cd274基因包含seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15和seqidno:16。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的cd274基因包含seqidno:13和seqidno:16。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的cd274基因包含seqidno:12和seqidno:13。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的cd274基因包含seqidno:12、seqidno:13和seqidno:17。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的cd274基因包含seqidno:13、seqidno:16和seqidno:17。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供人源化cd274基因座。在一些實(shí)施例中，人源化cd274基因座是經(jīng)過遺傳修飾而包含人cd274序列的內(nèi)源非人cd274基因座。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供人源化cd274基因座，該基因座包含非人cd274基因的一個或多個外顯子，這些外顯子有效連接至人cd274基因的一個或多個完整或部分的外顯子。在一些實(shí)施例中，人源化cd274基因座還包含5’和3’非人cd274非翻譯區(qū)(utr)，這些非翻譯區(qū)側(cè)接人cd274基因的一個或多個外顯子。在一些實(shí)施例中，人源化cd274基因座處于嚙齒動物啟動子的控制之下；在一些特定實(shí)施例中，處于內(nèi)源嚙齒動物啟動子的控制之下。

在一些實(shí)施例中，人源化cd274基因座包含非人cd274外顯子1、2、6和7，這些外顯子有效連接至人cd274外顯子3和4。在一些實(shí)施例中，人源化cd274基因座包含非人cd274外顯子1、2、6和7、人cd274外顯子3和4，且還包含cd274外顯子5，該cd274外顯子5包含人部分和非人部分，并且其中所述非人外顯子和人外顯子有效連接。在一些實(shí)施例中，cd274外顯子5的人部分包含這樣的核苷酸：這些核苷酸編碼作為人pd-l1多肽胞外結(jié)構(gòu)域的一部分的氨基酸殘基。在一些實(shí)施例中，cd274外顯子5的人部分包含編碼人pd-l1多肽的氨基酸殘基229-238的核苷酸。在一些實(shí)施例中，cd274外顯子5的人部分包含約32bp的人cd274外顯子5。在一些實(shí)施例中，cd274外顯子5的非人部分包含編碼跨膜序列的核苷酸。在一些實(shí)施例中，cd274外顯子5的非人部分包含約69bp的嚙齒動物cd274外顯子5。在一些特定實(shí)施例中，人源化cd274基因座包含具有seqidno:12中所示的序列的cd274外顯子5。在一些特定實(shí)施例中，人源化cd274基因座包含cd274外顯子5，該外顯子編碼與人pd-l1多肽的l229-r238相對應(yīng)的氨基酸以及與嚙齒動物pd-l1多肽的t238-q263相對應(yīng)的氨基酸。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包含cd274基因的非人動物，該基因包含內(nèi)源部分和人部分，其中內(nèi)源部分和人部分有效連接至非人cd274啟動子。在一些實(shí)施例中，非人cd274啟動子是嚙齒動物cd274啟動子。在一些特定實(shí)施例中，嚙齒動物cd274啟動子是內(nèi)源嚙齒動物cd274啟動子。

在一些實(shí)施例中，內(nèi)源部分包含內(nèi)源cd274外顯子1、2、6和7。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源部分還包含完整或部分的內(nèi)源cd274外顯子5。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源cd274基因的內(nèi)源cd274外顯子1、2、完整或部分外顯子5、外顯子6和7，與圖6中呈現(xiàn)的小鼠cd274基因的對應(yīng)外顯子1、2、完整或部分外顯子5、對應(yīng)外顯子6和7具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源cd274基因的內(nèi)源cd274外顯子1、2、完整或部分外顯子5、外顯子6和7，與圖6中呈現(xiàn)的小鼠cd274基因的對應(yīng)外顯子1、2、完整或部分外顯子5、對應(yīng)外顯子6和7基本上相同。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源cd274基因的內(nèi)源cd274外顯子1、2、完整或部分外顯子5、外顯子6和7，與圖6中呈現(xiàn)的小鼠cd274基因的對應(yīng)外顯子1、2、完整或部分外顯子5、對應(yīng)外顯子6和7相同。

在一些實(shí)施例中，人部分編碼人pd-l1多肽的氨基酸19-131、19-227或19-238。

在一些實(shí)施例中，人部分包含人cd274基因的外顯子3和4。在一些實(shí)施例中，人部分還包含完整或部分的人cd274外顯子5。在一些實(shí)施例中，人cd274外顯子3、4和完整或部分外顯子5，與圖6中呈現(xiàn)的人cd274基因的對應(yīng)外顯子3、4和完整或部分外顯子5具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些實(shí)施例中，人cd274外顯子3、4和完整或部分外顯子5，與圖6中呈現(xiàn)的人cd274基因的對應(yīng)外顯子3、4和完整或部分外顯子5基本上相同。在一些實(shí)施例中，人cd274外顯子3、4和完整或部分外顯子5，與圖6中呈現(xiàn)的人cd274基因的對應(yīng)外顯子3、4和完整或部分外顯子5相同。在一些實(shí)施例中，人部分的一序列經(jīng)過密碼子優(yōu)化，以便在非人動物中表達(dá)；在一些實(shí)施例中，在嚙齒動物中表達(dá)；在一些特定實(shí)施例中，在小鼠或大鼠中表達(dá)。

在一些實(shí)施例中，人部分的一序列與seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11或seqidno:12具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的同一性。在一些實(shí)施例中，人部分的一序列與seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11或seqidno:12基本上相同。在一些實(shí)施例中，人部分的一序列與seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11或seqidno:12相同。在一些實(shí)施例中，人部分包含seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11或seqidno:12。在一些實(shí)施例中，人部分的一序列與seqidno:7、seqidno:8或seqidno:11相同或基本上相同。在一些實(shí)施例中，人部分包含seqidno:7、seqidno:8或seqidno:11。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物具有包含cd274基因的基因組，該基因包含seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:16、seqidno:17，或它們的組合。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了由本文所述的非人動物產(chǎn)生、表達(dá)或生成的pd-l1多肽。在一些特定實(shí)施例中，由本文所述的非人動物產(chǎn)生、表達(dá)或生成的pd-l1多肽的氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人源化pd-l1多肽具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一些特定實(shí)施例中，由本文所述的非人動物產(chǎn)生、表達(dá)或生成的pd-l1多肽的氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人源化pd-l1多肽基本上相同。在一些特定實(shí)施例中，由本文所述的非人動物產(chǎn)生、表達(dá)或生成的pd-l1多肽的氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人源化pd-l1多肽相同。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了從本文所述的非人動物分離的細(xì)胞或組織。在一些實(shí)施例中，分離的細(xì)胞或組織包含本文所述的cd274基因。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞來自淋巴譜系。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞來自骨髓譜系。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞選自b細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，組織選自脂肪組織、膀胱、腦、乳腺、骨髓、眼部、心臟、腸、腎、肝、肺、淋巴結(jié)、肌肉、胰腺、血漿、血清、皮膚、脾、胃、胸腺、睪丸、卵細(xì)胞，以及它們的組合。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了其基因組包含本文所述的cd274基因的非人胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，非人胚胎干細(xì)胞是嚙齒動物胚胎干細(xì)胞。在一些特定實(shí)施例中，嚙齒動物胚胎干細(xì)胞是小鼠胚胎干細(xì)胞，并且來自129品系、c57bl品系，或它們的混合物。在一些特定實(shí)施例中，嚙齒動物胚胎干細(xì)胞是小鼠胚胎干細(xì)胞，并且是129和c57bl品系的混合物。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人胚胎干細(xì)胞具有包含cd274基因的基因組，該基因包含seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16，或它們的組合。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了本文所述的非人胚胎干細(xì)胞用于制備非人動物的用途。在一些特定實(shí)施例中，非人胚胎干細(xì)胞是小鼠胚胎干細(xì)胞，并且用于制備包含本文所述的cd274基因的小鼠。在一些特定實(shí)施例中，非人胚胎干細(xì)胞是大鼠胚胎干細(xì)胞，并且用于制備包含本文所述的cd274基因的大鼠。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了非人胚胎，該非人胚胎包含具有本文所述cd274基因的非人胚胎干細(xì)胞，由該非人胚胎干細(xì)胞制備，從該非人胚胎干細(xì)胞獲得，或由該非人胚胎干細(xì)胞生成。在一些特定實(shí)施例中，非人胚胎是嚙齒動物胚胎；在一些實(shí)施例中，為小鼠胚胎；在一些實(shí)施例中，為大鼠胚胎。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了本文所述的非人胚胎用于產(chǎn)生非人動物的用途。在一些特定實(shí)施例中，非人胚胎是小鼠胚胎，并且用于產(chǎn)生包含本文所述的cd274基因的小鼠。在一些特定實(shí)施例中，非人胚胎是大鼠胚胎，并且用于產(chǎn)生包含本文所述的cd274基因的大鼠。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供本文所述的靶向載體或核酸構(gòu)建體。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供包含本文所述的人源化cd274基因的靶向載體或核酸構(gòu)建體。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供包含cd274基因的靶向載體(或核酸構(gòu)建體)，該基因編碼包含人胞外結(jié)構(gòu)域全部或部分的pd-l1多肽；在一些特定實(shí)施例中，包含人pd-l1多肽的氨基酸19-131、19-227或19-238的pd-l1多肽。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的靶向載體或核酸構(gòu)建體包含非人cd274基因的一個或多個完整或部分的外顯子，這些外顯子有效連接至人cd274基因的一個或多個完整或部分的外顯子。在一些實(shí)施例中，靶向載體或核酸構(gòu)建體包含5’和3’非人cd274非翻譯區(qū)(utr)，這些非翻譯區(qū)側(cè)接人cd274基因的一個或多個外顯子。在一些實(shí)施例中，靶向載體或核酸構(gòu)建體包含一個或多個選擇標(biāo)記。在一些實(shí)施例中，靶向載體或核酸構(gòu)建體包含一個或多個位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。在一些實(shí)施例中，靶向載體或核酸構(gòu)建體包含人cd274外顯子3和4。在一些實(shí)施例中，靶向載體或核酸構(gòu)建體包含人cd274外顯子3和4，以及完整或部分的人cd274外顯子5。

在一些實(shí)施例中，靶向載體或核酸構(gòu)建體包含seqidno:7。在一些特定實(shí)施例中，靶向載體或核酸構(gòu)建體的序列與seqidno:9、seqidno:10和seqidno:11中的任一者相同或基本上相同。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了本文所述的靶向載體或核酸構(gòu)建體用于制備經(jīng)修飾的非人胚胎干細(xì)胞的用途。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了本文所述的靶向載體或核酸構(gòu)建體用于制備經(jīng)修飾的非人細(xì)胞的用途。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了本文所述的靶向載體或核酸構(gòu)建體用于制備經(jīng)修飾的非人胚胎的用途。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了本文所述的靶向載體或核酸構(gòu)建體用于制備非人動物的用途。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了制備由內(nèi)源cd274基因表達(dá)pd-l1多肽的非人動物的方法，其中pd-l1多肽包含人序列，該方法包括：(a)將基因組片段插入非人胚胎干細(xì)胞中的內(nèi)源cd274基因中，所述基因組片段包含編碼人pd-l1多肽全部或部分的核苷酸序列；(b)獲得(a)中生成的非人胚胎干細(xì)胞；以及(c)使用(b)的嚙齒動物胚胎干細(xì)胞形成非人動物。

在一些實(shí)施例中，人序列包含人pd-l1多肽的氨基酸19-131、19-227或19-238。

在一些實(shí)施例中，核苷酸序列包含人cd274外顯子3和4。在一些實(shí)施例中，核苷酸序列還包含完整或部分的人cd274外顯子5。在一些實(shí)施例中，核苷酸序列包含一個或多個選擇標(biāo)記。在一些實(shí)施例中，核苷酸序列包含一個或多個位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供制備其基因組包含cd274基因的非人動物的方法，該基因編碼具有人部分和內(nèi)源部分的pd-l1多肽，這兩部分有效連接至非人cd274啟動子，該方法包括：對非人動物的基因組進(jìn)行修飾，使得其包含cd274基因，該基因編碼具有人部分和內(nèi)源部分的pd-l1多肽，這兩部分有效連接至非人cd274啟動子，從而產(chǎn)生所述非人動物。在一些實(shí)施例中，非人cd274啟動子是嚙齒動物cd274啟動子。在一些特定實(shí)施例中，嚙齒動物cd274啟動子是內(nèi)源嚙齒動物cd274啟動子。

在一些實(shí)施例中，人部分包含人pd-l1多肽的氨基酸19-131、19-227或19-238。

在一些實(shí)施例中，cd274基因經(jīng)修飾而包含人cd274外顯子3和4。在一些實(shí)施例中，cd274基因經(jīng)修飾而包含人cd274外顯子3、4和完整或部分外顯子5。

在一些實(shí)施例中，在非人胚胎干細(xì)胞中對非人動物的基因組進(jìn)行修飾，然后用所述非人胚胎干細(xì)胞生成非人動物。在一些特定實(shí)施例中，非人胚胎干細(xì)胞是嚙齒動物胚胎干細(xì)胞；在一些實(shí)施例中，為小鼠胚胎干細(xì)胞；在一些實(shí)施例中，為大鼠胚胎干細(xì)胞。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了可通過本文所述方法獲得、由本文所述方法生成或由本文所述方法產(chǎn)生的非人動物。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了在非人動物中減少、防止或消除腫瘤生長的方法，該方法包括以下步驟：向其基因組包含cd274基因的非人動物施用靶向人pd-l1的藥物，該基因編碼具有人部分和內(nèi)源部分的pd-l1多肽，這兩部分有效連接至非人動物cd274啟動子；該施用在一定條件下進(jìn)行一定時間，使得足以在非人動物中減少、防止或消除腫瘤生長。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了在非人動物中殺死腫瘤細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟：向其基因組包含cd274基因的非人動物施用靶向人pd-l1的藥物，該基因編碼具有人部分和內(nèi)源部分的pd-l1多肽，這兩部分有效連接至非人動物cd274啟動子；該施用在一定條件下進(jìn)行一定時間，使得藥物足以在非人動物中介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的殺死。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了評估靶向人pd-l1的藥物的藥代動力學(xué)特性的方法，該方法包括以下步驟：向其基因組包含cd274基因的非人動物施用靶向人pd-l1的藥物，該基因編碼具有人部分和內(nèi)源部分的pd-l1多肽，這兩部分有效連接至非人動物cd274啟動子；以及執(zhí)行測定法以確定靶向人pd-l1的藥物的一個或多個藥代動力學(xué)特性。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了評估靶向人pd-l1的藥物的效能的方法，該方法包括以下步驟：向其基因組包含cd274基因的非人動物施用靶向人pd-l1的藥物，該基因編碼具有人部分和內(nèi)源部分的pd-l1多肽，這兩部分有效連接至非人動物cd274啟動子；以及執(zhí)行測定法以確定靶向人pd-l1的藥物的效能。

在各種實(shí)施例中，本文所述的非人動物是其基因組包含cd274基因的嚙齒動物，該基因編碼具有人部分和內(nèi)源部分的pd-l1多肽，這兩部分有效連接至嚙齒動物cd274啟動子。在各種實(shí)施例中，嚙齒動物cd274啟動子是內(nèi)源嚙齒動物cd274啟動子。在各種實(shí)施例中，人部分包含人pd-l1多肽的氨基酸19-131、19-227或19-238。

在一些實(shí)施例中，靶向人pd-l1的藥物是pd-l1拮抗劑。在一些實(shí)施例中，靶向人pd-l1的藥物是pd-l1激動劑。在一些實(shí)施例中，靶向人pd-l1的藥物是抗pd-l1抗體。在一些實(shí)施例中，以靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下方式向非人動物施用靶向人pd-l1的藥物。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于鑒別或驗(yàn)證藥物或疫苗的方法，該方法包括以下步驟：將藥物或疫苗遞送到其基因組包含本文所述cd274基因的非人動物，以及監(jiān)測對藥物或疫苗作出的免疫應(yīng)答、藥物或疫苗的安全特性或者對疾病、障礙或病癥的作用中的一者或多者。在一些實(shí)施例中，監(jiān)測安全特性包括確定非人動物是否因遞送藥物或疫苗而表現(xiàn)出副作用或不良反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，副作用或不良反應(yīng)選自發(fā)病、死亡、體重改變、一種或多種酶(例如，肝)的水平改變、一種或多種器官的重量改變、功能喪失(例如，感覺、運(yùn)動、器官等)、一種或多種疾病的易感性增加、非人動物的基因組改變、攝食量增加或減少以及一種或多種疾病的并發(fā)癥。在一些實(shí)施例中，疾病、障礙或病癥在非人動物中誘發(fā)。在一些實(shí)施例中，非人動物中誘發(fā)的疾病、障礙或病癥與需要治療的一個或多個人類患者所患的疾病、障礙或病癥相關(guān)聯(lián)。在一些特定實(shí)施例中，藥物是抗體。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了本文所述的非人動物用于開發(fā)適用于醫(yī)療(諸如用作藥劑)的藥物或疫苗的用途。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了本文所述的非人動物用于制造治療癌癥或瘤的藥劑的用途。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了本文所述的非人動物用于制造治療傳染性疾病的藥劑的用途。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了本文所述的非人動物用于制造治療炎性疾病、障礙或病癥的藥劑的用途。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了本文所述的非人動物用于制造治療自身免疫疾病、障礙或病癥的藥劑的用途。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的cd274基因包括本文所述的cd274基因。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的cd274基因編碼具有人部分和內(nèi)源部分的pd-l1多肽，這兩部分有效連接至嚙齒動物cd274啟動子。在各種實(shí)施例中，嚙齒動物啟動子是內(nèi)源嚙齒動物啟動子。在各種實(shí)施例中，人部分包含人cd274外顯子3和4。在各種實(shí)施例中，人部分包含人cd274外顯子3和4，以及完整或部分的人cd274外顯子5。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的pd-l1多肽包括本文所述的pd-l1多肽。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物無法可檢測地表達(dá)全長內(nèi)源非人pd-l1多肽。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物無法可檢測地表達(dá)內(nèi)源pd-l1多肽的胞外部分。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物無法可檢測地表達(dá)內(nèi)源pd-l1多肽的免疫球蛋白v結(jié)構(gòu)域，以及在一些實(shí)施例中，無法可檢測地表達(dá)內(nèi)源pd-l1多肽的免疫球蛋白c結(jié)構(gòu)域。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物是嚙齒動物；在一些實(shí)施例中，為小鼠；在一些實(shí)施例中，為大鼠。

如本申請中所用，術(shù)語“約”和“大約”作為等效詞使用。本申請中所用的帶有或不帶有約/大約修飾的任何數(shù)字，都意欲涵蓋相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解的任何正常波動。

本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)明示于以下具體實(shí)施方式中。然而，應(yīng)當(dāng)理解，盡管具體實(shí)施方式指出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，但僅以舉例說明形式給出，而非限制性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)具體實(shí)施方式將明了本發(fā)明范圍內(nèi)的各種變化和修改。

附圖說明

由下圖構(gòu)成的納入在本文中的附圖僅出于說明而非限制的目的。

圖1示出了非人(例如，小鼠)和人分化簇274(cd274)基因的基因組結(jié)構(gòu)的示意圖，該圖未按比例繪制。在每個外顯子下方均有外顯子編號。非翻譯區(qū)(utr)由空心矩形指示。

圖2示出了用于對非人分化簇274(cd274)基因進(jìn)行人源化的示例性構(gòu)建體的圖示，該圖未按比例繪制。上方的示意圖表示具有新霉素盒的人源化靶向載體，而下方的示意圖表示該盒已缺失的人源化靶向載體。所選擇的核苷酸接合位置用每個接合區(qū)下方的線條伴隨對應(yīng)seqidno.來標(biāo)記。示例性人源化片段在圖6中示出并說明如下：人源化片段a：人4,494bp-新霉素盒-人3,950bp(seqidno:7)；人源化片段b：人4,494bp-loxp-人3,950bp(seqidno:8)；人源化片段c：人4,494bp片段(seqidno:9)；人源化片段d：人3,950bp片段(seqidno:10)。

圖3示出了非人(例如，小鼠)和人分化簇274(cd274)基因的基因組結(jié)構(gòu)的示意圖，該圖未按比例繪制，其指示了實(shí)例1中所述的測定法中使用的探針的大概位置。還示出了人cd274基因內(nèi)的示例性人源化片段(人源化片段e；seqidno:11)以及小鼠cd274基因一部分的示例性缺失。

圖4示出了對于如實(shí)例1中所述內(nèi)源pd-l1基因的人源化而言純合的小鼠中在21天內(nèi)的示例性mc38.ova/hpd-l1腫瘤生長曲線。對照ab：對pd-l1沒有特異性的抗體，a-hpd-l1：對人pd-l1具有特異性的抗體。箭頭指示實(shí)驗(yàn)期間抗體處理的天數(shù)。針對每個處理組示出了第21天時的無腫瘤小鼠數(shù)。

圖5示出了在用抗pd-l1或?qū)φ湛贵w處理之后，在對于如實(shí)例1中所述內(nèi)源cd274基因而言純合的小鼠脾細(xì)胞中cd8b、cd3和pd-l1mrna表達(dá)的示例性實(shí)時pcr分析。a，每組六只小鼠的平均值。b，每個處理組中的單獨(dú)小鼠的表達(dá)水平。對照ab：對pd-l1沒有特異性的抗體；a-pd-l1：抗pd-l1抗體。

圖6示出了示例性小鼠、人和人源化cd274和pd-l1序列，以及用于對非人cd274基因進(jìn)行人源化的示例性人核酸序列。對于mrna序列而言，粗體字指示編碼序列，并且連續(xù)外顯子在指示時由交替下劃線文本分隔；對于人源化mrna序列而言，人序列包含于括號內(nèi)。對于蛋白質(zhì)序列而言，信號肽帶有下劃線，胞外序列是粗體字，免疫球蛋白v(igv)結(jié)構(gòu)域序列位于括號內(nèi)，并且胞內(nèi)序列為斜體；對于人源化蛋白質(zhì)序列而言，非人序列用常規(guī)字體指示，人序列用粗體字指示。人源化片段a：人4,494bp-新霉素盒-人3,950bp(seqidno:7)；人源化片段b：人4,494bp-loxp-人3,950bp(seqidno:8)；人源化片段c：人4,494bp片段(seqidno:9)；人源化片段d：人3,950bp片段(seqidno:10)。

定義

本發(fā)明不限于本文所述的特定方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@些方法和條件可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所用的術(shù)語僅用于描述具體實(shí)施例的目的，并且不旨在進(jìn)行限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍由權(quán)利要求書限定。

除非另有定義，否則本文所用的所有術(shù)語和短語包括所述術(shù)語和短語在本領(lǐng)域中已獲得的含義，除非明確地指出相反情況，或根據(jù)其中使用所述術(shù)語或短語的情形明顯看出相反情況。雖然與本文所述的那些方法和材料類似或等同的任何方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)施或測試，但現(xiàn)在將描述具體的方法和材料。本文中所提及的所有出版物據(jù)此以引用方式并入。

如本文應(yīng)用于一個或多個目標(biāo)值的術(shù)語“大約”，包括與所述參考值類似的值。在某些實(shí)施方案中，除非另有所指或根據(jù)情形明顯不同，否則術(shù)語“大約”或“約”是指在任一方向(大于或小于)上落在所述參考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小內(nèi)的值的范圍(除這樣的數(shù)字將超過可能值的100％時以外)。

如本文所用，術(shù)語“生物活性”包括在體外或體內(nèi)(例如，在生物體中)在生物系統(tǒng)中具有活性的任何試劑的特征。例如，在生物體內(nèi)具有生物效應(yīng)的試劑，當(dāng)其存在于生物體中時，被認(rèn)為具有生物活性。在特定實(shí)施例中，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或多肽具有生物活性時，該蛋白質(zhì)或多肽的共有所述蛋白質(zhì)或多肽的至少一種生物活性的部分通常被稱為“生物活性”部分。

如本文所用，短語“分化簇274蛋白質(zhì)”、“cd274蛋白質(zhì)”、“b7-h1蛋白質(zhì)”或“pd-l1蛋白質(zhì)”包括這樣的跨膜蛋白質(zhì)，其屬于細(xì)胞表面蛋白質(zhì)配體的b7家族，并且具有與免疫球蛋白可變和恒定結(jié)構(gòu)域相關(guān)的胞外免疫球蛋白v(igv)和免疫球蛋白恒定樣(igc)結(jié)構(gòu)域，以及跨膜和細(xì)胞質(zhì)(或胞內(nèi))結(jié)構(gòu)域。pd-l1在淋巴譜系(例如，b細(xì)胞、t細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等)和非淋巴譜系(心臟、肺、肝、胰腺等)中表達(dá)，并且參與膜表面蛋白諸如程序性細(xì)胞死亡蛋白1(pd-1)之間的相互作用以調(diào)控免疫功能。pd-l1的表達(dá)由細(xì)胞因子(例如，干擾素-γ)調(diào)控，并且據(jù)報道在許多人類癌癥中上調(diào)，這可使這些癌癥逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。已證實(shí)，pd-l1參與若干細(xì)胞過程，例如，胞內(nèi)感染、外周耐受、t細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)和t細(xì)胞增殖。已在小鼠和人之間鑒別了選擇性剪接的cd274亞型。舉例來說，圖6中提供了鼠和人cd274基因的核苷酸和氨基酸序列。技術(shù)人員在閱讀本公開內(nèi)容后將認(rèn)識到，基因組中的一個或多個內(nèi)源cd274基因(或所有)可通過一個或多個異源cd274基因(例如，多態(tài)變體、亞型或突變體、來自另一種物種的基因、人源化形式等)進(jìn)行替換、修飾、改變、缺失、破壞等。

如本文所用，“表達(dá)cd274的細(xì)胞”、“表達(dá)b7-h1的細(xì)胞”或“表達(dá)pd-l1的細(xì)胞”包括表達(dá)pd-l1跨膜多肽的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，表達(dá)pd-l1的細(xì)胞在其表面上表達(dá)pd-l1跨膜多肽。在一些實(shí)施例中，pd-l1多肽以足以介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用(例如，通過與pd-1受體多肽的相互作用)的量表達(dá)于細(xì)胞的表面上。示例性表達(dá)pd-l1的細(xì)胞包括b細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和t細(xì)胞。表達(dá)pd-l1的細(xì)胞調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的活化或抑制，以增強(qiáng)或減弱免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物展現(xiàn)出通過表達(dá)于非人動物一個或多個細(xì)胞的表面上的人源化pd-l1多肽來調(diào)控各種細(xì)胞過程(如本文所述)。

如本文所用，術(shù)語“可比較的(comparable)”包括兩種或更多種試劑、實(shí)體、狀況、條件組等，它們可彼此不同但充分相似以允許在它們之間進(jìn)行比較，使得可基于觀察到的差異或相似性合理地得出結(jié)論。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在情形中將理解，在任何給定的情況下，對于兩種或更多種這樣的試劑、實(shí)體、狀況、條件組等需要多大程度的同一性即可被認(rèn)為是可比較的。

如本文用于描述保守氨基酸置換的術(shù)語“保守”包括氨基酸殘基被置換為具有化學(xué)特性(例如，電荷或疏水性)相似的側(cè)鏈r基團(tuán)的另一個氨基酸殘基。一般來講，保守氨基酸置換不會實(shí)質(zhì)性改變蛋白質(zhì)的目標(biāo)功能特性，例如，受體結(jié)合配體的能力。具有化學(xué)特性相似的側(cè)鏈的氨基酸的組的例子包括：脂族側(cè)鏈，諸如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；脂族-羥基側(cè)鏈，諸如絲氨酸和蘇氨酸；含酰胺側(cè)鏈，諸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香族側(cè)鏈，諸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；堿性側(cè)鏈，諸如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；酸性側(cè)鏈，諸如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫側(cè)鏈，諸如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸置換組包括，例如，纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、賴氨酸/精氨酸、丙氨酸/纈氨酸、谷氨酸/天冬氨酸以及天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些實(shí)施例中，保守氨基酸置換可以是丙氨酸對蛋白質(zhì)中的任何天然殘基的置換，如例如丙氨酸掃描誘變中所用到的。在一些實(shí)施例中，保守置換是在據(jù)此以引用方式并入的gonnet,g.h.etal.,1992,science256:1443-1445(gonnet,g.h.等人，1992年，《科學(xué)》，第256卷，第1443-1445頁)中公開的pam250對數(shù)似然矩陣中具有正值的置換。在一些實(shí)施例中，如果置換在pam250對數(shù)似然矩陣中具有非負(fù)值，則該置換是適度保守的置換。

如本文所用，術(shù)語“對照”包括本領(lǐng)域所理解的“對照”的含義，即結(jié)果與其相比較的標(biāo)準(zhǔn)品。通常，對照用于增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的完整性，具體方式是隔離變量以便得出有關(guān)這些變量的結(jié)論。在一些實(shí)施例中，對照是一種反應(yīng)或測定法，它與測試反應(yīng)或測定法同時進(jìn)行以提供參比。如本文所用，“對照”可指“對照動物”。“對照動物”可具有本文所述的修飾、與本文所述不同的修飾，或沒有修飾(即，野生型動物)。在一個實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用“測試”(即，所測試的變量)。在第二實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用“對照”，即不應(yīng)用所測試的變量。在一些實(shí)施例中，對照是歷史性對照(即，此前執(zhí)行的測試或測定法，或此前已知的量或結(jié)果)。在一些實(shí)施例中，對照是或包括打印的或以其他方式保存的記錄。對照可為陽性對照或陰性對照。

如本文所用，術(shù)語“破壞”包括dna分子的同源重組事件(例如，經(jīng)由同源重組序列，諸如基因或基因座)的結(jié)果。在一些實(shí)施例中，破壞可實(shí)現(xiàn)或表示dna序列的插入、缺失、置換、替換、錯義突變或移碼，或它們的任何組合。插入可包括插入完整基因或基因的片段，例如外顯子，它們可具有內(nèi)源序列以外的起源(例如，異源序列)。在一些實(shí)施例中，破壞可增加基因或基因產(chǎn)物的(例如，由基因編碼的蛋白質(zhì)的)表達(dá)和/或活性。在一些實(shí)施例中，破壞可減少基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)和/或活性。在一些實(shí)施例中，破壞可改變基因或編碼的基因產(chǎn)物(例如，編碼的蛋白質(zhì))的序列。在一些實(shí)施例中，破壞可截短或片段化基因或編碼的基因產(chǎn)物(例如，編碼的蛋白質(zhì))。在一些實(shí)施例中，破壞可延長基因或編碼的基因產(chǎn)物；在一些這樣的實(shí)施例中，破壞可實(shí)現(xiàn)融合蛋白質(zhì)的組裝。在一些實(shí)施例中，破壞可影響基因或基因產(chǎn)物的水平而非活性。在一些實(shí)施例中，破壞可影響基因或基因產(chǎn)物的活性而非水平。在一些實(shí)施例中，破壞對基因或基因產(chǎn)物的水平可能沒有顯著影響。在一些實(shí)施例中，破壞對基因或基因產(chǎn)物的活性可能沒有顯著影響。在一些實(shí)施例中，破壞對基因或基因產(chǎn)物的水平或活性可能都沒有顯著影響。

術(shù)語“確定”、“測量”、“評價”、“評估”、“測定”和“分析”在本文中可互換使用，是指任何形式的測量，并包括確定元素存在與否。這些術(shù)語包括定量和/或定性確定。測定可為相對的或絕對的?！皽y定…的存在”可為確定某物存在的量和/或確定其是否存在。

如本文所用，短語“內(nèi)源基因座”或“內(nèi)源基因”包括在如本文所述的破壞、缺失、替換、改變或修飾引入之前，在親代或參考生物體中發(fā)現(xiàn)的遺傳基因座。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源基因座具有天然存在的序列。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源基因座是野生型基因座。在一些實(shí)施例中，參考生物體是野生型生物體。在一些實(shí)施例中，參考生物體是工程改造的生物體在一些實(shí)施例中，參考生物體是實(shí)驗(yàn)室培育的生物體(無論是野生型還是工程改造的)。

短語“內(nèi)源啟動子”包括與內(nèi)源基因天然關(guān)聯(lián)(例如在野生型生物體中)的啟動子。

如本文所用，術(shù)語“異源”包括來自不同來源的試劑或?qū)嶓w。例如，當(dāng)參考存在于特定細(xì)胞或生物體中的多肽、基因或基因產(chǎn)物使用時，該術(shù)語澄清相關(guān)多肽、基因或基因產(chǎn)物：1)是通過人工進(jìn)行工程改造的；2)是通過人工(例如，經(jīng)由遺傳工程)引入細(xì)胞或生物體(或其前體)中的；和/或3)是由相關(guān)細(xì)胞或生物體(例如，相關(guān)細(xì)胞類型或生物體類型)非天然地產(chǎn)生或非天然地存在于所述細(xì)胞或生物體中的。

如本文所用，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括已將異源(例如，外源)核酸或蛋白質(zhì)引入其中的細(xì)胞。技術(shù)人員在閱讀本公開內(nèi)容后將理解，這樣的術(shù)語不僅指特定的主題細(xì)胞(subjectcell)，而且還用于指這種細(xì)胞的子代。因?yàn)槟承┬揎椏梢蛲蛔兓颦h(huán)境影響而在后續(xù)世代中發(fā)生，所以這樣的子代事實(shí)上可不同于親本細(xì)胞，但仍包括在本文中使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是或包括原核或真核細(xì)胞。一般來講，宿主細(xì)胞是適合接受和/或產(chǎn)生異源核酸或蛋白質(zhì)的任何細(xì)胞，而不論所述細(xì)胞被指定歸屬哪個生命界。示例性細(xì)胞包括原核生物和真核生物(單細(xì)胞或多細(xì)胞)的細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞(例如，大腸桿菌(e.coli)、芽孢桿菌屬物種(bacillusspp.)、鏈霉菌屬物種(streptomycesspp.)等的菌株)、分枝桿菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞(例如，釀酒酵母(s.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(s.pombe)、巴斯德畢赤酵母(p.pastoris)、甲醇畢赤酵母(p.methanolica)等)、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞(例如，sf-9、sf-21、桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞、粉紋夜蛾(trichoplusiani)等)、非人動物細(xì)胞、人細(xì)胞或細(xì)胞融合物例如雜交瘤或四源雜交瘤。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞是人、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞是真核細(xì)胞并且選自以下細(xì)胞：cho(例如，chok1、dxb-11cho、veggie-cho)、cos(例如，cos-7)、視網(wǎng)膜細(xì)胞、vero、cv1、腎(例如，hek293、293ebna、msr293、mdck、hak、bhk)、hela、hepg2、wi38、mrc5、colo205、hb8065、hl-60、(例如，bhk21)、jurkat、daudi、a431(表皮的)、cv-1、u937、3t3、l細(xì)胞、c127細(xì)胞、sp2/0、ns-0、mmt060562、支持細(xì)胞、brl3a細(xì)胞、ht1080細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和來源于前述細(xì)胞的細(xì)胞系。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞包含一個或多個病毒基因，例如，表達(dá)病毒基因的視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如，細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是或包括分離的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是組織的一部分。在一些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是生物體的一部分。

術(shù)語“人源化”在本文中根據(jù)其本領(lǐng)域理解的含義使用，是指這樣的核酸或蛋白質(zhì)：所述核酸或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)(即，核苷酸或氨基酸序列)包括與非人動物中天然存在的特定基因或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基本上或完全對應(yīng)的部分，并且還包括與相關(guān)特定非人動物基因或蛋白質(zhì)中存在的結(jié)構(gòu)不同，而是與對應(yīng)人基因或蛋白質(zhì)中存在的可比較的結(jié)構(gòu)更密切對應(yīng)的部分。在一些實(shí)施例中，“人源化”基因是編碼具有與人多肽(例如，人蛋白質(zhì)或其部分，例如其特征性部分)的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽的基因。僅舉一個例子，在膜受體的情況下，“人源化”基因可編碼這樣的多肽，該多肽具有其氨基酸序列與人胞外部分的氨基酸序列相同的胞外部分，并且其余序列與非人(例如，小鼠)多肽的序列相同。在一些實(shí)施例中，人源化基因包含人基因的dna序列的至少一部分。在某個實(shí)施例中，人源化基因包含人基因的完整dna序列。在一些實(shí)施例中，人源化蛋白質(zhì)包含具有出現(xiàn)在人蛋白質(zhì)中的部分的序列。在一些實(shí)施例中，人源化蛋白質(zhì)包含人蛋白質(zhì)的完整序列，并且由非人動物的內(nèi)源基因座表達(dá)，該內(nèi)源基因座對應(yīng)于人基因的同源物或直系同源物。

如本文中結(jié)合序列的比較使用的，術(shù)語“同一性”包括如通過本領(lǐng)域中已知的可用于測量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的許多不同算法確定的同一性。在一些實(shí)施例中，使用clustalwv.1.83(慢)比對(采用10.0的開放空位罰分、0.1的延伸空位罰分)和使用gonnet相似性矩陣(macvector^tm10.0.2,macvectorinc.,2008)確定本文所述的同一性。

如本文所用，“改善”、“增加”、“消除”或“減少”或其語法對等詞，指示相對于以下測量值的值：基線測量值，諸如在啟動本文所述處理之前相同個體(或動物)中的測量值，或在不存在本文所述處理的情況下對照個體(或動物)或多個對照個體(或動物)中的測量值。

如本文所用，術(shù)語“分離的”包括這樣的物質(zhì)和/或?qū)嶓w，所述物質(zhì)和/或?qū)嶓w(1)已與至少一些當(dāng)最初產(chǎn)生(無論天然地還是在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中)時與其關(guān)聯(lián)的組分分離，和/或(2)已通過人工設(shè)計、產(chǎn)生、制備和/或制造。分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w可與約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或超過約99％的最初與其關(guān)聯(lián)的其他組分分離。在一些實(shí)施例中，分離的試劑是約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或超過約99％純的。如本文所用，如果物質(zhì)基本上不含其他組分，則其是“純的”。在一些實(shí)施例中，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的那樣，物質(zhì)在與某些其他組分例如一種或多種載體或賦形劑(例如，緩沖液、溶劑、水等)組合后，仍可被認(rèn)為是“分離的”或甚至“純的”；在這樣的實(shí)施例中，物質(zhì)的百分比分離或純度是在不包括這樣的載體或賦形劑情況下計算的。僅舉一個例子，在一些實(shí)施例中，天然存在的生物聚合物諸如多肽或多核苷酸在以下情況下被認(rèn)為是“分離的”：a)因其衍生的起源或來源而不與在其天然狀態(tài)下天然伴隨其的一些或全部組分關(guān)聯(lián)；b)其基本上不含與天然產(chǎn)生其的物種相同的物種的其他多肽或核酸；或c)由不是天然產(chǎn)生其的物種的細(xì)胞或其他表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)或以其他方式與來自所述細(xì)胞或其他表達(dá)系統(tǒng)的組分關(guān)聯(lián)。因此，例如，在一些實(shí)施例中，化學(xué)合成的或在與天然產(chǎn)生其的細(xì)胞系統(tǒng)不同的細(xì)胞系統(tǒng)中合成的多肽被認(rèn)為是“分離的”多肽。作為另外一種選擇或除此之外，在一些實(shí)施例中，已經(jīng)歷一種或多種純化技術(shù)的多肽若已與以下其他組分分離，則可被認(rèn)為是“分離的”多肽：a)在自然界中與其關(guān)聯(lián)的其他組分；和/或b)最初產(chǎn)生時與其關(guān)聯(lián)的其他組分。

如本文所用，短語“非人動物”是指任何不是人的脊椎動物生物體。在一些實(shí)施例中，非人動物是圓口類魚、硬骨魚、軟骨魚(例如，鯊魚或鰩)、兩棲動物、爬行動物、哺乳動物和鳥。在一些實(shí)施例中，非人哺乳動物是靈長類動物、山羊、綿羊、豬、狗、?；驀X動物。在一些實(shí)施例中，非人動物是嚙齒動物，諸如大鼠或小鼠。

如本文所用，短語“核酸”在其最廣義上包括被摻入或可被摻入寡核苷酸鏈中的任何化合物和/或物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，“核酸”是通過磷酸二酯鍵摻入或可通過磷酸二酯連鍵摻入寡核苷酸鏈中的化合物和/或物質(zhì)。如根據(jù)上下文將清楚的，在一些實(shí)施例中，“核酸”包括單獨(dú)核酸殘基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些實(shí)施例中，“核酸”包括包含單獨(dú)核酸殘基的寡核苷酸鏈。在一些實(shí)施例中，“核酸”是或包含rna；在一些實(shí)施例中，“核酸”是或包含dna。在一些實(shí)施例中，“核酸”是一個或多個天然核酸殘基、包含一個或多個天然核酸殘基或由一個或多個天然核酸殘基組成。在一些實(shí)施例中，“核酸”是一個或多個核酸類似物、包含一個或多個核酸類似物或由一個或多個核酸類似物組成。在一些實(shí)施例中，核酸類似物與“核酸”的差別在于它不利用磷酸二酯主鏈。例如，在一些實(shí)施例中，“核酸”是一個或多個“肽核酸”、包含一個或多個“肽核酸”或由一個或多個“肽核酸”組成，所述肽核酸在本領(lǐng)域中是已知的，并且在主鏈中具有肽鍵而非磷酸二酯鍵，其被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。作為另外一種選擇或除此之外，在一些實(shí)施例中，“核酸”具有一個或多個硫代磷酸酯和/或5’-n-亞磷酰胺連鍵而非磷酸二酯鍵。在一些實(shí)施例中，“核酸”是一種或多種天然核苷，包含一種或多種天然核苷或由一種或多種天然核苷組成(即，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷以及脫氧胞苷)。在一些實(shí)施例中，“核酸”是一種或多種核苷類似物，包含一種或多種核苷類似物或由一種或多種核苷類似物組成(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基胞苷、c-5丙炔基尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基尿苷、c5-丙炔基胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥苷、o(6)-甲基鳥嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化堿基、插入堿基，以及它們的組合)。在一些實(shí)施例中，“核酸”包含與天然核酸中的那些糖相比的一種或多種修飾糖(例如，2’-氟代核糖、核糖、2’-脫氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些實(shí)施例中，“核酸”具有編碼功能性基因產(chǎn)物(諸如rna或蛋白質(zhì))的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，“核酸”包含一個或多個內(nèi)含子。在一些實(shí)施例中，“核酸”包含一個或多個外顯子。在一些實(shí)施例中，“核酸”通過以下一種或多種方法制備：從天然來源分離、通過基于互補(bǔ)模板的聚合(體內(nèi)或體外)進(jìn)行的酶促合成、在重組細(xì)胞或系統(tǒng)中的復(fù)制以及化學(xué)合成。在一些實(shí)施例中，“核酸”的長度為至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000個或更多個殘基。在一些實(shí)施例中，“核酸”是單鏈的；在一些實(shí)施例中，“核酸”是雙鏈的。在一些實(shí)施例中，“核酸”具有包含至少一個元件的核苷酸序列，所述至少一個元件編碼多肽或者是編碼多肽的序列的互補(bǔ)序列。在一些實(shí)施例中，“核酸”具有酶活性。

如本文所用，短語“有效連接”包括這樣的并置，其中所述組分所處的關(guān)系允許它們以其預(yù)期方式發(fā)揮作用?！坝行нB接”至編碼序列的控制序列以一定方式連接，使得在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。“有效連接的”序列包括與目標(biāo)基因鄰接的表達(dá)控制序列以及通過反式或遠(yuǎn)程作用來控制目標(biāo)基因的表達(dá)控制序列。如本文所用，術(shù)語“表達(dá)控制序列”包括對于實(shí)現(xiàn)與它們連接的編碼序列的表達(dá)和加工而言必需的多核苷酸序列?！氨磉_(dá)控制序列”包括：適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄起始序列、終止序列、啟動子和/或增強(qiáng)子序列；高效的rna加工信號，諸如剪接信號和多腺苷酸化信號；穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mrna的序列；增強(qiáng)翻譯效率的序列(即，kozak共有序列)；增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；以及在需要時，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分泌的序列。這些控制序列的性質(zhì)根據(jù)宿主生物體而不同。例如，在原核生物中，這些控制序列一般包括啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列，而在真核生物中，這些控制序列通常包括啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語“控制序列”旨在包括其存在對于表達(dá)和加工是必需的組分，并且還可包括其存在是有利的附加組分，例如，前導(dǎo)序列和融合配偶體序列。

如本文所用，術(shù)語“多肽”包括氨基酸的任何聚合鏈。在一些實(shí)施例中，多肽具有天然存在的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，多肽具有非天然存在的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，多肽具有包含自然界中彼此分開地存在的部分(即，來自兩個或更多個不同生物體，例如，人部分和非人部分)的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，多肽具有經(jīng)工程改造的氨基酸序列，因?yàn)樗霭被嵝蛄型ㄟ^人工活動設(shè)計和/或產(chǎn)生。

如本文所用，“預(yù)防”當(dāng)結(jié)合疾病、障礙和/或病癥的發(fā)生使用時，包括降低出現(xiàn)疾病、障礙和/或病癥的風(fēng)險和/或延遲疾病、障礙或病癥的一種或多種特征或癥狀的發(fā)作。當(dāng)已使疾病、障礙或病癥的發(fā)作延遲預(yù)定時間段時，可認(rèn)為預(yù)防是徹底的。

如本文所用，術(shù)語“重組的”旨在指通過重組手段設(shè)計、工程改造、制備、表達(dá)、生成或分離的多肽(例如，如本文所述的pd-l1多肽)，諸如使用被轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞的重組表達(dá)載體表達(dá)的多肽，從重組的、組合的人多肽庫分離的多肽(hoogenboomh.r.,1997tibtech.15:62-70(hoogenboomh.r.，1997年，《生物技術(shù)趨勢》，第15卷，第62-70頁)；hoogenboomh.,andchamesp.,2000,immunologytoday21:371-378(hoogenboomh.和chamesp.，2000年，《今日免疫學(xué)》，第21卷，第371-378頁)；azzazyh.,andhighsmithw.e.,2002,clin.biochem.35:425-445(azzazyh.和highsmithw.e.，2002年，《臨床生物化學(xué)》，第35卷，第425-445頁)；gavilondoj.v.,andlarrickj.w.,2002,biotechniques29:128-145(gavilondoj.v.和larrickj.w.，2002年，《生物技術(shù)》，第29卷，第128-145頁))，從對于人免疫球蛋白基因是轉(zhuǎn)基因的動物(例如，小鼠)分離的抗體(參見，例如，taylor,l.d.,etal.,1992,nucl.acidsres.20:6287-6295(taylor,l.d.等人，1992年，《核酸研究》，第20卷，第6287-6295頁)；littlem.etal.,2000,immunologytoday21:364-370(littlem.等人，2000年，《今日免疫學(xué)》，第21卷，第364-370頁)；kellermanns.a.andgreenl.l.,2002,currentopinioninbiotechnology13:593-597(kellermanns.a.和greenl.l.，2002年，《生物技術(shù)當(dāng)前述評》，第13卷，第593-597頁)；murphy,a.j.,etal.,2014,proc.natl.acad.sci.u.s.a.111(14):5153-5158(murphy,a.j.等人，2014年，《美國國家科學(xué)院院刊》，第111卷，第14期，第5153-5158頁))，或通過涉及將所選擇的序列元件彼此剪接的任何其他手段制備、表達(dá)、生成或分離的多肽。在一些實(shí)施例中，一個或多個這樣的選擇的序列元件是天然存在的。在一些實(shí)施例中，一個或多個這樣的選擇的序列元件是經(jīng)計算機(jī)設(shè)計的。在一些實(shí)施例中，一個或多個這樣的選擇的序列元件由已知的序列元件(例如，來自天然的或合成的來源)的誘變(例如，體內(nèi)或體外)產(chǎn)生。例如，在一些實(shí)施例中，重組多肽包含目標(biāo)來源生物體(例如，人、小鼠等)的基因組中存在的序列。在一些實(shí)施例中，重組多肽包含自然界中彼此分開地存在于兩個不同生物體(例如，人生物體和非人生物體)中的序列(即，來自兩個或更多個不同生物體，例如，人部分和非人部分)。在一些實(shí)施例中，重組多肽具有由誘變(例如，體外或體內(nèi)，例如在非人動物中)產(chǎn)生的氨基酸序列，以使得所述重組多肽的氨基酸序列是雖然源自多肽序列且與多肽序列相關(guān)，但可以不是在體內(nèi)天然地存在于非人動物的基因組中的序列。

術(shù)語“替換”在本文中用來指這樣的過程：通過該過程，將存在于宿主基因座中(例如，基因組中)的“被替換的”核酸序列(例如，基因)從該基因座移除并將不同的“替換”核酸置于該位置。在一些實(shí)施例中，被替換的核酸序列與替換核酸序列是彼此可比較的，因?yàn)椋缢鼈儽舜送春?或包含對應(yīng)元件(例如，蛋白質(zhì)編碼元件、調(diào)控元件等)。在一些實(shí)施例中，被替換的核酸序列包括啟動子、增強(qiáng)子、剪接供體位點(diǎn)、剪接受體位點(diǎn)、內(nèi)含子、外顯子、非翻譯區(qū)(utr)中的一種或多種；在一些實(shí)施例中，替換核酸序列包括一個或多個編碼序列。在一些實(shí)施例中，替換核酸序列是被替換的核酸序列的同系物。在一些實(shí)施例中，替換核酸序列是被替換的序列的直系同系物。在一些實(shí)施例中，替換核酸序列是人核酸序列，或包含人核酸序列。在一些實(shí)施例中，包括其中替換核酸序列是人核酸序列或包含人核酸序列的情況，被替換的核酸序列是嚙齒動物序列或包含嚙齒動物序列(例如，小鼠或大鼠序列)。這樣放置的核酸序列可包含其是用于獲得這樣放置的序列的來源核酸序列的部分的一個或多個調(diào)控序列(例如，啟動子、增強(qiáng)子、5'-或3'-非翻譯區(qū)等)。例如，在各種實(shí)施例中，替換是用異源序列對內(nèi)源序列的置換，所述置換導(dǎo)致從這樣放置的核酸序列(包含所述異源序列)產(chǎn)生基因產(chǎn)物，但不表達(dá)內(nèi)源序列；替換是用編碼與由內(nèi)源序列編碼的蛋白質(zhì)具有相似功能的蛋白質(zhì)的核酸序列替換內(nèi)源基因組序列(例如，內(nèi)源基因組序列編碼pd-l1蛋白質(zhì)，并且dna片段編碼一種或多種人pd-l1蛋白質(zhì))。在各種實(shí)施例中，內(nèi)源基因或其片段被對應(yīng)的人基因或其片段替換。對應(yīng)的人基因或其片段是作為被替換的內(nèi)源基因或其片段的直系同源物的人基因或片段，或在結(jié)構(gòu)和/或功能上與被替換的內(nèi)源基因或其片段基本上相似或相同的人基因或片段。

術(shù)語“參考”在本文中用來描述目標(biāo)試劑、動物、同齡群、個體、群體、樣品、序列或值與之相比較的標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ赵噭?、動物、同齡群、個體、群體、樣品、序列或值。在一些實(shí)施例中，參考試劑、動物、同齡群、個體、群體、樣品、序列或值的測試和/或確定基本上與目標(biāo)試劑、動物、同齡群、個體、群體、樣品、序列或值的測試或確定同時進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，參考試劑、動物、同齡群、個體、群體、樣品、序列或值是任選地在有形介質(zhì)中體現(xiàn)的歷史參考。在一些實(shí)施例中，參考可指對照。如本文所用，“參考”可包括“參考動物”?！皡⒖紕游铩笨删哂斜疚乃龅男揎?、與本文所述不同的修飾，或沒有修飾(即，野生型動物)。通常，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的，參考試劑、動物、同齡群、個體、群體、樣品、序列或值在與用于確定或表征目標(biāo)試劑、動物(例如，哺乳動物)、同齡群、個體、群體、樣品、序列或值的那些條件相當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行確定或表征。

如本文所用，術(shù)語“基本上”包括表現(xiàn)出全部或接近全部范圍或程度的目標(biāo)特征或特性的定性條件。生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，生物和化學(xué)現(xiàn)象很少(如果有的話)進(jìn)行至完成和/或進(jìn)行至完全，或?qū)崿F(xiàn)或避免絕對的結(jié)果。因此術(shù)語“基本上”在本文中用于捕捉許多生物和化學(xué)現(xiàn)象中固有的潛在完全性缺乏。

如本文所用，短語“基本上同源”包括氨基酸或核酸序列之間的比較。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的，如果兩個序列在對應(yīng)的位置中含有同源殘基，則它們一般被認(rèn)為是“基本上同源的”。同源殘基可以是相同的殘基。另選地，同源殘基可以是具有適當(dāng)相似的結(jié)構(gòu)和/或功能特征的不相同的殘基。例如，如由本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，某些氨基酸通常被歸類為“疏水性”或“親水性”氨基酸，和/或歸類為具有“極性”或“非極性”側(cè)鏈。一種氨基酸置換為另一種相同類型的氨基酸可通常被認(rèn)為是“同源”置換。典型的氨基酸類別概述于表1和2中。

表1

表2

如本領(lǐng)域中所熟知的，氨基酸或核酸序列可使用多種算法的任何一種來進(jìn)行比較，所述算法包括商業(yè)計算機(jī)程序中可用的那些算法，諸如用于核苷酸序列的blastn以及用于氨基酸序列的blastp、空位blast和psi-blast。示例性的此類程序描述于altschul,s.f.etal.,1990,j.mol.biol.,215(3):403-410(altschul,s.f.等人，1990年，《分子生物學(xué)雜志》，第215卷，第3期，第403-410頁)；altschul,s.f.etal.,1997,methodsinenzymology(altschul,s.f.等人，1997年，《酶學(xué)方法》)；altschul,s.f.etal.,1997,nucleicacidsres.,25:3389-3402(altschul,s.f.等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402頁)；baxevanis,a.d.,andb.f.f.ouellette(eds.)bioinformatics:apracticalguidetotheanalysisofgenesandproteins,wiley,1998(baxevanis,a.d.和b.f.f.ouellette(編輯)，《生物信息學(xué)：基因和蛋白質(zhì)分析實(shí)用指南》，威立出版社，1998年)；以及miseneretal.(eds.)bioinformaticsmethodsandprotocols(methodsinmolecularbiology,vol.132),humanapress,1998(misener等人(編輯)，生物信息學(xué)方法指南(《分子生物學(xué)方法》，第132卷)，胡馬納出版社，1998年)。除了鑒別同源序列以外，上面提及的程序通常還提供同源性程度的指示。在一些實(shí)施例中，如果兩個序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的對應(yīng)殘基在相關(guān)的殘基區(qū)段上是同源的，則這兩個序列被認(rèn)為是基本上同源的。在一些實(shí)施例中，相關(guān)區(qū)段是完整序列。在一些實(shí)施例中，相關(guān)區(qū)段為至少9、10、11、12、13、14、15、16、17個或更多個殘基。在一些實(shí)施例中，相關(guān)區(qū)段包括沿著完整序列的鄰接殘基。在一些實(shí)施例中，相關(guān)區(qū)段包括沿著完整序列的不連續(xù)殘基，例如，通過多肽或其一部分的折疊構(gòu)象而聚集在一起的非鄰接殘基。在一些實(shí)施例中，相關(guān)區(qū)段為至少10、15、20、25、30、35、40、45、50個或更多個殘基。

如本文所用，短語“基本上同一”包括氨基酸或核酸序列之間的比較。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的，如果兩個序列在對應(yīng)的位置中含有相同殘基，則它們一般被認(rèn)為是“基本上同一的”。如本領(lǐng)域中所熟知的，氨基酸或核酸序列可使用多種算法的任何一種來進(jìn)行比較，所述算法包括商業(yè)計算機(jī)程序中可用的那些算法，諸如用于核苷酸序列的blastn以及用于氨基酸序列的blastp、空位blast和psi-blast。示例性的此類程序描述于altschul,s.f.etal.,1990,j.mol.biol.,215(3):403-410(altschul,s.f.等人，1990年，《分子生物學(xué)雜志》，第215卷，第3期，第403-410頁)；altschul,s.f.etal.,1997,methodsinenzymology(altschul,s.f.等人，1997年，《酶學(xué)方法》)；altschul,s.f.etal.,1997,nucleicacidsres.,25:3389-3402(altschul,s.f.等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402頁)；baxevanis,a.d.,andb.f.f.ouellette(eds.)bioinformatics:apracticalguidetotheanalysisofgenesandproteins,wiley,1998(baxevanis,a.d.和b.f.f.ouellette(編輯)，《生物信息學(xué)：基因和蛋白質(zhì)分析實(shí)用指南》，威立出版社，1998年)；以及miseneretal.(eds.)bioinformaticsmethodsandprotocols(methodsinmolecularbiology,vol.132),humanapress,1998(misener等人(編輯)，生物信息學(xué)方法指南(《分子生物學(xué)方法》，第132卷)，胡馬納出版社，1998年)。除了鑒別同一的序列以外，上面提及的程序通常還提供同一性程度的指示。在一些實(shí)施例中，如果兩個序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的對應(yīng)殘基在相關(guān)的殘基區(qū)段上是相同的，則這兩個序列被認(rèn)為是基本上同一的。在一些實(shí)施例中，相關(guān)區(qū)段是完整序列。在一些實(shí)施例中，相關(guān)區(qū)段為至少10、15、20、25、30、35、40、45、50個或更多個殘基。

如本文所用，短語“靶向載體”或“靶向構(gòu)建體”包括包含靶向區(qū)的多核苷酸分子。靶向區(qū)包含這樣的序列，其與靶細(xì)胞、組織或動物中的序列相同或基本上相同，并且可以經(jīng)由同源重組將靶向構(gòu)建體整合到所述細(xì)胞、組織或動物的基因組內(nèi)的位置中。還包括使用位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)(例如，loxp或frt位點(diǎn))進(jìn)行靶向的靶向區(qū)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的靶向構(gòu)建體還包含特定目標(biāo)核酸序列或基因、選擇性標(biāo)記、控制和/或調(diào)控序列以及其他核酸序列，這些核酸序列允許通過外源性添加幫助或促進(jìn)涉及這些序列的重組的蛋白質(zhì)來介導(dǎo)的重組。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的靶向構(gòu)建體還包含完整或部分的目標(biāo)基因，其中所述目標(biāo)基因是編碼具有與由內(nèi)源序列編碼的蛋白質(zhì)相似的功能的完整或部分的蛋白質(zhì)的異源基因。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的靶向構(gòu)建體還包含完整或部分的目標(biāo)人源化基因，其中所述目標(biāo)人源化基因編碼具有與由內(nèi)源序列編碼的蛋白質(zhì)相似的功能的完整或部分的蛋白質(zhì)。

如本文所用，術(shù)語“變體”包括顯示出與參考實(shí)體的顯著結(jié)構(gòu)同一性但相較于所述參考實(shí)體在一個或多個化學(xué)部分的存在或水平方面與所述參考實(shí)體結(jié)構(gòu)上不同的實(shí)體。在許多實(shí)施例中，“變體”還在功能上不同于其參考實(shí)體。一般來講，特定實(shí)體是否被適當(dāng)?shù)卣J(rèn)為是參考實(shí)體的“變體”是基于其與參考實(shí)體的結(jié)構(gòu)同一性的程度。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的，任何生物或化學(xué)參考實(shí)體具有某些特征性結(jié)構(gòu)元件。按照定義，“變體”是共用一個或多個這樣的特征性結(jié)構(gòu)元件的不同化學(xué)實(shí)體。僅舉幾例，小分子可具有特征性核心結(jié)構(gòu)元件(例如，大環(huán)核)和/或一個或多個特征性側(cè)基部分，以使得小分子的變體是共用核心結(jié)構(gòu)元件和特征性側(cè)基部分，但在其他側(cè)基部分上和/或在存在于核心內(nèi)的鍵的類型(單鍵相對于雙鍵，e相對于z，等)上不同的分子，多肽可具有包含在線性或三維空間中相對于彼此具有指定的位置和/或促成特定生物學(xué)功能的多個氨基酸的特征性序列元件，核酸可具有包含在線性或三維空間中相對于彼此具有指定的位置的多個核苷酸殘基的特征性序列元件。例如，“變體多肽”可因氨基酸序列中的一個或多個差異和/或共價附接于多肽主鏈的化學(xué)部分(例如，碳水化合物，脂質(zhì)等)中的一個或多個差異而不同于參考多肽。在一些實(shí)施例中，“變體多肽”顯示出與參考多肽具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的總體序列同一性。另選地或另外地，在一些實(shí)施例中，“變體多肽”不與參考多肽共用至少一個特征性序列元件。在一些實(shí)施例中，參考多肽具有一種或多種生物活性。在一些實(shí)施例中，“變體多肽”共用參考多肽的一種或多種生物活性。在一些實(shí)施例中，“變體多肽”缺少參考多肽的一種或多種生物活性。在一些實(shí)施例中，“變體多肽”顯示出相較于參考多肽降低水平的一種或多種生物活性。在許多實(shí)施例中，如果目標(biāo)多肽具有與親代的氨基酸序列相同但在特定位置上具有少數(shù)序列改變的氨基酸序列，則目標(biāo)多肽被認(rèn)為是親代或參考多肽的“變體”。通常，變體中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％的殘基相較于親代被置換。在一些實(shí)施例中，“變體”相較于親代具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個被置換的殘基。通常，“變體”具有非常少的數(shù)目(例如，少于5、4、3、2或1個)的被置換的功能殘基(即，參與特定生物活性的殘基)。此外，相較于親代，“變體”通常具有不超過5、4、3、2或1個添加或缺失，并且通常不具有添加或缺失。此外，任何添加或缺失通常少于約25、約20、約19、約18、約17、約16、約15、約14、約13、約10、約9、約8、約7、約6個，且通常少于約5、約4、約3或約2個殘基。在一些實(shí)施例中，親代或參考多肽是天然存在的多肽。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的，特定目標(biāo)多肽的多個變體通?？梢允翘烊淮嬖诘?，特別是當(dāng)目標(biāo)多肽是傳染性因子多肽時。

如本文所用，術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其關(guān)聯(lián)的另一種核酸的核酸分子。在一些實(shí)施例中，載體能夠在宿主細(xì)胞諸如原核和/或真核細(xì)胞中進(jìn)行染色體外復(fù)制和/或表達(dá)與它們連接的核酸。能夠指導(dǎo)有效連接的基因的表達(dá)的載體在本文中被稱為“表達(dá)載體”。

如本文所用，術(shù)語“野生型”具有其本領(lǐng)域中理解的含義，即包括具有如在“正?！?相對于突變、患病的、改變的等)狀態(tài)或背景中天然存在的結(jié)構(gòu)和/或活性的實(shí)體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，野生型基因和多肽通常以多種不同的形式(例如，等位基因)存在。

具體實(shí)施方式

除了別的方面以外，本發(fā)明提供了具有編碼程序性死亡配體1(pd-l1)多肽的人源化遺傳物質(zhì)的改良和/或工程改造的非人動物，以用于確定pd-l1調(diào)節(jié)劑(例如，抗pd-l1抗體)治療癌癥、自身免疫疾病和傳染性病原體的治療效能，以及對免疫細(xì)胞應(yīng)答和功能的測定。可以設(shè)想，此類非人動物在確定pd-l1調(diào)節(jié)劑的治療效能及其對pd-1:pd-l1(或pd-l1:b7-1)阻斷的潛力方面提供了改進(jìn)。因此，本發(fā)明特別適用于開發(fā)抗pd-l1，并且在一些實(shí)施例中，適用于開發(fā)抗pd-1療法，以便治療各種癌癥、自身免疫疾病以及增強(qiáng)免疫應(yīng)答以治療和/或改善傳染性病因。具體地講，本發(fā)明涵蓋嚙齒動物cd274基因的人源化，使得在非人動物的細(xì)胞表面上表達(dá)人源化pd-l1多肽。此類人源化pd-l1非人動物能夠提供人pd-l1⁺細(xì)胞的來源，以便確定抗pd-l1治療劑促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答的效能。此類人源化pd-l1非人動物還能夠提供人pd-l1⁺細(xì)胞的來源，以便確定抗pd-l1治療劑改善自身免疫疾病、障礙或病癥的效能。此外，此類人源化pd-l1非人動物提供體內(nèi)系統(tǒng)，以用于篩選和開發(fā)治療各種癌癥、自身免疫疾病和傳染性疾病的抗pd-l1療法。在一些實(shí)施例中，治療效能在本發(fā)明的非人動物中可由以下方式展現(xiàn)：疾病、障礙或病癥的體征和/或癥狀減少或消失；在一些實(shí)施例中，疾病、障礙或病癥的一些(而非所有)體征和癥狀減少或消失；在一些實(shí)施例中，疾病、障礙或病癥的所有體征和癥狀減少或消失，但疾病、障礙或病癥仍可能存在于非人動物體內(nèi)。在各種實(shí)施例中，疾病、障礙或病癥與癌癥相關(guān)聯(lián)。在各種實(shí)施例中，疾病、障礙或病癥與自身免疫疾病、障礙或病癥相關(guān)聯(lián)。在各種實(shí)施例中，疾病、障礙或病癥與傳染性病原體(例如，細(xì)菌)相關(guān)聯(lián)。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物展現(xiàn)出通過表達(dá)于非人動物細(xì)胞表面上的人源化pd-l1多肽阻斷pd-1:pd-l1信號傳導(dǎo)而調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施例中，人源化pd-l1多肽具有與人pd-l1多肽的完整或部分免疫球蛋白v和c結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)的序列。在一些實(shí)施例中，人源化pd-l1多肽具有與人pd-l1多肽的基本上所有胞外結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)的序列。在一些實(shí)施例中，人源化pd-l1多肽具有與嚙齒動物pd-l1多肽的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)的序列；在一些實(shí)施例中，人源化pd-l1多肽具有與嚙齒動物pd-l1多肽的跨膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)的序列。在一些實(shí)施例中，人源化pd-l1多肽具有與人pd-l1多肽的氨基酸殘基19-238(或19-227、或19-131)相對應(yīng)的序列。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物包含cd274基因，該基因包含來自非人動物和異源物種(例如，人)的遺傳物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物包含人源化cd274基因，其中該人源化cd274基因包含人cd274基因的外顯子3、外顯子4和完整或部分的外顯子5。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物包含人源化cd274基因，其中人源化cd274基因包含與外顯子3及外顯子3的3’端約4,160bp的人基因組序列相對應(yīng)的、約4,494bp的人cd274基因。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物包含人源化cd274基因，其中人源化cd274基因包含與人cd274基因的外顯子4的5’端約1,253bp的人基因組序列、外顯子4、內(nèi)含子4及外顯子5最開始32bp相對應(yīng)的、約3,950bp的人cd274基因。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物包含人源化cd274基因，其中人源化cd274基因包含與位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)(例如，loxp位點(diǎn))并置的約4,494bp和約3,950bp的人cd274基因，所述4,494bp和3,950bp對應(yīng)于人cd274基因的外顯子3、外顯子4及外顯子5的最開始32bp。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物包含人源化cd274基因，其中人源化cd274基因包含與人cd274基因的外顯子3、外顯子4及外顯子5的最開始32bp相對應(yīng)的、約8,444bp的人cd274基因。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物(例如，嚙齒動物，諸如小鼠或大鼠)包含人源化cd274基因，其中人源化cd274基因包含人cd274基因的外顯子3、外顯子4和一部分外顯子5，它們有效連接至非人cd274基因(例如，內(nèi)源非人cd274基因)的外顯子1、2、一部分外顯子5、外顯子6和7；并且在具體實(shí)施例中，人源化cd274基因編碼人源化pd-l1多肽，該多肽包含人pd-l1多肽的所有或基本上所有胞外結(jié)構(gòu)域，以及非人pd-l1多肽的所有或基本上所有跨膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物包含圖2中所示的人源化cd274基因。

在下面的章節(jié)中詳細(xì)地描述本發(fā)明的各個方面。章節(jié)的使用并非意在限制本發(fā)明。每個章節(jié)可適用于本發(fā)明的任何方面。在本申請整篇中，除非另有說明，否則“或”的使用意指“和/或”。

分化簇274(cd274)基因

cd274編碼稱為程序性細(xì)胞死亡配體1(pd-l1，也稱為b7-h1)的多肽，該基因是使用b7家族成員b7-1和b7-2搜索人表達(dá)序列標(biāo)簽(est)時發(fā)現(xiàn)的(dong,h.etal.,1999,naturemed.5(12):1365-1369(dong,h.等人，1999年，《自然醫(yī)學(xué)》，第5卷，第12期，第1365-1369頁)；freeman,g.j.etal.,2000,j.exp.med.192(7):1027-1034(freeman,g.j.等人，2000年，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》，第197卷，第7期，第1027-1034頁))。cd274基因由七個外顯子組成，每個外顯子編碼pd-l1多肽的不同部分；外顯子1：非編碼區(qū)并含有5’utr；外顯子2：信號序列；外顯子3：免疫球蛋白v(igv)結(jié)構(gòu)域；外顯子4：免疫球蛋白c(igc)結(jié)構(gòu)域；外顯子5：胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的c端部分；外顯子6：胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；以及外顯子7：胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的約6個氨基酸殘基及3’utr。pd-l1多肽與其他b7家族成員(b7-1和b7-2)具有共同的結(jié)構(gòu)組織，盡管序列同一性百分比較低(約20％)。相比之下，小鼠和人的pd-l1多肽序列具有約70％序列同一性(freeman,g.j.等人，出處同上)。pd-l1在心臟、骨骼肌、胎盤和肺中明顯表達(dá)，在胸腺、脾、腎和肝中較少表達(dá)，并且在腦、結(jié)腸或小腸中不表達(dá)(dong,h.等人，出處同上)。此外，pd-l1在小鼠體內(nèi)的t細(xì)胞、b細(xì)胞、骨髓細(xì)胞(例如，樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等)和角化細(xì)胞上組成型表達(dá)，然而已報道了在活化后在人體內(nèi)的相同細(xì)胞中的表達(dá)(例如，keir,m.e.,etal.,2008,annu.rev.immunol.26:677-704(keir,m.e.等人，2008年，《免疫學(xué)年評》，第26卷，第677-704頁)中所綜述)。實(shí)際上，據(jù)報道小鼠和人基因的cd274啟動子包含干擾素調(diào)節(jié)因子1(irf-1)的結(jié)合位點(diǎn)，已證實(shí)這些結(jié)合位點(diǎn)負(fù)責(zé)人癌細(xì)胞中的pd-l1上調(diào)(lee,s.j.etal.,2006,febslett.580(3):755-762(lee,s.j.等人，2006年，《歐洲生化學(xué)會聯(lián)合會快報》，第580卷，第3期，第755-762頁))。已報道了pd-l1剪接變體(參見例如下文及he,x.h.etal.,2005,actapharmacolsin.26(4):462-468(he,x.h.等人，2005年，《中國藥理學(xué)報》，第26卷，第4期，第462-468頁))，但是尚未發(fā)現(xiàn)與任何疾病的因果關(guān)系。pd-l1專門結(jié)合pd-1，而不與結(jié)構(gòu)類似于pd-1的其他蛋白質(zhì)(ctla4、cd28、icos；參見dong.dong,h.等人和freeman,g.j.等人，出處同上)發(fā)生任何相互作用。pd-l1與pd-1接合會引起免疫細(xì)胞中的多種刺激或抑制功能，其中一些功能包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生及t細(xì)胞受體和b細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)。還已證實(shí)，pd-l1(以及pd-l2)參與雙向信號傳導(dǎo)(例如，參見dong,h.etal.,2003,j.clin.invest.111:363-370(dong,h.等人，2003年，《臨床研究雜志》，第111卷，第363-370頁)；kuipers,h.etal.,2006,eur.j.immunol.36:2472-2782(kuipers,h.等人，2006年，《歐洲免疫學(xué)雜志》，第36卷，第2472-2782頁))。有趣的是，已表明pd-l1結(jié)合b7-1(cd80)，即cd28的配體，但與cd28自身的相互作用尚無報道(butte,m.j.etal.,2007,immunity27:111-122(butte,m.j.等人，2007年，《免疫》，第27卷，第111-122頁))。與b7-1的這種獨(dú)特相互作用對于其參與t細(xì)胞應(yīng)答和耐受性的調(diào)控特別重要。實(shí)際上，由于其共刺激和共抑制功能提供了多個功能性結(jié)果，pd-l1作為治療自身免疫和炎性疾病以及治療癌癥的潛在靶標(biāo)，已受到廣泛關(guān)注。事實(shí)上，抗pd-l1療法目前正在人臨床試驗(yàn)中開展測試(參見，例如，pedoeem,a.etal.,2014,clin.immunol.153:145-152(pedoeem,a.等人，2014年，《臨床免疫學(xué)》，第153卷，第145-152頁)；以及philips,g.k.andatkins,m.,2014,intern.immunol.8pages(philips,g.k.和atkins,m.，2014年，《國際免疫學(xué)》，8頁))。

為了開發(fā)在未來治療癌癥和自身免疫性的實(shí)用靶向療法，需要更深入透徹地理解在表達(dá)pd-l1的多種細(xì)胞類型(例如，非淋巴細(xì)胞)之中pd-l1介導(dǎo)的功能以及與其他b7家族成員的獨(dú)特相互作用。

cd274和pd-l1(b7-h1)序列

示例性鼠、人和人源化cd274和pd-l1序列在圖6中示出。用于對非人cd274基因進(jìn)行人源化的示例性人核酸序列也在圖6中示出。對于mrna序列而言，粗體字指示編碼序列，并且連續(xù)外顯子在指示時由交替下劃線文本分隔；對于人源化mrna序列而言，人序列包含于括號內(nèi)。對于蛋白質(zhì)序列而言，信號肽帶有下劃線，胞外序列是粗體字，免疫球蛋白v(igv)結(jié)構(gòu)域序列位于括號內(nèi)，并且胞內(nèi)序列為斜體；對于人源化蛋白質(zhì)序列而言，非人序列用常規(guī)字體指示，人序列用粗體字指示。

cd274轉(zhuǎn)錄物變體是本領(lǐng)域已知的。一種轉(zhuǎn)錄物變體相較于規(guī)范序列(參見圖6)缺少5’編碼區(qū)中的框內(nèi)外顯子，并導(dǎo)致殘基17-130(即，igv結(jié)構(gòu)域加約5個氨基酸殘基)的缺失。該變體的mrna和蛋白質(zhì)序列可分別見于genbank登記號nm_001267706.1和np_001254635.1，這些登記號據(jù)此以引用方式并入。另一種變體編碼具有k178d置換和殘基179-290的缺失的可溶性蛋白質(zhì)。該變體的mrna和蛋白質(zhì)序列可分別見于genbank登記號xm_006716759.1和xp_006716822.1，這些登記號據(jù)此以引用方式并入。已描述了第三種變體(nr_052005.1)，該變體相較于規(guī)范序列缺少交替內(nèi)部區(qū)段，因此被表示為非編碼變體，原因在于5’最末端支持的翻譯起始密碼子的使用使得轉(zhuǎn)錄物成為無義介導(dǎo)的mrna降解(nmd)的候選物。其他亞型描述于wo2014/197369中，該申請據(jù)此以引用方式并入。

人源化cd274非人動物

提供了非人動物，這些非人動物由于編碼pd-l1多肽的非人動物內(nèi)源基因座(例如，cd274基因座)的遺傳修飾，而在非人動物的細(xì)胞表面上表達(dá)人源化pd-l1多肽。本文所述的合適例子包括嚙齒動物，在一些實(shí)施例中，包括小鼠。

人源化cd274基因在一些實(shí)施例中包含來自異源物種(例如，人)的遺傳物質(zhì)，其中人源化cd274基因編碼pd-l1多肽，該多肽包含來自異源物種的遺傳物質(zhì)的編碼部分。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的人源化cd274基因包含異源物種的基因組dna，該dna編碼在細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)的pd-l1多肽的胞外部分。還提供了用于制備包含所述人源化cd274基因的非人動物、非人胚胎和細(xì)胞的非人動物、胚胎、細(xì)胞和靶向構(gòu)建體。

在一些實(shí)施例中，內(nèi)源cd274基因缺失。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源cd274基因改變，其中內(nèi)源cd274基因的一部分被替換為異源序列(例如，完整或部分的人cd274序列)。在一些實(shí)施例中，所有或基本上所有內(nèi)源cd274基因被替換為異源基因(例如，人cd274基因)。在一些實(shí)施例中，異源cd274基因的一部分在內(nèi)源cd274基因座處插入到內(nèi)源非人cd274基因中。在一些實(shí)施例中，異源基因是人基因。在一些實(shí)施例中，對內(nèi)源cd274基因的兩個拷貝之一進(jìn)行修飾或人源化，從而產(chǎn)生對于人源化cd274基因而言為雜合的非人動物。在其他實(shí)施例中，提供對于人源化cd274基因而言為純合的非人動物。

在各個方面，非人動物在內(nèi)源非人cd274基因座處包含完整或部分的人cd274基因。在一些實(shí)施例中，非人動物在內(nèi)源非人cd274基因座之外的位置包含人cd274基因。因此，此類非人動物可被描述為具有異源cd274基因。內(nèi)源cd274基因座處(或內(nèi)源cd274基因座之外)被替換、插入、修飾或改變的cd274基因或者由這種基因表達(dá)的(或由非人動物的基因組的其他地方表達(dá)的)多肽可以使用多種方法檢測，包括例如pcr、蛋白質(zhì)印跡、dna印跡、限制性片段長度多態(tài)性(rflp)或者等位基因獲得或丟失測定法。在一些實(shí)施例中，非人動物對于人源化cd274基因而言為雜合的。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第三外顯子的cd274基因，該第三外顯子的序列與圖6的人cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第三外顯子具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第三外顯子的cd274基因，該第三外顯子的序列與圖6的人cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第三外顯子基本上相同。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第三外顯子的cd274基因，該第三外顯子的序列與圖6的人cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第三外顯子相同。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第四外顯子的cd274基因，該第四外顯子的序列與圖6的人cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第四外顯子具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第四外顯子的cd274基因，該第四外顯子的序列與圖6的人cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第四外顯子基本上相同。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第四外顯子的cd274基因，該第四外顯子的序列與圖6的人cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第四外顯子相同。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第五外顯子的cd274基因，該第五外顯子的序列與圖6的人源化cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第五外顯子具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第五外顯子的cd274基因，該第五外顯子的序列與圖6的人源化cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第五外顯子基本上相同。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第五外顯子的cd274基因，該第五外顯子的序列與圖6的人源化cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第五外顯子相同。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第三、第四和第五外顯子的cd274基因，每個外顯子的序列與圖6的人源化cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第三、第四和第五外顯子具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第三、第四和第五外顯子的cd274基因，每個外顯子的序列與圖6的人源化cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第三、第四和第五外顯子基本上相同。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第三、第四和第五外顯子的cd274基因，每個外顯子的序列與圖6的人源化cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第三、第四和第五外顯子相同。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第一、第二、第六和第七外顯子的cd274基因，每個外顯子的序列與圖6的小鼠cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第一、第二、第六和第七外顯子具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第一、第二、第六和第七外顯子的cd274基因，每個外顯子的序列與圖6的小鼠cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第一、第二、第六和第七外顯子基本上相同。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括具有第一、第二、第六和第七外顯子的cd274基因，每個外顯子的序列與圖6的小鼠cd274mrna序列中呈現(xiàn)的第一、第二、第六和第七外顯子相同。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括包含與seqidno:12具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的序列的cd274基因。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括包含與seqidno:12基本上相同的序列的cd274基因。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括包含與seqidno:12相同的序列的cd274基因。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括包含與seqidno:13或seqidno:16具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的序列的cd274基因。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括包含與seqidno:13或seqidno:16基本上相同的序列的cd274基因。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括包含與seqidno:13或seqidno:16相同的序列的cd274基因。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括包含與seqidno:13具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的第一序列以及與seqidno:16具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的第二序列的cd274基因。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括包含與seqidno:13基本上相同的第一序列以及與seqidno:16基本上相同的第二序列的cd274基因。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括包含與seqidno:13相同的第一序列以及與seqidno:16相同的第二序列的cd274基因。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包含seqidno:13、seqidno:16和位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)，其中所述位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)位于所述人源化cd274基因的內(nèi)含子內(nèi)。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包含seqidno:13、seqidno:16和loxp位點(diǎn)，其中所述loxp位點(diǎn)位于所述人源化cd274基因的內(nèi)含子內(nèi)。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括在cd274外顯子3與cd274外顯子4之間包含內(nèi)含子的cd274基因，其中所述內(nèi)含子包含與seqidno:17基本上相同的序列。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括在cd274外顯子3與cd274外顯子4之間包含內(nèi)含子的cd274基因，其中所述內(nèi)含子包含與seqidno:17相同的序列。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括包含seqidno:12、seqidno:13、seqidno:16和seqidno:17的cd274基因。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括包含seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15和seqidno:16的cd274基因。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括這樣的cd274基因，其核苷酸編碼序列(例如，cdna序列)與圖6的人源化cd274核苷酸編碼序列中呈現(xiàn)的核苷酸編碼序列具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括這樣的cd274基因，其核苷酸編碼序列(例如，cdna序列)與圖6的人源化cd274核苷酸編碼序列中呈現(xiàn)的核苷酸編碼序列基本上相同。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因包括這樣的cd274基因，其核苷酸編碼序列(例如，cdna序列)與圖6的人源化cd274核苷酸編碼序列中呈現(xiàn)的核苷酸編碼序列相同。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274mrna序列包含與圖6的人源化cd274mrna序列具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的序列。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274mrna序列包含與圖6的人源化cd274mrna序列基本上相同的序列。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274mrna序列包含與圖6的人源化cd274mrna序列相同的序列。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因編碼這樣的pd-l1多肽，其氨基酸序列與圖6的pd-l1多肽序列具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因編碼這樣的pd-l1多肽，其氨基酸序列與圖6的pd-l1多肽序列基本上相同。

在各種實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的人源化cd274基因編碼這樣的pd-l1多肽，其氨基酸序列與圖6的pd-l1多肽序列相同。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽具有這樣的胞外部分，其氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人pd-l1多肽的胞外部分具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽具有這樣的胞外部分，其氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人pd-l1多肽的胞外部分基本上相同。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽具有這樣的胞外部分，其氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人pd-l1多肽的胞外部分相同。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽包含與圖6的人或人源化pd-l1多肽中呈現(xiàn)的氨基酸殘基19-131具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的氨基酸序列。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽包含與圖6的人或人源化pd-l1多肽中呈現(xiàn)的氨基酸殘基19-131基本上相同的氨基酸序列。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽包含與圖6的人或人源化pd-l1多肽中呈現(xiàn)的氨基酸殘基19-131相同的氨基酸序列。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽包含與圖6的人或人源化pd-l1多肽中呈現(xiàn)的氨基酸殘基19-227具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的氨基酸序列。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽包含與圖6的人或人源化pd-l1多肽中呈現(xiàn)的氨基酸殘基19-227基本上相同的氨基酸序列。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽包含與圖6的人或人源化pd-l1多肽中呈現(xiàn)的氨基酸殘基19-227相同的氨基酸序列。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽包含與圖6的人或人源化pd-l1多肽中呈現(xiàn)的氨基酸殘基19-238具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的氨基酸序列。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽包含與圖6的人或人源化pd-l1多肽中呈現(xiàn)的氨基酸殘基19-238基本上相同的氨基酸序列。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽包含與圖6的人或人源化pd-l1多肽中呈現(xiàn)的氨基酸殘基19-238相同的氨基酸序列。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽具有這樣的免疫球蛋白v(igv)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人pd-l1多肽的igv結(jié)構(gòu)域具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽具有這樣的免疫球蛋白v(igv)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人pd-l1多肽的igv結(jié)構(gòu)域基本上相同。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽具有這樣的免疫球蛋白v(igv)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人pd-l1多肽的igv結(jié)構(gòu)域相同。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽具有免疫球蛋白v(igv)結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白c(igc)結(jié)構(gòu)域，每種結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人pd-l1多肽的igv結(jié)構(gòu)域和igc結(jié)構(gòu)域具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽具有免疫球蛋白v(igv)結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白c(igc)結(jié)構(gòu)域，每種結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人pd-l1多肽的igv結(jié)構(gòu)域和igc結(jié)構(gòu)域基本上相同。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽具有免疫球蛋白v(igv)結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白c(igc)結(jié)構(gòu)域，每種結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的人pd-l1多肽的igv結(jié)構(gòu)域和igc結(jié)構(gòu)域相同。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽具有跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，每種結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的小鼠pd-l1多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽具有跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，每種結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的小鼠pd-l1多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域基本上相同。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽具有跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，每種結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與圖6中呈現(xiàn)的小鼠pd-l1多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相同。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽包含與圖6中呈現(xiàn)的人源化pd-l1多肽的氨基酸序列具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的氨基酸序列。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽具有與圖6中呈現(xiàn)的人源化pd-l1多肽的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。

在各種實(shí)施例中，由本發(fā)明的非人動物產(chǎn)生的pd-l1多肽具有與圖6中呈現(xiàn)的人源化pd-l1多肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

提供了用于制備表達(dá)人源化pd-l1多肽(包括特定多態(tài)形式、等位變體(例如，單氨基酸差異)或選擇性剪接的亞型)的非人動物的組合物和方法，包括用于制備由人啟動子和一個或多個人調(diào)控序列表達(dá)此類多肽的非人動物的組合物和方法。在一些實(shí)施例中，還提供了用于制備由內(nèi)源啟動子和一個或多個內(nèi)源調(diào)控序列(在一些實(shí)施例中，由內(nèi)源嚙齒動物啟動子和一個或多個內(nèi)源嚙齒動物調(diào)控序列)表達(dá)此類多肽的非人動物的組合物和方法。該方法包括將編碼完整或部分人pd-l1多肽的遺傳物質(zhì)(例如，人cd274dna序列)插入在與內(nèi)源cd274基因相對應(yīng)的非人動物基因組中的精確位置處，從而形成表達(dá)完全或部分為人源的pd-l1多肽的人源化cd274基因。另選地，編碼完整或部分人pd-l1多肽的遺傳物質(zhì)的插入，可在非人動物基因組中的隨機(jī)位置處(即在內(nèi)源cd274基因之外)進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，所述方法包括將與人cd274基因的外顯子3-5(或外顯子3、4和一部分外顯子5)相對應(yīng)的基因組dna插入到非人動物的內(nèi)源cd274基因中，從而形成編碼pd-l1多肽的人源化基因，該多肽包含具有由所插入的外顯子編碼的氨基酸的人部分。在一些實(shí)施例中，所述方法包括將與全長(或cdna)人cd274基因相對應(yīng)的基因組dna隨機(jī)插入到非人動物的基因組中，從而形成編碼全長人pd-l1多肽的人cd274轉(zhuǎn)基因。

在適當(dāng)情況下，編碼完整或部分人pd-l1多肽的遺傳物質(zhì)或一個或多個多核苷酸序列的編碼區(qū)可經(jīng)修飾而包含針對非人動物中的表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化的密碼子(例如，參見美國專利no.5,670,356和5,874,304)。密碼子所優(yōu)化的序列是合成序列，并且其優(yōu)選地編碼由非密碼子優(yōu)化的親代多核苷酸編碼的相同多肽(或具有與全長多肽基本上相同活性的全長多肽的生物活性片段)。在一些實(shí)施例中，編碼完整或部分人pd-l1多肽的遺傳物質(zhì)的編碼區(qū)可包括改變的序列，以針對特定細(xì)胞類型(例如，嚙齒動物細(xì)胞)優(yōu)化密碼子使用。例如，與要插入到非人動物(例如，嚙齒動物)的內(nèi)源cd274基因中的、人cd274基因的外顯子3-5(或外顯子3、4和一部分外顯子5)相對應(yīng)的基因組dna的密碼子，可針對非人動物的細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。這種序列可被描述為密碼子優(yōu)化的序列。

人源化cd274基因方法采用內(nèi)源基因的相對最少修飾，并引起非人動物中天然cd274介導(dǎo)的(即，pd-l1介導(dǎo)的)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，原因在于例如cd274基因的基因組序列在單個片段中被修飾，因此通過包含必需調(diào)控序列和一些實(shí)施例中的內(nèi)含子序列而保留正常功能性。因此，在此類實(shí)施例中，cd274基因修飾不會影響其他周圍基因或其他與cd274相互作用的內(nèi)源基因(例如，pdcd1等)。此外，在各種實(shí)施例中，該修飾不會影響功能性pd-l1跨膜多肽在質(zhì)膜上的組裝，并且通過結(jié)合及隨后穿過多肽細(xì)胞質(zhì)部分(未受該修飾的影響)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而保持正常效應(yīng)子功能。

嚙齒動物(例如，小鼠)cd274基因和人cd274基因的基因組結(jié)構(gòu)的示意圖(未按比例繪制)在圖1中示出。使用包含人cd274基因的外顯子3、4和一部分外顯子5的基因組片段對內(nèi)源嚙齒動物(例如，小鼠)cd274基因進(jìn)行人源化的示例性構(gòu)建體在圖2中示出。如圖所示，由靶向構(gòu)建體將包含人cd274基因的外顯子3、4和一部分外顯子5的基因組dna插入到內(nèi)源嚙齒動物(例如，小鼠)cd274基因座中。該基因組dna包含編碼人pd-l1多肽胞外部分(例如，氨基酸殘基19-238)的基因部分。如果期望如此，可由靶向構(gòu)建體將包含人cd274基因的外顯子3和4的基因組dna插入到內(nèi)源嚙齒動物(例如，小鼠)cd274基因座中，以便包含編碼人pd-l1多肽的免疫球蛋白v和c結(jié)構(gòu)域(例如，氨基酸殘基19-227)的基因部分。另選地，可由靶向構(gòu)建體將僅包含人cd274基因的外顯子3的基因組dna插入到內(nèi)源嚙齒動物(例如，小鼠)cd274基因座中，以便僅包含編碼人pd-l1多肽的免疫球蛋白v結(jié)構(gòu)域(例如，氨基酸殘基19-131)的基因部分。技術(shù)人員在閱讀本公開內(nèi)容后將理解，可按照本文所述的方法，根據(jù)需要的所編碼的pd-l1多肽，將人cd274基因的各種量的遺傳物質(zhì)插入到非人動物的基因組中。

可通過本領(lǐng)域已知的任何方法制備在內(nèi)源cd274基因座處具有人源化cd274基因的非人動物(例如，小鼠)。例如，可制備將完整或部分的人cd274基因與選擇性標(biāo)記基因一起引入的靶向載體。圖2示出了小鼠基因組的內(nèi)源cd274基因座，其包含人cd274基因的外顯子3、4和一部分外顯子5(約32bp)的插入。如圖所示，靶向構(gòu)建體包含：含有內(nèi)源鼠cd274基因外顯子3上游的序列的5’同源臂(約92.9kb)，之后是含有人cd274基因外顯子3的基因組dna片段(約4494bp)，相對于內(nèi)源鼠cd274基因處于相反轉(zhuǎn)錄方向的藥物選擇盒(例如，兩側(cè)側(cè)接loxp序列的新霉素抗性基因；約5kb)，含有人cd274基因的外顯子4和一部分外顯子5的基因組dna片段(約3950bp)，以及含有內(nèi)源鼠cd274基因的一部分外顯子5及下游基因組序列(包括外顯子6和7)的3’同源臂(約67.6kb)。靶向構(gòu)建體包含自刪除藥物選擇盒(例如，側(cè)接loxp序列的新霉素抗性基因；參見美國專利no.8,697,851、8,518,392和8,354,389，所有這些專利據(jù)此以引用方式并入)。在同源重組后，內(nèi)源鼠cd274基因的外顯子3、4和一部分外顯子5被替換為靶向載體中含有的序列(即，人cd274基因的外顯子3、4和一部分外顯子5)，導(dǎo)致缺失約8,964bp。形成了人源化cd274基因，從而得到表達(dá)人源化pd-l1多肽的細(xì)胞或非人動物，該多肽包含由人cd274基因的所插入的基因組dna編碼的氨基酸。該藥物選擇盒將以發(fā)育依賴性方式被去除，即，從其種系細(xì)胞含有上述人源化cd274基因的小鼠衍生的子代將在發(fā)育過程中從分化的細(xì)胞脫落選擇性標(biāo)記。

雖然本文廣泛討論了在小鼠中采用人源化cd274基因(即，具有編碼包含人部分和小鼠部分的pd-l1多肽的cd274基因的小鼠)的實(shí)施例，但還提供了包含人源化cd274基因的其他非人動物。在一些實(shí)施例中，這些非人動物包含有效連接至內(nèi)源cd274啟動子的人源化cd274基因。在一些特定實(shí)施例中，內(nèi)源cd274啟動子是內(nèi)源嚙齒動物啟動子。在一些實(shí)施例中，這些非人動物由內(nèi)源基因座表達(dá)人源化pd-l1多肽，其中人源化pd-l1多肽包含人pd-l1多肽的氨基酸殘基19-238(或19-227或19-131)。這些非人動物包括可經(jīng)遺傳修飾而表達(dá)如本文所公開的pd-l1多肽的那些動物中的任何一種，包括例如哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、豬、?？苿游?例如，奶牛、公牛、水牛)、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、狗、雪貂、靈長類動物(例如，絨猴、獼猴)等。非人cd274直系同源物的示例性序列包括例如雞pd-l1(xm_424811.3和xp_424811.3)、黑猩猩(xm_001140705.2和xp001140705.1)、奶牛pd-l1(nm_001163412.1和np_001156884.1)和狗pd-l1(xm.541302.3和xp_541302.3)、猴(nm_001083889.1和np001077358.1)以及大鼠(nm_001191954.1和np_001178883.1)，這些序列據(jù)此以引用方式并入。例如，對于適當(dāng)?shù)目蛇z傳修飾的es細(xì)胞不易獲得的那些非人動物而言，采用其他方法產(chǎn)生包含遺傳修飾的非人動物。此類方法包括例如對非es細(xì)胞基因組(例如，成纖維細(xì)胞或誘導(dǎo)多能細(xì)胞)進(jìn)行修飾并采用體細(xì)胞核移植(scnt)將經(jīng)遺傳修飾的基因組轉(zhuǎn)移到合適的細(xì)胞，例如去核卵母細(xì)胞，并且在合適的條件下在非人動物中孕育經(jīng)修飾的細(xì)胞(例如，經(jīng)修飾的卵母細(xì)胞)而形成胚胎(參見例如wilmut,i.etal.,1997,nature385:810-813(wilmut,i.等人，1997年，《自然》，第385卷，第810-813頁)；國際專利申請公布no.wo97/07668和wo97/07669)。

用于修飾非人動物基因組(例如，豬、奶牛、嚙齒動物、雞等基因組)的方法包括，例如采用鋅指核酸酶(zfn)或轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)來修飾基因組以包含人源化cd274基因。

也可通過將cd274核酸序列隨機(jī)引入到非人動物的基因組中作為轉(zhuǎn)基因來形成攜帶如本文所述的人源化cd274基因的非人動物。根據(jù)上下文，可采用cdna或基因組人cd274序列。例如，內(nèi)含子序列和多腺苷酸化信號可包含在轉(zhuǎn)基因中，以提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)的效率和水平。一個或多個組織特異性調(diào)控序列可有效連接至cd274轉(zhuǎn)基因，以指導(dǎo)pd-l1多肽表達(dá)于特定細(xì)胞類型。組成型啟動子可有效連接至cd274核酸序列，以使得所編碼的pd-l1多肽過表達(dá)(即，以更高水平表達(dá)和/或在野生型非人動物中未觀察到的組織中表達(dá))。

可基于其基因組中cd274轉(zhuǎn)基因的存在和/或在非人動物組織或細(xì)胞中pd-l1mrna的表達(dá)，來鑒別轉(zhuǎn)基因首建者非人動物。然后可使用轉(zhuǎn)基因首建者非人動物培育攜帶cd274轉(zhuǎn)基因的另外的非人動物。此外，攜帶編碼完整或部分人pd-l1多肽的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因非人動物可進(jìn)一步嫁接到攜帶其他轉(zhuǎn)基因(例如，pdcd1或cd80轉(zhuǎn)基因)的其他轉(zhuǎn)基因非人動物。

還可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動物，使之包含允許轉(zhuǎn)基因的經(jīng)調(diào)控或經(jīng)指導(dǎo)的表達(dá)的所選系統(tǒng)。示例性系統(tǒng)包括噬菌體p1的cre/loxp重組酶系統(tǒng)(參見例如lakso,m.etal.,1992,proc.natl.acad.sci.usa89:6232-6236(lakso,m.等人，1992年，《美國國家科學(xué)院院刊》，第89卷，第6232-6236頁))和釀酒酵母(s.cerevisiae)的flp/frt重組酶系統(tǒng)(o’gorman,s.etal,1991,science251:1351-1355(o’gorman,s.等人，1991年，《科學(xué)》，第251卷，第1351-1355頁))。這些動物可通過構(gòu)建“雙重”轉(zhuǎn)基因動物來提供，例如使兩種轉(zhuǎn)基因動物交配，一種轉(zhuǎn)基因動物包含編碼所選多肽的轉(zhuǎn)基因(例如，cd274轉(zhuǎn)基因)，而另一種轉(zhuǎn)基因動物包含編碼重組酶(例如，cre重組酶)的轉(zhuǎn)基因。

本發(fā)明的非人動物可如上所述那樣制備或使用本領(lǐng)域已知的方法制備，以包含附加人或人源化基因，具體包含哪種基因這通常取決于非人動物的預(yù)期用途。可通過以下方式引入這些附加人或人源化基因的遺傳物質(zhì)：進(jìn)一步改變具有上述遺傳修飾的細(xì)胞(例如，胚胎干細(xì)胞)的基因組，或根據(jù)需要，采用與其他經(jīng)遺傳修飾的品系進(jìn)行的、本領(lǐng)域已知的培育技術(shù)。在一些實(shí)施例中，制備本發(fā)明的非人動物，使之進(jìn)一步包含一種或多種人或人源化基因，這些基因選自配體的b7家族和/或受體的cd28家族(例如，pdcd1(pd-1)等)。在一些實(shí)施例中，可通過將本文所述的靶向載體引入到來自經(jīng)修飾的品系的細(xì)胞中，來制備本發(fā)明的非人動物。在一些實(shí)施例中，制備本發(fā)明的非人動物，使之進(jìn)一步包含人或人源化程序性細(xì)胞死亡蛋白1(pdcd1)基因。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物包含本文所述的人源化cd274基因以及來自異源物種(例如，人)的遺傳物質(zhì)，其中該遺傳物質(zhì)編碼完整或部分的一種或多種異源多肽，這些多肽選自配體的b-7家族或受體的cd28家族。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物包含本文所述的人源化cd274基因以及來自異源物種(例如，人)的遺傳物質(zhì)，其中該遺傳物質(zhì)編碼完整或部分的異源(例如，人)pd-1多肽。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物還包含具有內(nèi)源部分和人部分的pdcd1基因，其中人部分編碼人pd-1多肽的胞外結(jié)構(gòu)域，并且內(nèi)源部分編碼內(nèi)源pd-1多肽的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；在一些實(shí)施例中，人部分和內(nèi)源部分有效連接至內(nèi)源pdcd1啟動子；在一些實(shí)施例中，連接至內(nèi)源嚙齒動物pdcd1啟動子。

例如，如本文所述，包含人源化cd274基因的非人動物可進(jìn)一步包含(例如，通過雜交或多種基因靶向策略)一種或多種修飾，如2015年6月19日提交的美國專利申請no.14/744,592中所述，該專利申請據(jù)此以引用方式并入。在某些實(shí)施例中，使下述兩種嚙齒動物雜交：包含人源化cd274基因(即，人cd274基因的外顯子3、4及外顯子5的5’部分，它們有效連接至內(nèi)源嚙齒動物cd274基因的外顯子1、2、外顯子5的3’部分、6和7，以使得人源化cd274基因編碼具有來自人pd-l1多肽的胞外部分和來自嚙齒動物pd-l1多肽的胞內(nèi)部分的pd-l1多肽)的嚙齒動物，與包含人源化pdcd1基因(例如，人pdcd1基因的外顯子2及外顯子3的5’部分，它們有效連接至內(nèi)源嚙齒動物pdcd1基因的外顯子1、外顯子3的3’部分、4和5，以使得人源化pdcd1基因編碼具有來自人pd-1多肽的胞外部分和來自嚙齒動物pd-1多肽的胞內(nèi)部分的pd-1多肽；參見例如2015年6月19日提交的美國專利申請no.14/744,592，該專利申請據(jù)此以引用方式并入)的嚙齒動物。在一些實(shí)施例中，人源化pdcd1基因包含非人(例如，嚙齒動物)pdcd1外顯子1、4和5、人pdcd1外顯子2和pdcd1外顯子3，該pdcd1外顯子3包含人部分和非人部分，并且其中所述非人外顯子和人外顯子有效連接。在一些實(shí)施例中，pdcd1外顯子3的人部分包含編碼pd-1莖區(qū)序列的核苷酸。在一些實(shí)施例中，pdcd1外顯子3的人部分包含約71bp的人pdcd1外顯子3。在一些實(shí)施例中，pdcd1外顯子3的非人部分包含編碼跨膜序列的核苷酸。在一些實(shí)施例中，pdcd1外顯子3的非人部分包含約91bp的嚙齒動物pdcd1外顯子3。在具體實(shí)施例中，人源化pdcd1基因編碼人源化pd-1多肽，該多肽包含來自人pd-1多肽的胞外部分(例如，基本上整個胞外結(jié)構(gòu)域)，以及來自嚙齒動物pd-1多肽的跨膜部分(例如，基本上整個跨膜結(jié)構(gòu)域)和胞內(nèi)部分(例如，基本上整個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域)。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物是哺乳動物。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物是例如跳鼠總科(dipodoidea)或鼠總科(muroidea)的小型哺乳動物。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的動物是嚙齒動物。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的嚙齒動物選自小鼠、大鼠和倉鼠。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的嚙齒動物選自鼠總科。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的動物來自選自下列的科：麗倉鼠科(calomyscidae)(例如，麗倉鼠)、倉鼠科(cricetidae)(例如，倉鼠、新世界鼠、田鼠)、鼠科(muridae)(真小鼠和大鼠(truemiceandrats)、沙鼠、非洲刺毛鼠、冠鼠)、馬島鼠科(nesomyidae)(攀鼠、巖鼠、白尾鼠、馬島鼠(malagasyratsandmice))、刺睡鼠科(platacanthomyidae)(例如，刺睡鼠)以及鼴形鼠科(spalacidae)(例如，鼴形鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的嚙齒動物選自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、非洲刺毛鼠和冠鼠。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的小鼠來自鼠科的成員。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物是嚙齒動物。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的嚙齒動物選自小鼠和大鼠。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物是小鼠。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物是嚙齒動物，該嚙齒動物是選自c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola的c57bl品系的小鼠。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的小鼠是129品系，該129品系選自是以下的品系：129p1、129p2、129p3、129x1、129s1(例如，129s1/sv、129s1/svim)、129s2、129s4、129s5、129s9/svevh、129/svjae、129s6(129/svevtac)、129s7、129s8、129t1、129t2(參見例如festingetal.,1999,mammaliangenome10:836(festing等人，1999年，《哺乳動物基因組》，第10卷，第836頁)；auerbach,w.etal.,2000,biotechniques29(5):1024-1028,1030,1032(auerbach,w.等人，2000年，《生物技術(shù)》，第29卷，第5期，第1024-1028、1030、1032頁))。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的小鼠是上述129品系與上述c57bl/6品系的混合型。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的小鼠是上述129品系的混合型或上述bl/6品系的混合型。在一些特定實(shí)施例中，本文所述的混合型的129品系是129s6(129/svevtac)品系。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的小鼠是balb品系，例如balb/c品系。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的小鼠是balb品系與另一種上述品系的混合型。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物是大鼠。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的大鼠選自wistar大鼠、lea品系、spraguedawley品系、fischer品系、f344、f6以及darkagouti。在一些特定實(shí)施例中，本文所述的大鼠品系是選自wistar、lea、spraguedawley、fischer、f344、f6以及darkagouti中的兩種或更多種品系的混合型。

采用具有人源化cd274基因的非人動物的方法

已報道了cd274突變型和轉(zhuǎn)基因非人動物(例如，小鼠)和細(xì)胞(iwai,y.etal.,2002,proc.nat.acad.sci.99(19):12293-12297(iwai,y.等人，2002年，《美國國家科學(xué)院院刊》，第99卷，第19期，第12293-12297頁)；latchman,y.e.etal.,2004,proc.nat.acad.sci.101(29):10691-10696(latchman,y.e.等人，2004年，《美國國家科學(xué)院院刊》，第101卷，第29期，第10691-10696頁)；subudhi,s.k.etal.,2004,j.clin.invest.113(5):694-700(subudhi,s.k.等人，2004年，《臨床研究雜志》，第113卷，第5期，第694-700頁)；guleria,i.etal.,2005,j.exp.med.202(2):231-237(guleria,i.等人，2005年，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》，第202卷，第2期，第231-237頁)；keir,m.e.etal.,2006,j.exp.med.203(4):883-895(keir,m.e.等人，2006年，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》，第203卷，第4期，第883-895頁)；tanaka,k.etal.,2007,j.immunol.179:5204-5210(tanaka,k.等人，2007年，《免疫學(xué)雜志》，第179卷，第5204-5210頁)；wang,c.etal.,2008,diabetes57:1861-1869(wang,c.等人，2008年，《糖尿病》，第57卷，第1861-1869頁)；wen,x.etal.,2008,transplant.86(11):1596-1602(wen,x.等人，2008年，《移植》，第86卷，第11期，第1596-1602頁)；plege,a.etal.,2009,transpl.87(7):975-982(plege,a.等人，2009年，《移植》，第87卷，第7期，第975-982頁)；cao,y.etal.,2010,cancerres.71(4):1235-1243(cao,y.等人，2010年，《癌癥研究》，第71卷，第4期，第1235-1243頁)；plege,a.etal.,2010,eur.soc.organtransplant.23:1293-1300(plege,a.等人，2010年，《歐洲器官移植學(xué)會》，第23卷，第1293-1300頁)；ritprajak,p.etal.,2010,j.immunol.184:4918-4925(ritprajak,p.等人，2010年，《免疫學(xué)雜志》，第184卷，第4918-4925頁)；yantha,j.etal.,2010,diabetes59:2588-2596(yantha,j.等人，2010年，《糖尿病》，第59卷，第2588-2596頁)；ding,q.etal.,2011,j.leukocytebiol.90:77-86(ding,q.等人，2011年，《白血球生物學(xué)雜志》，第90卷，第77-86頁)；tang,l.etal.,2011,xibaoyufenzimianyixuezazhi27(4):357-359(tang,l.等人，2011年，《細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志》，第27卷，第4期，第357-359頁)；ghazizadeh,s.etal.,2012,20(1):196-203(ghazizadeh,s.等人，2012年，第20卷，第1期，第196-203頁))。這些突變型和轉(zhuǎn)基因動物可用于確定pd-l1表達(dá)和功能的分子方面，及pd-1:pd-l1通路對于調(diào)控免疫應(yīng)答(具體地講，t細(xì)胞應(yīng)答)的作用。然而，它們存在局限性，這部分歸咎于所得結(jié)果所展示的可變性。許多轉(zhuǎn)基因pd-l1動物采用的是使用被設(shè)計成過表達(dá)內(nèi)源pd-l1的轉(zhuǎn)基因(參見例如ghazizadeh等人，出處同上)，而其他人則專注于將轉(zhuǎn)基因pd-l1表達(dá)與組織特異性啟動子聯(lián)系起來(參見例如ritprajak等人，出處同上)。這些動物中的一些動物已顯示出不與野生型轉(zhuǎn)錄譜相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)基因pd-l1的表達(dá)模式(參見例如wang等人和yantha等人，出處同上)。此外，由于使用相同來源遺傳物質(zhì)(例如，小鼠中的小鼠pd-l1轉(zhuǎn)基因)，pd-l1過表達(dá)可能對應(yīng)于內(nèi)源pd-l1而不是轉(zhuǎn)基因pd-l1，原因在于轉(zhuǎn)基因的可能位置效應(yīng)。在一些情況下，此類動物展現(xiàn)出疾病加速發(fā)展的現(xiàn)象，因此讓人擔(dān)憂的是，轉(zhuǎn)基因可能已形成或修飾了一種或多種表型，從而使pd-l1功能的分析復(fù)雜化。這些結(jié)果可合理地歸因于構(gòu)建體設(shè)計。在人pd-l1的情形中，經(jīng)工程改造而穩(wěn)定表達(dá)cmv驅(qū)動的人pd-l1的豬腸內(nèi)皮細(xì)胞已在微型豬皮膚移植模型中采用，并且提供了同種異體移植模型中異位人pd-l1表達(dá)的重要見解(ding等人，出處同上)。已證實(shí)現(xiàn)有pd-l1轉(zhuǎn)基因非人動物可用于闡明pd-l1和pd-1:pd-l1通路的一些生物學(xué)功能，但是如上面所展現(xiàn)的，目前利用pd-l1介導(dǎo)的生物學(xué)的體內(nèi)系統(tǒng)是不完備的。pd-1:pd-l1通路的分子方面及其在癌癥和自身免疫性背景下對于免疫應(yīng)答調(diào)控的作用尚未在轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)中得到其最大限度地利用。

本發(fā)明的非人動物提供了可用于多種測定法的表達(dá)人(或人源化)pd-l1的生物材料(例如，細(xì)胞)的改良體內(nèi)系統(tǒng)和來源。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于開發(fā)靶向pd-l1和/或調(diào)節(jié)pd-1:pd-l1信號傳導(dǎo)(例如，干擾與pd-1的相互作用)和/或調(diào)節(jié)pd-l1與其他結(jié)合配偶體(例如，b7-1)的相互作用的治療劑。此類動物特別有用，因?yàn)榕c用于體內(nèi)研究的許多其他動物模型相比，它們具有完全免疫活性；因此，療法的療效分析不會因受損的免疫狀態(tài)而變得復(fù)雜。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于鑒別、篩選和/或開發(fā)結(jié)合人pd-l1的候選治療劑(例如，抗體)。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于篩選和開發(fā)阻斷人pd-l1與人pd-1和/或人b7-1的相互作用的候選治療劑(例如，抗體)。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于確定人源化pd-l1多肽的拮抗劑和/或激動劑在本文所述的非人動物的細(xì)胞表面上的結(jié)合特性；在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于確定結(jié)合人pd-l1的一種或多種候選治療劑抗體的一個或多個表位。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于確定抗pd-l1抗體的藥代動力學(xué)特性。在各種實(shí)施例中，使本發(fā)明的一個或多個非人動物和一個或多個對照或參考非人動物各自暴露于各種劑量(例如，0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/mg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、或50mg/kg或更大)的一種或多種候選治療劑抗pd-l1抗體。可通過任何所需的施用途徑(包括腸胃外的和非腸胃外的施用途徑)給予候選治療劑抗體。腸胃外途徑包括例如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、鞘內(nèi)、腦室內(nèi)、顱內(nèi)、胸膜內(nèi)或其他注射途徑。非腸胃外途徑包括例如口服、鼻腔、經(jīng)皮、肺、直腸、口頰、陰道、眼。施用還可采取持續(xù)輸注、局部施用、從植入物(凝膠、膜等)緩釋和/或靜脈內(nèi)注射。在各個時間點(diǎn)(例如，0小時、6小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、或最多30天或更多天)從非人動物(人源化和對照)分離血液?？墒褂玫米员疚乃龇侨藙游锏臉悠穲?zhí)行各種測定法，以確定所施用的候選治療劑抗體的藥代動力學(xué)特性，包括但不限于總igg、抗治療性抗體應(yīng)答、凝集等。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于測量阻斷或調(diào)節(jié)pd-l1信號傳導(dǎo)(或pd-1:pd-l1信號傳導(dǎo)、或pd-l1:b7-1介導(dǎo)的相互作用)的療效以及因細(xì)胞變化而引起的對基因表達(dá)的影響。在各種實(shí)施例中，使本發(fā)明的非人動物或從其分離的細(xì)胞暴露于候選治療劑，該候選治療劑結(jié)合非人動物細(xì)胞表面上的人源化pd-l1多肽(或pd-l1多肽的人部分)，在此后一段時間之后，分析對pd-l1依賴性過程(例如相互作用)的影響，例如粘附、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子產(chǎn)生、炎癥、增殖、自身耐受性和病毒性感染(或應(yīng)答)。

本發(fā)明的非人動物表達(dá)人源化pd-l1多肽，因此可生成細(xì)胞、細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)物，以便作為用于結(jié)合和功能測定法的人源化pd-l1的來源，例如以便測定pd-l1拮抗劑或激動劑的結(jié)合或功能，特別是在拮抗劑或激動劑對人pd-l1序列或表位具有特異性，或者，對與pd-1和/或b7-1相關(guān)聯(lián)的人pd-l1序列或表位具有特異性的情況下。在各種實(shí)施例中，可使用從本發(fā)明的非人動物分離的細(xì)胞確定候選治療劑抗體所結(jié)合的pd-l1表位。

在各種實(shí)施例中，由本文所述的非人動物表達(dá)的人源化pd-l1多肽可包含變體氨基酸序列。示例性人pd-l1多肽變體包括列于ncbi的snpgeneview網(wǎng)頁中的那些變體，并匯總于表3中。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物表達(dá)人源化pd-l1多肽變體。在各種實(shí)施例中，該變體在與配體結(jié)合相關(guān)聯(lián)的氨基酸位置處呈多態(tài)性。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于確定通過與人pd-l1的多態(tài)性多肽變體相互作用而對配體結(jié)合的影響。在一些特定實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物表達(dá)表3中呈現(xiàn)的人pd-l1多肽變體。

表3

來自本發(fā)明的非人動物的細(xì)胞可根據(jù)需要進(jìn)行分離和使用，或可在培養(yǎng)物中維持許多代。在各種實(shí)施例中，使來自本發(fā)明的非人動物的細(xì)胞永生化(例如，通過使用病毒)，并在培養(yǎng)物(例如，在連續(xù)培養(yǎng)物中)中無限期地維持。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的細(xì)胞和/或非人動物用于各種免疫方案，以確定在對抗原的免疫應(yīng)答(例如，t細(xì)胞應(yīng)答)中pd-l1介導(dǎo)的功能。在一些實(shí)施例中，在本發(fā)明的非人動物中表征了結(jié)合人(或人源化)pd-l1或阻斷人(或人源化)pd-l1的一種或多種功能的候選治療劑。合適的測量法包括各種細(xì)胞測定法、增殖測定法、血清免疫球蛋白分析(例如，抗體滴度)、細(xì)胞毒性測定法、配體-受體相互作用的表征(例如，免疫沉淀測定法)以及配體-配體相互作用的表征。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于表征調(diào)控對抗原的免疫應(yīng)答的pd-l1介導(dǎo)的功能。在一些實(shí)施例中，抗原與自身免疫疾病、障礙或病癥相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施例中，抗原與炎性疾病、障礙或病癥相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施例中，該抗原與瘤相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施例中，抗原與傳染性因子(例如，細(xì)菌)相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施例中，抗原是測試抗原(例如，卵清蛋白或ova)。在一些實(shí)施例中，抗原是與需要治療的一個或多個人患者所患的疾病或病癥相關(guān)聯(lián)的靶標(biāo)。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于確定自身抗體產(chǎn)生的滴度的血清測定法，以便測試靶向人pd-l1的候選治療劑的藥物毒理學(xué)方面。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物中的自身抗體產(chǎn)生由非人動物中誘導(dǎo)的一種或多種自身免疫疾病、障礙或病癥引起。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于利用一種或多種抗原進(jìn)行攻擊以確定化合物或生物試劑調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答(包括但不限于對給定抗原的特異性t細(xì)胞依賴性和b細(xì)胞依賴性應(yīng)答)的pd-l1依賴性調(diào)控的治療潛力。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的細(xì)胞和/或非人動物用于存活和/或增殖測定法(例如，采用b或t細(xì)胞)以篩選和開發(fā)調(diào)節(jié)人pd-l1信號傳導(dǎo)的候選治療劑。pd-l1的活化或抑制在t細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)控中起到重要作用，并且pd-l1對自身耐受性的調(diào)控可由pd-l1的胞外結(jié)構(gòu)域的特定表位的活化引起，因此，可使用本發(fā)明的非人動物的細(xì)胞和/或本文所述的非人動物來鑒別、表征和開發(fā)候選pd-l1調(diào)節(jié)劑(例如，拮抗劑或激動劑)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的細(xì)胞和/或非人動物用于一種或多種存活或死亡測定法，以確定在pd-l1存在和不存在的情況下對一個或多個特定細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞)的增殖或細(xì)胞凋亡的影響。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的細(xì)胞和/或非人動物用于異源(例如，人)細(xì)胞或組織的異種移植，以確定在對移植的人細(xì)胞或組織的生理(例如，免疫)應(yīng)答中pd-l1介導(dǎo)的功能。在一些實(shí)施例中，在本發(fā)明的非人動物中表征了結(jié)合人pd-l1或阻斷人pd-l1的一種或多種功能的候選治療劑。合適的測量法包括各種細(xì)胞測定法、增殖測定法、血清免疫球蛋白分析(例如，抗體滴度)、細(xì)胞毒性測定法以及配體-受體相互作用的表征(免疫沉淀測定法)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于表征調(diào)控對抗原的免疫應(yīng)答的pd-l1介導(dǎo)的功能。在一些實(shí)施例中，抗原與瘤相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施例中，抗原與自身免疫疾病、障礙或病癥相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施例中，抗原與炎性疾病、障礙或病癥相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施例中，抗原是與需要治療的一個或多個人患者所患的疾病或病癥相關(guān)聯(lián)的靶標(biāo)。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于移植或過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，以確定化合物或生物試劑調(diào)節(jié)異種淋巴細(xì)胞及其免疫功能的pd-l1依賴性調(diào)控的治療潛力。在各種實(shí)施例中，向本發(fā)明的非人動物中移植人t細(xì)胞；在一些實(shí)施例中，初始t細(xì)胞；在一些實(shí)施例中，活化t細(xì)胞。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物的細(xì)胞用于t細(xì)胞測定法，以確定化合物或生物試劑調(diào)節(jié)t細(xì)胞依賴性應(yīng)答和功能的pd-l1依賴性調(diào)控的治療潛力。示例性t細(xì)胞測定法包括但不限于，elispot、胞內(nèi)細(xì)胞因子染色、主要組織相容性復(fù)合物(mhc)限制性、病毒抑制測定法、細(xì)胞毒性測定法、增殖測定法和調(diào)節(jié)性t細(xì)胞抑制測定法。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物的細(xì)胞用于細(xì)胞遷移測定法，以篩選和開發(fā)調(diào)節(jié)人pd-l1的候選治療劑。細(xì)胞遷移涉及細(xì)胞跨越內(nèi)皮的遷移，并且遷移測定法允許測量與白細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的相互作用，以及白細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞從內(nèi)皮的遷移。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物的細(xì)胞用于腫瘤細(xì)胞生長(或增殖)測定法，以確定化合物或生物試劑調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的pd-l1依賴性調(diào)控和/或細(xì)胞凋亡的治療潛力。

在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物的細(xì)胞用于細(xì)胞因子產(chǎn)生測定法，以確定化合物或生物試劑調(diào)節(jié)從t細(xì)胞釋放細(xì)胞因子(例如，干擾素-γ、白介素-10)的pd-l1依賴性調(diào)控的治療潛力。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物的細(xì)胞用于檢測(和/或測量)因人源化pd-l1與靶向人pd-l1的藥物或pd-l1結(jié)合配偶體(例如，pd-1、b7-1或其可溶形式)的相互作用而引起的胞內(nèi)細(xì)胞因子釋放。

在各種實(shí)施例中，在本發(fā)明的一個或多個非人動物中誘發(fā)自身免疫疾病、障礙或病癥，以提供用于確定化合物或生物試劑調(diào)節(jié)自身免疫疾病、障礙或病癥的一個或多個功能(或方面)的pd-l1依賴性調(diào)控的治療潛力的體內(nèi)系統(tǒng)?？稍诒景l(fā)明的一個或多個非人動物中誘發(fā)的示例性自身免疫疾病、障礙或病癥包括糖尿病、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(例如，多發(fā)性硬化癥的模型)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和全身性紅斑狼瘡。

本發(fā)明的非人動物提供了用于藥物或疫苗的分析和測試的體內(nèi)系統(tǒng)。在各種實(shí)施例中，可將候選藥物或疫苗遞送至本發(fā)明的一個或多個非人動物，隨后監(jiān)測非人動物以確定以下一者或多者：對藥物或疫苗的免疫應(yīng)答、藥物或疫苗的安全特性、或?qū)膊』虿“Y和/或疾病或病癥的一種或多種癥狀的作用。在一些實(shí)施例中，疫苗的靶標(biāo)是病毒，例如，人類免疫缺陷病毒或肝炎病毒(例如，hcv)。用于確定安全特性的示例性方法包括測量毒性、最佳劑量濃度、藥物或疫苗的效能和可能的風(fēng)險因素?？稍诖祟惙侨藙游镏懈牧己?或開發(fā)此類藥物或疫苗。

本發(fā)明的非人動物提供了用于通過過繼轉(zhuǎn)移闡明人細(xì)胞間相互作用的機(jī)制的改良的體內(nèi)系統(tǒng)。在各種實(shí)施例中，可用腫瘤異種移植物植入本發(fā)明的非人動物，隨后進(jìn)行腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(可通過過繼轉(zhuǎn)移在非人動物中植入)的第二植入，以確定消除實(shí)體瘤或其他惡性腫瘤的有效性。由于人pd-l1的唯一性存在(不存在與非人動物的內(nèi)源pd-l1競爭)，可利用人細(xì)胞進(jìn)行這樣的實(shí)驗(yàn)。此外，可在此類非人動物中改良和/或開發(fā)用于異種移植的療法和藥物。

本發(fā)明的非人動物提供了用于評估靶向人pd-l1的藥物的藥代動力學(xué)特性的體內(nèi)系統(tǒng)。在各種實(shí)施例中，可將靶向人pd-l1的藥物遞送或施用到本發(fā)明的一個或多個非人動物，然后監(jiān)測非人動物(或從其分離的細(xì)胞)或執(zhí)行對非人動物(或從其分離的細(xì)胞)的一種或多種測定法，以確定藥物對非人動物的作用。藥代動力學(xué)特性包括但不限于，動物如何將藥物處理成各種代謝物(或檢測一種或多種藥物代謝物(包括但不限于毒性代謝物)的存在或不存在)、藥物半衰期、施用之后藥物的循環(huán)水平(例如，藥物的血清濃度)、抗藥物應(yīng)答(例如，抗藥物抗體)、藥物吸收和分布、施用途徑、排泄途徑和/或藥物清除率。在一些實(shí)施例中，在本發(fā)明的非人動物中或通過使用本發(fā)明的非人動物監(jiān)測藥物(例如，pd-l1調(diào)節(jié)劑)的藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)特性。

本發(fā)明的非人動物提供了用于評估靶向人pd-l1的藥物的在靶毒性(on-targettoxicity)的體內(nèi)系統(tǒng)。在各種實(shí)施例中，可將靶向人pd-l1的藥物遞送或施用到本發(fā)明的一個或多個非人動物，然后監(jiān)測非人動物(或從其分離的細(xì)胞)或執(zhí)行對非人動物(或從其分離的細(xì)胞)的一種或多種測定法，以確定藥物對非人動物的在靶毒性效應(yīng)。通常，藥物旨在調(diào)節(jié)其靶標(biāo)的一種或多種功能。僅舉一個例子，pd-l1調(diào)節(jié)劑旨在通過以下方式調(diào)節(jié)pd-l1介導(dǎo)的功能(例如，pd-l1信號傳導(dǎo)和/或pd-l1相互作用)：以某種方式與一個或多個細(xì)胞的表面上的pd-l1分子相互作用，并且在一些實(shí)施例中，阻斷與一個或多個pd-l1結(jié)合配偶體的相互作用。在一些實(shí)施例中，這種調(diào)節(jié)劑可具有不利效應(yīng)，即夸大調(diào)節(jié)劑的一種或多種所需藥理作用。此類效應(yīng)稱為在靶效應(yīng)。示例性在靶效應(yīng)包括劑量過高、慢性活化/失活以及不正確組織中的正確作用。在一些實(shí)施例中，在本發(fā)明的非人動物中或通過使用本發(fā)明的非人動物鑒別的靶向pd-l1的藥物的在靶效應(yīng)，用于確定pd-l1的此前未知的一種或多種功能。

本發(fā)明的非人動物提供了用于評估靶向人pd-l1的藥物的脫靶毒性的體內(nèi)系統(tǒng)。在各種實(shí)施例中，可將靶向人pd-l1的藥物遞送或施用到本發(fā)明的一個或多個非人動物，然后監(jiān)測非人動物(或從其分離的細(xì)胞)或執(zhí)行對非人動物(或從其分離的細(xì)胞)的一種或多種測定法，以確定藥物對非人動物的脫靶毒性效應(yīng)。當(dāng)藥物與非預(yù)期靶標(biāo)相互作用(例如，與共同表位的交叉反應(yīng)性)時，可發(fā)生脫靶效應(yīng)。此類相互作用可在預(yù)期或非預(yù)期組織中發(fā)生。僅舉一個例子，藥物的鏡像異構(gòu)體(對映異構(gòu)體)可引起脫靶毒性效應(yīng)。此外，藥物可不適當(dāng)?shù)嘏c不同受體亞型相互作用并意外地活化不同受體亞型。示例性脫靶效應(yīng)包括不正確靶標(biāo)的不正確活化/抑制，而不論存在不正確靶標(biāo)的是何種組織。在一些實(shí)施例中，通過將藥物施用到本發(fā)明的非人動物的效應(yīng)與一個或多個參考非人動物進(jìn)行比較，確定靶向人pd-l1的藥物的脫靶效應(yīng)。

在一些實(shí)施例中，執(zhí)行測定法包括確定對施用了藥物的非人動物的表型和/或基因型的效應(yīng)。在一些實(shí)施例中，執(zhí)行測定法包括對pd-l1調(diào)節(jié)劑(例如，拮抗劑或激動劑)或靶向pd-l1的藥物的批次間可變性。在一些實(shí)施例中，執(zhí)行測定法包括確定向本發(fā)明的非人動物和參考非人動物施用的、靶向pd-l1的藥物的效應(yīng)之間的差異。在各種實(shí)施例中，參考非人動物可具有本文所述的修飾、與本文所述不同的修飾(例如，具有改變、破壞、缺失、插入、修飾等的或其他方面非功能性的cd274基因的修飾)或沒有修飾(即，野生型非人動物)。

為了評估靶向人pd-l1的藥物的藥代動力學(xué)特性、在靶毒性和/或脫靶毒性而可在非人動物中(或在從其分離的細(xì)胞中和/或使用從其分離的細(xì)胞)測量的示例性參數(shù)包括但不限于，凝集、自噬、細(xì)胞分裂、細(xì)胞死亡、補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血、dna完整性、藥物特異性抗體滴度、藥物代謝、基因表達(dá)陣列、代謝活性、線粒體活性、氧化應(yīng)激、吞噬作用、蛋白質(zhì)生物合成、蛋白質(zhì)降解、蛋白質(zhì)分泌、應(yīng)激反應(yīng)、靶組織藥物濃度、非靶組織藥物濃度、轉(zhuǎn)錄活性等。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于確定pd-l1調(diào)節(jié)劑(例如，靶向pd-l1的藥物)的藥學(xué)有效劑量。

本發(fā)明的非人動物提供了開發(fā)和表征用于癌癥的候選治療劑的改良體內(nèi)系統(tǒng)。在各種實(shí)施例中，可用腫瘤(或腫瘤細(xì)胞)植入本發(fā)明的非人動物，隨后施用一種或多種候選治療劑。在一些實(shí)施例中，候選治療劑可包括多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)或抗體混合物；在一些實(shí)施例中，候選治療劑包括組合療法，例如，以依次或同時給予的方式施用兩種或更多種單特異性抗體?？稍谑┯靡环N或多種候選治療劑之前預(yù)留足夠的時間，讓腫瘤在非人動物內(nèi)的一個或多個位置中建立?？稍谑┯靡环N或多種候選治療劑之前和之后測量腫瘤細(xì)胞增殖、生長、存活情況等。還可根據(jù)需要，在非人動物中測量候選治療劑的細(xì)胞毒性。

本發(fā)明的非人動物提供了開發(fā)和表征用于傳染性疾病的候選治療劑的改良體內(nèi)系統(tǒng)。在各種實(shí)施例中，可通過注射使本發(fā)明的非人動物感染病毒(例如，mhv、hiv、hcv等)或病原體(例如，細(xì)菌)，隨后施用一種或多種候選治療劑。在一些實(shí)施例中，候選治療劑可包括多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)或抗體混合物；在一些實(shí)施例中，候選治療劑包括組合療法，例如，以依次或同時給予的方式施用兩種或更多種單特異性抗體；在一些實(shí)施例中，候選治療劑可包括疫苗?？深A(yù)留足夠的時間，讓病毒或病原體在非人動物內(nèi)的一個或多個位置或細(xì)胞中建立，以使得在非人動物中形成與病毒或病原體的感染相關(guān)聯(lián)的一種或多種癥狀?？稍谑┯靡环N或多種候選治療劑之前和之后測量t細(xì)胞增殖和生長情況。此外，可在受病毒或病原體感染的非人動物中測量存活率、血清和/或胞內(nèi)細(xì)胞因子分析、肝和/或脾組織病理學(xué)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于確定與病毒性感染相關(guān)聯(lián)的器官損傷程度。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非人動物用于在受特定病毒感染的非人動物的各種器官中確定細(xì)胞因子表達(dá)譜和/或基因表達(dá)譜。

本發(fā)明的非人動物可用于評估靶向人細(xì)胞的治療藥物的效能。在各種實(shí)施例中，向本發(fā)明的一個或多個非人動物中移植人細(xì)胞，然后向這種非人動物施用靶向此類人細(xì)胞的藥物候選物。然后通過監(jiān)測藥物施用之后非人動物中的人細(xì)胞，確定藥物的治療效能?？稍诜侨藙游镏袦y試的藥物包括小分子化合物，即分子量小于1500kd、1200kd、1000kd或800道爾頓的化合物，以及大分子化合物(諸如蛋白質(zhì)，例如抗體)，它們通過靶向人細(xì)胞(例如，與之結(jié)合和/或?qū)ζ渥饔?，而具有治療人疾病和病癥的預(yù)期療效。

在一些實(shí)施例中，藥物是抗癌藥物，并且人細(xì)胞是癌細(xì)胞，這些癌細(xì)胞可以是原發(fā)性癌癥的細(xì)胞，或由原發(fā)性癌癥建立的細(xì)胞系的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，向本發(fā)明的非人動物中移植人癌細(xì)胞，并將抗癌藥物給予非人動物?？赏ㄟ^以下方式確定藥物效能：評估非人動物中的人癌細(xì)胞的生長或轉(zhuǎn)移是否因藥物的施用而受到抑制。

在具體實(shí)施例中，抗癌藥物是抗體分子，其結(jié)合人癌細(xì)胞上的抗原。在特定實(shí)施例中，抗癌藥物是雙特異性抗體，其結(jié)合于人癌細(xì)胞上的抗原，并結(jié)合于其他人細(xì)胞(例如人免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(或“人免疫細(xì)胞”)，諸如b細(xì)胞和t細(xì)胞)上的抗原。

實(shí)例

提供以下實(shí)例，以向本領(lǐng)域的技術(shù)人員描述如何制備和使用本發(fā)明的方法和組合物，并且不旨在限制本發(fā)明人視作其發(fā)明的對象的范圍。除非另外指明，否則溫度以攝氏度表示，壓力為大氣壓或接近大氣壓。

實(shí)例1.內(nèi)源分化簇274(cd274)基因的人源化

本實(shí)例舉例說明在非人動物諸如嚙齒動物(例如，小鼠)中對編碼程序性細(xì)胞死亡配體1(pd-l1)的內(nèi)源cd274基因進(jìn)行人源化的示例性方法?？刹捎帽緦?shí)例中所述的方法，使用任何人序列或根據(jù)需要使用序列(或序列片段)的組合，對非人動物的內(nèi)源cd274基因進(jìn)行人源化。在本實(shí)例中，采用genbank登記號nm_014143.3(seqidno:11)中呈現(xiàn)的、含有人cd274基因外顯子3、4和5(部分)的約8,444bp人dna片段，對小鼠的內(nèi)源cd274基因進(jìn)行人源化。使用技術(shù)構(gòu)建靶向載體，該靶向載體用于人源化編碼內(nèi)源cd274基因的胞外結(jié)構(gòu)域的遺傳物質(zhì)，該胞外結(jié)構(gòu)域包括n端igv結(jié)構(gòu)域和igc2型結(jié)構(gòu)域(參見例如美國專利no.6,586,251以及valenzuelaetal.,2003,naturebiotech.21(6):652-659(valenzuela等人，2003年，《自然生物技術(shù)》，第21卷，第6期，第652-659頁)；這些文獻(xiàn)以引用方式并入本文)。

簡而言之，對小鼠細(xì)菌人工染色體(bac)克隆rp23-467a9(英杰公司(invitrogen))進(jìn)行修飾，使內(nèi)源小鼠cd274基因的外顯子3、4和5(部分)的編碼序列(約8942bp)缺失，然后使用編碼人pd-l1多肽的氨基酸19-238的約8444bp人dna片段插入人cd274基因的外顯子3、4和5(部分)。保留含有外顯子1、外顯子2、外顯子6和外顯子7以及非翻譯區(qū)(utr)的內(nèi)源dna。約8,444bp人dna片段的序列分析確認(rèn)了所有人cd274外顯子(即，外顯子3、4和5(部分))和剪接信號。序列分析揭示，該序列匹配人cd274轉(zhuǎn)錄物nm014143.3。首先，分兩個部分?jǐn)U增約8,444bp人dna片段(圖2，頂部)。使用含有nhei限制性位點(diǎn)的3’引物和含有促進(jìn)細(xì)菌同源重組的小鼠同源盒的5’引物，通過pcr擴(kuò)增含有人cd274外顯子2和部分內(nèi)含子3的5’部分(約4,494bp)。使用含有xhoi限制性位點(diǎn)的5’引物和含有促進(jìn)細(xì)菌同源重組的小鼠同源盒的3’引物，通過pcr擴(kuò)增含有部分內(nèi)含子3、外顯子4、內(nèi)含子4和部分外顯子5(約32bp)的3’部分(約3,950bp)。對pcr產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，并分別用對應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行消化。采用nhei-xhoi限制性位點(diǎn)，按照與含有人cd274編碼序列的dna片段相反的取向，將約4,494bp和約3,950bpdna片段連接到約4,996bp自刪除新霉素盒(loxp-hub1-em7-neo-pa-mprm1-crei-loxp；參見美國專利no.8,697,851、8,518,392和8,354,389，所有這些專利據(jù)此以引用方式并入)的5’端和3’端。后續(xù)的選擇采用新霉素。按照設(shè)計，人cd274外顯子5的一部分(即，初始32bp)和內(nèi)源cd274外顯子5之間的接合區(qū)保留外顯子5中的開放閱讀框(圖2)并形成獨(dú)特的cd274外顯子5(aactacctctggcacatcctccaaatgaaaggactcactgggtgcttctgggatccatcctgttgttcctcattgtagtgtccacggtcctcctcttcttgagaaaacaag；seqidno:12)。所得的靶向載體從5’到3’包含：含有來自bac克隆rp23-467a9的約92.9kb小鼠基因組dna的5’同源臂，含有人cd274基因外顯子3和部分內(nèi)含子3的約4,494bp人dna片段，側(cè)接loxp位點(diǎn)的自刪除新霉素盒，含有人cd274基因的部分內(nèi)含子3、外顯子4、內(nèi)含子4和外顯子5最開始32bp的約3950bp人dna片段，以及來自bac克隆rp23-467a9的約67.6kb小鼠基因組dna。

上述經(jīng)修飾的rp23-467a9克隆用于對小鼠胚胎干(es)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔以形成經(jīng)修飾的es細(xì)胞，這些細(xì)胞包含從外顯子3到部分外顯子5發(fā)生人源化的內(nèi)源cd274基因(即，缺失約8,964的內(nèi)源cd274基因并插入約8,444bp的人cd274序列)。通過測定法(valenzuela等人，出處同上)鑒別被陽性靶向的含有人源化cd274基因的es細(xì)胞，該測定法檢測到人cd274序列(例如，外顯子3、4和部分外顯子5)的存在，并確認(rèn)小鼠cd274序列(例如，外顯子3、4和部分外顯子5和/或外顯子1、2、6和7)的缺失和/或保留。表4列出了如上所述用于確認(rèn)內(nèi)源小鼠cd274基因的人源化的引物和探針的示例性序列(圖3中示出)。

跨越各個接合區(qū)的核苷酸序列在圖2的示意圖中示出?？缭缴嫌尾迦朦c(diǎn)的核苷酸序列包括以下序列，其表示與插入點(diǎn)下游的人cd274序列鄰接的內(nèi)源小鼠cd274序列(包含在以下括號內(nèi))：

跨越自刪除新霉素盒5’端的核苷酸序列包括以下序列，其表示與插入點(diǎn)下游的盒序列(包含在以下括號內(nèi)，其中nhei限制性位點(diǎn)以斜體表示，并且loxp序列以粗體字表示)鄰接的人cd274序列：

跨越自刪除新霉素盒3’端的核苷酸序列包括以下序列，其表示與插入點(diǎn)下游的人cd274序列鄰接的盒序列(包含在以下括號內(nèi)，其中l(wèi)oxp序列以粗體字表示，并且xhoi限制性位點(diǎn)以斜體表示)：

跨越人cd274序列3’端的核苷酸序列包括以下序列，其表示與小鼠cd274序列(包含在以下括號內(nèi))鄰接的人cd274序列：

在新霉素盒缺失之后跨越插入點(diǎn)的核苷酸序列包括以下序列，其表示與其余盒序列l(wèi)oxp序列(包含在以下括號內(nèi)，其中nhei和xhoi限制性位點(diǎn)以斜體表示，并且loxp序列以粗體字表示)并置的人基因組序列：

然后使用方法將陽性es細(xì)胞克隆植入雌性小鼠(參見例如美國專利no.7,294,754以及poueymirouetal.,2007,naturebiotech.25(1):91-99(poueymirou等人，2007年，《自然生物技術(shù)》，第25卷，第1期，第91-99頁))，從而生成在內(nèi)源小鼠cd274基因中插入有人cd274外顯子3、4和部分人cd274外顯子5的一窩幼仔。使用檢測人cd274基因序列的存在的測定法(valenzuela等人，出處同上)，通過對分離自斷尾的dna進(jìn)行基因分型，再次確認(rèn)并鑒別攜帶內(nèi)源cd274基因的外顯子3、4和部分外顯子5的人源化(即，約8,444bp人dna片段)的小鼠。對幼仔進(jìn)行基因分型，并且選擇對于人源化pdcd1基因構(gòu)建體而言雜合的動物的同齡群進(jìn)行表征。還讓小鼠繁育達(dá)到純合性。

表4

實(shí)例2.人源化pd-l1在活化t細(xì)胞上的表達(dá)

本實(shí)例展示了根據(jù)實(shí)例1修飾而包含人源化cd274基因的非人動物(例如，嚙齒動物)，在活化淋巴細(xì)胞的表面上表達(dá)人源化pd-l1多肽的情況。在本實(shí)例中，取自野生型小鼠以及其基因組含有如實(shí)例1中所述的人源化cd274基因的小鼠的活化t細(xì)胞用商業(yè)抗pd-l1抗體染色，以確定pd-l1在受刺激和未受刺激的t細(xì)胞中的表達(dá)。

簡而言之，從野生型小鼠以及對于如實(shí)例1中所述的內(nèi)源cd274基因而言純合的小鼠收獲脾，并通過機(jī)械解離將其加工成單細(xì)胞懸液。在介質(zhì)(補(bǔ)充有10％fbs的rpmi)中洗滌細(xì)胞，以1×10⁶/ml重懸，然后將200μl(200000個細(xì)胞)接種于96孔板中。用抗cd3和抗cd28抗體(均為1μg/ml)刺激所選孔中的細(xì)胞72小時。使用識別cd3、cd4、cd8和人(克隆mih1，bd生物科學(xué)事業(yè)部(bdbiosciences))或小鼠(克隆10f.9g2，ebioscience)pd-l1的抗體，根據(jù)制造商技術(shù)規(guī)范對細(xì)胞進(jìn)行染色以用于facs。在lsrii流式細(xì)胞儀上運(yùn)行經(jīng)染色的細(xì)胞，并使用flowjo^tm軟件分析數(shù)據(jù)。對cd8⁺t(cd3⁺cd8⁺)和cd4⁺t(cd3⁺cd4⁺)細(xì)胞設(shè)門，并分析這些細(xì)胞的人和小鼠pd-l1的表達(dá)。示例性平均熒光強(qiáng)度值列于表5中。

如表5中所示，攜帶如實(shí)例1中所述的人源化cd274基因的小鼠在活化t細(xì)胞上表達(dá)包含人部分和內(nèi)源部分的pd-l1多肽。人部分可檢測地表達(dá)(通過對全人pd-l1多肽具有反應(yīng)性的抗體進(jìn)行識別)，該抗體不會識別野生型小鼠中的小鼠pd-l1多肽。相比之下，抗小鼠pd-l1抗體克隆10f.9g2展現(xiàn)出在抗cd3/抗cd28刺激之后對野生型小鼠中的小鼠pd-l1的高染色水平，以及人源化pd-l1小鼠中的邊際染色水平。這最可能歸因于與人pd-l1的部分交叉反應(yīng)性。

表5

α-hpd-l1：抗人pd-l1

α-mpd-l1：抗小鼠pd-l1

實(shí)例3.pd-l1調(diào)節(jié)劑的體內(nèi)效能

本實(shí)例展示了根據(jù)實(shí)例1修飾而包含人源化cd274基因的非人動物(例如，嚙齒動物)可用于體內(nèi)測定法，以篩選pd-l1調(diào)節(jié)劑(例如，抗pd-l1抗體)并確定各種特征，例如，降低腫瘤生長和/或殺死腫瘤細(xì)胞。在本實(shí)例中，在對于內(nèi)源cd274基因的人源化(如實(shí)例1中所述)而言純合的、皮下注射了mc38.ova腫瘤細(xì)胞的小鼠中篩選了若干抗pd-l1抗體，以確定促進(jìn)腫瘤消退的最佳抗體劑量和抗pd-l1抗體介導(dǎo)殺死腫瘤細(xì)胞的程度。

簡而言之，將小鼠根據(jù)體重均分為研究1的五個處理或?qū)φ战M(n＝5至8只小鼠/組)或隨機(jī)分配到研究2的七個處理組中(n＝5至6只小鼠)。通過異氟烷吸入麻醉研究1動物，然后向右側(cè)腹部皮下注射100μldmem懸液中的1×10⁶個mc38.ova細(xì)胞(第0天)。mc38.ova(小鼠結(jié)腸癌)細(xì)胞經(jīng)工程改造而表達(dá)雞卵清蛋白，以便增強(qiáng)腫瘤免疫原性并允許監(jiān)測對明確限定的抗原卵清蛋白肽的t細(xì)胞免疫應(yīng)答。還使用在sffv病毒啟動子的控制之下表達(dá)全長人pd-l1的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)mc38.ova細(xì)胞，并且使用對人pd-l1具有特異性的抗體(克隆mih1，bd生物科學(xué)事業(yè)部)，通過流式細(xì)胞術(shù)針對人pd-l1(mc38.ova/hpd-l1)的陽性表達(dá)分選這些細(xì)胞。mc38.ova細(xì)胞還表達(dá)低水平的內(nèi)源小鼠pd-l1。在第3、7、10、14和17天，向研究1處理組腹膜內(nèi)注射500μg的三種抗pd-l1抗體之一或?qū)d-l1沒有特異性的兩種同型對照抗體之一。單組動物不做處理。還向研究2動物皮下植入1×10⁶個mc38.ova/hpd-l1細(xì)胞(第0天)，但是向研究2處理組腹膜內(nèi)施用10mg/kg或5mg/kg劑量的抗pd-l1抗體(aba、abb或abc)或?qū)φ湛贵w(即，對pd-l1沒有特異性)。在第3、7、10、14和17天，向處理組施用抗體。每項(xiàng)研究的實(shí)驗(yàn)劑量和處理方案列于表6中。

表6

對于每項(xiàng)研究而言，通過在實(shí)驗(yàn)持續(xù)時間(研究1持續(xù)17天，研究2持續(xù)21天)內(nèi)每周用卡尺測量來監(jiān)測腫瘤體積，并在每項(xiàng)研究結(jié)束時記錄存活百分比。還在每項(xiàng)研究結(jié)束時記下無腫瘤小鼠的數(shù)量。示例性結(jié)果(表示為平均腫瘤體積(mm³±sd))、存活百分比和無腫瘤小鼠的數(shù)量列于表7和8中。圖4中提供了示例性腫瘤生長曲線。

表7

表8

對于研究1而言，所有三種抗pd-l1抗體在500μg/小鼠下都能有效促進(jìn)腫瘤消退，其中所有來自接受abb和abc的處理組的小鼠在第17天時沒有腫瘤(表7)。在aba處理組中，五只小鼠中有四只(80％)到第17天時沒有腫瘤，而對照組中所有動物都有腫瘤。單因素方差分析及dunnett多重比較事后檢驗(yàn)揭示了用抗pd-l1抗體處理和用對照抗體處理之間腫瘤體積的顯著差異，其中p值<0.05。對照2是無關(guān)的匹配同型對照抗體，而對照1是無關(guān)的不匹配同型對照抗體。

對于研究2而言，所選擇的抗pd-l1抗體的施用使得腫瘤生長受到抑制，從而促進(jìn)腫瘤消退(表8)。所測試的所有抗pd-l1抗體在10mg/kg和5mg/kg下均有效，并且在整個實(shí)驗(yàn)過程中以劑量依賴性方式促進(jìn)經(jīng)處理的小鼠中的腫瘤消退。用對照抗體處理的所有動物都有腫瘤(表8)。單因素方差分析及tukey多重比較事后檢驗(yàn)揭示了用抗pd-l1抗體處理和用對照抗體處理之間腫瘤體積的顯著差異，其中p值<0.05或更低。對照1是無關(guān)的匹配同型對照。

如圖4及表7和8中所示，在具有如實(shí)例1中所述的人源化cd274基因的小鼠中，抗pd-l1抗體顯著抑制了預(yù)防性mc38.ova/hpd-l1腫瘤生長模型中的腫瘤生長。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，10mg/kg和5mg/kg的抗pd-l1抗體療法促進(jìn)了所有小鼠中的腫瘤消退，使得到第21天時，在10mg/kg組中六只小鼠中有三只仍然沒有腫瘤，并且在5mg/kg處理組中五只小鼠中有兩只仍然沒有腫瘤，而對照組中所有動物都有腫瘤(0/6)(圖4)。單因素方差分析及dunnett多重比較事后檢驗(yàn)揭示了第21天時抗pd-l1與對照抗體處理之間腫瘤體積的顯著差異，其中p值<0.01(5mg/kg處理組)及p值<0.0001(10mg/kg處理組)。

在類似的實(shí)驗(yàn)中，通過在用抗pd-l1抗體處理的荷瘤小鼠的脾細(xì)胞中測量cd8⁺和cd3⁺t細(xì)胞應(yīng)答，調(diào)查了含有如實(shí)例1中所述的人源化cd274基因的小鼠中的完整功能性pd-l1信號傳導(dǎo)。

簡而言之，在第21天(上述)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時從用抗pd-l1或?qū)φ湛贵w處理的、含有如實(shí)例1中所述的人源化cd274基因的小鼠分離脾細(xì)胞。分離總rna，并且使用對小鼠cd8b、小鼠cd3ζ(mm00446171_m1，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems))、人pd-l1和小鼠pd-l1具有特異性的寡核苷酸和taqman^tm探針混合物(表9)，對逆轉(zhuǎn)錄的cdna進(jìn)行實(shí)時pcr。樣品相對于小鼠親環(huán)素b的表達(dá)進(jìn)行歸一化。圖5中提供了示例性結(jié)果。

表9

如圖5中所示，抗hpd-l1抗體的施用在含有人源化cd274基因(如實(shí)例1中所述)且荷mc38.ova/hpd-l1腫瘤的小鼠的脾細(xì)胞中引起了cd8⁺和cd3⁺t細(xì)胞的數(shù)量的增加。這確認(rèn)了含有人源化cd274基因(如實(shí)例1中所述)的小鼠通過細(xì)胞表面上的人源化pd-l1展現(xiàn)出正確的表達(dá)和信號傳導(dǎo)，因?yàn)閙c38.ova細(xì)胞的pd-l1表達(dá)無法抑制抗腫瘤cd8⁺t細(xì)胞的增殖?？偟膩碚f，與經(jīng)對照處理的小鼠相比，在兩個處理組中都觀察到所展現(xiàn)的t細(xì)胞的增加，但是使用單因素方差分析及dunnett多重比較事后檢驗(yàn)得出的cd8b(p值<0.01)和cd3(p<0.001)水平的統(tǒng)計差異僅在10mg/kg抗pd-l1抗體和對照處理組之間達(dá)到。

使用為人pd-l1多肽的胞外部分設(shè)計的人特異性探針(表9)測量人pd-l1mrna表達(dá)，并且確認(rèn)了人源化pd-l1蛋白質(zhì)在細(xì)胞表面上的正確表達(dá)(圖5)。另外，使用被設(shè)計成檢測小鼠pd-l1的胞外部分的引物(表9)來測量小鼠pd-l1mrna表達(dá)，結(jié)果未能產(chǎn)生產(chǎn)物。這些數(shù)據(jù)確認(rèn)了表5中給出的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，即，人源化pd-l1小鼠的確表達(dá)了完整的且在細(xì)胞表面上發(fā)揮功能的人源化pd-l1。

綜上所述，本實(shí)例展現(xiàn)出本發(fā)明的非人動物可用于評估靶向pd-l1的藥物(例如，抗體)的體內(nèi)效能，并且此類動物可用于判別抗pd-l1抗體的療效。此外，本文所述的非人動物可用于評估靶向pd-l1的藥物促進(jìn)腫瘤消退和/或介導(dǎo)殺死腫瘤細(xì)胞的程度。本發(fā)明的非人動物(例如，小鼠)展現(xiàn)出功能性人源化pd-l1多肽在細(xì)胞表面上的表達(dá)，以及通過抑制腫瘤模型中的cd8⁺t細(xì)胞的pd-l1依賴性抑制而實(shí)現(xiàn)的免疫應(yīng)答的正確pd-l1調(diào)控。

等同方案

在如此地描述了本發(fā)明的至少一個實(shí)施例的若干方面后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，其將容易想到各種改變、修改和改良。此類改變、修改和改良旨在是本公開內(nèi)容的一部分，且旨在處于本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。因此，前述描述和附圖僅僅作為示例的方式，并且本發(fā)明通過隨后的的權(quán)利要求書進(jìn)行詳細(xì)描述。

在權(quán)利要求中使用序數(shù)術(shù)語如“第一”、“第二”、“第三”等來修飾權(quán)利要求要素，其本身并不意味著一個權(quán)利要求要素相對于另一個要素的任何優(yōu)先性、優(yōu)先級或順序或者其中執(zhí)行方法行為的時間順序，而是僅用作區(qū)分具有某一名稱的一個權(quán)利要求要素與具有同一名稱(但使用序數(shù)術(shù)語)的另一個要素的標(biāo)記，以區(qū)分這些權(quán)利要求要素。

除非明確地指出相反，否則在本文說明書和權(quán)利要求書中使用的冠詞“一個”和“一種”應(yīng)被理解為包括其復(fù)數(shù)指代物。除非指出相反情況或根據(jù)情形明顯不同，否則如果組成員的一個、多于一個或全部存在于、應(yīng)用于或以其他方式相關(guān)于給定的產(chǎn)物或過程，則在該組的一個或多個成員之間包括“或”的權(quán)利要求或描述被認(rèn)為是滿足的。本發(fā)明包括其中組的正好一個成員存在于、應(yīng)用于或以其他方式相關(guān)于給定的產(chǎn)物或過程的實(shí)施例。本發(fā)明還包括其中多于一個或全部組成員存在于、應(yīng)用于或以其他方式相關(guān)于給定的產(chǎn)物或過程的實(shí)施例。此外，應(yīng)當(dāng)理解，除非以其他方式指出或除非對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言很明顯地會產(chǎn)生矛盾或不一致，否則本發(fā)明涵蓋其中將來自一個或多個所列的權(quán)利要求的一個或多個限制、要素、條款、說明性術(shù)語等引入另一項(xiàng)依賴于相同基礎(chǔ)權(quán)利要求(或，如果相關(guān)，任何其他權(quán)利要求)的權(quán)利要求的所有變化、組合和置換。當(dāng)要素被表示為列表(例如，以馬庫什組或類似格式)時，應(yīng)當(dāng)理解，要素的每個亞組也被公開，并且可從組中移除任何要素。應(yīng)當(dāng)理解，一般來講，當(dāng)本發(fā)明或本發(fā)明的方面被稱為包含特定要素、特征等時，本發(fā)明的某些實(shí)施例或本發(fā)明的方面由或基本上由此類要素、特征等組成。為簡單起見，那些實(shí)施例并沒有在每一種情況下都以如此多的語句具體地闡述。還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的任何實(shí)施例或方面可從權(quán)利要求書中明確地排除在外，而不管該特定排除是否于說明書中列明。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可歸屬于本文所述的測定法或其他方法中獲得的值的典型標(biāo)準(zhǔn)偏差或誤差。本文中提及的描述本發(fā)明的背景和提供關(guān)于其實(shí)施的額外細(xì)節(jié)的出版物、網(wǎng)站和其他參考資料據(jù)此以引用方式并入。

序列表

<110>雷杰納榮制藥公司(regeneronpharmaceuticals,inc.)

<120>具有人源化分化簇274基因的非人動物

<130>31971(10133wo01)

<150>62/106,525

<151>2015-01-22

<150>62/089,549

<151>2014-12-09

<160>38

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>3653

<212>dna

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>1

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<210>2

<211>290

<212>prt

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>2

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argalaphethrilethralaprolysaspleutyrvalvalglutyr

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290

<210>3

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<213>智人(homosapiens)

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<210>4

<211>290

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<213>智人(homosapiens)

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245250255

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260265270

glyileglnaspthrasnserlyslysglnseraspthrhisleuglu

275280285

gluthr

290

<210>5

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<212>prt

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202530

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195200205

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225230235240

trpvalleuleuglyserileleuleupheleuilevalvalserthr

245250255

valleuleupheleuarglysglnvalargmetleuaspvalglulys

260265270

cysglyvalgluaspthrserserlysasnargasnaspthrglnphe

275280285

glugluthr

290

<210>7

<211>13440

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>多核苷酸（人源化片段a）

<400>7

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<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>23

ggtcatccttgaagtttagtttagc25

<210>24

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>24

caggacgcaggcgtttac18

<210>25

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>25

ctgcataatcagctacggtggtgcgg26

<210>26

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>26

ttcagcgtgattcgcttgtag21

<210>27

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>27

ctggagtgcccaagagtc18

<210>28

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>28

cagacatggaagaaacacaacccgcac27

<210>29

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>29

ctgctaagccgcttctgtc19

<210>30

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>30

gctctggctggtcttcagtatg22

<210>31

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>31

agcagctctgccctcat17

<210>32

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>32

ttgccgtatggttggtttgaac22

<210>33

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>33

acagcctgctgtcacttgc19

<210>34

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>34

tacgggcgtttactgtcac19

<210>35

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>35

accacatataggtccttgggaac23

<210>36

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>36

ttctcaatgtgaccagcagtc21

<210>37

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>37

agggtcaacgccacagcgaatga23

<210>38

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>38

tcctgttctgtggaggatgtg21