專利名稱：一種暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法，屬于低溫生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
暗色唇魚Semilabeo obscurus Lin,隸屬于鯉科(Cyprinidae)野駿亞科(Labeoninae)唇魚屬(SemiIabeo)。由于該魚體肥、肉嫩、味美,成了捕撈的首選目標(biāo)。又因其具有群居巖洞的生活習(xí)性，便成為不法分子電、毒、炸的最大受害者，隨著魚類資源的利用強(qiáng)度加大和捕撈技術(shù)的更新，魚類生物多樣性呈下降趨勢(shì)，暗色唇魚已成為李仙江流域珍稀瀕危物種。且暗色唇魚1989年被列入云南省II級(jí)保護(hù)動(dòng)物，1998年被列入《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書》。為了保護(hù)、開發(fā)利用這ー珍稀的土著魚類資源，2007年由云南省環(huán)保局批準(zhǔn)立項(xiàng)，云南大唐國(guó)際李仙江流域水電開發(fā)有限公司委托中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所開展了暗色唇魚的人工増殖放流研究。而開展暗色唇魚的精子冷凍保存研究，建立精子庫(kù)，長(zhǎng) 期保存精子，是種質(zhì)資源保護(hù)與保存的有效途徑之一，也能為遺傳育種提供優(yōu)良種質(zhì)材料。自從1949年首次用甘油作為抗凍劑冷凍成功保存精子以來，精子低溫冷凍保存的研究取得了很大進(jìn)展，并逐漸發(fā)展成為物種遷地保護(hù)和遺傳種質(zhì)資源保存的ー個(gè)重要手段。在魚類塘養(yǎng)種群遺傳管理實(shí)踐中，精子低溫和超低溫冷凍保存能有效地“延長(zhǎng)”繁殖個(gè)體的繁殖壽命，并在塘養(yǎng)種群的世代數(shù)最小化方面顯示出很廣泛的應(yīng)用潛力，但該技術(shù)僅在一小部分動(dòng)物物種中使用。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見與本發(fā)明的相同報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供ー種方法簡(jiǎn)單、操作性強(qiáng)的暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法。本發(fā)明的暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法，其具體步驟如下a.配子的采集采精方法為輕壓腹部法，選擇形態(tài)正常、生長(zhǎng)良好、無疾病、達(dá)到性成熟的親魚原種或良種，用100 ppm的MS-222麻醉5 min，魚類腹部用毛巾擦干，然后輕輕擠壓腹部，成熟的精液自然流出到5 mL離心管中；b.鮮精活力檢測(cè)先用移液器滴一滴水于載玻片上，對(duì)準(zhǔn)視野，然后用針尖挑取上述精液立即于顯微鏡下攪拌，觀察其活力，鮮精活力在85%以上的精液樣品用于精子冷凍；c.冷凍方法將精液與抗凍液按常規(guī)三步稀釋法稀釋至精子終密度為2. 5 X IO8個(gè)/mL后分裝入I. 8 mL凍存管中，經(jīng)4°C平衡30 min，然后在液氮面上方6 cm處平衡10min，液氮面上平衡5 min后投入液氮中保存；其中抗凍液為稀釋液D_15+5%甲醇。使用時(shí)將保存的精子在40°C水浴中解凍，然后按照常規(guī)方法進(jìn)行人工授精。本發(fā)明的各步驟中所用的百分比為體積百分比。本發(fā)明具有成本低，操作簡(jiǎn)便，保存時(shí)間長(zhǎng)，復(fù)蘇后精子的活力較高，人工繁殖的暗色唇魚的受精率和孵化率較高，能投入規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)；對(duì)于開展魚類資源恢復(fù)與重建也具有重要意義。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法，其具體步驟如下I、配子的采集采精方法為輕壓腹部法，選擇性成熟的優(yōu)良親魚，用100 ppm的MS-222 (Tricaine, C10H15NO3S)麻醉5 min，魚類腹部用毛巾擦干，然后輕輕擠壓腹部，成熟的精液自然流出到5 mL離心管中；2、鮮精活力檢測(cè)先用移液器滴一滴水于載玻片上，對(duì)準(zhǔn)視野，然后用針尖挑取上述精液立即于顯微鏡下攪拌，觀察其活力，鮮精活力在85%以上的精液樣品用于精子冷凍；3、冷凍方法將精液與抗凍液按三步稀釋法稀釋至精子終密度為2. 5 X IO8個(gè)/mL后分裝入I. 8 mL凍存管中，經(jīng)4°C平衡30 min，然后在液氮面上方6 cm處平衡10 min，液氮面上平衡5 min后投入液氮中保存；抗凍液是以稀釋液D-15 (0. 8% NaCUO. 05% KC1、1. 5%Glucose)為基礎(chǔ)液，其中加入5%甲醇。 4、鮮精壽命檢測(cè)即精子從被激活至視野中90%以上的精子基本不動(dòng)為止所持續(xù)的時(shí)間；5、細(xì)胞膜完整率檢測(cè)精液稀釋100倍后，用0. 4%臺(tái)盼藍(lán)染色3 min ;細(xì)胞膜破損的精子頭部被染成藍(lán)色，而細(xì)胞膜完整的精子頭部不被染色；顯微鏡下計(jì)算未染色的精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比；使用時(shí)將凍存管從液氮中取出后迅速置于40°C水浴鍋中快速晃動(dòng)30 S，然后進(jìn)行人工授精，即將暗色唇魚魚卵擠入容器中，按IO5 1的精卵數(shù)量比例加入解凍后的精液，拌勻，再滴加0. 2 ml激活液，攪拌，使卵受精。應(yīng)用結(jié)果表明在鮮精活力為86. 17±4. 06%，壽命為47. 5±3. I S，細(xì)胞膜完整率為86. 22±5. 29% ;通過上述冷凍方法，暗色唇魚的精液在超低溫下能夠保存一年；通過上述凍精解凍方法，復(fù)蘇后凍精的精子活力為76. 33±1. 70%，精子壽命為44. 3±3. 6 S，細(xì)胞膜完整率為85. 67± I. 11%，受精率達(dá)85%以上。
權(quán)利要求
1.ー種暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法，其特征在于該保存方法的具體步驟如下 a.配子的采集采精方法為輕壓腹部法，選擇形態(tài)正常、生長(zhǎng)良好、無疾病、達(dá)到性成熟的親魚原種或良種，用100 ppm的MS-222麻醉5 min，魚類腹部用毛巾擦干，然后輕輕擠壓腹部，成熟的精液自然流出到5 mL離心管中； b.鮮精活力檢測(cè)先用移液器滴一滴水于載玻片上，對(duì)準(zhǔn)視野，然后用針尖挑取上述精液立即于顯微鏡下攪拌，觀察其活力，鮮精活力在85%以上的精液樣品用于精子冷凍； c.冷凍方法將精液與抗凍液按常規(guī)三步稀釋法稀釋至精子終密度為2.5 X IO8個(gè)/mL后分裝入I. 8 mL凍存管中，經(jīng)4°C平衡30 min，然后在液氮面上方6 cm處平衡10 min,液氮面上平衡5 min后投入液氮中保存；其中抗凍液為稀釋液D-15+5%甲醇。
全文摘要
一種暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法，屬于低溫生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的方法為選擇達(dá)到性成熟的優(yōu)質(zhì)原種或良種，用100ppm的MS-222麻醉5min，輕輕擠壓擦干的腹部，成熟的精液流入5mL離心管中，檢測(cè)鮮精活力，活力在85%以上的精液樣品用于精子冷凍。將采集的優(yōu)質(zhì)精液與抗凍液(D-15+5%甲醇)按三步稀釋法稀釋，使精子終密度為2.5×108個(gè)/mL，分裝入1.8ml凍存管中，4℃平衡30min，液氮面上6cm平衡10min，液氮面上平衡5min后投入液氮中保存。使用時(shí)將保存的精子在40℃水浴中解凍，進(jìn)行人工授精。本發(fā)明具有成本低，操作簡(jiǎn)便，保持時(shí)間長(zhǎng)，復(fù)蘇后精子的活力較高，人工繁殖的暗色唇魚的受精率和孵化率較高，能投入規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)；對(duì)于開展魚類資源恢復(fù)與重建也具有重要意義。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102763640SQ20121027752
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月7日
發(fā)明者楊君興, 潘曉賦, 王曉愛, 陳小勇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所