本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種巖黃連愈傷組織高效誘導方法。
背景技術(shù)：
巖黃連,為罌粟科植物巖黃連(Euphorbia pekinensis Rupr.)，多年生常綠草本，根為圓柱狀，長20-30厘米，花期5-8月，果期6-9月。巖黃連廣布于全國(除臺灣、云南、西藏和新疆)，北方尤為普遍，生于山坡、灌叢、路旁、荒地、草叢、林緣和疏林內(nèi)。巖黃連根可入藥，具有較高的藥用價值，具有逐水通便，消腫散結(jié)，主治水腫，并有通經(jīng)之效，用于治療慢性腎炎，治療晚期血吸蟲病腹水或其他肝硬變腹水等癥。近年來其資源遭到了嚴重破壞，且對生長環(huán)境要求苛刻，隨著市場需求量的不斷增加，野生巖黃連資源瀕臨枯竭了，生產(chǎn)上難以實現(xiàn)大面積栽培。如何保護野生巖黃連資源并讓其大量繁殖是目前急需解決的問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是解決野生巖黃連難以大面積繁殖的問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種巖黃連愈傷組織高效誘導方法，取巖黃連外植體經(jīng)洗凈消毒后接種至誘導培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)10-15天得到愈傷組織，所述誘導培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入6-芐基腺嘌呤0.5-1.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.5-1.5mg/L、維生素C 5-20mg/L、活性炭0.1-0.3g/L、蔗糖20-30g/L以及瓊脂3.8-4.5g/L，所述誘導培養(yǎng)基的pH值為6.0。
優(yōu)選的是，將所述愈傷組織接種至增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，所述增殖培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還添加6-芐基腺嘌呤0.1-1.0mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.2-1.0mg/L、維生素C5-20mg/L、活性炭0.1-0.3g/L、蔗糖20-30g/L以及瓊脂3.8-4.5g/L，所述增殖培養(yǎng)基的pH值為5.8。
優(yōu)選的是，所述誘導培養(yǎng)的具體步驟為：將消毒后的所述巖黃連外植體放于溫度為23-26℃下，先暗培養(yǎng)1周后，再置于的光照時間為10-12h/d，光照強度1400-2000lux 的條件下培養(yǎng)3-8天。
優(yōu)選的是，所述增殖培養(yǎng)的條件為：培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強度1400-2000lux，光照強度為10-12h/d。
優(yōu)選的是，所述巖黃連外植體洗凈消毒方法為：取巖黃連外植體依次用2％清洗劑水溶液浸泡5-10min、線狀自來水沖洗5-15min、質(zhì)量濃度為75％乙醇表面消毒30-45s、質(zhì)量濃度為0.1％HgCl2消毒8-10min、無菌水沖洗3-5次，最后用消毒濾紙吸去表面水分，備用。
優(yōu)選的是，所述巖黃連外植體為葉片、葉柄，莖中的一種。
優(yōu)選的是，所述誘導培養(yǎng)基中還加入有水楊酸0.59-0.88mg/L、茉莉酸甲酯0.42-0.79mg/L、精氨酸0.4-1g/L、L-半胱氨酸0.2-0.8g/L以及賴氨酸0.1-0.6g/L。
優(yōu)選的是，所述增殖培養(yǎng)基中還加入油菜素內(nèi)酯0.04-0.08mg/L、硼氫化鉀7-12mg/L、硫酸亞鐵3-6mg/L以及葉酸0.4-0.8mg/L。
本發(fā)明至少包括以下有益效果：
(1)6-芐基腺嘌呤一般在誘導培養(yǎng)基中誘導外植體出芽，本發(fā)明加入2,4-二氯苯氧乙酸，可以協(xié)同6-芐基腺嘌呤加快出芽速度，在愈傷組織增殖過程中，一般用2,4-二氯苯氧乙酸誘導增殖，本發(fā)明在增殖培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤，協(xié)同2,4-二氯苯氧乙酸誘導愈傷組織快速增殖，本發(fā)明可以高效誘導出愈傷組織且能使得愈傷組織快速增殖，從而解決野生巖黃連難以大面積繁殖的問題；
(2)本發(fā)明在誘導培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基中均加入VC，可以防止外植體出芽和愈傷組織發(fā)生褐化；
(3)本發(fā)明在誘導培養(yǎng)基中加入水楊酸，水楊酸不但可以起到殺菌的作用還能促進芽的生長，茉莉酸甲酯可促進外植體在誘導過程中基因的表達，進而加快誘導過程，精氨酸、L-半胱氨酸以及賴氨酸的加入不但為外植體在誘導過程中提供了營養(yǎng)，而且精氨酸可以促進外植體細胞分裂，L-半胱氨酸是一種還原劑，可以進一步防止組織褐化，賴氨酸能夠促進芽的生長發(fā)育，加快愈傷組織的形成；
(4)本發(fā)明在增殖培養(yǎng)基中添加油菜素內(nèi)酯、硼氫化鉀、硫酸亞鐵以及葉酸，油菜素內(nèi)酯能夠激發(fā)愈傷組織的潛能，使得愈傷組織繁殖高效高速，硼氫化鉀、硫酸亞鐵均為還原劑，能夠進一步防止愈傷組織褐化，且硼氫化鉀、硫酸亞鐵能為愈傷組織提供硼、鉀 以及鐵元素，這三者在愈傷組織生長過程中能為愈傷組織提供營養(yǎng)，葉酸是一種營養(yǎng)素，其能加快愈傷組織生長。
本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
具體實施方式
下面對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。
需要說明的是，下述實施方案中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
實施例1
(1)外植體的選擇與消毒：取巖黃連葉片作為外植體，依次用2％洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水沖洗5min、75％乙醇中表面消毒45s、0.1％HgCl2消毒9min、無菌水沖洗5次，最后用消毒濾紙吸去表面水分，得到葉片外植體；
(2)外植體誘導獲得愈傷組織：將步驟(1)得到的葉片外植體接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入激素6-芐基腺嘌呤1.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1mg/L、VC20mg/L、活性炭0.2g/L、蔗糖30g/L以及瓊脂4.5g/L，調(diào)節(jié)誘導培養(yǎng)基的pH值為6.0，培養(yǎng)溫度為25℃，將葉片外植體先暗培養(yǎng)1周后再光照培養(yǎng)，光照培養(yǎng)的光照強度為1400-2000lux，光照時間為12h/d，黑暗培養(yǎng)12h/d，培養(yǎng)10d后開始萌發(fā)，14d開始形成愈傷組織；
(3)愈傷組織增殖培養(yǎng)：將步驟(2)中得到的愈傷組織置于增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)30d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為1400-2000lux，光照時間為12h/d，黑暗培養(yǎng)12h/d，增殖培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還添加激素6-芐基腺嘌呤0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.2mg/L、VC5mg/L、活性炭0.3g/L、蔗糖30g/L以及瓊脂4.5g/L，調(diào)節(jié)增殖培養(yǎng)基的pH值為5.8。
實施例2
(1)外植體的選擇與消毒：取巖黃連葉柄作為外植體，依次用2％洗潔精水溶液浸泡10min、線狀自來水沖洗15min、75％乙醇中表面消毒30s、0.1％HgCl2消毒8min、無菌水沖洗3次，最后用消毒濾紙吸去表面水分，得到葉柄外植體；
(2)外植體誘導獲得愈傷組織：將步驟(1)得到的葉柄外植體接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入激素6-芐基腺嘌呤1.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L、VC5mg/L、活性炭0.3g/、蔗糖20g/L以及瓊脂3.8g/L，調(diào)節(jié)誘導培養(yǎng)基的pH值為6.0，培養(yǎng)溫度為23℃，將葉柄外植體先暗培養(yǎng)1周后再光照培養(yǎng)，光照培養(yǎng)的光照強度為1400-2000lux，光照時間為10h/d，黑暗培養(yǎng)14h/d，培養(yǎng)10d后開始萌發(fā)，14d開始形成愈傷組織；
(3)愈傷組織增殖培養(yǎng)：將步驟(2)中得到的愈傷組織置于增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)30d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為1400-2000lux，光照時間為10h/d，黑暗培養(yǎng)14h/d，增殖培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還添加激素6-芐基腺嘌呤1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1mg/L、VC20mg/L、活性炭0.1g/L、蔗糖28g/L以及瓊脂4g/L，調(diào)節(jié)增殖培養(yǎng)基的pH值為5.8。
實施例3
(1)外植體的選擇與消毒：取巖黃連莖作為外植體，依次用2％洗潔精水溶液浸泡7min、線狀自來水沖洗10min、75％乙醇中表面消毒40s、0.1％HgCl2消毒10min、無菌水沖洗4次，最后用消毒濾紙吸去表面水分，得到莖外植體；
(2)外植體誘導獲得愈傷組織：將步驟(1)得到的莖外植體接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入激素6-芐基腺嘌呤0.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L、VC10mg/L、活性炭0.1g/L、蔗糖27g/L以及瓊脂4.1g/L，調(diào)節(jié)誘導培養(yǎng)基的pH值為6.0，培養(yǎng)溫度為26℃，將莖外植體先暗培養(yǎng)1周后再光照培養(yǎng)，光照培養(yǎng)的光照強度為1400-2000lux，光照時間為11h/d，黑暗培養(yǎng)13h/d，培養(yǎng)10d后開始萌發(fā)，15d開始形成愈傷組織；
(3)愈傷組織增殖培養(yǎng)：將步驟(2)中得到的愈傷組織置于增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)30d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為1400-2000lux，光照時間為10h/d，黑暗培養(yǎng)14h/d，增殖培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還添加激素6-芐基腺嘌呤0.7mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.8mg/L、VC12mg/L、活性炭0.2g/L、蔗糖20g/L以及瓊脂3.8g/L，調(diào)節(jié)增殖培養(yǎng)基的pH值為5.8。
實施例4
(1)外植體的選擇與消毒：取巖黃連葉片作為外植體，依次用2％洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水沖洗5min、75％乙醇中表面消毒45s、0.1％HgCl2消毒9min、無菌 水沖洗5次，最后用消毒濾紙吸去表面水分，得到葉片外植體；
(2)外植體誘導獲得愈傷組織：將步驟(1)得到的葉片外植體接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入激素6-芐基腺嘌呤1.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1mg/L、VC20mg/L、水楊酸0.88mg/L、茉莉酸甲酯0.79mg/L以及精氨酸0.4g/L，L-半胱氨酸0.8g/L，賴氨酸0.1g/L、活性炭0.2g/L、蔗糖30g/L以及瓊脂4.5g/L，調(diào)節(jié)誘導培養(yǎng)基的pH值為6.0，培養(yǎng)溫度為25℃，將葉片外植體先暗培養(yǎng)1周后再光照培養(yǎng)，光照培養(yǎng)的光照強度為1400-2000lux，光照時間為12h/d，黑暗培養(yǎng)12h/d，培養(yǎng)10d后開始萌發(fā)，14d開始形成愈傷組織；
(3)愈傷組織增殖培養(yǎng)：將步驟(2)中得到的愈傷組織置于增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)30d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為1400-2000lux，光照時間為12h/d，黑暗培養(yǎng)12h/d，增殖培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還添加激素6-芐基腺嘌呤0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.2mg/L、VC5mg/L，油菜素內(nèi)酯0.08mg/L、硼氫化鉀12mg/L、硫酸亞鐵6mg/L、葉酸0.8mg/L、活性炭0.3g/L、蔗糖30g/L以及瓊脂4.5g/L，調(diào)節(jié)增殖培養(yǎng)基的pH值為5.8。
實施例5
(1)外植體的選擇與消毒：取巖黃連葉柄作為外植體，依次用2％洗潔精水溶液浸泡10min、線狀自來水沖洗15min、75％乙醇中表面消毒30s、0.1％HgCl2消毒8min、無菌水沖洗3次，最后用消毒濾紙吸去表面水分，得到葉柄外植體；
(2)外植體誘導獲得愈傷組織：將步驟(1)得到的葉柄外植體接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入激素6-芐基腺嘌呤1.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L、VC5mg/L、水楊酸0.59mg/L、茉莉酸甲酯0.42mg/L、精氨酸1g/L、L-半胱氨酸0.8g/L以及賴氨酸0.3g/L、活性炭0.3g/L、蔗糖20g/L以及瓊脂3.8g/L，調(diào)節(jié)誘導培養(yǎng)基的pH值為6.0，培養(yǎng)溫度為23℃，將葉柄外植體先暗培養(yǎng)1周后再光照培養(yǎng)，光照培養(yǎng)的光照強度為1400-2000lux，光照時間為10h/d，黑暗培養(yǎng)14h/d，培養(yǎng)10d后開始萌發(fā)，14d開始形成愈傷組織；
(3)愈傷組織增殖培養(yǎng)：將步驟(2)中得到的愈傷組織置于增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)30d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為1400-2000lux，光照時間為10h/d，黑暗培養(yǎng)14h/d，增殖培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還添加激素6-芐基腺嘌呤1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1mg/L、VC20mg/L、油菜素內(nèi)酯0.04mg/L、硼氫化鉀7mg/L、硫酸亞鐵3mg/L、 葉酸0.4mg/L、活性炭0.1g/L、蔗糖28g/L以及瓊脂4g/L，調(diào)節(jié)增殖培養(yǎng)基的pH值為5.8。
實施例6
(1)外植體的選擇與消毒：取巖黃連莖作為外植體，依次用2％洗潔精水溶液浸泡7min、線狀自來水沖洗10min、75％乙醇中表面消毒40s、0.1％HgCl2消毒10min、無菌水沖洗4次，最后用消毒濾紙吸去表面水分，得到莖外植體；
(2)外植體誘導獲得愈傷組織：將步驟(1)得到的莖外植體接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入激素6-芐基腺嘌呤0.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L、VC10mg/L、水楊酸0.66mg/L、茉莉酸甲酯0.61mg/L、精氨酸0.7g/L、L-半胱氨酸0.4g/L、賴氨酸0.6g/L、活性炭0.1g/L、蔗糖27g/L以及瓊脂4.1g/L，調(diào)節(jié)誘導培養(yǎng)基的pH值為6.0，培養(yǎng)溫度為26℃，將莖外植體先暗培養(yǎng)1周后再光照培養(yǎng)，光照培養(yǎng)的光照強度為1400-2000lux，光照時間為11h/d，黑暗培養(yǎng)13h/d，培養(yǎng)10d后開始萌發(fā)，15d開始形成愈傷組織；
(3)愈傷組織增殖培養(yǎng)：將步驟(2)中得到的愈傷組織置于增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)30d，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為1400-2000lux，光照時間為10h/d，黑暗培養(yǎng)14h/d，增殖培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還添加激素6-芐基腺嘌呤0.7mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.8mg/L、VC12mg/L、油菜素內(nèi)酯0.06mg/L、硼氫化鉀9mg/L、硫酸亞鐵5mg/L、葉酸0.5mg/L、活性炭0.2g/L、蔗糖20g/L以及瓊脂3.8g/L，調(diào)節(jié)增殖培養(yǎng)基的pH值為5.8。
為了說明本發(fā)明的效果，本申請人取對照組與實施例1和實施例4進行對比，對照組由如下步驟得到：取巖黃連葉片外植體清洗消毒放于誘導培養(yǎng)基中于25℃下培養(yǎng)，該誘導培養(yǎng)基以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入激素6-芐基腺嘌呤1.1mg/L、活性炭0.2g/L、蔗糖30g/L以及瓊脂4.5g/L，調(diào)節(jié)誘導培養(yǎng)基的pH值為5.8，取三組該誘導培養(yǎng)基，每組培養(yǎng)基上接種20個葉片外植體，將葉片外植體先暗培養(yǎng)1周后再光照培養(yǎng)，光照培養(yǎng)的光照強度為1400-2000lux，光照時間為12h/d，黑暗培養(yǎng)12h/d，培養(yǎng)14d得到愈傷組織，計算三組誘導愈傷組織的誘導率的平均值，并計算三組誘導培養(yǎng)基上外植體的褐化率的平均值；再將愈傷組織放于增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度為1400-2000lux，光照時間為12h/d，黑暗培養(yǎng)12h/d，增殖培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還添加激素2,4-二氯苯氧乙酸0.2mg/L、活性炭0.3g/L、蔗糖30g/L以及瓊脂4.5g/L， 調(diào)節(jié)增殖培養(yǎng)基的pH值為5.8，愈傷組織在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d，計算三組增殖倍數(shù)的平均值，并計算三組增殖培養(yǎng)基上愈傷組織的褐化率的平均值；
實施例1、實施例2以及實施例3分別取三組上述誘導培養(yǎng)基，每組培養(yǎng)基上接種20個葉片外植體，在步驟2的誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d，計算三組誘導愈傷組織的誘導率的平均值，并計算三組誘導培養(yǎng)基上外植體的褐化率的平均值，實施例1、實施例2以及實施例3在步驟3中將愈傷組織在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d，計算三組增殖倍數(shù)的平均值，并計算三組誘導培養(yǎng)基上外植體的褐化率的平均值；實施例4、實施例5以及實施例6分別取三組上述誘導培養(yǎng)基，每組培養(yǎng)基上接種20個葉片外植體，在步驟2的誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d，計算三組誘導愈傷組織的誘導率的平均值，并計算三組誘導培養(yǎng)基置于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d，計算三組增殖倍數(shù)的平均值，并計算三組增殖培養(yǎng)基上愈傷組織的褐化率的平均值；得到具體數(shù)據(jù)如表1所示：
表1 各試驗組誘導率和褐化率表
由表1可以看出，對照組的誘導率在50％左右，有一半的葉片外植體不能有效誘導出愈傷組織，愈傷組織移植到增殖培養(yǎng)基中增殖的倍數(shù)也僅在1.78，而實施例1的葉片外植體經(jīng)過改進，其誘導率上升至90.8％，增殖倍數(shù)也上升至3.16，因此可以看出激素6-芐基腺嘌呤和2,4-二氯苯氧乙酸的協(xié)同作用明顯，可以有效地提高誘導率；實施例4的葉片外植體是在實施例1的基礎(chǔ)上進一步改進，在誘導培養(yǎng)基中加入了水楊酸、茉莉酸甲酯、精氨酸、L-半胱氨酸以及賴氨酸，在增殖培養(yǎng)基中加入了油菜素內(nèi)酯和葉酸，實施例4的誘導率高達95.7％，增殖倍數(shù)高達3.95，由此可見，實施例4的方法可以高效誘導愈傷組織 并使愈傷組織增殖。對照組中葉片外植體褐化率為58.9％，愈傷組織的褐化率為60.2％，可見不采取任何防褐化處理，葉片外植體和愈傷組織的褐化嚴重；實施例1中加入VC，可以明顯的降低葉片外植體和愈傷組織的褐化率，由于VC的存在實施例1中葉片外植體褐化率降低至10.3％，愈傷組織的褐化率降低至11.4％；由于加入了L-半胱氨酸和硼氫化鉀、硫酸亞鐵，實施例4中的葉片外植體褐化率和愈傷組織的褐化率分別降低至3.1％和1.9％，由此可見，實施例4中采取的措施對降低葉片外植體和愈傷組織的褐化率是顯著有效的。
實施例2和實施例3的葉柄和莖的誘導率和增殖倍數(shù)也分別在90％和3倍以上，實施例5和實施例6的葉柄和莖的誘導率和增殖倍數(shù)分別在95％和3.9倍以上，因此本發(fā)明對于提高葉柄外植體和莖外植體都是行之有效的
盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的實施例。