專利名稱：α－瓊脂糖酶及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及α-瓊脂糖酶及其生產(chǎn)方法。具體來說，本發(fā)明涉及可用于生產(chǎn)具有瓊脂糖各種生理活性、聚合程度低的瓊脂寡糖的α-瓊脂糖酶和生產(chǎn)α-瓊脂糖酶的方法以及α-瓊脂糖酶的用途。本發(fā)明還涉及具有α-瓊脂糖酶活性的多肽以及編碼所述多肽的基因。具體來說，本發(fā)明涉及α-瓊脂糖酶的氨基酸序列以及編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述α-瓊脂糖酶可用于生產(chǎn)具有瓊脂糖各種生理活性、聚合程度低的瓊脂寡糖。而且，本發(fā)明涉及應(yīng)用基因工程生產(chǎn)具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的方法。此外，本發(fā)明涉及采用具有α-瓊脂糖酶活性的多肽生產(chǎn)瓊脂寡糖的方法。
背景技術(shù)：
瓊脂糖是瓊脂的主要成分。瓊脂糖是一種多糖，它具有其中D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖通過α-1，3-鍵和β-1，4鍵交替連接在一起的結(jié)構(gòu)。人們必須使瓊脂糖降解為小分子，以便由瓊脂產(chǎn)生寡糖。已知化學降解瓊脂糖的方法和酶消化降解瓊脂糖的方法用于此目的。在化學降解法中，可使用酸水解瓊脂糖。在這種情況下，主要裂解α-1，3鍵。已知兩種酶可消化瓊脂糖，一種是β-瓊脂糖酶，它裂解瓊脂糖中的β-1，4鍵，另一種是α-瓊脂糖酶，它裂解瓊脂糖中的α-1，3鍵。
裂解瓊脂糖的β-1，4鍵獲得的寡糖稱為新瓊脂寡糖。新瓊脂寡糖在其還原末端具有D-半乳糖，而其聚合程度表現(xiàn)為偶數(shù)。另一方面，裂解瓊脂糖α-1，3鍵獲得的寡糖稱為瓊脂寡糖。瓊脂寡糖在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖，而其聚合程度表現(xiàn)為偶數(shù)。最近證實在其還原末端含有3，6-脫水-L-半乳糖的瓊脂寡糖具有生理活性，例如誘導細胞凋亡活性、抑癌活性、各種抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抗過敏活性、抗炎活性以及抑制α-糖苷酶活性(WO99/24447、日本專利申請?zhí)?1-11646)。鑒于其生理活性，所以可提供含有瓊脂寡糖作為其活性成分的藥用組合物和功能食品或飲料。
在化學降解瓊脂糖的方法中，難以控制所產(chǎn)生的寡糖的大小。尤其是難以選擇性產(chǎn)生聚合程度低的小分子寡糖(例如T.Tokunaga等，Bioscience & Industry，49734(1991))。如果使用β-瓊脂糖酶，則因為該酶只裂解β-1，4鍵而只能獲得沒有上述生理活性的新瓊脂寡糖。
預(yù)期通過采用具有裂解α-1，3鍵活性的α-瓊脂糖酶產(chǎn)生具有生理活性的瓊脂寡糖。已知的α-瓊脂糖酶包括革蘭氏陰性海洋細菌株GJ1B產(chǎn)生的酶(Carbohydrate Research，66207-212(1978)；該菌株在European Journal of Biochemistry，214599-607(1993)中稱為異單胞菌屬(Alteromonas)瓊脂裂解菌株GJ1B)和弧菌屬(Vibrio)細菌(JP-A 7-322878；JT0107-L4株)產(chǎn)生的酶。然而，采用異單胞菌屬瓊脂裂解菌株GJ1B產(chǎn)生的α-瓊脂糖酶不能產(chǎn)生具有顯著生理活性的瓊脂二糖，因為所述酶不能消化己糖或較短的寡糖。此外，弧菌屬細菌產(chǎn)生的α-瓊脂糖酶不能用來利用瓊脂糖作為原料產(chǎn)生瓊脂寡糖，因為該酶只對己糖和較短的寡糖具有活性，而對瓊脂糖根本沒有作用。
如上所述，現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于產(chǎn)生在其還原末端含有3，6-脫水-L-半乳糖而且具有各種生理活性的小分子瓊脂寡糖(例如瓊脂二糖和瓊脂四糖)存在各種問題。
發(fā)明目的本發(fā)明主要目的是提供可用于有效產(chǎn)生小分子瓊脂寡糖的具有α-瓊脂糖酶活性的多肽、所述多肽的氨基酸序列、編碼所述多肽的基因、產(chǎn)生所述多肽的方法以及產(chǎn)生所述小分子瓊脂寡糖的方法。發(fā)明概述由于存在上述各種問題，所以本發(fā)明人進行了深入研究，以便獲得裂解瓊脂糖的α-1，3鍵而且產(chǎn)生具有顯著生理活性的瓊脂寡糖的酶。因此，本發(fā)明人成功發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生具有適用于此目的的特性的酶的兩個微生物菌株。分離這兩種微生物產(chǎn)生的酶，并闡明其物理化學特性以及酶學特性。此外，本發(fā)明人成功分離了所述酶的基因，而且找到了通過采用所述基因的基因工程容易地產(chǎn)生具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的方法，因此而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明概述如下。本發(fā)明的第一方面涉及具有以下物理化學特性的新型α-瓊脂糖酶(1)作用水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵；(2)底物特異性作用于瓊脂糖、瓊脂己糖和較瓊脂己糖更長的瓊脂寡糖，但是對瓊脂四糖沒有作用；(3)最適溫度在55％或更低溫度下呈現(xiàn)其酶活性；以及(4)熱穩(wěn)定性于48℃處理30秒后保留其20％或更高活性。
這樣的α-瓊脂糖酶中的典型酶例如為它包含SEQ ID NO14的氨基酸序列第177號氨基酸至第925號氨基酸的749個殘基組成的氨基酸序列，或者在749個殘基組成的所述氨基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個氨基酸的氨基酸序列；或者例如為這樣的酶它包含SEQ ID NO15氨基酸序列第184號氨基酸至第950號氨基酸的767個殘基組成的氨基酸序列，或者在767個殘基組成的所述氨基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個氨基酸的氨基酸序列。
本發(fā)明的第二方面涉及編碼具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的基因，該基因編碼第一方面的α-瓊脂糖酶。這類基因中的典型基因例如為它包含SEQ ID NO12核苷酸序列第529號堿基至2775號堿基的2473個堿基組成的核苷酸序列，或在2473個堿基組成的所述核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個堿基的核苷酸序列；或者例如為這樣的基因它包含SEQ ID NO13核苷酸序列第550號堿基至2850號堿基的2301個堿基組成的核苷酸序列，或者在2301個堿基組成的所述核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個堿基的核苷酸序列。
本發(fā)明的第三方面涉及在嚴格條件下可與所述第二方面的基因雜交而且編碼第一方面的α-瓊脂糖酶的基因。
本發(fā)明的第四方面涉及包含所述第二或第三方面的基因的重組DNA分子。
本發(fā)明的第五方面涉及含有所述第四方面的重組DNA分子的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明的第六方面涉及一種產(chǎn)生具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的方法，包括培養(yǎng)能夠產(chǎn)生α-瓊脂糖酶的微生物(例如屬于微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)所屬的微生物屬的微生物)，以及從所述培養(yǎng)物中收集所述第一方面的α-瓊脂糖酶。微生物TKR1-7AGα和TKR4-3AGα于1999年1月26日(最初保藏日期)根據(jù)布達佩斯條約分別以保藏號FERM BP-6990和FERMBP-6991保藏于日本國際貿(mào)易和工業(yè)部工業(yè)科技局的國立生命科學和人體技術(shù)研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)。
本發(fā)明的第七方面涉及一種產(chǎn)生具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的方法，包括培養(yǎng)所述第五方面的轉(zhuǎn)化體以及從所述培養(yǎng)物中收集所述第一方面的α-瓊脂糖酶。
本發(fā)明的第八方面涉及一種產(chǎn)生瓊脂寡糖的方法，包括用所述第一方面的α-瓊脂糖酶消化瓊脂糖以及從所獲得消化物中收集瓊脂寡糖。
附圖簡述


圖1圖示本發(fā)明的α-瓊脂糖酶對瓊脂己糖的消化作用。
圖2圖示本發(fā)明的α-瓊脂糖酶對瓊脂己糖的消化作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明使用的寡糖是指2個或2個以上以及10個或10個以下的單糖組成的糖。瓊脂寡糖是指具有通過α-1，3鍵以及β-1，4鍵交替將D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖連接在一起的結(jié)構(gòu)而且在其還原末端含有3，6-脫水-L-半乳糖的寡糖。多糖是指除單糖和寡糖以外的糖。
本發(fā)明的α-瓊脂糖酶是一種水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的酶。它既可作用于多糖如瓊脂糖又可作用于寡糖如瓊脂己糖。本發(fā)明的酶不是特定限制的酶，只要它們具有這樣的特性。其實例包括海洋微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或TKR4-3AGα(FERM BP-6991)產(chǎn)生的α-瓊脂糖酶。
微生物TKR1-7AGα產(chǎn)生的瓊脂糖酶1-7和微生物TKR4-3AGα產(chǎn)生的瓊脂糖酶4-3是水解多糖和寡糖中的3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的酶。這些酶作用于瓊脂糖、瓊脂己糖和比瓊脂己糖更大瓊脂寡糖以及新瓊脂己糖和比新瓊脂己糖更大的新瓊脂寡糖。
以下描述檢測上述兩種酶的活性的方法以及這兩種酶的物理化學特性和酶學特性。
(1)檢測酶活性的方法如下檢測本發(fā)明的α-瓊脂糖酶的活性采用瓊脂糖作為底物進行酶反應(yīng)，然后定量產(chǎn)生的瓊脂四糖。具體來說，在此用于檢測純化的酶制劑的活性以及純化過程中的酶的活性的酶活性檢測方法如下制備在10mM tris鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣和10mM氯化鈉中含有濃度為0.2％的瓊脂糖(Takara Shuzo，編號5003)的溶液。將作為底物的180μl該溶液與20μl酶溶液混合。使混合物于42℃反應(yīng)30-120分鐘、優(yōu)選60分鐘，然后于60℃加熱1分鐘終止反應(yīng)。使30μl所述反應(yīng)混合物過TSK凝膠α-2500柱(內(nèi)徑7.8mm；長度300mm；Tosoh，編號18339)。采用70％乙腈溶液作洗脫液、流速為0.8ml/min，在保留時間約26分鐘洗脫出一個峰。定量在所述峰的酶反應(yīng)產(chǎn)生的瓊脂四糖。一個單位(1U)定義為在10分鐘內(nèi)產(chǎn)生1微摩爾瓊脂四糖的酶量。
(2)最適pH使酶作用于采用醋酸鹽緩沖液(pH 4.5)、蘋果酸鹽緩沖液(pH5.5)、醋酸鹽緩沖液(pH 6.0，6.5)或tris鹽酸鹽緩沖液(pH 7.0，7.5，8.8)制備的反應(yīng)混合物中的底物瓊脂糖。結(jié)果證實，瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3分別在中性至弱酸性條件下和弱堿性至弱酸性條件下顯示其消化瓊脂糖的活性。
(3)最適溫度本發(fā)明的酶在55℃或更低溫度下呈現(xiàn)其酶活性。在30-48℃溫度范圍具有高活性，而在約37-42℃下具有最大活性。
(4)熱穩(wěn)定性測量在48℃、50℃或60℃處理30秒鐘后保留的酶制劑活性。結(jié)果瓊脂糖酶1-7于48℃處理后保留其25％活性，而瓊脂糖酶4-3于50℃處理后保留其22％活性。
(5)分子量根據(jù)采用10-20％聚丙烯酰胺梯度凝膠的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定，鑒定瓊脂糖酶1-7的分子量約95,000。
采用甘油密度梯度平衡密度梯度離心和SDS-PAGE測定瓊脂糖酶4-3的分子量。結(jié)果測得瓊脂糖酶4-3的分子量為約85,000。
(6)用Edman降解法測定氨基酸序列采用Edman降解法測得的瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3的N-末端氨基酸序列分別為Asp-Thr-Leu-Ser-Val-Glu-Ala-Glu-Met-Phe和Gly-Asp-Ile-Val-Ile-Glu-Leu-Glu-Asp-Phe-Asp-Ala-Thr-Gly-Thr-Thr-GLy-Arg-Val-Ala。瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3的N-末端氨基酸序列分別示于SEQ ID NO1和2。
如下所述，分離編碼瓊脂糖酶1-7的基因和編碼瓊脂糖酶4-3的基因。此外，測得這些基因編碼的氨基酸序列。瓊脂糖酶1-7基因和瓊脂糖酶4-3基因編碼的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO14和15。SEQ ID NO14氨基酸序列的第177號至第925號氨基酸的749個氨基酸組成的多肽和SEQ ID NO15氨基酸序列的第184號至第950號氨基酸的767個氨基酸組成的多肽二者均具有本發(fā)明的α-瓊脂糖酶活性。
可以從通過培養(yǎng)微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)獲得的培養(yǎng)物純化本發(fā)明的α-瓊脂糖酶。從海水分離同化瓊脂的細菌TKR1-7AGα和TKR4-3AGα。它們具有以下微生物特性。
微生物特性(1)形態(tài)學制備100ml人工海水(產(chǎn)品名稱Jamarine S；JamarineLaboratory)。在其中加入0.3g蛋白胨(DIFCO，編號0123-17-3)和0.02g酵母提取物(DIFCO，編號0127-17-9)。用3M碳酸鈉將pH調(diào)節(jié)至8.0。把獲得的混合物轉(zhuǎn)移到500ml錐形瓶中。向其中加入0.1g瓊脂(Nacalai Tesque，編號010-28)。用高壓滅菌器滅菌后，將一種上述微生物接種到所述混合物中，于25℃、120rpm培養(yǎng)過夜。生長于所述培養(yǎng)基中的TKR1-7AGα和TKR4-3AGα細胞是桿菌并可運動。
(2)生長制備100ml人工海水(產(chǎn)品名稱Jamarine S；JamarineLaboratory)。在其中加入0.3g蛋白胨和0.02g酵母提取物。用3M碳酸鈉將pH調(diào)節(jié)至8.0。向其中加入1.5g瓊脂(Nacalai Tesque，編號010-28)。用高壓滅菌器滅菌混合物以制備平板。將上述微生物接種到所述平板上，證實(a)它們于23-30℃生長良好；和
(b)隨著所述細菌細胞的生長使所述瓊脂凝膠液化。
制備100ml人工海水(產(chǎn)品名稱Jamarine S；JamarineLaboratory)。在其中加入0.3g蛋白胨和0.02g酵母提取物。用3M碳酸鈉將pH調(diào)節(jié)至不同pH。把獲得的混合物轉(zhuǎn)移到500ml錐形瓶中。向其中加入0.1g瓊脂。用高壓滅菌器滅菌后，將一種上述微生物接種到所述混合物中。然后證實(c)它們于pH 7.0-8.5生長良好。
TKR1-7AGα和TKR4-3AGα于1999年1月26日(最初保藏日期)根據(jù)布達佩斯條約分別以保藏號FERM BP-6990和FERM BP-6991保藏于日本國際貿(mào)易和工業(yè)部工業(yè)科技局的國立生命科學和人體技術(shù)研究所。
通過分析其核苷酸序列已知為每種微生物菌株特異性的16S核糖體RNA的基因的編碼核苷酸序列，可獲得關(guān)于每種上述微生物的分類學定位的信息。具體來說，從微生物菌株TKR1-7AGα和TKR4-3AGα提取染色體DNA。采用可用于擴增所述基因的一個區(qū)或其部分的引物進行PCR。測定所擴增的DNA片段的核苷酸序列。對所測定的序列利用GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性檢索。然后可知道與所述區(qū)的核苷酸序列相似的微生物，即分類學上密切相關(guān)的微生物。
按照Bulletin of Japanese Society of Microbial Ecology，1031-42(1995)所述的方法，擴增從微生物TKR1-7AGα和TKR4-3AGα的16S核糖體RNA基因獲得的DNA片段。將所述文獻描述的引物27f和1492r用于所述PCR(引物27f和1492r的核苷酸序列示于SEQ ID NO16和17)。分析所獲得的擴增DNA片段的核苷酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了以下微生物，各微生物的上述區(qū)與一種產(chǎn)生本發(fā)明的α-瓊脂糖酶的微生物的同源性約95％TKR1-7AGα科爾韋爾氏菌屬(Colwellia)樣細菌；TKR4-3AGα海洋嗜冷菌IC079。
含有每種所述微生物可利用的氮源、無機物質(zhì)等以及作為碳源的瓊脂、瓊脂糖等的培養(yǎng)基可用作培養(yǎng)所述微生物的培養(yǎng)基?？墒褂檬惺郗傊铜傊?。氮源實例包括肉膏、酵母提取物、酪蛋白水解產(chǎn)物、胰蛋白胨、蛋白胨等。優(yōu)選使用酵母提取物和蛋白胨。這樣的氮源也可以用作除瓊脂或瓊脂糖外的碳源。此外，作為鹽類可聯(lián)合使用以下物質(zhì)氯化鈉、檸檬酸鐵、氯化鎂、硫酸鈉、氯化鈣、氯化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、溴化鉀、氯化鍶、硼酸鈉、硅酸鈉、氟化鈉、硝酸銨、磷酸氫二鈉等。
特別優(yōu)選使用通過在人工海水Jamarine S組成的培養(yǎng)基中加入蛋白胨、酵母提取物和瓊脂或瓊脂糖制備的培養(yǎng)基。優(yōu)選加入瓊脂或瓊脂糖的濃度為0.1-2.0％。通過適當改變瓊脂或瓊脂糖的濃度可制備固體或液體培養(yǎng)基。使用濃度為0.1-0.3％的液體培養(yǎng)基優(yōu)選用于產(chǎn)生酶，而使用濃度為1.2-2.0％的固體培養(yǎng)基優(yōu)選用于保藏細胞。如果低熔點瓊脂糖用于液體培養(yǎng)基，則可以0.1-1.0％濃度使用。
盡管培養(yǎng)條件或多或少取決于培養(yǎng)基的組成，但是培養(yǎng)溫度為23-30℃、優(yōu)選25℃，培養(yǎng)基的pH為7.0-8.5、優(yōu)選7.2-8.2，而培養(yǎng)時間為12-48小時、優(yōu)選24-36小時。
如上所述培養(yǎng)期間產(chǎn)生的本發(fā)明的α-瓊脂糖酶分泌出所述細胞。然后在培養(yǎng)后通過離心、過濾等去除細胞，獲得培養(yǎng)物上清液。
采用真空濃縮或超濾可濃縮獲得的培養(yǎng)物上清液，以制備液體酶。或者，可通過冷凍干燥、噴霧干燥等使所述培養(yǎng)物上清液轉(zhuǎn)變?yōu)榉坌兔?，以制備粗酶制劑。采用常?guī)純化方法例如用硫酸銨鹽析或溶劑沉淀，可部分純化本發(fā)明的α-瓊脂糖酶。而且，采用已知的純化方法例如組合柱層析(例如陰離子交換柱和凝膠過濾柱)可獲得電泳產(chǎn)生一條帶的純化酶制劑。
通過使由此獲得的培養(yǎng)物或不同純化程度的本發(fā)明α瓊脂糖酶與紅海藻中含的多糖如瓊脂或瓊脂糖作為底物進行反應(yīng)，可產(chǎn)生瓊脂寡糖例如瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。
瓊脂糖為具有交替通過α-1，3鍵和β-1，4鍵使D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖連接在一起的結(jié)構(gòu)的多糖。β-瓊脂糖酶是水解瓊脂糖β-1，4鍵的酶。該酶作用產(chǎn)生的在其還原末端具有D-半乳糖的寡糖稱為新瓊脂寡糖，它不具有生理活性，例如用瓊脂寡糖觀測到的生理活性。如果使用裂解瓊脂糖α-1，3鍵的α-瓊脂糖酶，則可產(chǎn)生在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的瓊脂寡糖。異單胞菌屬瓊脂裂解菌株GJ1B和一種弧菌屬細菌(菌株JT0107-L4)產(chǎn)生的兩種酶已知為α-瓊脂糖酶。然而，異單胞菌屬瓊脂裂解菌株GJ1B產(chǎn)生的α-瓊脂糖酶不能作用于瓊脂己糖或更短的寡糖，而弧菌屬細菌產(chǎn)生的α-瓊脂糖酶不能消化瓊脂糖。因此，不能采用已知α-瓊脂糖酶有效由瓊脂糖原料產(chǎn)生瓊脂二糖或瓊脂四糖。
根據(jù)上述物理化學特性可知，本發(fā)明的α-瓊脂糖酶是作用于瓊脂糖、瓊脂己糖和比瓊脂己糖更長的瓊脂寡糖的酶。因此，它作用于瓊脂糖產(chǎn)生瓊脂寡糖。而且，它可裂解因為所述作用產(chǎn)生的瓊脂己糖中一個α-1，3鍵。換句話說，通過使本發(fā)明的α-瓊脂糖酶可作用于瓊脂糖，可獲得瓊脂二糖和瓊脂四糖，瓊脂二糖和瓊脂四糖是按照常規(guī)方法幾乎不能大量產(chǎn)生的二糖和四糖。
已知的α-瓊脂糖酶和本發(fā)明的α-瓊脂糖酶的底物特異性示于表1。在表1中，符號+和-分別表示所述酶能夠和不能夠消化所述底物。表1

本發(fā)明的α-瓊脂糖酶作用于瓊脂己糖產(chǎn)生瓊脂二糖和瓊脂四糖。
采用本發(fā)明的α-瓊脂糖酶產(chǎn)生的瓊脂寡糖含有瓊脂二糖和瓊脂四糖。所述瓊脂寡糖可含有瓊脂己糖或比瓊脂己糖更長的瓊脂寡糖，前提是其存在不干擾所述使用目的。瓊脂、瓊脂糖或瓊脂或瓊脂糖產(chǎn)生的瓊脂寡糖可用作采用本發(fā)明的α-瓊脂糖酶產(chǎn)生瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖的原料。用于所述α-瓊脂糖酶作用的條件不特別限制，前提是所述酶在所用的條件下具有活性。例如，在中性至弱酸性條件下可優(yōu)選使瓊脂糖酶1-7發(fā)揮作用，在弱堿性至弱酸性條件下可優(yōu)選使瓊脂糖酶4-3發(fā)揮作用，而在37-42℃時可使所述酶二者發(fā)揮作用。所述反應(yīng)混合物的組成不特別限制，前提是它適用于所述酶的作用。
如上所述，采用本發(fā)明的α-瓊脂糖酶產(chǎn)生的寡糖主要是己糖或聚合程度低的更短寡糖。但是，可通過適當選擇所述反應(yīng)條件等任選產(chǎn)生不同聚合程度的寡糖。也可以通過分離和純化由此獲得的寡糖，分別獲得瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。
本發(fā)明的α-瓊脂糖酶基因是編碼具有上述α-瓊脂糖酶活性的多肽的基因。因此，它是指包含編碼具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。本發(fā)明的α-瓊脂糖酶基因的實例包括包含編碼微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)產(chǎn)生的瓊脂糖酶1-7的核苷酸序列的基因和包含微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)產(chǎn)生的瓊脂糖酶4-3的核苷酸序列的基因。編碼瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3的基因例如為具有編碼SEQ ID NO14中的第177號氨基酸至第925號氨基酸的749個氨基酸殘基組成的多肽的核苷酸序列的基因和具有編碼SEQ ID NO15中的第184號氨基酸至第950號氨基酸的767個氨基酸殘基組成的多肽的核苷酸序列的基因。
本發(fā)明的α-瓊脂糖酶基因還包括包含編碼多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽具有在上述氨基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個氨基酸的氨基酸序列，而且具有α-瓊脂糖酶活性。
此外，本發(fā)明的基因包括具有SEQ ID NO12第529號堿基至2775號堿基的22473個堿基組成的核苷酸序列的基因和具有SEQ ID NO13第550號堿基至2850號堿基的2247個堿基組成的核苷酸序列的基因。本發(fā)明的基因還包括包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列具有在上述核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個堿基的核苷酸序列，而且編碼具有α-瓊脂糖酶活性的多肽。
此外，本發(fā)明的基因包括包含在嚴格條件下與上述基因雜交而且編碼具有α-瓊脂糖酶活性的核苷酸序列的核酸?？烧绽鏣.Maniatis等(編輯)，Molecular CloningA Laboratory Manual第二版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory所述的方法進行雜交。嚴格條件例如為在含6×SSC(1×SSC0.15 M NaCl、0.015檸檬酸鈉，pH 7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt’s和100mg/ml鯡魚精子DNA的溶液中于65℃下與探針溫育過夜。
例如可如下克隆本發(fā)明的α-瓊脂糖酶基因。
用產(chǎn)生α-瓊脂糖酶的微生物制備基因組DNA?？砂凑找环N合適的已知方法制備所述基因組DNA。例如，組合使用諸如溶菌酶處理、蛋白酶處理、RNA酶處理、酚處理和乙醇沉淀的已知方法可制備基因組DNA。由此獲得的基因組DNA用合適的已知方法例如超聲處理或限制酶消化降解。按照常規(guī)方法將獲得的DNA片段摻入載體(例如質(zhì)粒載體)中，以構(gòu)建重組DNA分子。然后將重組DNA分子導入合適的宿主(例如大腸桿菌)中獲得轉(zhuǎn)化體。根據(jù)常規(guī)方法所用的載體和宿主例如Molecular CloningA Laboratory Manual第二版中所述的載體和宿主，可適當選擇構(gòu)建重組DNA分子、轉(zhuǎn)化等的方法。因此獲得含有α-瓊脂糖酶基因的轉(zhuǎn)化體的基因組文庫。
其次，篩選基因組文庫，以選擇具有α-瓊脂糖酶基因的轉(zhuǎn)化體。篩選方法的實例如下(1)利用α-瓊脂糖酶活性的表達作為指標的篩選使基因組文庫生長于瓊脂板上。具有α-瓊脂糖酶基因的轉(zhuǎn)化體表達具有α-瓊脂糖酶活性的多肽。所述多肽通過其α-瓊脂糖酶活性作用溶解瓊脂凝膠。因此選擇溶解瓊脂板中的的瓊脂凝膠的菌落或菌斑。
(2)利用抗體的篩選如上所述制備α-瓊脂糖酶的部分純化的粗酶制劑或純化的酶制劑。采用所述酶制劑作抗原，按照常規(guī)方法制備抗α-瓊脂糖酶的抗體。
使基因組文庫生長于平板上。將生長的菌落或菌斑轉(zhuǎn)移到尼龍或硝酸纖維素濾膜上。表達的重組蛋白與所述菌落或菌斑一起轉(zhuǎn)移到所述濾膜上。使濾膜上的重組蛋白與抗α-瓊脂糖酶抗體反應(yīng)，以鑒定與抗體反應(yīng)的克隆。
按照已知方法可鑒定與所述抗體反應(yīng)的克隆，例如使結(jié)合過氧化物酶的二抗與已經(jīng)與所述抗α-瓊脂糖酶抗體反應(yīng)的濾膜反應(yīng)，使濾膜與顯色底物反應(yīng)，然后檢測產(chǎn)生的顏色。
如果將使摻入所述載體的DNA中的基因高效表達的表達載體用于構(gòu)建用于上述方法(1)或(2)的基因組文庫，則能夠容易地選擇具有目的基因的轉(zhuǎn)化體。
(3)利用DNA探針雜交的篩選使基因組文庫生長于平板上。將生長的菌落或菌斑轉(zhuǎn)移到尼龍或硝酸纖維素濾膜上。通過變性使DNA固定在所述濾膜上。按照常規(guī)方法使所述濾膜上的DNA雜交到標記探針上，以鑒定與所述探針雜交的克隆。
用于該篩選的探針包括根據(jù)上述α-瓊脂糖酶的氨基酸序列信息制備的寡核苷酸、根據(jù)另一種氨基酸序列信息制備的寡核苷酸以及采用根據(jù)這種氨基酸序列信息制備的引物擴增的PCR片段。用于所述探針的標記的實例包括但不限于放射性同位素標記、熒光標記、地高辛標記和生物素標記。
如下制備的富集具有α-瓊脂糖酶基因的轉(zhuǎn)化體的基因組文庫可用作用于所述篩選的基因組文庫。
由產(chǎn)生α-瓊脂糖酶的微生物制備基因組DNA，用合適的限制酶消化，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，然后按照常規(guī)方法將其印跡到尼龍或硝酸纖維素濾膜上。按照常規(guī)方法使濾膜上的DNA與上述標記的探針雜交，以檢測與所述探針雜交的DNA片段。從所述瓊脂糖凝膠提取并純化對應(yīng)于所述信號的DNA片段。
按照常規(guī)方法將由此獲得的DNA片段摻入載體(例如質(zhì)粒載體)中，以構(gòu)建重組DNA分子。然后將重組DNA分子導入合適的宿主(例如大腸桿菌)中獲得轉(zhuǎn)化體。根據(jù)常規(guī)方法例如Molecular CloningALaboratory Manual第二版中所述方法，可選擇適用于所用載體的轉(zhuǎn)化方法。因此獲得富集含有α-瓊脂糖酶基因的轉(zhuǎn)化體的基因組文庫。
采用這樣的基因組文庫可更有效地進行篩選。
(4)利用PCR的體外克隆通過篩選如上所述的方法(1)至(3)的轉(zhuǎn)化體，克隆目的基因。利用PCR可體外進行克隆，而不必利用轉(zhuǎn)化體。
由產(chǎn)生α-瓊脂糖酶的微生物制備基因組DNA。通過合適的已知方法例如超聲處理或用限制酶消化降解基因組DNA。按照常規(guī)方法使接頭連接到由此獲得的DNA片段。
采用根據(jù)α-瓊脂糖酶的氨基酸序列信息制備的寡核苷酸和與所述接頭雜交的寡核苷酸作為引物以及用所述基因組文庫作模板，進行PCR。按照常規(guī)方法使獲得的擴增產(chǎn)物摻入載體(例如質(zhì)粒載體)中。
按照已知方法可測定上述(1)至(3)獲得的含有α-瓊脂糖酶基因的轉(zhuǎn)化體中的α-瓊脂糖酶基因的核苷酸序列以及上述(4)獲得的含有α-瓊脂糖酶基因的重組DNA分子的核苷酸序列。如果所述克隆不編碼完整的α-瓊脂糖酶多肽，則通過重復步驟揭示所述α-瓊脂糖酶的完整讀框，所述步驟包括根據(jù)已確定的核苷酸序列制備新探針，并用所述探針篩選基因組文庫以獲得新的克隆。例如根據(jù)由此獲得的信息可制備包含編碼α-瓊脂糖酶的完整讀框的克隆。
通過將上述獲得的編碼α-瓊脂糖酶的基因與合適的表達載體連接在一起，經(jīng)基因工程可大量產(chǎn)生具有α-瓊脂糖酶活性的多肽。
以下簡述獲得瓊脂糖酶1-7基因的方法。
用溶菌酶裂解通過培養(yǎng)TKR1-7AG獲得的細胞，然后使其去除蛋白，乙醇沉淀等獲得基因組DNA。用限制酶BamHI部分消化基因組DNA。將獲得的DNA片段插入質(zhì)粒載體(氨芐青霉素抗性)中，以構(gòu)建質(zhì)粒文庫。使用質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌。使轉(zhuǎn)化體在含1.5％(w/v)瓊脂和50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長，并于37℃培養(yǎng)5天。培養(yǎng)后，分離觀測到周圍瓊脂分解的菌落，將其接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中并培養(yǎng)。測定由所述細胞制備的粗提取物的α-瓊脂糖酶活性。按照常規(guī)方法由觀測到α-瓊脂糖酶活性的轉(zhuǎn)化體提取質(zhì)粒DNA。測得插入質(zhì)粒DNA的DNA長度約8kb。該重組質(zhì)粒命名為pAA1。用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌命名并表示為大腸桿菌JM109/pAA1，于1999年5月26日(最初保藏日期)根據(jù)布達佩斯條約以保藏號FERM BP-6992保藏于日本國際貿(mào)易和工業(yè)部工業(yè)科技局的國立生命科學和人體技術(shù)研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)。
對插入質(zhì)粒pAA1的DNA片段的核苷酸序列進行分析顯示，它含有作為編碼α-瓊脂糖酶的一個區(qū)的編碼925個氨基酸組成的多肽的讀框(ORF)。所述讀框的核苷酸序列和所述讀框編碼的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO12和14。因此，SEQ ID NO14的氨基酸序列是本發(fā)明瓊脂糖酶的一個實例。比較該氨基酸序列與以前測定的瓊脂糖酶1-7的N-末端氨基酸序列(P1)表明，瓊脂糖酶1-7是SEQ ID NO14氨基酸序列第28號氨基酸至第925號氨基酸的氨基酸序列組成的多肽，而且所述氨基酸序列由SEQ ID NO12核苷酸序列第82號堿基至2778號堿基(包括終止密碼子)的核苷酸序列編碼。認為SEQ ID NO14氨基酸序列的氨基酸1-27組成的氨基酸序列是信號序列。而且，具有SEQID NO14氨基酸序列第177號氨基酸至第925號氨基酸的749個氨基酸殘基組成的氨基酸序列的多肽也具有本發(fā)明的α-瓊脂糖酶的一種活性。
以下簡述獲得α-瓊脂糖酶4-3基因的方法。根據(jù)SEQ ID NO2表示的瓊脂糖酶4-3的N-末端氨基酸序列(P2)制備混合的引物3和4。混合的引物3和4的序列分別示于SEQ ID NO6和7。
如以上關(guān)于α-瓊脂糖酶1-7所述，由TKR4-3AGα制備的染色體DNA用限制酶BamHI完全消化。使BamHI接頭連接到消化的DNA末端。采用獲得的DNA作為模板以及采用LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)所附的混合的引物3和引物Cl進行PCR。
其次，采用第一PCR如此獲得產(chǎn)物作為模板以及LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)所附的混合的引物4和引物C2進行PCR。結(jié)果觀測到約2kb的擴增產(chǎn)物。該DNA片段命名為4-3N。
分析所擴增片段的末端區(qū)的核苷酸序列。根據(jù)對應(yīng)于所述瓊脂糖酶N-末端部分的編碼區(qū)的核苷酸序列，制備其核苷酸序列分別示于SEQ ID NO8和9的引物5和6。同樣，根據(jù)對應(yīng)于所述瓊脂糖酶C末端部分的核苷酸序列，制備其核苷酸序列分別示于SEQ ID NO10和11的引物7和8。
當如上所述對4-3N進行PCR時，例外的是使用引物5和6代替混合的引物3和4，獲得約1.0kb的DNA片段，稱為4-3UN。同樣，當用引物7和8進行PCR時，獲得約2.0kb的DNA片段，稱為4-3C。盡管考慮了以前確定的4-3N的核苷酸序列，但是對片段4-3UN和4-3C進行核苷酸序列分析顯示，編碼951個氨基酸組成的多肽的讀框。所述讀框的核苷酸序列和所述讀框核苷酸序列編碼的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO13和15。在R-3UN中，發(fā)現(xiàn)了編碼氨基酸序列P2的核苷酸序列(編碼183個氨基酸的上游核苷酸序列)以及另一個上游SD樣序列。
所以，SEQ ID NO15氨基酸序列為本發(fā)明瓊脂糖酶的一個實例。比較此氨基酸序列與前面鑒定的瓊脂糖酶4-3的N-末端氨基酸序列表明，瓊脂糖酶4-3為SEQ ID NO15氨基酸序列第184號氨基酸至第951號氨基酸的氨基酸序列組成的多肽，而所述氨基酸序列由SEQ ID NO13核苷酸序列的第550號至第2856號(包括終止密碼子)的核苷酸序列編碼。
如上所述獲得的瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3的氨基酸序列和編碼這些酶的基因的核苷酸序列與β-瓊脂糖酶的氨基酸序列和編碼所述酶的基因的核苷酸序列沒有同源性，其中β-瓊脂糖酶是以不同于本發(fā)明瓊脂糖酶的方式裂解瓊脂糖的已知瓊脂糖消化酶。因此，認為這些序列是絕對新的。
通過將編碼本發(fā)明α-瓊脂糖酶的基因(例如編碼瓊脂糖酶1-7或瓊脂糖酶4-3的基因)連接到合適載體上，能夠構(gòu)建重組DNA分子。而且，通過將重組DNA分子導入合適宿主中可制備轉(zhuǎn)化體。用通過培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體獲得的培養(yǎng)物生產(chǎn)本發(fā)明的α-瓊脂糖酶。所以，采用所述轉(zhuǎn)化體有可能大量生產(chǎn)本發(fā)明的α-瓊脂糖酶(例如瓊脂糖酶1-7或瓊脂糖酶4-3)。
按照已知方法在編碼α-瓊脂糖酶的基因中導入一種突變，可產(chǎn)生突變的α-瓊脂糖酶?？墒褂玫膶胪蛔兊姆椒▽嵗ǖ幌抻诠押塑账犭p琥珀法(Hashimoto-Gotoh，T.等，Gene，152271-275(1995))、缺口雙鏈體法(Kramer，W.等，Nucl.Acids Res.，129441(1984)；Kramer，W.等，Methods in Enzymology，154350(1987))和Kunkel法(Kunkel，T.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488(1985)；Kunkel，T.A.，Methodsin Enzymology，154367(1987))。
通過表達編碼其中在需要表達的α-瓊脂糖酶的N-末端加入信號序列的多肽的基因，可使目的α-瓊脂糖酶分泌出轉(zhuǎn)化體。所述信號序列不限于具體某一種，例如SEQ ID NO14的第1-27號氨基酸代表的瓊脂糖酶1-7的信號序列。該信號序列由SEQ ID NO12的第1-81號堿基的核苷酸序列編碼。
可用于構(gòu)建所述重組DNA分子的載體的實例包括但不限于質(zhì)粒載體、嗜菌體載體和病毒載體。根據(jù)使用所述重組DNA的目的可選擇合適的載體。如果構(gòu)建重組DNA分子是為了產(chǎn)生α-瓊脂糖酶，則優(yōu)選含有啟動子和/或其它用于表達控制的區(qū)段的載體。這類質(zhì)粒載體的實例包括但不限于pKF19k、pT7BlueT和pET16b。可用于制備轉(zhuǎn)化體的宿主包括但不限于諸如細菌、酵母和絲狀真菌的微生物以及哺乳動物、魚、昆蟲等的培養(yǎng)細胞。使用采用適用于所述宿主的載體構(gòu)建的重組DNA分子，制備轉(zhuǎn)化體。
下面簡述通過基因工程產(chǎn)生瓊脂糖酶1-7的方法。
采用編碼α-瓊脂糖酶1-7基因的質(zhì)粒pAA1作為模板，通過PCR擴增含有編碼多肽的核苷酸序列的DNA片段，所述多肽具有例如從SEQ ID NO14第28或177號氨基酸開始的氨基酸序列，以便構(gòu)建其中所擴增的片段插入合適質(zhì)粒載體(例如pKF19k(Takara Shuzo)、pT7BlueT(Takara Shuzo)或pET16b(Takara Shuzo))中的質(zhì)粒。用合適液體培養(yǎng)基培養(yǎng)用這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(例如大腸桿菌JM109或BL21(DE3)pLysS)。必要時，采用IPTG等進行誘導。表達插入所述質(zhì)粒的DNA片段編碼的多肽。單位體積培養(yǎng)物內(nèi)轉(zhuǎn)化體表達的α-瓊脂糖酶活性通常高于TKR1-7AGα培養(yǎng)物觀測到的活性。
對于瓊脂糖酶4-3，在用所述微生物TKR4-3α的染色體DNA作為模板，通過PCR擴增含有編碼例如具有從SEQ ID NO15的第184號氨基酸開始的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的DNA片段后，如以上關(guān)于瓊脂糖酶1-7所述，可用基因工程制備編碼所述α-瓊脂糖酶的轉(zhuǎn)化體。獲得的轉(zhuǎn)化體表達α-瓊脂糖酶活性，而且單位體積培養(yǎng)物的活性高于TKR4-3AGα培養(yǎng)物觀測到的活性。
采用常規(guī)純化方法例如用硫酸銨鹽析或溶劑沉淀，能夠部分純化用如上所述的基因工程產(chǎn)生的本發(fā)明α-瓊脂糖酶。此外，利用已知純化方法例如組合柱層析(例如陰離子交換柱和凝膠過濾柱)能夠獲得電泳時產(chǎn)生單一帶的純化酶制劑。
使如此獲得的不同純度的本發(fā)明重組α-瓊脂糖酶與作為底物的紅海藻含有的多糖如瓊脂或瓊脂糖反應(yīng)，可產(chǎn)生諸如瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖的瓊脂寡糖。
實施例以下實施例更詳細地闡明本發(fā)明，而不是用來限制本發(fā)明范圍。
實施例1用TKR1-7AGα產(chǎn)生α-瓊脂糖酶純化本發(fā)明的α-瓊脂糖酶后，如下檢測酶活性用瓊脂糖L03(Takara Shuzo，編號5003)作底物進行酶反應(yīng)，然后采用高效液相色譜定量產(chǎn)生的瓊脂四糖。下文更詳細介紹該方法。
制備在10mM tris鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣和10mM氯化鈉中含有瓊脂糖L03濃度為0.2％的溶液。使180μl該溶液與20μl酶溶液混合。使該混合物于42℃反應(yīng)30-120分鐘、優(yōu)選60分鐘，然后于60℃加熱1分鐘終止反應(yīng)。將30μl反應(yīng)混合物過TSK凝膠α-2500柱(內(nèi)徑7.8mm；長度300mm；Tosoh，編號18339)。利用70℃乙腈溶液作洗脫液、流速0.8ml/分鐘，在保留時間約26分鐘洗脫出一個峰。定量在所述峰中酶反應(yīng)產(chǎn)生的瓊脂四糖。1單位(U)本發(fā)明α-瓊脂糖酶定義為10分鐘產(chǎn)生1微摩爾瓊脂四糖的酶量。
制備100ml人工海水(產(chǎn)品名稱Jamarine S；JamarineLaboratory)。分別以0.3％和0.02％濃度向其中加入蛋白胨(DIFCO，編號0123-17-3)和酵母提取物(DIFCO，編號0127-17-9)。然后用3M碳酸鈉將pH調(diào)節(jié)至8.0。把獲得的混合物轉(zhuǎn)移到500ml錐形瓶中。向其中加入0.1g瓊脂(Nacalai Tesque，編號010-28)。用高壓滅菌器滅菌后，將微生物TKR1-7AGα接種到所述混合物中，于25℃、120rpm培養(yǎng)過夜。獲得的培養(yǎng)物用作預(yù)培養(yǎng)物。
如下進行主培養(yǎng)。以51小型發(fā)酵罐制備31上述培養(yǎng)基，用高壓滅菌器滅菌。將30ml預(yù)培養(yǎng)物接種到所述培養(yǎng)基中，于25℃、250rpm培養(yǎng)24小時。然后以8,000×g離心培養(yǎng)物20分鐘收集約31去除細胞的上清液。
于4℃或4℃以下進行以下步驟。
將所述上清液置于透析膜(Sanko Junyaku，編號UC-36-32-100)，并將其浸入約500g聚乙二醇2個夜晚進行濃縮，直到其中的溶液體積約100ml為止，然后用緩沖液A(20mM tris-鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣、10mM氯化鈉)透析脫鹽。將透析液上樣到用緩沖液A平衡的裝填30ml強陰離子交換樹脂Super Q(Tosoh，編號17227)的柱上。用10mM-150mM氯化鈣的線性梯度(總洗脫體積600ml)洗脫吸附的α瓊脂糖酶。收集于50mM-100mM氯化鈣濃度洗脫的約60ml具有α-瓊脂糖酶活性的流分。
用緩沖液B(10mM tris-鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣、10mM氯化鈉)透析該流分，使其脫鹽，然后加樣到裝填20ml Super Q的柱(2cm×6.3mm)上。在這種情況下，用10mM-1.0M氯化鈉線性梯度(總洗脫體積200ml)洗脫所吸附的酶。于約0.5M氯化鈉洗脫獲得40ml具有α-瓊脂糖酶活性的流分。用緩沖液B透析該流分，然后使其過裝填10ml DEAE-TOYOPEARL(Tosoh，編號007473)的柱(0.8cm×5.7mm)。用10mM-150mM氯化鈣線性梯度(總洗脫體積100ml)收集約20ml具有α-瓊脂糖酶活性的流分。
然后用離心超濾膜Centriprep-10(Amicon，編號4304)使所述流分濃縮至約1ml。利用以緩沖液B平衡的裝填Sephadex G-100(Pharmacia，編號17-0060-01)的柱(0.8cm×60mm)，使?jié)饪s液進行凝膠過濾，獲得約15ml具有α-瓊脂糖酶活性的流分。使該流分過5ml QAE-TOYOPEARL(Tosoh，編號14026)的柱(0.8cm×10mm)，利用10mM-150mM氯化鈣線性梯度(總洗脫體積100ml)洗脫獲得約4ml的α-瓊脂糖酶流分。
經(jīng)SDS-PAGE分析如此獲得的α-瓊脂糖酶流分揭示，目的酶幾乎純化至均一，其分子量約95,000。如此獲得的純化α-瓊脂糖酶制劑的總活性為45U。該流分在以下的實驗中用作瓊脂糖酶1-7。
實施例2用TKR4-3AGα產(chǎn)生α-瓊脂糖酶如在上文實施例1中關(guān)于微生物TKR1-7AGα所述，培養(yǎng)微生物TKR4-3AGα，以獲得約31培養(yǎng)物上清液。
將培養(yǎng)物上清液置于透析膜(Sanko Junyaku，編號UC-36-32-100)，并將其浸入約500g聚乙二醇2個夜晚進行濃縮，直到其中的溶液體積約300ml為止，然后用緩沖液C(10mM tris-鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣、50mM氯化鈉)透析。將約三分之二的透析液上樣到用緩沖液C平衡的裝填30mlSuper Q的柱(2cm×9.5mm)上。用10mM-80mM氯化鈣線性梯度(總洗脫體積400ml)洗脫吸附的α瓊脂糖酶。收集于40mM-50mM氯化鈣濃度洗脫的約40ml具有α-瓊脂糖酶活性的流分用Centriprep-10濃縮該流分，并用緩沖液B稀釋脫鹽，然后加樣到裝填10ml DEAE-TOYOPEARL的柱(1.5cm×5.7mm)。用10mM-100mM氯化鈣線性梯度(總洗脫體積100ml)洗脫吸附的酶。于約45mM氯化鈣濃度洗脫獲得9ml具有α瓊脂糖酶活性的流分。用Centriprep-30(Amicon，編號4306)濃縮該流分，并用緩沖液B稀釋5倍，然后將其過用緩沖液B平衡的裝填2ml QAE-TOYOPEARL的柱(0.8cm×4cm)。用10mM-120mM氯化鈣線性梯度(總洗脫體積40ml)收集吸附于所述柱上的α瓊脂糖酶的流分。
經(jīng)SDS-PAGE分析如此獲得的α-瓊脂糖酶流分揭示，所述α-瓊脂糖酶幾乎純化至均一。獲得的所述α-瓊脂糖酶總活性為1.53U。該流分在以下的實驗中用作瓊脂糖酶4-3。
實施例3檢測酶的各種特性(1)底物特異性和作用制備10μl反應(yīng)緩沖液(10mM tris-鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣、10mM氯化鈉)，它含有一種選自以下的糖4種瓊脂寡糖(瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂己糖和瓊脂八糖)(濃度各為2.5mM)、3種新瓊脂寡糖(新瓊脂二糖、新瓊脂四糖和新瓊脂己糖)(濃度各為2.5mM)和瓊脂糖L03(濃度為1％)。向其中加入10μl瓊脂糖酶1-7或瓊脂糖酶4-3溶液。使所述混合物于42℃反應(yīng)30分鐘。利用展開溶劑使反應(yīng)產(chǎn)物進行薄層層析，所述展開溶劑的組成為氯仿∶甲醇∶醋酸＝3∶3∶1。展開后，苔黑酚-硫酸法證實反應(yīng)產(chǎn)物。
結(jié)果證實，瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3均裂解瓊脂己糖、瓊脂八糖、新瓊脂己糖和瓊脂糖。
使瓊脂糖酶1-7作用于瓊脂己糖獲得的薄層層析結(jié)果示于
圖1。使瓊脂糖酶4-3作用于瓊脂己糖獲得的薄層層析結(jié)果示于圖2。在
圖1和2中，在相應(yīng)的道上展開的樣品如下道1瓊脂二糖；道2瓊脂四糖；道3瓊脂己糖；道4與本發(fā)明瓊脂糖酶反應(yīng)的瓊脂己糖；道5瓊脂二糖和瓊脂四糖的混合物。由這些圖可知，本發(fā)明的α-瓊脂糖酶消化瓊脂己糖產(chǎn)生瓊脂二糖和瓊脂四糖。
(2)鑒定α-瓊脂糖酶反應(yīng)的產(chǎn)物在10mM tris-鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣和10mM氯化鈉中含有1.0％濃度瓊脂糖L03的溶液2.0ml中加入瓊脂糖酶1-7或瓊脂糖酶4-3。使所述混合物于42℃反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)后，取部分反應(yīng)混合物過凝膠過濾柱(Tosoh，TSKgel α-2500)，采用70％乙腈作洗脫劑、流速0.8ml/分鐘進行層析。收集保留時間約26分鐘洗脫的流分，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至干。測定產(chǎn)物重量約4mg。
利用JNM-EX270 FT NMR系統(tǒng)(Nippon Denshi)經(jīng)核磁共振分析流分證實，各酶作用由瓊脂糖產(chǎn)生而且包含于所述流分的物質(zhì)為瓊脂四糖。因此，證實瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3均可水解瓊脂糖分子中D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的α-1，3鍵，產(chǎn)生包含瓊脂四糖的瓊脂寡糖。
(3)反應(yīng)pH
制備10μl反應(yīng)混合物，它包含1％瓊脂糖L03、10mM氯化鈣和10mM氯化鈉，采用終濃度為10mM的括號內(nèi)所示緩沖液將反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)至以下值4.5(醋酸鹽緩沖液)；5.5(蘋果酸鹽緩沖液)；6.0、6.5(醋酸鹽緩沖液)；或7.0、7.5或8.8(tris緩沖液)。向其中加入10μl酶溶液。使混合物于42℃反應(yīng)1小時。使反應(yīng)混合物進行薄層層析，用氯仿∶甲醇∶醋酸＝3∶3∶1(v/v/v)展開。通過苔黑酚-硫酸法證實反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果證實，瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3分別在中性至弱酸性條件下和弱堿性至弱酸性條件下呈現(xiàn)其消化瓊脂糖的活性。
(4)最適溫度于不同溫度下檢測瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3的酶活性。對于瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-4而言，抑制酶失活而且反應(yīng)迅速進行的溫度為37-42℃。
(5)熱穩(wěn)定性于48℃、50℃或60℃加熱瓊脂糖酶1-7或瓊脂糖酶4-3的純化酶溶液30秒鐘。然后在所加熱的溶液中加入含0.2％濃度瓊脂糖L03的10mM tris-鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣和10mM氯化鈉的溶液。使混合物于42℃反應(yīng)1小時。用沸水加熱1分鐘終止反應(yīng)。按照實施例1所述測定活性的方法定量反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果，瓊脂糖酶1-7于48℃處理后保留其25％活性，而瓊脂糖酶4-3于50℃處理后保留其22％活性，沒有熱處理的活性定義為100％。
(6)分子量通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定瓊脂糖酶1-7的分子量。用含SDS的10-20％聚丙烯酰胺梯度凝膠，將瓊脂糖酶1-7和分子量標記物(Bio-Rad，肌球蛋白(m.w.200,000)，β-半乳糖苷酶(m.w.116,250)、磷酸化酶b(m.w.97,400)、牛血清白蛋白(m.w.66,200)、卵清蛋白(m.w.45,000)、碳酸酐酶(m.w.31,000)、胰蛋白酶抑制劑(m.w.21,500)、溶菌酶(m.w.14,400))一起電泳。根據(jù)基于在凝膠中的遷移率測定，瓊脂糖酶1-7的分子量約95,000道爾頓。
通過平衡密度梯度離心測定瓊脂糖酶4-3的分子量。通過變化緩沖液中的15％-35％的甘油濃度制備密度梯度，所述緩沖液含有10mMtris-鹽酸(pH 7.0)、10mM氯化鈣和50mM氯化鈉。用2個5-ml離心管制備4.8ml線性密度梯度，使得最低層的甘油濃度為35％，而最高層的甘油濃度為15％。將100μl溶液覆蓋于一支離心管上層液，所述溶液含15μl分子量標記物Low Range(Bio-Rad)和15％濃度甘油的上述緩沖液。使100μl瓊脂糖酶4-3酶制劑覆蓋于另一支離心管上層液。利用擺動式轉(zhuǎn)子于45,000rpm、4℃將兩支離心管離心21小時。離心后，從每支離心管的頂部至底部收集各含250μl緩沖液的流分1-20。對從加入分子量標記物的離心管收集的相應(yīng)流分進行SDS-PAGE。對從加入酶制劑的離心管收集的相應(yīng)流分進行SDS-PAGE以及測量酶活性。根據(jù)含分子量標記物的流分的SDS-PAGE結(jié)果，在相當于分子量約65,000-85,000的流分第8-10號檢測到α-瓊脂糖酶活性峰。根據(jù)這些結(jié)果以及含所述酶制劑的流分的SDS-PAGE結(jié)果，估計瓊脂糖酶4-3的分子量約85,000。
(7)利用Edman降解法分析氨基酸序列用Edman降解法測定實施例1和2獲得的α-瓊脂糖酶1-7和α-瓊脂糖酶4-3的氨基酸序列。利用10-20％聚丙烯酰胺梯度凝膠，對含相當于10皮摩爾酶蛋白的瓊脂糖酶1-7或瓊脂糖酶4-3的純化酶制劑進行SDS-PAGE。電泳后，把在凝膠中分離的酶印跡到膜ProBlot(AppliedBiosystems)上。用蛋白質(zhì)測序儀G1000A(Hewlett Packard)分析吸附有酶的膜部分。結(jié)果測得瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3分別包含氨基酸序列P1Asp-Thr-Leu-Ser-Val-Glu-Ala-Glu-Met-Phe(SEQ ID NO1)和氨基酸序列P2Gly-Asp-Ile-Val-Ile-Glu-Leu-Glu-Asp-Phe-Asp-Ala-Thr-Gly-Thr-Thr-Gly-Arg-Val-Ala(SEQ ID NO2)。
實施例4產(chǎn)生瓊脂寡糖以1.0％(w/v)濃度在2ml反應(yīng)緩沖液(10mM tris-鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣、10mM氯化鈉)中加入瓊脂糖L03。再向其中加入2U純化的瓊脂糖酶1-7制劑。使混合物于42℃反應(yīng)16小時。反應(yīng)后，使反應(yīng)混合物通過0.22-μm濾膜(Millipore，編號SLGVL040S)過濾。在與在實施例1中用于測定本發(fā)明的所述酶的活性的相同條件下，利用高效液相層析分析過濾后的反應(yīng)混合物，以測定所產(chǎn)生的瓊脂寡糖。結(jié)果在反應(yīng)混合物中檢測到瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。因此，證實上述酶反應(yīng)產(chǎn)生這些較小的瓊脂寡糖。
實施例5用TKR1-7AGα和TKR4-3AGα制備染色體DNA制備人工海水(產(chǎn)品名稱Jamarine S；Jamarine Laboratory)。分別以0.3％(w/v)和0.02％(w/v)濃度向其中加入蛋白胨(DIFCO，編號0123-17-3)和酵母提取物(DIFCO，編號0127-17-9)。然后用3M碳酸鈉將pH調(diào)節(jié)至8.0。以0.1％(w/v)濃度向其中加入瓊脂(Nacalai Tesque，編號010-28)。用高壓滅菌器滅菌混合物。將10μlα-瓊脂糖酶生產(chǎn)菌株TKR1-7AGα和TKR4-3AGα之一的甘油原種接種到2ml所述培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)過夜。將1ml所述培養(yǎng)物接種到100ml所述相同培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)過夜。然后以8,000×g離心10分鐘收集細胞。將細胞懸浮于10ml緩沖液A(100mM氯化鈉、100mM tris-鹽酸鹽(pH 8.0)、10mM EDTA(pH 8.0))中。向其中加入0.25ml溶菌酶溶液(20mg/ml)。使混合物于37℃溫育1小時。然后向其中加入2.5ml含5％濃度SDS的緩沖液A。振搖下使獲得的混合物于60℃溫育20分鐘。向其中加入1.5ml蛋白酶K溶液(20mg/ml)。使混合物于37℃溫育過夜。然后加入幾乎等體積的酚，室溫下輕輕振搖混合物約10分鐘。以2,000×g離心混合物10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到冷乙醇中。用玻棒纏繞染色體DNA。重復所述步驟2次后，加入50μl RNA酶溶液(10mg/ml)，使所述混合物于37℃溫育10分鐘。通過乙醇沉淀從所述溶液回收染色體DNA，并懸浮于5ml緩沖液B(140mM氯化鈉、20mM tris-鹽酸鹽(pH 7.5)、1mM EDTA(pH 7.5))中。用相同緩沖液透析所述懸浮液過夜。然后從TKR1-7AGα和TKR1-7AGα分別獲得約1.5mg和約3.1mg染色體DNA。根據(jù)OD260nm/280nm檢測各DNA的純度。在各情況下純度測定值均約1.8。染色體DNA用于下文所述的克隆。
實施例6克隆α-瓊脂糖酶1-7基因用1.0％低熔點瓊脂糖凝膠對10μg用限制酶BamHI部分消化的TKR1-7AGα染色體DNA進行電泳。用溴化乙錠染色后，在紫外線照射下切取相當于4-10kb的部分。通過按照常規(guī)方法熱熔化從凝膠提取以及純化DNA。利用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo)使回收的DNA片段插入質(zhì)粒pUC19(Takara Shuzo)的BamHI位點中。用質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。使轉(zhuǎn)化體在含1.5％(w/v)濃度瓊脂和50μg/ml濃度氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長。于37℃培養(yǎng)過夜后，一個平板上生長約1000個轉(zhuǎn)化體。使20個平板再于25℃培養(yǎng)4天。結(jié)果觀測到2個菌落周圍的瓊脂降解。把各菌株接種到2ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過夜。檢測到由獲得細胞制備的粗提取物的α-瓊脂糖酶活性。按照常規(guī)方法提取各轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA。用限制酶BamHI消化測得各轉(zhuǎn)化體的插入DNA長度約7.2kb。根據(jù)限制酶消化譜型認為這些雜種質(zhì)粒彼此相同，命名為pAA1。將用質(zhì)粒pAA1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌命名并表示為大腸桿菌JM109/pAA1，于1999年5月26日(最初保藏日期)根據(jù)布達佩斯條約以保藏號FERM BP-6992保藏于日本國際貿(mào)易和工業(yè)部工業(yè)科技局的國立生命科學和人體技術(shù)研究所。
根據(jù)SEQ ID NO1表示的瓊脂糖酶1-7的氨基酸序列P1，設(shè)計SEQ ID NO3表示的混合引物1。采用該引物和與pUC載體特異性雜交、SEQ ID NO4表示的引物2以及pAA1作為模板進行PCR。
在0.5-ml試管中加入50ng pAA1、5μl ExTaq緩沖液、8μl dNTP混合物、1μl混合的引物1、1μl引物2和0.5μl TaKaRa ExTaq，以進行PCR。再加入無菌水使總體積為50μl。在所述溶液上方覆蓋50μl礦物油后，將試管置于自動基因擴增儀Thermal Cycler(Takara Shuzo)中。于94℃變性2分鐘后，進行30個PCR循環(huán)。每個循環(huán)包括于94℃變性1分鐘，引物于50℃退火2分鐘以及于72℃進行合成反應(yīng)3分鐘。PCR后，使全部反應(yīng)混合物在1.0％低熔點瓊脂糖凝膠中進行電泳。使從所述凝膠切除的約3.5kb的擴增DNA片段與pT7Blue(Novagen)連接。用Tap DNA聚合酶，按照雙脫氧鏈終止法從其N端側(cè)測定該DNA片段的核苷酸序列。根據(jù)如上所述測定的序列設(shè)計SEQID NO5表示的引物。利用該引物測定上游核苷酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在編碼對應(yīng)于SEQ ID NO1表示的氨基酸序列P1的核苷酸序列的上游存在編碼27個氨基酸的核苷酸序列，在其進一步的上游區(qū)存在SD樣序列，而pAA1含有編碼總計925個氨基酸組成的多肽的讀框(ORF)。該讀框的核苷酸序列和此讀框編碼的氨基酸序列分別示于SEQID NO12和14。從微生物TKR1-7AGα純化的α-瓊脂糖酶的N-末端序列P1等于SEQ ID NO13氨基酸序列第28號至第37號氨基酸的序列。
實施例7克隆α-瓊脂糖酶4-3基因根據(jù)SEQ ID NO2表示的瓊脂糖酶4-3的氨基酸序列P2第2-11號以及第12-20號氨基酸的序列，設(shè)計混合的引物3和4。利用LAPCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)使用這些引物克隆瓊脂糖酶4-3基因?；旌系囊?和4的序列分別示于SEQ ID NO6和7。
如下進行第一輪PCR。用限制酶BamHI完全消化由實施例5的TKR4-3AGα制備的染色體DNA。用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo)使BamHI接頭連接到消化的DNA末端。將一部分連接混合物置于0.5-ml試管中，以進行PCR，其中加入5μl 10×LA PCR緩沖液、8μl dNTP混合物、1μl混合引物3、1μl LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)附帶的引物Cl和0.5μl TaKaRa LATaq。再加入無菌水使總體積為50μl。在所述溶液上方覆蓋50μl礦物油后，將試管置于自動基因擴增儀Thermal Cycler(Takara Shuzo)中。于94℃變性2分鐘后，進行30個PCR循環(huán)。每個循環(huán)包括于94℃變性1分鐘，引物于50℃退火2分鐘以及于72℃進行合成反應(yīng)3分鐘。
用如此獲得的第一輪PCR產(chǎn)物進行第二輪PCR。在第一輪PCR所用的相同條件下，用1μL第一輪PCR反應(yīng)混合物作模板，以及混合引物4和LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)附帶的引物C2的組合進行PCR。去除上層覆蓋的礦物油后，使5μl反應(yīng)混合物在1.0％瓊脂糖凝膠中進行電泳。利用溴化乙錠染色DNA證實擴增的產(chǎn)物。結(jié)果觀測到約2kb的擴增產(chǎn)物，將所述DNA片段命名為4-3N。
從瓊脂糖凝膠切除此擴增片段，按照常規(guī)方法提取純化，并將其連接到載體pT7Blue。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。用獲得的轉(zhuǎn)化體按照雙脫氧鏈終止法測定4-3末端區(qū)核苷酸序列。
根據(jù)測定的4-3N末端區(qū)序列設(shè)計引物。利用LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)克隆位于4-3N上游以及下游的DNA片段。
根據(jù)如上所述測定的4-3N末端區(qū)中的N-末端周圍區(qū)序列設(shè)計、分別以SEQ ID NO8和9表示的引物5和6，使用它們克隆位于4-3N上游的DNA片段。如上所述進行克隆，以克隆4-3N，不同的是退火引物的溫度變?yōu)?5℃。結(jié)果獲得約1.0kb的DNA片段，命名為4-3U。
根據(jù)如上所述測定的4-3N末端區(qū)中的C-末端周圍區(qū)序列設(shè)計、分別以SEQ ID NO10和11表示的引物8和9，使用它們克隆位于4-3N下游的DNA片段。如上所述進行克隆，以克隆4-3N，不同的是退火引物的溫度變?yōu)?5℃。結(jié)果獲得約2.0kb的DNA片段，命名為4-3C。
將由此獲得的4-3UN和4-3C片段各自連接到載體pT7Blue(Novagen)。按照雙脫氧鏈終止法測定核苷酸序列。對如上所述測定的4-3N、4-3UN和4-3C DNA片段的核苷酸序列進行分析和序列對比，揭示一個讀框(ORF)編碼951個氨基酸組成的多肽。所述讀框的核苷酸序列和所述讀框的所述核苷酸序列編碼的氨基酸序列分別以SEQ IDNO13和15表示。在4-3UN中，發(fā)現(xiàn)編碼氨基酸序列P2的核苷酸序列、編碼183個氨基酸的上游核苷酸序列和更上游的SD樣序列。測得從微生物TKR4-3純化的α-瓊脂糖酶的N-末端氨基酸序列P2等于SEQ ID NO15氨基酸序列第184號至第203號氨基酸的序列。
如上所述獲得的瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3的氨基酸序列以及所述基因的核苷酸序列與β-瓊脂糖酶氨基酸序列及其基因的核苷酸序列沒有同源性，已知β-瓊脂糖酶以不同于本發(fā)明的瓊脂糖酶的方式裂解瓊脂糖的瓊脂糖消化酶。因此，認為這些序列絕對是新型的。
實施例8構(gòu)建表達α-瓊脂糖酶1-7的質(zhì)粒合成具有SEQ ID NO18序列的引物10。引物10是這樣一種引物它在第8至13號堿基含有限制酶NdeI的識別序列，在第14至25號堿基含對應(yīng)于α-瓊脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQ ID NO14)中的第28至31號氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列。
采用引物10和與pAA1的一部分載體pUC19雜交的引物2(SEQID NO4)以及用pAA1作模板進行PCR。
在0.5-ml試管中加入引物10和引物2各10皮摩爾、10ng作為模板的實施例6獲得的pAA1、5μl 10×ExTaq緩沖液、8μl dNTP混合物和0.5μl TaKaRa ExTaq，以進行PCR。再加入無菌水使總體積為50μl。將試管置于自動基因擴增儀Thermal Cycler(Takara Shuzo)中。于94℃變性2分鐘后，進行25個PCR循環(huán)。每個循環(huán)包括94℃1分鐘，55℃2分鐘以及72℃3分鐘。通過乙醇沉淀濃縮PCR產(chǎn)物并使其脫鹽，用限制酶NdeI(Takara Shuzo)和BamHI(Takara Shuzo)雙重消化，然后使其在1.0％瓊脂糖凝膠中進行電泳。分離、提取以及純化NdeI-BamHI消化產(chǎn)物。用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo)使純化產(chǎn)物與用NdeI和BamHI消化的pKF19k(Takara Shuzo)混合并連接。用10μl連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。使轉(zhuǎn)化體生長于含1.5％(w/v)濃度的瓊脂和50μg/ml濃度的卡那霉素的LB培養(yǎng)基上。用白色菌落制備質(zhì)粒，進行DNA測序，選擇所述PCR產(chǎn)物正確插入的質(zhì)粒，命名為pAA201。pAA201是編碼瓊脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQ ID NO14)第28至925號氨基酸的氨基酸序列的質(zhì)粒。
將插入pAA201的轉(zhuǎn)化體接種到2.5ml含50μg/ml卡那霉素和10mM氯化鈣的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過夜。取一部分培養(yǎng)物接種到2.5ml相同新鮮培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)直到指數(shù)生長期為止。此時以1.0mM終濃度加入IPTG。繼續(xù)于15℃培養(yǎng)過夜，以誘導目的蛋白表達。然后離心收集細胞，將其懸浮于150μl細胞破碎溶液(20mM tris鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣、10mM氯化鈉)中。超聲破碎細胞。離心使上清液提取物和沉淀物彼此分離，并用作利用瓊脂糖作底物檢測α-瓊脂糖酶活性的樣品。然后觀測提取物的活性。在100ml培養(yǎng)物中含有的活性比野生型菌株TKR1-7AGα活性高約25倍。
實施例9采用pT7BlueT載體表達α-瓊脂糖酶1-7的系統(tǒng)合成具有SEQ ID NO19序列的引物11。引物11是這樣一種引物它在第13至30號堿基具有對應(yīng)于α-瓊脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQID NO14)第28至33號氨基酸序列的核苷酸序列。
用引物11和引物2并使用pAA1作為模板進行PCR。在1.0％瓊脂糖凝膠中通過電泳分離PCR產(chǎn)物，提取以及純化。使純化PCR產(chǎn)物連接到設(shè)計用于克隆的載體pT7BlueT(Takara Shuzo)，以構(gòu)建表達載體。用于PCR的條件與實施例8所述條件相同。進行DNA測序，并選擇正確插入所述PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒。
選定的雜種質(zhì)粒命名為pAA301。pAA301是一個類似于pAA201的質(zhì)粒，編碼α-瓊脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQ ID NO14)第28至925號氨基酸序列。
使用pAA301轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，將獲得的轉(zhuǎn)化體接種到含50μg/ml氨芐青霉素和10mM氯化鈣的LB培養(yǎng)基中。利用IPTG誘導目的蛋白表達，按照以上實施例8所述測定α-瓊脂糖酶活性。然后觀測到提取物的活性。100ml所述培養(yǎng)物含有的活性比TKR1-7AGα的活性高約100倍。
實施例10利用pET16b表達α-瓊脂糖酶1-7的系統(tǒng)合成具有SEQ ID NO20序列的引物12。引物12是這樣一種引物它在第17至34號堿基具有與對應(yīng)于α-瓊脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQ ID NO14)第919至924號氨基酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，在第9至14號堿基具有限制酶BamHI識別序列。
利用引物10(SEQ ID NO18)和引物12(SEQ ID NO18)并使用pAA1作為模板，在實施例8所述條件下進行PCR。通過乙醇沉淀濃縮所擴增的片段并使其脫鹽，用NdeI(Takara Shuzo)和BamHI(TakaraShuzo)消化，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，提取以及純化。使所述產(chǎn)物連接到用NdeI和BamHI消化的pET16b(Takara Shuzo)中。獲得的雜種質(zhì)粒命名為pAA401。pAA401是類似于pAA201和pAA301的質(zhì)粒，編碼α-瓊脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQ ID NO14)第28至925號氨基酸的氨基酸序列。
使用pAA401轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，用獲得的轉(zhuǎn)化體如以上實施例8所述測定α-瓊脂糖酶活性，不同的是用氨芐青霉素代替卡那霉素作為藥物。然后觀測到提取物的活性。100ml所述培養(yǎng)物含有的活性比TKR1-7AGα的活性高約100倍。
實施例11構(gòu)建表達α-瓊脂糖酶4-3的質(zhì)粒合成具有SEQ ID NO21序列的引物13和具有SEQ ID NO22序列的引物14。
引物13是這樣一種引物它在第12至17號堿基具有限制酶NdeI識別序列，在第18至29號堿基具有與對應(yīng)于α-瓊脂糖酶4-3氨基酸序列(SEQ ID NO15)第184至187號氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列。
引物14是這樣一種引物它在第8至13號堿基具有限制酶BamHI識別序列，并且具有與克隆獲得的α-瓊脂糖酶4-3基因的讀框下游區(qū)雜交的序列。
利用引物13和14并使用野生型菌株TKR4-3AGα的染色體DNA作為模板進行PCR。制備PCR反應(yīng)混合物，它含有引物13和14各10皮摩爾、10ng用作模板的用限制酶BamHI消化的野生型菌株TKR4-3AGα的染色體DNA和ExTaq(Takara Shuzo)。于94℃變性2分鐘后，進行25個PCR循環(huán)。每個循環(huán)包括94℃1分鐘，50℃2分鐘以及72℃3分鐘。通過乙醇沉淀濃縮PCR產(chǎn)物，用限制酶NdeI(Takara Shuzo)和BamHI(Takara Shuzo)雙重消化。在1.0％瓊脂糖凝膠中電泳分離NdeI-BamHI消化產(chǎn)物，提取以及純化。如實施例8所述構(gòu)建具有pKF19k的雜種質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。用獲得的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒，選擇所述PCR產(chǎn)物以正確方向插入的的質(zhì)粒，命名為pAH101。pAH101是編碼α瓊脂糖酶4-3氨基酸序列(SEQ ID NO15)第184至951號氨基酸的氨基酸序列的質(zhì)粒。
用質(zhì)粒pAH101轉(zhuǎn)化的大腸桿菌命名并表示為大腸桿菌JM109/pAH101，于2000年1月27日根據(jù)布達佩斯條約以保藏號FERM BP-7008保藏于日本國際貿(mào)易和工業(yè)部工業(yè)科技局的國立生命科學和人體技術(shù)研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)。
如以上實施例8所述測定具有pAH101的轉(zhuǎn)化體的α-瓊脂糖酶活性。然后觀測到所述提取物的活性。100ml培養(yǎng)物含有的活性比野生型菌株TKR4-3AGα的活性高約15倍。
實施例12利用pET16b表達α-瓊脂糖酶4-3的系統(tǒng)合成具有SEQ ID NO23序列的引物15。
引物15是這樣一種引物它在第10至15號堿基具有限制酶BamHI識別序列，在第18至35號堿基具有與對應(yīng)于α-瓊脂糖酶4-3氨基酸序列(SEQ ID NO15)第945至950號氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
利用引物13和15并使用實施例11所述的野生型菌株TKR4-3AGα的染色體DNA作為模板，在實施例8所述的條件下進行PCR。通過乙醇沉淀濃縮所擴增的PCR片段，用限制酶NdeI和BamHI消化，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，提取以及純化。使所述產(chǎn)物連接到用NdeI和BamHI消化的pET16b(Takara Shuzo)中。獲得的雜種質(zhì)粒命名為pAH201。pAH201是編碼α瓊脂糖酶4-3氨基酸序列(SEQ ID NO15)第184至950號氨基酸的氨基酸序列的質(zhì)粒。
用pAH201轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，獲得的轉(zhuǎn)化體用來如以上實施例8所述測定α-瓊脂糖酶活性，不同的是用氨芐青霉素代替卡那霉素作為藥物。然后觀測到所述提取物的活性。100ml培養(yǎng)物含有的活性比TKR4-3AGα活性高約75倍。
實施例13修飾蛋白的活性如下所述通過基因工程制備修飾蛋白。測定修飾蛋白的α-瓊脂糖酶活性。
合成具有SEQ ID NO24序列的引物16。
引物16是這樣一種引物它在第3至11號堿基具有對應(yīng)于α瓊脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQ ID NO14)的第172至174號氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列，在第18至32號堿基具有對應(yīng)于α-瓊脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQ ID NO14)的第177至181號氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列，并且在第12-17號堿基具有限制酶NdeI識別序列。
利用引物16和引物2(SEQ ID NO4)并使用pAA1作為模板進行PCR。使所述產(chǎn)物連接到pKF19k，如實施例8所述轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。用獲得的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒。通過證實連接位點的DNA序列獲得的雜種質(zhì)粒命名為pAA501。pAA501是編碼缺失α-瓊脂糖酶1-7直至第176號氨基酸的部分的多肽(即SEQ ID NO14第177至925號氨基酸的氨基酸序列)的質(zhì)粒。
如實施例8所述培養(yǎng)用pAA501轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109，并用IPTG誘導pAA501編碼的蛋白的表達，然后觀測提取物的α-瓊脂糖酶活性。隨后觀察到所述提取物的α-瓊脂糖酶活性。
實施例14DNA印跡雜交用插入α-瓊脂糖酶4-3克隆pAH101的片段作探針，針對野生型菌株TKR1-7AGα的染色體DNA進行DNA雜交。按照DIG DNA標記/檢測試劑盒(Roche)的方案進行以下步驟。在這種情況下，用限制酶NdeI和BamHI消化pAH101。通過瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)生的約2.4kb片段，提取和純化。按照上述試劑盒的方案標記約1.0μg所述純化片段并用作探針。
用BamHI消化約2.0μg TKR1-7AGα的染色體DNA，在1.0％瓊脂糖凝膠中電泳。按照常規(guī)方法用0.4N氫氧化鈉將DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Amersham)上。然后于68℃預(yù)雜交1小時。熱變性標記探針，并加入其中。用含6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt’s和100mg/ml鯡魚精子DNA的溶液于68℃雜交過夜。所述膜用2×SSC、0.1％(w/v)SDS中于室溫下洗滌2次，每次5分鐘，然后用0.1×SSC、0.1％(w/v)SDS于68℃洗滌2次，每次15分鐘，以去除過量的探針。然后按照所述方案進行檢測反應(yīng)。結(jié)果在相應(yīng)于約7.2kb的位置觀測到一條帶。如上所述，通過利用α-瓊脂糖酶4-3基因作探針在嚴格條件下進行檢測，能夠檢測到編碼活性α-瓊脂糖酶的基因，即野生型菌株TKR1-7AGα的α-瓊脂糖酶的基因。比較瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3讀框的完整序列揭示，它們的氨基酸序列和基因的核苷酸序列的同源性分別為51％和61％。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供新型α-瓊脂糖酶?？衫盟雒钢苯佑森傊钱a(chǎn)生在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的低聚合程度的瓊脂寡糖(例如瓊脂二糖和瓊脂四糖)。用本發(fā)明的α-瓊脂糖酶產(chǎn)生的瓊脂寡糖具有生理活性，例如誘導細胞凋亡活性、抑癌活性、各種抗氧化劑活性、免疫調(diào)節(jié)活性和抗過敏活性。因此，它們可用于藥用組合物、食品和飲料領(lǐng)域。
本發(fā)明首次公開了α-瓊脂糖酶的氨基酸序列和核苷酸序列。因此，可提供編碼具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的基因。本發(fā)明還提供利用所述基因通過基因工程生產(chǎn)具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的工業(yè)上有用的方法。
此外，在利用所述基因的基因工程生產(chǎn)方法中，不需要在培養(yǎng)基中加入瓊脂糖誘導產(chǎn)生α-瓊脂糖酶。因此，認為培養(yǎng)時能夠節(jié)省力而且所述酶容易純化。
另外，基于本發(fā)明首次提供α-瓊脂糖酶基因的事實，根據(jù)所述基因的信息，本發(fā)明提供所述基因編碼的重組多肽、特異性結(jié)合所述多肽的抗體或其片段、以及特異性雜交α-瓊脂糖酶的探針或引物。
序列表獨立文本SEQ ID NO1瓊脂糖酶1-7的N-末端氨基酸序列。
SEQ ID NO2瓊脂糖酶4-3的N-末端氨基酸序列。
SEQ ID NO3設(shè)計用于利用pAA1作為模板進行PCR的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO4設(shè)計用于利用pAA1作為模板進行PCR的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO5設(shè)計用于對pAA1進行DNA測序的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO6設(shè)計用于擴增DNA片段4-3N的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO7設(shè)計用于擴增DNA片段4-3N的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO8設(shè)計用于克隆DNA片段4-3UN的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO9設(shè)計用于克隆DNA片段4-3UN的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO10設(shè)計用于克隆DNA片段4-3C的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO11設(shè)計用于克隆DNA片段4-3C的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO12瓊脂糖酶1-7基因中的ORF核苷酸序列。
SEQ ID NO13瓊脂糖酶4-3基因中的ORF核苷酸序列。
SEQ ID NO14瓊脂糖酶1-7的氨基酸序列。
SEQ ID NO15瓊脂糖酶4-3的氨基酸序列。
SEQ ID NO16設(shè)計用于擴增16S核糖體的DNA片段的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO17設(shè)計用于擴增16S核糖體的DNA片段的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO18設(shè)計用于構(gòu)建表達瓊脂糖酶1-7的質(zhì)粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO19設(shè)計用于構(gòu)建表達瓊脂糖酶1-7的質(zhì)粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO20設(shè)計用于構(gòu)建表達瓊脂糖酶1-7的質(zhì)粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO21設(shè)計用于構(gòu)建表達瓊脂糖酶4-3的質(zhì)粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO22設(shè)計用于構(gòu)建表達瓊脂糖酶4-3的質(zhì)粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO23設(shè)計用于構(gòu)建表達瓊脂糖酶4-3的質(zhì)粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO24設(shè)計用于構(gòu)建表達瓊脂糖酶1-7的質(zhì)粒的寡核苷酸。
權(quán)利要求
1.一種具有以下物理化學特性的α-瓊脂糖酶(1)作用水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵；(2)底物特異性作用于瓊脂糖和瓊脂己糖以及比瓊脂己糖更長的瓊脂寡糖，但是對瓊脂四糖沒有作用；(3)最適溫度于55℃或更低溫度呈現(xiàn)其酶活性；以及(4)熱穩(wěn)定性于48℃處理30秒鐘后保留其20％或更高活性。
2.按照權(quán)利要求1的α-瓊脂糖酶，它可得自微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)。
3.按照權(quán)利要求1或2的α-瓊脂糖酶，它包含SEQ ID NO14氨基酸序列的第177號氨基酸至第925號氨基酸的749個殘基組成的氨基酸序列、或在所述749個殘基組成的氨基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個氨基酸的氨基酸序列。
4.按照權(quán)利要求1或2的α-瓊脂糖酶，它包含SEQ ID NO15氨基酸序列的第184號氨基酸至第950號氨基酸的767個殘基組成的氨基酸序列、或在所述767個殘基組成的氨基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個氨基酸的氨基酸序列。
5.一種基因，它編碼權(quán)利要求1-4任一項定義的α-瓊脂糖酶。
6.按照權(quán)利要求5的基因，它可得自微生物TKR1-7AGα(FERMBP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)。
7.按照權(quán)利要求5或6的基因，它編碼一種α-瓊脂糖酶，該α-瓊脂糖酶包含SEQ ID NO14氨基酸序列的第177號氨基酸至第925號氨基酸的749個殘基組成的氨基酸序列、或在所述749個殘基組成的氨基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個氨基酸的氨基酸序列。
8.按照權(quán)利要求5或6的基因，它編碼一種α-瓊脂糖酶，該α-瓊脂糖酶包含SEQ ID NO15氨基酸序列的第184號氨基酸至第950號氨基酸的767個殘基組成的氨基酸序列、或在所述767個殘基組成的氨基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個氨基酸的氨基酸序列。
9.按照權(quán)利要求5或6的基因，它包含SEQ ID NO12核苷酸序列的第529號堿基至第2775號堿基的2247個堿基組成的核苷酸序列、或在所述2247個堿基組成的核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個堿基的核苷酸序列。
10.按照權(quán)利要求5或6的基因，它包含SEQ ID NO13核苷酸序列的第550號堿基至第2850號堿基的2301個堿基組成的核苷酸序列、或在所述2301個堿基組成的核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個堿基的核苷酸序列。
11.一種基因，它可與權(quán)利要求5-10任一項定義的基因在嚴格條件下雜交并編碼具有以下物理化學特性的α-瓊脂糖酶(1)作用水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵；(2)底物特異性作用于瓊脂糖和瓊脂己糖以及比瓊脂己糖更長的瓊脂寡糖，但是對瓊脂四糖沒有作用；(3)最適溫度于55℃或更低溫度呈現(xiàn)其酶活性；以及(4)熱穩(wěn)定性于48℃處理30秒鐘后保留其20％或更高活性。
12.一種重組DNA分子，它包含權(quán)利要求5-11任一項定義的基因。
13.一種轉(zhuǎn)化體，它帶有權(quán)利要求12定義的重組DNA分子。
14.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1-4任一項定義的α-瓊脂糖酶的方法，包括培養(yǎng)能夠產(chǎn)生權(quán)利要求1-4任一項定義的α-瓊脂糖酶的微生物以及從所述培養(yǎng)物收集所述α-瓊脂糖酶。
15.按照權(quán)利要求14的方法，包括培養(yǎng)屬于微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)所屬微生物屬的微生物以及從所述培養(yǎng)物收集所述α-瓊脂糖酶。
16.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1-4任一項定義的α-瓊脂糖酶的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求13定義的轉(zhuǎn)化體以及從所述培養(yǎng)物收集α-瓊脂糖酶。
17.一種產(chǎn)生瓊脂寡糖的方法，包括用權(quán)利要求1-4任一項定義的α-瓊脂糖酶消化瓊脂糖以及從獲得的消化物收集瓊脂寡糖。
全文摘要
具有以下物理化學特性的α－瓊脂糖酶:(1)作用:水解3,6－脫水－L－半乳糖和D－半乳糖之間的α－1,3鍵;(2)底物特異性:作用于瓊脂糖和瓊脂己糖以及更長瓊脂寡糖,而不作用于瓊脂四糖;(3)最適溫度:于55℃或更低溫度呈現(xiàn)其酶活性;以及(4)熱穩(wěn)定性:于48℃處理30秒鐘后保有其20%或更高活性。
文檔編號C12N9/24GK1347452SQ00806331
公開日2002年5月1日 申請日期2000年2月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月23日
發(fā)明者友野潤, 野村佳子, 佐川裕章, 酒井武, 加藤郁之進 申請人:寶酒造株式會社