本發(fā)明涉及一種利用沙冬青幼嫩側(cè)根誘導(dǎo)沙冬青愈傷組織形成的方法。

背景技術(shù)：

沙冬青屬于豆科沙冬青屬，其作為一種超旱生沙漠常綠灌木，能適宜沙漠各種極端環(huán)境(干旱、高溫、低溫和風(fēng)蝕等)，同時又是第三紀(jì)古老的殘遺種，屬于瀕危物種，所以沙冬青是帶有較好抗逆有益基因資源植物，并同時具有基因和植物生物學(xué)性狀遺傳進化研究價值。前人只是開展了大量關(guān)于其自然保護、群落分布、生物學(xué)特性及遺傳背景分析等研究工作，直到近期，有部分的研究報道是關(guān)于沙冬青的基因克隆與轉(zhuǎn)錄組測序分析工作，其研究目標(biāo)也是在于發(fā)掘沙冬青所蘊藏的寶貴抗逆基因資源及其抗逆機制，以解決當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和氣候變化問題。

但由于沙冬青生長周期長，種子結(jié)實率和發(fā)芽率低，同時易遭受蟲害，所以沙冬青繁殖能力弱；其成熟組織較老化，發(fā)芽后的幼苗生長后期也易于老化及木質(zhì)化均不利于DNA和RNA提取等，而且科研人員無法在室內(nèi)種植繁育沙冬青，必須每年采摘大量新種子開展科研，這在很大程度上限制了分子生物技術(shù)在沙冬青的基因克隆與功能研究方面的應(yīng)用。目前還沒有關(guān)于沙冬青組織培養(yǎng)和愈傷誘導(dǎo)的專利報道，僅有部分中文期刊有少量有關(guān)沙冬青愈傷組織誘導(dǎo)的報道，但誘導(dǎo)效率偏低且不穩(wěn)定(3％～80％)，方法可重復(fù)性差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用沙冬青幼嫩側(cè)根誘導(dǎo)沙冬青愈傷組織形成的方法，簡便、高效、低成本和穩(wěn)定地獲得沙冬青愈傷組織。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種利用沙冬青幼嫩側(cè)根誘導(dǎo)沙冬青愈傷組織形成的方法，包括以下步驟：a.利用沙冬青種子進行無菌育苗，通過1/2MS培養(yǎng)基不斷誘導(dǎo)帶根毛的側(cè)根形成；b.然后剪取幼嫩的毛狀側(cè)根作為外植體，在暗處于CDB1 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織，并在光下或暗處于CDB6-2培養(yǎng)基上繼代和擴繁所誘導(dǎo)出的愈傷組織。

進一步地：

在含有1/2MS固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中使種子發(fā)芽，然后轉(zhuǎn)至裝有1/2MS培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)瓶中誘導(dǎo)幼苗，待幼苗長出許多側(cè)根后，移栽到新的裝有1/2MS培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)瓶中，使部分側(cè)根露在培養(yǎng)基表面，誘導(dǎo)側(cè)根形成大量帶有根毛的短側(cè)根。

步驟a中利用沙冬青種子進行無菌育苗的過程包括：

(1)挑選成熟度好、外形完好、未被蟲子吃過的沙冬青種子，裝到已滅菌、密閉的瓶或管中；

(2)在瓶或管中，先用75％乙醇消毒沙冬青種子10min；

(3)去除乙醇，然后用6％次氯酸鈉消毒沙冬青種子30min；

(4)去除次氯酸鈉，用無菌水清洗滅菌種子5～6次；

(5)去除無菌水，稍微瀝干水分，即可轉(zhuǎn)接種子到含有固體1/2MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；

(6)在22℃～28℃條件下培養(yǎng)2～5天，使種子發(fā)芽。

步驟a中通過1/2MS培養(yǎng)基不斷誘導(dǎo)帶根毛的側(cè)根形成的過程包括：

(1)挑選發(fā)芽勢好的種子轉(zhuǎn)接到裝有固體1/2MS培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)瓶中，以利于發(fā)芽種子的生長；

(2)當(dāng)沙冬青幼苗長出多條側(cè)根后，開展第二次轉(zhuǎn)接，將生長健壯的幼苗移栽到新的裝有固體1/2MS培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)瓶中，并露出部分側(cè)根在培養(yǎng)基表面；

(3)生長20～40天后，露在培養(yǎng)基表面的側(cè)根會長出許多帶有根毛的短側(cè)根，以此作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體材料。

步驟b中在暗處于CDB1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織的過程包括：

在無菌條件下，剪取部分毛狀側(cè)根置于CDB1培養(yǎng)基上，在暗處28℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)20～35天，其中CDB1培養(yǎng)基成分為：MS+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L 6-BA，pH5.8～7.5。

步驟b中在光下或暗處于CDB6-2培養(yǎng)基上繼代和擴繁所誘導(dǎo)出的愈傷組織的過程包括：

將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接到CDB6-2培養(yǎng)基上，在28℃有光條件或暗處下培養(yǎng)，每隔10～15天繼代一次，其中CDB6-2培養(yǎng)基成分為：MS+0.2 mg/L IBA+0.1mg/L KT+0.5mg/L GA3，pH5.8～7.5。

本發(fā)明的有益效果：

利用本發(fā)明形成沙冬青愈傷組織，可以開展沙冬青DNA和RNA提取，進行基因組測序或基因克隆與功能研究等分子生物學(xué)研究，而不需要再額外采種育苗，因而可以降低研究成本，提高研究效率，同時保護原生地國家瀕危植物沙冬青的種群。

本發(fā)明的優(yōu)勢具體體現(xiàn)在以下方面：

(1)沙冬青無菌育苗長出許多側(cè)根后，通過無菌條件再移栽，并留部分根系露在1/2MS無菌培養(yǎng)基表面，可以誘導(dǎo)其側(cè)根上再長出許多帶根毛的短側(cè)根，剪取幼嫩的毛狀側(cè)根即可作為沙冬青愈傷組織培養(yǎng)的外植體材料。該取材方法不會影響無菌瓶中該單株的正常生長，又能長期獲得幼嫩的外植體材料，供后續(xù)愈傷組織誘導(dǎo)之用。

(2)幼嫩的毛狀側(cè)根易于誘導(dǎo)愈傷形成(誘導(dǎo)率≥80％)，愈傷誘導(dǎo)穩(wěn)定，而且無需再采種育苗。

(3)本發(fā)明僅需要在暗處用CDB1培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷，再轉(zhuǎn)到光下或暗處用CBD6-2培養(yǎng)基將愈傷組織繼代與擴繁培養(yǎng)，步驟簡單。

(4)可獲得大量無菌、均一、穩(wěn)定的沙冬青愈傷組織，供沙冬青分子生物學(xué)研究(如基因克隆與功能研究)之用，無需再去野外采種或育苗。

(5)沙冬青愈傷組織可用于DNA或RNA提取，用于有益基因資源發(fā)掘。

(6)如果愈傷組織能再生成苗，可以實現(xiàn)沙冬青的分子遺傳改良，獲得繁殖力強、抗逆性強的沙冬青，實現(xiàn)沙冬青種質(zhì)的保護，和用于防風(fēng)固沙、園林綠化等。

附圖說明

圖1為沙冬青滅菌種子接種在1/2MS培養(yǎng)基的實驗樣本示意圖；

圖2為沙冬青種子在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽5天表型的實驗樣本示意圖；

圖3為無菌培育的帶根毛短側(cè)根沙冬青幼苗(35天)的實驗樣本示意圖；

圖4為帶根毛側(cè)根在CDB1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織(20天)的實驗樣本示意圖；

圖5為沙冬青愈傷組織在CDB6-2培養(yǎng)基上繼代與擴繁的實驗樣本示意圖(光照培養(yǎng))。

圖6為沙冬青愈傷組織在CDB6-2培養(yǎng)基上繼代與擴繁的實驗樣本示意圖(暗培養(yǎng))。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的實施方式作詳細說明。應(yīng)該強調(diào)的是，下述說明僅僅是示例性的，而不是為了限制本發(fā)明的范圍及其應(yīng)用。

在一種實施例中，一種利用沙冬青幼嫩側(cè)根誘導(dǎo)沙冬青愈傷組織形成的方法，包括以下步驟：a.利用少量沙冬青種子進行無菌育苗，通過1/2MS培養(yǎng)基不斷誘導(dǎo)帶根毛的側(cè)根形成；b.然后剪取幼嫩的毛狀側(cè)根作為外植體，在暗處于CDB1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織，并在光下或暗處于CDB6-2培養(yǎng)基上繼代和擴繁所誘導(dǎo)出的愈傷組織。

在優(yōu)選的實施例中，步驟a包括：通過無菌育苗，在含有1/2MS固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中使種子發(fā)芽，然后轉(zhuǎn)至裝有1/2MS培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)瓶中誘導(dǎo)幼苗，待幼苗長出許多側(cè)根后，移栽到新的裝有1/2MS培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)瓶中，使部分側(cè)根露在培養(yǎng)基表面，誘導(dǎo)側(cè)根形成大量帶有根毛的短側(cè)根。步驟b中，將此帶根毛短側(cè)根作為幼嫩外植體，在CDB1培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織和在CDB6-2培養(yǎng)基上繼代與擴繁，從而獲得大量均一的沙冬青愈傷組織，供開展沙冬青后續(xù)相關(guān)研究之用。優(yōu)選地，在暗處用CDB1(MS+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L 6-BA，pH5.8～7.5)培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織形成，然后在光下或暗處用CBD6-2(MS+0.2mg/L IBA+0.1mg/L KT+0.5mg/L GA3，pH5.8～7.5)培養(yǎng)基進行愈傷組織的繼代與擴繁培養(yǎng)。

在優(yōu)選的實施例中，沙冬青無菌育苗過程具體包括以下步驟：

(1)挑選成熟度好、外形完好、未被蟲子吃過的沙冬青種子，裝到已滅菌、密閉的瓶或管中；

(2)在瓶或管中，先用75％乙醇消毒沙冬青種子10min；

(3)倒掉75％乙醇，然后用6％次氯酸鈉消毒沙冬青種子30min；

(4)倒掉6％次氯酸鈉，用無菌水清洗滅菌種子5～6次；

(5)倒掉無菌水，稍微瀝干水分，即可轉(zhuǎn)接種子到含有固體1/2MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；

(6)在22℃～28℃條件下培養(yǎng)2～5天，使種子發(fā)芽。

在優(yōu)選的實施例中，沙冬青毛狀側(cè)根誘導(dǎo)過程具體包括以下步驟：

(1)沙冬青種子發(fā)芽后，挑選發(fā)芽勢好的種子轉(zhuǎn)接到裝有固體1/2MS培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)瓶中，以利于發(fā)芽種子的生長；

(2)當(dāng)沙冬青幼苗長出多條側(cè)根后，可以開展第二次轉(zhuǎn)接，將生長健壯的幼苗移栽到新的裝有固體1/2MS培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)瓶中，并露出部分 側(cè)根在培養(yǎng)基表面；

(3)生長20～40天后，露在培養(yǎng)基表面的側(cè)根會長出許多帶有根毛的短側(cè)根，以此作為誘導(dǎo)愈傷的外植體材料。

在優(yōu)選的實施例中，沙冬青愈傷組織誘導(dǎo)過程具體包括以下步驟：

在無菌條件下，剪取部分毛狀側(cè)根置于CDB1(MS+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L 6-BA，pH5.8～7.5)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在暗處28℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)20～35天。

在優(yōu)選的實施例中，沙冬青愈傷組織繼代與擴繁過程具體包括以下步驟：

將誘導(dǎo)出的愈傷組織再轉(zhuǎn)接到CDB6-2(MS+0.2mg/L IBA+0.1mg/L KT+0.5mg/L GA3，pH5.8～7.5)愈傷組織繼代與擴繁培養(yǎng)基上，在28℃有光或暗處條件下培養(yǎng)，每隔10～15天繼代一次。

實例

(1)挑選外形完好，未被蟲吃過的沙冬青種子，裝到50mL已滅菌離心管中；

(2)在無菌操作臺上，先加入40mL 75％乙醇消毒沙冬青種子10min，期間不時振蕩；

(3)倒掉75％乙醇，然后用40mL高樂氏漂白水(含6.25％次氯酸鈉活性)消毒沙冬青種子30min，期間不時振蕩；

(4)倒掉高樂氏漂白水，用無菌水清洗滅菌種子5～6次；

(5)倒掉無菌水，在無菌操作臺上，用滅菌的鑷子，從離心管中取出種子直接接種到含有固體1/2MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(90×15mm)中(如圖1所示)；

注：1/2MS培養(yǎng)基，2.22g/L MS(含Gamborg's vitamins)(Sigma)；2g/100mL Sucrose(Caisson)；8g/L phytoblend(Caisson)，用1M KOH調(diào)pH至5.7；

(6)22℃光照培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3天，使種子發(fā)芽；

(7)沙冬青種子發(fā)芽后，挑選發(fā)芽整齊的種子(如圖2所示)轉(zhuǎn)接到裝有固體1/2MS培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)瓶中，以利于發(fā)芽種子的生長；

(8)當(dāng)沙冬青幼苗長出多條側(cè)根后，可以開展第二次轉(zhuǎn)接，將生長健壯的幼苗移栽到新的裝有固體1/2MS培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)瓶中，并露出部分側(cè)根在培養(yǎng)基表面；

(9)35天后，露在培養(yǎng)基表面的側(cè)根會長出許多帶有根毛的短側(cè)根(如圖3所示)，以此作為愈傷誘導(dǎo)的外植體材料；

(10)在無菌操作臺上，剪取部分毛狀側(cè)根于CDB1(MS+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/L 6-BA，pH5.8～7.5)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在暗處28℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)20天，誘導(dǎo)出的愈傷組織如圖4所示；

(11)將誘導(dǎo)出的愈傷組織再轉(zhuǎn)接到CDB6-2(MS+0.2mg/L IBA+0.1mg/L KT+0.5mg/L GA3，pH5.8～7.5)愈傷組織繼代與擴繁培養(yǎng)基上，在28℃有光條件(或暗處)下愈傷組織擴繁，每隔15天繼代一次，擴繁的愈傷組織如圖5(光照培養(yǎng)，20天，培養(yǎng)基pH5.8)，圖6(暗培養(yǎng)，40天，左圖pH7.5，右圖pH5.8)所示。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體/優(yōu)選的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，其還可以對這些已描述的實施方式做出若干替代或變型，而這些替代或變型方式都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。