專利名稱：編碼植物脂酶的dna、轉(zhuǎn)基因植物和控制植物衰老的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼植物多肽并表現(xiàn)出衰老誘導(dǎo)表達(dá)的的多核苷酸，含有呈反義方向的所述多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物，以及控制植物衰老的方法。更具體地講，本發(fā)明涉及一種植物脂酶基因，其表達(dá)是由衰老的開始誘導(dǎo)的，以及用所述脂酶基因控制植物的衰老。
現(xiàn)有技術(shù)衰老是植物生命中生物學(xué)發(fā)育的終結(jié)期。它預(yù)示著發(fā)生在各種生物學(xué)組構(gòu)水平上的死亡，包括全植株、器官、花、果實(shí)、組織和單細(xì)胞。
細(xì)胞膜損傷是衰老的早期基本特征。脂類代謝，特別是膜脂代謝是細(xì)胞衰老的若干生化證據(jù)之一。例如，隨著衰老的發(fā)展，玫瑰花瓣維持較高的乙酰水解酶活性，與它相伴的是膜功能的喪失(Borochov等，植物生理學(xué)，1982，69，296-299)。細(xì)胞膜損傷是衰老的早期特有的特征，逐漸形成增強(qiáng)了的可滲透性，喪失離子梯度并減弱關(guān)鍵膜蛋白，如離子泵的功能(Brown等，植物生理學(xué)論文，X卷，學(xué)術(shù)出版社，1991，227-275頁)。膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的這種衰減，大多歸因于脂酶介導(dǎo)的磷脂代謝。在衰老的花瓣、葉片、子葉和成熟的果實(shí)上，證實(shí)了磷脂的喪失(Thompson，J.E.，植物的衰老和老化，學(xué)術(shù)出版社，SanDiego，1988，51-83頁)，并且，它似乎使膜雙層的分子組構(gòu)發(fā)生了大的變化，隨著衰老的發(fā)展會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能的損傷。具體地講，對(duì)多種衰老植物組織所做的研究業(yè)已提供了膜中脂相分離的證據(jù)，這似乎歸因于在膜雙層中脂類代謝物的積累(McKersie和Thompson，1979，生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(bào)，508197-212，Chia等，1981，植物生理學(xué)，67415-420)。有越來越多的證據(jù)表明，衰老組織中脂類的大部分代謝是通過基因表達(dá)的衰老特異性變化而實(shí)現(xiàn)的(Buchanan-Wollaston，V.，實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志，1997，307181-199)。
衰老的開始可以通過不同的內(nèi)部和外部因素誘導(dǎo)。例如，乙烯在許多植物的多種發(fā)育過程，如種子發(fā)芽、幼苗發(fā)育、果實(shí)成熟和花老化中起作用。植物中乙烯的產(chǎn)生還可能與外傷相關(guān)，所述外傷是通過機(jī)械創(chuàng)傷、化合物、脅迫(如通過溫度和水量改變產(chǎn)生)和通過疾病誘導(dǎo)的。在很多植物中，乙烯都參與了葉片衰老的調(diào)控，但用轉(zhuǎn)基因植物和乙烯響應(yīng)突變體獲得的證據(jù)表明，盡管乙烯對(duì)衰老有影響，但它不是該過程的重要調(diào)節(jié)子。在很多植物中，乙烯似乎在果實(shí)成熟或衰老中不起作用。例如，在諸如草莓的無轉(zhuǎn)變期植物的果實(shí)成熟中，在諸如金針菜的某些花的衰老中，以及在諸如擬南芥屬的某些葉片的衰老中，特別是在不需要乙烯信號(hào)的單子葉植物中乙烯似乎不起作用(Smart，C.M.，1994，新植物學(xué)，126419-448；Valpuesta等，1995，植物分子生物學(xué)，28575-582)。
能誘導(dǎo)衰老提前開始的外部因素包括環(huán)境脅迫，如溫度、干旱、光照較差或營養(yǎng)供應(yīng)，以及病原體的侵襲。對(duì)于自然(與年齡相關(guān))衰老來說，環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的衰老的特征是細(xì)胞膜完整性的喪失。具體地講，接觸環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的電解質(zhì)滲漏反映了膜損傷(Sharom等，1994，植物生理學(xué)，105305-308；Wright和Simon，1973，實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志，24400-411；Wright，M.，1974，植物，12063-69；和Eze等，1986，植物生理學(xué)，68323-328)，膜磷脂含量的降低(Wright，M.，1974，植物，12063-69)和脂相轉(zhuǎn)變(Sharom等，1994，植物生理學(xué)，105305-308)，以上所有現(xiàn)象均可歸因于脂酶的作用。受到環(huán)境脅迫的植物組織也會(huì)產(chǎn)生乙烯，通常稱為脅迫乙烯(Buchanan-Wollaston，V.，1997，實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志，48181-199；Wright，M.，1974，植物，12063-69)。如上文所述，已知乙烯能導(dǎo)致某些植物的衰老。
會(huì)導(dǎo)致滲漏的膜損傷也是組織衰老的重要特征，并且有證據(jù)表明它恢復(fù)了來自膜磷脂的脂肪酸的脫酯化(McKersie，B.D.，Senarata，T.，Walker，M.A.，Kendall，E.J.和Hetherington，P.R.參見植物衰老和老化，L.D.Nooden和A.C.Leoopold著，學(xué)術(shù)出版社，1988，441-464頁)。
目前，尚沒有能廣泛用于控制由諸如環(huán)境脅迫的內(nèi)部或外部因素誘導(dǎo)的衰老開始的方法。目前，用于控制新鮮的、易壞的植物產(chǎn)品，如水果、鮮花和蔬菜的衰老，并延長其貨架壽命的技術(shù)主要依賴于減少乙烯的生物合成。例如，US5824875披露了轉(zhuǎn)基因天竺葵植物，由于它降低了乙烯的水平而具有較長的貨架壽命，乙烯水平的降低，是由于三個(gè)呈反義方向的1-氨基-環(huán)丙烷-羧酸(ACC)合成酶基因之一的表達(dá)所導(dǎo)致的。因此，該技術(shù)僅能應(yīng)用于對(duì)乙烯敏感的、范圍有限的植物。
通過減少乙烯的生物合成，還可以延長某些果實(shí)的貨架壽命，這樣能導(dǎo)致成熟進(jìn)行的更慢一些。由于這些果實(shí)的衰老是在成熟以后誘導(dǎo)的，減少乙烯生物合成對(duì)貨架壽命的影響是間接的。用于延緩果實(shí)成熟的另一種方法是改變聚半乳糖醛酸酶的細(xì)胞含量，這種酶是在成熟早期合成的軟化酶。該方法與控制乙烯生物合成的相似之處在于，它也是僅僅是間接地影響衰老，并且僅可應(yīng)用于有限的植物。
因此，需要一種可應(yīng)用于多種植物的控制植物衰老的方法，因此，有必要開發(fā)一種能應(yīng)用于所有類型植物的與乙烯敏感性無關(guān)的衰老調(diào)控技術(shù)。
發(fā)明概述本發(fā)明基于編碼香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶的全長cDNA克隆的發(fā)現(xiàn)和克隆。本文披露了所述衰老誘導(dǎo)脂酶基因的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶基因的核苷酸序列，業(yè)已被用作異源探針，在若干以類似方式調(diào)控的植物中，檢測相應(yīng)的基因或RNA轉(zhuǎn)錄物。
本發(fā)明提供了一種用于對(duì)植物進(jìn)行遺傳學(xué)修飾，以便控制衰老(年齡相關(guān)的衰老或環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的衰老)的開始的方法。沿反方向?qū)⒈景l(fā)明衰老誘導(dǎo)脂酶的核苷酸序列、及片段或所述片段的組合導(dǎo)入植物細(xì)胞，以便抑制內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶基因的表達(dá)，從而降低內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶的含量，并改變轉(zhuǎn)化植物的衰老。
使用本發(fā)明的方法，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因植物，并監(jiān)測其生長和發(fā)育。由于降低了衰老誘導(dǎo)脂酶的含量，而表現(xiàn)出相對(duì)植物生長、開花而言，具有延長了的壽命或貨架壽命，降低了的果實(shí)易壞性，降低了的組織老化和/或降低了的葉片變黃的植物或分離的植物部分(例如，切穗、花、營養(yǎng)組織、果實(shí)、種子或葉片)被選擇作為具有改善了的特性的理想產(chǎn)品，包括減弱了的葉片變黃，減弱了的花瓣脫落，在運(yùn)輸和儲(chǔ)存期間減弱了的果實(shí)腐爛。繁殖所述優(yōu)良植物。類似地，選擇對(duì)環(huán)境脅迫具有增強(qiáng)了的抗性，例如，對(duì)低溫(寒冷)、干旱、感染等的降低了的易感性的植物作為優(yōu)良產(chǎn)品。
在一方面，本發(fā)明涉及編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的分離的DNA分子，其中，所述DNA分子能與SEQ ID NO1雜交，或者能與SEQ ID NO1雜交的所述分離的DNA分子的功能性衍生物。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所述分離的DNA分子具有SEQ ID NO1的核苷酸序列，即與SEQ ID NO1的互補(bǔ)性為100％(序列相同性)。在本發(fā)明這一方面的另一種實(shí)施方案中，所述分離的DNA包括SEQ ID NO4的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，提供了一種由上述DNA分子編碼的分離的蛋白或其功能性衍生物。一種優(yōu)選的蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，或者是它的功能性衍生物。
本發(fā)明還提供了一種編碼互補(bǔ)于上述DNA分子的RNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分的RNA分子的反義寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述RNA分子能與所述RNA轉(zhuǎn)錄物雜交，因此，改變了內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶的表達(dá)。所述反義寡核苷酸或多核苷酸可以是完整長度，或者優(yōu)選具有大約6-大約100個(gè)核苷酸。
所述反義寡核苷酸或多核苷酸大體上互補(bǔ)于編碼衰老誘導(dǎo)脂酶DNA分子的一股鏈的至少一部分，其中，所述編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子能與SEQ ID NO1雜交，或者大體上互補(bǔ)于由編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子編碼的RNA序列的至少一部分。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸大體上互補(bǔ)于SEQ ID NO1或由SEQ ID NO1所編碼的RNA轉(zhuǎn)錄物的一股核苷酸序列的至少一部分。在另一種實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸大體上互補(bǔ)于編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子的一股鏈的5’非編碼部分的至少一部分，其中，所述DNA分子能與SEQ ID NO1雜交。在另一種實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸大體上互補(bǔ)于SEQ ID NO4或由SEQ ID NO4所編碼的RNA轉(zhuǎn)錄物的一股核苷酸序列的開放讀框的一部分。
本發(fā)明還涉及用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體，它包括(a)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它大體上互補(bǔ)于(1)編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子的一股鏈的至少一部分，其中，所述編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子能與SEQ ID NO1雜交，或(2)由所述編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子所編碼的RNA序列的至少一部分；和
(b)可操作地連接于所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調(diào)控序列，因此，所述反義寡核苷酸或多核苷酸能在用它轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞中表達(dá)。
所述調(diào)控序列包括能在轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型的或組成型的。所述調(diào)控序列可選擇性地包括一個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)。
本發(fā)明還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞，由所述細(xì)胞產(chǎn)生的小植株或成熟植株，或所述小植株或植株的植物部分。
本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)與未修飾過的植物相比具有降低了的衰老誘導(dǎo)脂酶含量的植物的方法，包括(1)用上述載體轉(zhuǎn)化植物；(2)讓所述植物至少生長到小植株階段；(3)測定所述轉(zhuǎn)化植株或小植株的改變了的衰老誘導(dǎo)脂酶活性，和/或改變了的衰老和/或改變了的環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的衰老和/或乙烯誘導(dǎo)的衰老；和(4)選擇并生長與非轉(zhuǎn)化過植物相比具有改變了的衰老誘導(dǎo)脂酶活性，和/或改變了的衰老和/或改變了的環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的衰老或乙烯誘導(dǎo)的衰老的植物。
按上述方法生產(chǎn)的植物、或后代、雜交種、克隆或植物部分，優(yōu)選具有降低了的衰老誘導(dǎo)脂酶表達(dá)和推遲了的衰老和推遲了的脅迫誘導(dǎo)的衰老或乙烯誘導(dǎo)的衰老。
本發(fā)明還涉及一種抑制植物細(xì)胞中內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶表達(dá)的方法，該方法包括(1)將包括以下部分的載體整合到所述植物的基因組中(A)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它大體上互補(bǔ)于(i)編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子的一股鏈的至少一部分，其中，所述編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子能與SEQ ID NO1雜交，或(ii)由所述衰老誘導(dǎo)脂酶基因所編碼的RNA序列的至少一部分；和(B)可操作地連接于所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調(diào)控序列，因此，所述反義寡核苷酸或多核苷酸能表達(dá)；和(2)生長所述植物，以便轉(zhuǎn)錄所述反義寡核苷酸或多核苷酸，并且，該轉(zhuǎn)錄物結(jié)合于所述內(nèi)源RNA上，因此抑制了所述衰老誘導(dǎo)脂酶基因的表達(dá)。
附圖簡述


圖1表示由從香石竹花cDNA文庫中獲得的衰老誘導(dǎo)脂酶cDNA克隆(SEQ ID NO1)編碼的衍生氨基酸序列。該氨基酸序列上的共有基序如下單下劃線，酰胺化位點(diǎn)；下部點(diǎn)劃線，蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)；雙下劃線，N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)；方框，cAMP磷酸化位點(diǎn)；加陰影的方框，酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)；加交叉斜線的方框，脂酶家族的共有序列；點(diǎn)劃線方框，N-糖基化位點(diǎn)。
圖2表示與脂酶樣蛋白的部分序列排比的衍生的全長香石竹花瓣衰老誘導(dǎo)脂酶氨基酸序列。Carlip，香石竹花瓣衰老誘導(dǎo)脂酶的全長序列(SEQ ID NO11)；arlip，源于擬南芥的脂酶樣蛋白的部分序列(GenBank保藏號(hào)AL021710)(SEQ ID NO12)；ipolip，源于Ipomea的脂酶樣序列的部分序列(GenBank保藏號(hào)U55867)(SEQ ID NO13)；arlipi，源于擬南芥的脂酶樣蛋白的部分序列(GenBank保藏號(hào)U93215)(SEQ ID NO14)。在上述三種或四種序列上相同的氨基酸上加方框。
圖3表示通過在大腸桿菌中表達(dá)香石竹脂酶cDNA所獲得的融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡分析。用所述衰老誘導(dǎo)脂酶蛋白的抗體檢測所述Western印跡。泳道1，麥芽糖結(jié)合蛋白；泳道2，由香石竹脂酶通過一個(gè)蛋白水解(因子Xa)裂解位點(diǎn)與麥芽糖結(jié)合蛋白cDNA融合的融合蛋白；泳道3用因子Xa部分裂解過的融合蛋白，形成了游離的脂酶蛋白(50.2kDa)和游離的麥芽糖結(jié)合蛋白。
圖4是從不同發(fā)育階段的香石竹花瓣中分離的RNA的Northern印跡分析。圖4A是總RNA的溴化乙錠染色的凝膠。每一個(gè)泳道含有10微克RNA。圖4B是用32P-dCTP-標(biāo)記的全長香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶cDNA檢測的所述Northern印跡的放射性自顯影照片。
圖5是原位驗(yàn)證解脂酰基水解酶，即通過在大腸桿菌中超量表達(dá)香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶cDNA所獲得的蛋白產(chǎn)物的脂酶活性。mal，在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中僅含有麥芽糖結(jié)合蛋白的大腸桿菌細(xì)胞；mLip，在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中僅含有由香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶與麥芽糖結(jié)合蛋白融合所構(gòu)成的融合蛋白的大腸桿菌細(xì)胞；40mal/40mLip，在補(bǔ)充了Tween40的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中僅含有麥芽糖結(jié)合蛋白[mal]的大腸桿菌細(xì)胞或含有脂酶-麥芽糖結(jié)合蛋白融合產(chǎn)物[mLip]的大腸桿菌細(xì)胞；60mal/60mLip，在補(bǔ)充了Tween60的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中僅含有麥芽糖結(jié)合蛋白[mal]的大腸桿菌細(xì)胞或含有脂酶-麥芽糖結(jié)合蛋白融合產(chǎn)物[mLip]的大腸桿菌細(xì)胞。
圖6A表示香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶的開放讀框的限制酶圖譜。有關(guān)數(shù)字表示該開放讀框中的核苷酸。
圖6B是用香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶cDNA檢測的用各種限制酶消化過的香石竹基因組DNA的Southern印跡分析。
圖7是香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶cDNA克隆的核苷酸序列。實(shí)下劃線，所述香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶cDNA的非編碼序列；無下劃線的序列是開放讀框。
圖8是香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶cDNA的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖9A是表示接受0.5ppm乙烯處理15小時(shí)的II期花瓣中香石竹脂酶表達(dá)的Northern印跡分析。圖9A是表示每一個(gè)泳道中加了相同量的香石竹RNA的溴化乙錠染色的凝膠(花瓣泳道1和2；葉片泳道3和4；+，用乙烯處理；-，未處理過的)；圖9B是用標(biāo)記過的全長香石竹花瓣衰老誘導(dǎo)脂酶cDNA檢測的圖9A所示凝膠的Northern印跡的放射性自顯影。
圖10是番茄葉片基因組衰老誘導(dǎo)脂酶的部分核苷酸序列(SEQ IDNO6)和相應(yīng)的推測氨基酸序列。在保守的脂酶共有基序上加陰影。用于產(chǎn)生所述基因組片段的引物的序列分別加下劃線。
圖11是表示寒冷對(duì)膜滲漏影響的棒圖。番茄植株在8℃下冷凍48小時(shí)，然后回溫到室溫。對(duì)沒有冷凍過的對(duì)照植株和冷凍了6和24小時(shí)的植株的葉子圓切片進(jìn)行擴(kuò)散滲漏(μMhos)測定。
圖12是從在8℃下冷凍了48小時(shí)，并回溫到環(huán)境溫度24小時(shí)的植物中分離的番茄葉片RNA的Northern印跡分析。
圖12A是總?cè)~片RNA的溴化乙錠染色的凝膠。
圖12B是用32P-dCTP-標(biāo)記的全長香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶cDNA檢測的所述Northern印跡的放射性自顯影。
圖13是擬南芥屬EST(基因GenBank保藏號(hào)N38227)的部分核苷酸序列(SEQ ID NO15)和相應(yīng)的推測氨基酸序列(SEQ ID NO16)，它與香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶在64個(gè)氨基酸的片段上具有55.5％的相同性。在保守的脂酶共有基序上加陰影。
發(fā)明詳述提供了改變植物細(xì)胞中衰老誘導(dǎo)脂酶基因表達(dá)的方法和組合物。植物中衰老誘導(dǎo)脂酶基因表達(dá)的改變會(huì)導(dǎo)致衰老開始的推遲，和改善了的對(duì)環(huán)境脅迫的抗性，因此，具有延長了植物的貨架壽命和/或生長期。
業(yè)已從用香石竹花的衰老花瓣的mRNA制備的cDNA文庫中分離了編碼具有衰老誘導(dǎo)表達(dá)的香石竹脂酶基因的全長cDNA序列。將相當(dāng)于所述分離的香石竹花脂酶cDNA序列的特定片段和全長香石竹脂酶cDNA的多核苷酸探針用于測定在衰老的香石竹葉片中、成熟的番茄果實(shí)中和衰老的綠豆葉片中、以及環(huán)境脅迫的(冷凍的)番茄葉片中編碼脂酶基因的mRNA的存在。通過用香石竹脂酶cDNA設(shè)計(jì)的引物制備聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物，使用番茄葉片基因組DNA作模板。該P(yáng)CR產(chǎn)物含有編碼包括保守的脂酶共有基序ITFTGHSLGA(SEQ IDNO3)在內(nèi)的部分蛋白序列的部分開放讀框。所述番茄核苷酸序列與香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶序列具有53.4％的序列相同性，與擬南芥屬脂酶序列具有43.5％的相同性。所述擬南芥屬脂酶序列與香石竹核苷酸序列有44.3％的相同性。
通過抗細(xì)胞質(zhì)脂蛋白顆粒(香石竹脂酶的一個(gè)來源)的抗體篩選用衰老的香石竹花瓣制備的cDNA表達(dá)文庫，分離本發(fā)明的衰老誘導(dǎo)脂酶基因。獲得了相當(dāng)于所述衰老誘導(dǎo)脂酶基因的陽性全長cDNA克隆，并進(jìn)行測序。所述衰老誘導(dǎo)脂酶cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。所述cDNA克隆編碼計(jì)算分子量為50.2kDa的447個(gè)氨基酸多肽(SEQ ID NO2)。所述cDNA克隆在大腸桿菌中的表達(dá)得到了一種具有預(yù)期分子量的蛋白，該蛋白具有?；饷富钚?，即所述表達(dá)蛋白能水解對(duì)硝基苯基棕櫚酸、磷脂和三乙酰甘油。根據(jù)這種酶在發(fā)育中的香石竹花中的表達(dá)形式以及所述蛋白的活性，可以判斷它與衰老相關(guān)。
用所述全長香石竹cDNA檢測的香石竹花瓣總RNA的Northern印跡顯示，在衰老即將開始之前，所述衰老誘導(dǎo)脂酶基因受到了顯著誘導(dǎo)(圖4)。Northern印跡分析還表明，所述衰老誘導(dǎo)脂酶基因是受諸如冷凍(
圖12)和乙烯(圖4和9)的環(huán)境脅迫條件誘導(dǎo)的，已知乙烯是相應(yīng)環(huán)境脅迫而產(chǎn)生的。所述Northern印跡分析表明，香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶mRNA在衰老中的(發(fā)育IV期)的花瓣中的含量明顯高于在早期的I、II和III期香石竹花瓣中的含量。另外，乙烯刺激的II期花還表現(xiàn)出較高的衰老誘導(dǎo)脂酶基因表達(dá)。類似地，受到過寒冷溫度并恢復(fù)到環(huán)境溫度的植物也表現(xiàn)出所述衰老誘導(dǎo)脂酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)，與冷害損傷癥狀(例如滲漏)的發(fā)展吻合(
圖11和12)。在諸如香石竹、綠豆、番茄的各種植物和諸如葉片、果實(shí)和花的各種植物組織中基因的總體表達(dá)模式表明，本發(fā)明的脂酶基因與所述植物和植物組織中衰老的開始有關(guān)。因此，預(yù)計(jì)通過顯著抑制或改變植物組織中衰老誘導(dǎo)脂酶基因表達(dá)，可以推遲變質(zhì)和腐爛，延長易壞果實(shí)、花和蔬菜的貨架壽命。這一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的；生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，其中，在果實(shí)、花和營養(yǎng)組織中，所述脂酶cDNA或其寡核苷酸片段是以反義形式表達(dá)的，優(yōu)選使用諸如CaMV35S啟動(dòng)子的組成型啟動(dòng)子，或使用組織專一型或衰老誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
所述香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶基因是單拷貝基因。對(duì)用各種限制酶裂解過的香石竹基因組DNA進(jìn)行Southern印跡分析，所述限制酶不能識(shí)別所述衰老誘導(dǎo)脂酶cDNA的開放讀框之內(nèi)的序列。用32P-dCTP-標(biāo)記的全長cDNA(SEQ ID NO1)檢測所述限制酶消化過的基因組DNA。在高嚴(yán)格雜交條件下，只有一種限制片段與所述cDNA克隆雜交(雜交和洗滌溫度均為68℃，洗滌緩沖液0.2×SSC，0.1％SDS)。因此，所述香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶基因是一種單拷貝基因(圖6)。該基因不是香石竹中多基因家族的一員這一事實(shí)，強(qiáng)烈暗示了它在其他植物中是單拷貝基因。因此，了解所述香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶基因的完整核苷酸序列，就足于從各種其他植物中分離衰老誘導(dǎo)脂酶基因。實(shí)際上，正如本發(fā)明所表明的，業(yè)已通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將基于香石竹cDNA序列的寡核苷酸引物成功地用于制備番茄葉片衰老誘導(dǎo)脂酶基因，使用番茄葉片基因組DNA作模板。
以反向取向(反義)導(dǎo)入受諸如玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子、花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子CaMV35S或MAS啟動(dòng)子的組成型啟動(dòng)子控制的所述克隆的衰老誘導(dǎo)脂酶基因或其片段，能夠?qū)χ参镞M(jìn)行遺傳學(xué)修飾，并改變修飾過的植物的衰老。從其他植物中選擇的與香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶基因有組構(gòu)的序列相同性的反義序列，可被用于進(jìn)行類似的遺傳學(xué)修飾。所述遺傳學(xué)修飾的一個(gè)結(jié)果，是內(nèi)源可翻譯的衰老誘導(dǎo)脂酶編碼mRNA含量的降低。因此，降低了植物細(xì)胞中所產(chǎn)生的衰老誘導(dǎo)脂酶的量，并因此降低了細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞滲漏量，例如，由于老化或環(huán)境脅迫所導(dǎo)致的葉片、果實(shí)和/或花腐爛。所述遺傳學(xué)修飾可以對(duì)所述植物中衰老誘導(dǎo)脂酶含量實(shí)施永久性改變，并可以通過自交或其他繁殖方式在后代植株中繁殖。用所述遺傳學(xué)改變的植物生產(chǎn)植物新品種或品系，其中，所述改變能從一代到下一代穩(wěn)定地傳遞。本發(fā)明首次提供了可用于對(duì)多種不同植物的衰老進(jìn)行穩(wěn)定的遺傳學(xué)修飾的合適的DNA序列。
一般，為了鑒定和分離所述衰老誘導(dǎo)脂酶基因，質(zhì)粒DNA的制備、限制酶消化、DNA的瓊脂糖凝膠電泳、蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern印跡、Northern印跡、DNA連接和細(xì)菌轉(zhuǎn)化是用本領(lǐng)域所熟知的常規(guī)方法進(jìn)行的。例如，參見Sambrook，J.等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，NY，1989。核酸雜交技術(shù)由Sambrook披露(同上)。
在本文中，術(shù)語“植物”是指全植株、植物部分、植物細(xì)胞或一組植物細(xì)胞。可用于本發(fā)明方法中的植物類型不受限制，并可以包括，例如，乙烯敏感型和乙烯不敏感型植物，結(jié)實(shí)植物，如杏、蘋果、柑橘、香蕉、梨、番茄、草莓、鱷梨等；蔬菜，如胡蘿卜、豌豆、萵苣、甘藍(lán)、蘿卜、馬鈴薯、花椰菜、蘆筍等；花，如香石竹、玫瑰、梅等；并且，一般包括能吸收并表達(dá)本發(fā)明DNA分子的任何植物。它可以包括多種倍性水平的植物，包括單倍體、二倍體、四倍體和多倍體。
在本文中，轉(zhuǎn)基因植物被定義為以某種方式進(jìn)行過遺傳學(xué)修飾的植物，包括，但不限于在其基因組中業(yè)已整合了異源或同源衰老誘導(dǎo)脂酶DNA或修飾過的DNA或異源衰老誘導(dǎo)脂酶DNA的某些部分或同源衰老誘導(dǎo)脂酶DNA的植物。所述改變了的遺傳材料可以編碼一種蛋白，它包括一個(gè)調(diào)控或控制序列，或可以是或包括一種反義序列或編碼一種反義DNA，它相對(duì)該植物的內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶DNA或mRNA序列或其部分而言是反義的?！稗D(zhuǎn)基因”或“轉(zhuǎn)基因序列”被定義為被整合到轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因或部分序列。
在本文中，術(shù)語“雜交”通常被用于表示核酸在合適的嚴(yán)緊條件下的雜交，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)探針序列和靶序列的性質(zhì)，方便地確定所述雜交條件。雜交和洗滌條件為本領(lǐng)域所公知，根據(jù)序列的嚴(yán)格性，可以通過改變該培養(yǎng)時(shí)間、溫度和/或溶液的離子強(qiáng)度，方便地實(shí)現(xiàn)條件的調(diào)整。例如，參見Sambrook J.等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，NY，1989。條件的選擇取決于待雜交序列的長度，特別是探針序列的長度、核酸的相對(duì)G-C含量和容容許的錯(cuò)配量。當(dāng)需要在具有較低程度的互補(bǔ)性的鏈之間進(jìn)行部分雜交時(shí)，優(yōu)選低嚴(yán)緊條件。當(dāng)需要完整的或接近完整的互補(bǔ)性時(shí)，優(yōu)選高嚴(yán)緊條件。對(duì)于典型的高嚴(yán)緊條件來說，雜交溶液含有6×SSC、0.0MEDTA、1×Denhardt’s溶液和0.5％SDS。對(duì)于克隆DNA的片段來說，雜交要在大約68℃下進(jìn)行大約3-4小時(shí)，而對(duì)于總的真核細(xì)胞DNA來說，要進(jìn)行大約12-16小時(shí)。對(duì)于低嚴(yán)格性來說，雜交溫度要降低到低于有關(guān)雙鏈體解鏈溫度(TM)大約12℃。已知TM受G-C含量和雙鏈體長度以及溶液離子強(qiáng)度的影響。
在本文中，術(shù)語“顯著的序列相同性”或“顯著的同源性”被用于表示與另一種核苷酸或氨基酸序列有明顯結(jié)構(gòu)或功能相同性的核苷酸序列或氨基酸序列。具有顯著序列相同性或顯著同源性序列之間的任何結(jié)構(gòu)或功能差異應(yīng)當(dāng)是微不足道的，就是說，它不會(huì)對(duì)該序列在預(yù)期用途中起作用的能力產(chǎn)生影響。例如，差異可能是由于不同物種之間密碼子利用的固有差異所導(dǎo)致的。如果在兩個(gè)或兩個(gè)以上不同序列之間存在顯著量的序列重疊或相似性，或者不同序列具有相似的物理特征，甚至如果有關(guān)序列在長度和結(jié)構(gòu)上不同的話，這種結(jié)構(gòu)差異被視為微不足道的。例如，所述特征包括在特定條件下雜交的能力，或者對(duì)于蛋白來說，免疫交叉反應(yīng)性，類似的酶促活性等。
另外，如果兩個(gè)序列之間具有至少大約70％，更優(yōu)選80％，最優(yōu)選大約90％的序列相似性的話，則認(rèn)為這兩種核苷酸序列是“大體上互補(bǔ)的”。如果兩種氨基酸序列的多肽的活性部分之間具有至少50％，優(yōu)選70％的相似性的話，則認(rèn)為這兩種序列是大體上同源的。
在本文中，術(shù)語核酸(多核苷酸或寡核苷酸)的“功能性衍生物”表示編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的基因或核苷酸序列的片段、變體、同系物或類似物。一種功能性衍生物可以至少保留衰老誘導(dǎo)脂酶編碼DNA功能的一部分，使其能用于本發(fā)明中。所述功能可以包括與天然香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶或來自另一種植物的編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的大體上同源的DNA或與它的mRNA轉(zhuǎn)錄物雜交的能力，或呈反義方向，以便抑制植物衰老誘導(dǎo)脂酶mRNA的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
基因或DNA序列的“片段”，是指所述分子的任何亞類，例如，較短的多核苷酸或寡核苷酸?！白凅w”是指與特定的完整基因或其片段大體上相似的分子，如具有一個(gè)或多個(gè)取代了的核苷酸取代變體，不過，它保留了與所述特定基因雜交的能力，或者編碼能與天然DNA雜交的mRNA轉(zhuǎn)錄物。“同系物”是指源于不同植物屬或種的片段或變體序列?！邦愃莆铩笔侵复篌w上類似于特定完整分子或其變體或片段，或以與之相關(guān)的方式起作用的非天然分子。
一種基因，例如，衰老誘導(dǎo)脂酶基因“改變了的表達(dá)”或“修飾過的表達(dá)”，表示發(fā)生在未修飾過的香石竹或其他植物中的特定的基因的正常表達(dá)，以某種方式發(fā)生改變的任何過程或結(jié)果。在本發(fā)明中，基因表達(dá)的改變，能全面或部分減弱衰老誘導(dǎo)脂酶基因的表達(dá)，但還可以包括表達(dá)時(shí)序的改變，或者另一種狀態(tài)，其中，所述衰老誘導(dǎo)脂酶基因的表達(dá)，不同于最有可能在未修飾過的植物或栽培品種中天然發(fā)生的形式。一種優(yōu)選的改變是，能導(dǎo)致與未修飾過的植物相比，導(dǎo)致衰老誘導(dǎo)脂酶的產(chǎn)量降低。
在按照本發(fā)明生產(chǎn)遺傳學(xué)改變了的植物時(shí)，優(yōu)選根據(jù)所需性狀選擇單個(gè)小植株或植株，通常是根據(jù)減弱了的衰老誘導(dǎo)脂酶的表達(dá)或產(chǎn)生。例如，可以用本文所披露的特殊抗體，通過常規(guī)免疫測定方法，對(duì)衰老誘導(dǎo)脂酶的表達(dá)進(jìn)行定量。另外，可以通過本文所披露的生物化學(xué)方法測定衰老誘導(dǎo)脂酶的酶促活性。
為了讓新插入的基因或DNA序列表達(dá)，導(dǎo)致它所編碼蛋白的產(chǎn)生，或者對(duì)于要轉(zhuǎn)錄的反義DNA來說，得到反義RNA分子，在正確的位置上應(yīng)當(dāng)存在正確的調(diào)控因子，并且，相對(duì)所述基因或DNA序列而言呈正確取向。所述調(diào)控片段可以包括一個(gè)啟動(dòng)子，一個(gè)5’-非翻譯前導(dǎo)序列和3’聚腺苷酸化序列，以及增強(qiáng)子和其他調(diào)控序列。
可以與衰老誘導(dǎo)脂酶基因組合用于生產(chǎn)該基因的有義或反義轉(zhuǎn)錄物的啟動(dòng)子調(diào)控因子，一般來說包括任何植物啟動(dòng)子，更具體地講，包括組成型啟動(dòng)子，如包括玄參花葉病毒35S，花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子CaMV35S啟動(dòng)子，或MAS啟動(dòng)子或組織專一性或衰老誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如香石竹花瓣GST1啟動(dòng)子或擬南芥屬SAG12啟動(dòng)子(例如，參見J.C.Palaqui等，植物生理學(xué)1221447-1456(1996)；Morton等，分子育種，1123-132(1995)；Fobert等，植物雜志，6567-577(1994)；和Gan等，植物生理學(xué)113313(1997)，以上文獻(xiàn)被收作本文參考)。用于本發(fā)明中的所述啟動(dòng)子優(yōu)選是組成型啟動(dòng)子。
用于本發(fā)明的啟動(dòng)子的表達(dá)水平可以用常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)測試，例如，通過測定導(dǎo)入了所述啟動(dòng)子/報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)基因植物的葉片、花、果實(shí)或其他組織提取物中報(bào)導(dǎo)基因產(chǎn)物(例如，蛋白或mRNA)的含量而完成。
本發(fā)明提供了互補(bǔ)于編碼香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶或互補(bǔ)于能在低至高嚴(yán)緊條件下與所述香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶基因雜交的、來自其他植物的基因或基因片段的反義寡核苷酸和多核苷酸。所述反義寡核苷酸的長度應(yīng)當(dāng)至少大約為6個(gè)核苷酸，以便提供雜交的最低專一性，并可以互補(bǔ)于編碼衰老誘導(dǎo)脂酶或其一部分的DNA或mRNA的一股鏈，或互補(bǔ)于與調(diào)控衰老誘導(dǎo)脂酶基因表達(dá)相關(guān)的基因組DNA的旁側(cè)序列。所述反義寡核苷酸可以大到有100個(gè)核苷酸，并且其長度可以延長到與它反義的編碼序列的長度或超過該長度。所述反義寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈的DNA或RNA或其嵌合混合物或其衍生物或其修飾過的形式。
所述反義寡核苷酸的作用是，可以導(dǎo)致細(xì)胞中衰老誘導(dǎo)脂酶基因表達(dá)的改變，主要是抑制。有關(guān)反義的一般性說明可以參見Alberts等，細(xì)胞分子生物學(xué)，第2版，Garland出版公司，紐約(1989)，特別參見195-196頁，被收作本文參考。
所述反義寡核苷酸可以互補(bǔ)于衰老誘導(dǎo)脂酶基因的任何部分。例如，在一種實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸的長度可以為6-100個(gè)核苷酸，并可以互補(bǔ)于衰老誘導(dǎo)脂酶基因的5’-非編碼序列。已知主要互補(bǔ)于5’-非編碼序列的寡核苷酸，是編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)的有效抑制劑。Branch，M.A.，分子細(xì)胞生物學(xué)134284-4290(1993)。
優(yōu)選的反義寡核苷酸大體上互補(bǔ)于編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的mRNA的一部分。例如，沿反義方向向植物中導(dǎo)入編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的全長cDNA克隆，預(yù)計(jì)能導(dǎo)致成功地改變衰老誘導(dǎo)脂酶基因表達(dá)。而且，導(dǎo)入針對(duì)衰老誘導(dǎo)脂酶基因的特定部分的部分序列可能同樣有效。
本發(fā)明所需要的最低同源性程度為，足于產(chǎn)生重復(fù)的互補(bǔ)性，以便能夠識(shí)別特定的靶RNA或DNA，抑制并減弱其翻譯或功能，同時(shí)又不會(huì)影響其他RNA或DNA分子的功能和其他基因的表達(dá)。盡管本發(fā)明的反義寡核苷酸包括互補(bǔ)于衰老誘導(dǎo)脂酶基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分的序列，但絕對(duì)的互補(bǔ)性是不必要的(盡管是優(yōu)選的)。雜交的能力取決于反義寡核苷酸的長度和互補(bǔ)性程度。一般，雜交的核酸越長，它所包含的與衰老誘導(dǎo)脂酶靶序列的堿基錯(cuò)配就越多，但仍然能形成穩(wěn)定的雙鏈體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用標(biāo)準(zhǔn)方法通過測定雜交復(fù)合體的解鏈溫度來確定容許的錯(cuò)配程度。
所述反義RNA寡核苷酸可以通過外源導(dǎo)入的核酸序列的轉(zhuǎn)錄而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生?？梢杂弥T如質(zhì)?；虿《镜妮d體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或感染將所述反義分子輸送到細(xì)胞中，所述載體中整合了編碼反義衰老誘導(dǎo)脂酶序列的DNA，該序列可操作地連接于包括啟動(dòng)子在內(nèi)的合適的調(diào)控因子上。所述外源DNA序列在所述細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生衰老誘導(dǎo)脂酶基因的反義RNA。
載體可優(yōu)選為質(zhì)粒，或者可以是本領(lǐng)域所公知的病毒或其他載體，以便能在植物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制并表達(dá)其編碼的基因。所述載體被整合到染色體上，以便它能夠轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生所需的反義衰老誘導(dǎo)脂酶RNA。所述質(zhì)?；虿《据d體可以通過本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法構(gòu)建。例如，所述載體可以是含有能在原核宿主中起作用的復(fù)制系統(tǒng)和本發(fā)明的反義寡核苷酸或多核苷酸的質(zhì)粒載體。另外，所述載體可以是含有能在農(nóng)桿菌中起作用的復(fù)制系統(tǒng)和本發(fā)明的反義寡核苷酸或多核苷酸的質(zhì)粒載體。能夠在農(nóng)桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒為本領(lǐng)域所熟知。參見Miki等，將外源DNA導(dǎo)入植物的方法，植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法，B.R.Glick和J.E.Thompson著，CRC出版社(1993)，67-83頁。
按以下方法將所述香石竹脂酶基因沿反義方向克隆到質(zhì)粒載體上。用pCD質(zhì)粒克隆香石竹脂酶基因。所述質(zhì)粒是用pUC18主鏈構(gòu)建的，并且包括來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子，它后面是一個(gè)多克隆位點(diǎn)和一個(gè)章魚氨酸合成酶終止序列。pCd-脂酶(反義)質(zhì)粒是通過將全長香石竹脂酶基因沿反義方向亞克隆到pCd的HindIII和EcoRI位點(diǎn)而構(gòu)建的。類似地，pCDΔ35S-GST-1脂酶(反義)質(zhì)粒是通過首先將香石竹谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶1(GST1)啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增片段(-703至+19bp)亞克隆到pCd載體的BamHI和SalI位點(diǎn)上而構(gòu)建的。然后將全長香石竹脂酶基因沿反義方向亞克隆到該結(jié)構(gòu)的HindIII和EcoRI位點(diǎn)上。另一種質(zhì)粒pGdΔ35S-GST1-GUS質(zhì)粒是通過首先將香石竹谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶1(GST1)啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增片段(-703至+19bp)亞克隆到pCd載體的BamHI和SalI位點(diǎn)上而構(gòu)建的。然后將報(bào)導(dǎo)基因β-葡糖醛酸酶(GUS)亞克隆到該結(jié)構(gòu)的SalI和EcoRI位點(diǎn)上。通過首先將雙鏈35S啟動(dòng)子(含有兩個(gè)拷貝的串聯(lián)CaMV35S啟動(dòng)子)亞克隆到pCd載體的SalI和HindIII位點(diǎn)上構(gòu)建pCd-35S2-脂酶(反義)質(zhì)粒。然后將全長香石竹脂酶基因沿反義方向亞克隆到該結(jié)構(gòu)的HindIII和EcoRI位點(diǎn)上。
例如，可以通過重組核苷酸技術(shù)或從單核苷酸或較短寡核苷酸合成制備長度優(yōu)選為大約6-大約100個(gè)核苷酸并且互補(bǔ)于衰老誘導(dǎo)脂酶的靶系列的寡核苷酸?？梢杂米詣?dòng)合成儀化學(xué)合成本發(fā)明的寡核苷酸和多核苷酸。構(gòu)建本發(fā)明重組核苷酸分子的方法披露于Sambrook等的著述中，參見分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，N.Y.(1989)，以全文形式將其收作本文參考文獻(xiàn)?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法制備編碼互補(bǔ)于衰老誘導(dǎo)脂酶序列的反義RNA的核苷酸。有關(guān)所述方法的細(xì)節(jié)披露于Maniatis，T.等的著述中，控制基因表達(dá)的分子機(jī)制，Nierlich等著，學(xué)術(shù)出版社，N.Y.(1976)。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，對(duì)內(nèi)源植物衰老誘導(dǎo)脂酶表達(dá)的抑制是通過超量表達(dá)導(dǎo)入該植物細(xì)胞中的外源衰老誘導(dǎo)脂酶基因或基因片段而進(jìn)行共抑制所產(chǎn)生的。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，用本文所披露的用于反義分子的相同方式，將編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的載體沿有義方向?qū)胨黾?xì)胞。所述衰老誘導(dǎo)脂酶優(yōu)選可操作地連接于強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子上，如玄參花葉病毒啟動(dòng)子或CaMV35S。
按照本發(fā)明生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物可以用本領(lǐng)域所公知的任何植物轉(zhuǎn)化方法通過DNA轉(zhuǎn)化制備。植物轉(zhuǎn)化方法包括植物、組織或細(xì)胞與根癌農(nóng)桿菌的直接共培養(yǎng)或直接感染(Miki等，植物分子生物學(xué)方法和生物技術(shù)，1993，67-88頁)；將基因直接轉(zhuǎn)移到原生質(zhì)體中或原生質(zhì)體吸收(Paszkowski等，EMBO J.，122717，1984)；粒子轟擊(Klein等，生物技術(shù)，6559-563，1988)；注射到幼苗或植物的分生組織中(De LaPena等，自然，325274-276，1987)；注射到培養(yǎng)細(xì)胞和組織的原生質(zhì)體(Reich等，生物技術(shù)，41001-1004，1986)。
通常，通過所述轉(zhuǎn)化方法獲得全植株。植株是由原生質(zhì)體、愈傷組織、組織部分或外殖體等再生的。在本文中，“植物”的定義包括從其中的衰老誘導(dǎo)脂酶表達(dá)已經(jīng)改變了的再生植物獲得的植物部分，如葉片、花、果實(shí)、種子等?！爸参铩钡亩x還包括所述再生植物的后代、變體和突變體。
本發(fā)明還提供了由本發(fā)明的cDNA分子所編碼的香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶蛋白，和能與所述香石竹蛋白的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)的蛋白。所述蛋白具有圖2中所示SEQ ID NO2的氨基酸序列，或與SEQ ID NO2所示蛋白的抗體具有交叉反應(yīng)性。
所述香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶蛋白或其功能性衍生物，優(yōu)選是通過重組技術(shù)生產(chǎn)的，選擇性地與化學(xué)合成方法組合生產(chǎn)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所述衰老誘導(dǎo)脂酶是作為包括與麥芽糖結(jié)合蛋白融合的衰老誘導(dǎo)脂酶的融合蛋白形式表達(dá)的。編碼所述重組融合蛋白的克隆的表達(dá)，得到了一種具有預(yù)期分子量的融合蛋白，它能水解對(duì)硝基苯基棕櫚酸，磷脂和三乙酰甘油，這些都是脂酶活性的指標(biāo)。在用抗香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶的抗體進(jìn)行免疫吸印之后進(jìn)行的Western印跡分子中，所述重組衰老誘導(dǎo)脂酶蛋白表現(xiàn)出一個(gè)優(yōu)勢帶。在Western印跡分析中，通過用蛋白酶因子Xa處理所述融合蛋白所釋放出的游離的衰老誘導(dǎo)脂酶(50.2kDa)，也能與所述衰老誘導(dǎo)脂酶抗體起反應(yīng)(圖3)。對(duì)衰老誘導(dǎo)脂酶氨基酸序列進(jìn)行的基序檢索，發(fā)現(xiàn)了用于通過酰胺鍵與肉桂酸共價(jià)結(jié)合的潛在的N-肉桂?；稽c(diǎn)的存在(
圖1)(參見Johnson等，生物化學(xué)年度綜述，63869-914，1994；Towler等，生物化學(xué)年度綜述，5797-99，1988；和R.J.A.Grand，生物化學(xué)雜志258625-638，1989)。蛋白基序檢索還證實(shí)，所述香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶含有序列ITFAGHSLGA(SEQ ID NO4)，它是保守脂酶的共有序列(表1)。來自多種植物的保守脂酶共有序列示于下表中。
表1
本發(fā)明的衰老誘導(dǎo)脂酶蛋白，在體外和原位測定中都被證實(shí)具有脂酶活性。對(duì)于體外測定來說，用對(duì)硝基苯基棕櫚酸和大豆磷脂(40％磷脂酰膽堿和60％其他磷脂)作底物，并通過分光光度法測定該反應(yīng)的產(chǎn)物，它們分別是對(duì)硝基苯酚和游離的脂肪酸(Pencreac’s和Baratti，1996；Nixon和Chan，1979；Lin等，1983)。還利用改進(jìn)過的Nixon和Chan(1979)和Lin等(1983)的方法通過氣相層析體外測定脂酶活性。反應(yīng)混合物含有100mM Tris-HCl(pH8.0)，2.5mM底物(三亞油精，大豆磷脂或二亞油酰磷脂酰膽堿)和酶蛋白(100微克)終體積為100微升。所述底物在添加到反應(yīng)混合物中之前用5％的阿拉伯樹膠乳化。為此將底物溶解在氯仿中，添加到阿拉伯樹膠溶液中，并通過超聲波乳化30秒。在乳化之后，通過氮?dú)饬魇孤确抡舭l(fā)。反應(yīng)在25℃下進(jìn)行不同的時(shí)間，最多達(dá)2小時(shí)。然后對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行脂類提取，并通過TLC純化游離脂肪酸，衍生化，并通過GC定量(McKegney等，1995)。
用由Tsuboi等(1996)改進(jìn)的Furukawa等(1983)的方法，原位測定解脂?；饷富钚?。在后一種測定中，在補(bǔ)充了Tween40或Tween60(二者均為長鏈脂肪酸酯，作為唯一的碳源)的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，生長用編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的全長cDNA克隆轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌。因此，只有當(dāng)所述脂肪酸酯被脂酶水解之后，才能提供細(xì)菌生長所需要的碳。用衰老誘導(dǎo)脂酶cDNA轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌，在經(jīng)過最初的延滯期之后，能在Tween40和ween60基礎(chǔ)培養(yǎng)基這中生長，而沒有轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌對(duì)照培養(yǎng)物不能生長，這一發(fā)現(xiàn)，證實(shí)了所述編碼重組蛋白的脂酶活性(圖5)。就是說，衰老誘導(dǎo)脂酶能釋放硬脂酸(Tween60)和棕櫚酸(Tween40)，以便獲得生長所必需的碳。
本文所披露的衰老誘導(dǎo)脂酶蛋白的“功能性衍生物”，是衰老誘導(dǎo)脂酶的片段、變體、類似物、或化學(xué)衍生物，它保留了衰老誘導(dǎo)脂酶活性的至少一部分，或者能與衰老誘導(dǎo)脂酶的專一性抗體進(jìn)行免疫交叉反應(yīng)。衰老誘導(dǎo)脂酶蛋白的片段是指該分子的任何亞類。變體肽可以通過直接化學(xué)合成制備，例如，使用本領(lǐng)域眾所周知的方法。衰老誘導(dǎo)脂酶的類似物，是指大體上類似于所述完整蛋白或其片段的非天然蛋白。衰老誘導(dǎo)脂酶的化學(xué)衍生物，含有正常情況下不是所述肽或肽片段的一部分的其他化學(xué)部分?？梢酝ㄟ^讓所述肽的靶氨基酸殘基與能夠與特定側(cè)鏈或末端殘基起反應(yīng)的有機(jī)衍生試劑起反應(yīng)，將改變引入衰老誘導(dǎo)脂酶肽或其片段。
本發(fā)明的衰老誘導(dǎo)脂酶蛋白或肽可以這樣生產(chǎn)培養(yǎng)用本發(fā)明核苷酸序列轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞(沿有義方向)，讓所述細(xì)胞合成所述蛋白，然后根據(jù)所使用的克隆方法，從培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物中以游離蛋白或融合蛋白形式分離所述蛋白。另外，所述蛋白可以在無細(xì)胞系統(tǒng)中生產(chǎn)。Ranu等，酶學(xué)方法，60459-484，1979。
在對(duì)本發(fā)明作過一般性說明之后，通過參考下面的實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明，提供這些實(shí)施例是為了說明目的，而不是要限定本發(fā)明，除非特別指明。實(shí)施例1用于分離香石竹脂酶cDNA的植物材料用生長并保持在溫室中的香石竹植物(Dianthus caryophyllusL.cv.，改良的白色Sim)分離相當(dāng)于衰老誘導(dǎo)脂酶基因的核苷酸序列。將衰老花瓣形式的花組織(來自不同發(fā)育階段)收集到緩沖液中或者在-70℃下保存待用。
從衰老即將開始時(shí)所收集的香石竹花瓣中分離細(xì)胞質(zhì)脂類顆粒。用Omnimizer在勻漿緩沖液(50mM Epps-0.25M山梨醇，pH7.4，10mMEDTA，2mM EGTA，1mM PMSF，1mM芐脒，10mM氨基-n-己酸和4％的聚乙烯吡咯烷酮)，在4℃下將香石竹花瓣(25克/150毫升緩沖液)勻漿45秒，并在Polytron勻漿器中再勻漿1分鐘。通過四層紗布過濾勻漿物，并在4℃下以10000g的速度離心濾液20分鐘。以250000g的速度離心上清液1小時(shí)，以便分離微粒體膜。用Hudak和Thompson的方法(1997，植物生理學(xué)，114705-713)，通過在漂浮離心之后收集顆粒，在微粒體上清液之后獲得脂類顆粒。用蔗糖將上清液調(diào)整到10％(w/v)，并將23毫升上清液注入60Ti Beckman離心管中，用1.5毫升分離緩沖液覆蓋，并在4℃下以305000g的速度離心12小時(shí)。用巴氏吸管從所述分離緩沖液覆蓋層中取出顆粒。將3毫升顆粒懸浮液加樣到用無菌PBS(10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.5，加0.85％氯化鈉)平衡過的Sepharose G-25柱上，并用無菌PBS洗脫該懸浮液。洗脫含有所述顆粒的外水體積，并用Centricon-10過濾器(由Amicon提供)將其濃縮到蛋白濃度為600微克。然后用300微克脂類顆粒接種兔子，在兔子體內(nèi)制備抗體。通過Western印跡分析測定血液的IgG效價(jià)。mRNA分離大體上按Chomczynski和Sachi所披露的方法(分析生物化學(xué)，162156-159，1987)從I、II、III或IV期香石竹花瓣中分離總RNA。簡單地講，在液氮中冷凍15克花瓣組織，并在含有4M硫代鹽酸胍，25mM檸檬酸，pH7.0，0.5％十二烷基肌氨酸鈉和0.1Mβ-巰基乙醇的緩沖液中勻漿30秒。將150毫升水飽和的苯酚，30毫升氯仿和15毫升2M乙酸鈉，pH4.0加入所述勻漿樣品中。以10000g的速度離心該樣品10分鐘，并除去水相，用150毫升異丙醇從中沉淀出核酸。以5000g的速度離心該樣品10分鐘，并用30毫升的4M氯化鋰洗滌沉淀物1次，用30毫升氯仿提取，并用含有0.2M乙酸鈉，pH5.0的異丙醇沉淀。將RNA溶解在DEPC處理過的水中，并在-70℃下保存。
用Promega提供的PolyA+片段mRNA分離系統(tǒng)，從總RNA中分離PolyA+mRNA。用PolyA+mRNA作模板，用Stratagene(La Jolla，Calif.)提供的ZAP ExpresscDNA合成系統(tǒng)進(jìn)行cDNA合成。香石竹花瓣cDNA文庫篩選將用從IV期香石竹花瓣中分離的mRNA制備的cDNA文庫稀釋到大約5×106PFU/ml，并用脂類顆?？寡暹M(jìn)行免疫篩選。用ExAssist輔助噬菌體/SOLR菌株系統(tǒng)回收陽性cDNA克隆，并重新環(huán)化在pBluescript噬菌粒上(Stratagene)。同樣用32P-標(biāo)記過的19個(gè)堿基的探針(5’-ACCTACTAGGTTCCGCGTC-3’)(SEQ ID NO5)篩選III期香石竹花瓣cDNA。將陽性cDNA克隆從噬菌體上切除，并用生產(chǎn)商說明書中的方法，將其重新環(huán)化到pBK-CMV(Stratagene)噬菌粒上。將全長cDNA(1.53kb片段)插入pBK-CMV載體上。質(zhì)粒DNA分離，DNA測序用Sambrook等所披露的堿性裂解方法(同上)分離質(zhì)粒DNA。用雙脫氧測序方法對(duì)全長陽性cDNA克隆進(jìn)行測序。Sanger等，美國科學(xué)院院報(bào)，74；5463-5467。通過BLAST檢索(GenBank，Bethesda，MD)編輯并分析開放讀框，用BCM檢索發(fā)射器多序列排比形式誘導(dǎo)的多重排比方法(參見F.Corpet，核酸研究，1610881-10890，1987)完成五種同源性最高的蛋白與編碼基因的衍生氨基酸序列的排比。通過MultiFinder確認(rèn)所述衍生氨基酸序列中的功能性基序。以融合蛋白形式表達(dá)脂酶用EcoRI和XbaI消化含有全長衰老誘導(dǎo)脂酶的噬菌粒pBK-CMV，釋放出1.53kb的脂酶片段，將該片段亞克隆到EcoRI和XbaI消化過的融合載體pMalc(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)上。將被命名為pMLip的含有衰老誘導(dǎo)脂酶pMalc載體用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌B1-21(DE3)細(xì)胞。
按照Sambrook等所披露的方法(同上)和Ausubel等所披露的方法(參見當(dāng)代分子生物學(xué)方法，Green Publishing Associates和WileyInterscience，紐約，1987，16.4.1-16.4.3)分離并純化由pMLip編碼的融合蛋白(衰老誘導(dǎo)脂酶和麥芽糖結(jié)合蛋白的融合體)。簡單地講，將用pMLip轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌BL21細(xì)胞重新懸浮在含有8微升50mMPMSF和80微升20毫克/毫升溶菌酶的3毫升/克裂解緩沖液(50mMTris，pH8.0，100mM氯化鈉和1mM EDTA)/克細(xì)胞中，并在室溫下振蕩培養(yǎng)20分鐘。然后添加80微升5％脫氧膽酸和40單位的DNAseI，并在室溫下振動(dòng)細(xì)胞，直到細(xì)胞被完全裂解。通過離心使細(xì)胞碎片沉淀，并重新懸浮在2倍體積的添加了8M尿素和0.1mM PMSF的裂解緩沖液中。1小時(shí)之后，添加7倍體積的緩沖液(50mM磷酸二氫鉀，1mMEDTA和50mM氯化鈉，pH7.0)，以便中和該懸浮液。用鹽酸將該細(xì)胞懸浮液的pH調(diào)整到8.0，并使細(xì)胞碎片沉淀。上清液用20mM Tris，pH8.0，100mM氯化鈉和1mM EDTA在4℃下透析過夜。用直鏈淀粉柱(新英格蘭實(shí)驗(yàn)室提供)純化麥芽糖結(jié)合蛋白-脂酶融合產(chǎn)物(Malip)。用蛋白酶因子Xa(1微克/100微克融合蛋白)裂解含有融合蛋白的級(jí)份，以便從該融合產(chǎn)物上分離脂酶。通過SDS-PAGE電泳和Western印跡，分析融合蛋白和裂解過的脂酶。用由pMalc編碼的麥芽糖結(jié)合蛋白作對(duì)照。結(jié)果示于圖3中。香石竹RNA的Northern印跡雜交在1％變性的甲醛瓊脂糖凝膠上分離從I、II、III、IV期花中分離的10微克總RNA，并固定到尼龍膜上。將用隨機(jī)引物試劑盒(Boereinger)由32P-dCTP標(biāo)記過的1.53kb EcoRI-XbaI脂酶片段檢測所述濾膜(7×107cpm)。用室溫下的1×SSC，0.1％SDS洗滌濾膜1次，用65℃的0.2×SSC，0.1％SDS洗滌3次。讓濾膜干燥，并在-70℃下對(duì)X光膠片曝光1夜，結(jié)果示于圖4中。基因組DNA分離和Southern印跡雜交將新采割的香石竹花瓣冷凍在液氮中，磨成粉，并用提取緩沖液(0.1MTris，pH8.2，50mMEDTA，0.1M氯化鈉，2％SDS，和0.1毫克/毫升蛋白酶K)勻漿(2毫升/克)，以便分離基因組DNA。將勻漿材料在37℃下培養(yǎng)10分鐘，并用苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)提取。用乙酸鈉和異丙醇使DNA沉淀。將DNA沉淀溶解在1×TE，pH8.0中，用苯酚再次提取，重新沉淀并重新懸浮于1×TE，pH8.0中。
分別用限制性內(nèi)切核酸酶(BamHI、XbaI、XhoI、EcoRI、HindIII和SalI)消化基因組DNA，并且在1％瓊脂糖凝膠上分離消化過的DNA。將分離的DNA吸印到尼龍膜上，并用32P dCTP-標(biāo)記過的1.53kb脂酶片段進(jìn)行雜交。在高嚴(yán)緊條件(68℃，6×SSC，2×Denhardt’s試劑，0.1％SDS)和低嚴(yán)緊條件(雜交和洗滌溫度為42℃)(6×SSC，5×Denhardt’s試劑，0.1％SDS)下進(jìn)行雜交和洗滌。結(jié)果示于圖6中，從圖中可以看出，所述脂酶cDNA探針僅能檢測到一種基因組片段，這表明香石竹脂酶基因是單拷貝基因。脂酶測定用對(duì)硝基苯基棕櫚酸和大豆磷脂作外源底物，通過分光光度法，測定純化的脂酶融合蛋白的解脂?；饷富钚?。對(duì)于被用作對(duì)照的麥芽糖結(jié)合蛋白本身來說，在以磷脂作底物時(shí)沒有可檢測的脂酶活性(表2)。在將對(duì)硝基苯基棕櫚酸用作麥芽糖結(jié)合蛋白本身的底物時(shí)，可檢測到少量的脂酶反應(yīng)的預(yù)期產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚，反映了商業(yè)對(duì)硝基苯基棕櫚酸制劑中對(duì)硝基苯酚的背景水平(表2)。不過，在存在純化脂酶融合蛋白的情況下，強(qiáng)的脂酶活性表現(xiàn)為從磷脂中釋放游離脂肪酸，和從對(duì)硝基苯基棕櫚酸中釋放出對(duì)硝基苯酚(表2)。
表2通過分光光度法測定在大腸桿菌中表達(dá)的并且通過直鏈蛋白柱層析純化的麥芽糖結(jié)合蛋白和脂酶融合蛋白的解脂?；饷富钚浴?br> 使用兩種底物，對(duì)硝基苯基棕櫚酸和大豆磷脂。
活性以所產(chǎn)生的產(chǎn)物形式表達(dá)(由對(duì)硝基苯基棕櫚酸產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚和由大豆磷脂產(chǎn)生的游離脂肪酸)。
示出了n＝3重復(fù)的平均值±SE。
在其他實(shí)施方案中，通過氣相層析測定脂酶融合蛋白的酶促活性。該技術(shù)能夠?qū)牡孜镏嗅尫懦龅挠坞x脂肪酸進(jìn)行定量和鑒定。用三亞油精、大豆磷脂和二亞油酰磷脂酰膽堿作底物，并通過薄層層析純化脫酯化的脂肪酸，然后通過氣相層析分析。與所述分光光度測定相似(表2)，對(duì)于麥芽糖結(jié)合蛋白本身來說，它對(duì)于大豆磷脂和二亞油酰磷脂酰膽堿沒有可檢測的脂酶活性，這表明所述底物基本上不含脫酯化脂肪酸(表3)。不過，在將脂酶融合蛋白用做酶源時(shí)，從大豆磷脂提取物中脫酯化產(chǎn)生了棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸，從二亞油酰磷脂酰膽堿中脫酯化產(chǎn)生了亞油酸(表3)。與磷脂底物不同，在三亞油精中存在可檢測含量的游離亞油酸，不過，在存在脂酶融合蛋白的情況下游離亞油酸的含量明顯提高，這表明所述脂酶能從三乙酰甘油中將脂肪酸脫酯化(表3)。
表3通過GC測定大腸桿菌中表達(dá)的通過直鏈淀粉柱層析純化的麥芽糖結(jié)合蛋白和脂酶融合蛋白的解脂?；饷富钚?。
產(chǎn)物(μg/mg蛋白)1脂酶底物融合蛋白 麥芽糖結(jié)合蛋白三-亞油精2亞油酸(18∶2) 15.9±0.75 33.4±1.58大豆磷脂3棕櫚酸(16∶0) ND44.80硬脂酸(18∶0) ND 9.68亞油酸(18∶2) ND 5.80二亞油酰 亞油酸(18∶2) ND 20.0磷脂酰膽堿31讓反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)，在這段時(shí)間內(nèi)不是連續(xù)的線性2示出n＝3重復(fù)的平均值±SE3一次實(shí)驗(yàn)4不可檢測按照Tsuboi等(感染免疫學(xué)，642936-2940，1996)；Wang等(生物技術(shù)9741-746，1995)；和Sierra(微生物學(xué)和血液學(xué)雜志，2315-22，1957)所披露的方法，在活體內(nèi)測定通過在大腸桿菌中表達(dá)所述脂酶cDNA所獲得的蛋白脂酶活性。將用pMal轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌BL-21細(xì)胞的單菌落和pMLip轉(zhuǎn)化過的另一種大腸桿菌BL-21菌落接種含有以下成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(pH7.0)(克/升)磷酸氫二鉀(4.3)，磷酸二氫鉀(3.4)，硫酸銨(2.0)，氯化鎂(0.16)，四水氯化錳(0.001)，七水硫酸鐵(0.0006)，二水氯化鈣(0.026)和二水鉬酸鈉(0.002)。以1％的濃度添加Tween40(聚氧乙烯山梨聚糖單棕櫚酸酯)或Tween60(聚氧乙烯山梨聚糖單硬脂酸酯)。讓所述細(xì)菌細(xì)胞在37℃下，在振蕩的條件下生長，通過測定600nm的吸收監(jiān)測其生長(圖5)。從圖5可以看出，用pMLip轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌細(xì)胞，在經(jīng)過最初的延滯期之后，能夠在添加了Tween40/Tween60的基礎(chǔ)鹽中生長。不過，用pMal轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌細(xì)胞不能在添加了Tween的培養(yǎng)基中生長。實(shí)施例2香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶基因的乙烯誘導(dǎo)在密封容器中，用0.5ppm乙烯處理II期香石竹花和香石竹切穗15小時(shí)。按以下方法從乙烯處理過的II期花瓣和處理過的切穗的葉片中提取RNA，并從未處理過的香石竹花和切穗中提取RNA。
在液氮中研磨花或葉片(一朵花或5克葉片)。將研磨的粉末與30毫升胍鹽緩沖液(4M異硫氰酸胍，5mM乙酸鈉，pH8.5，0.8％β-巰基乙醇)混合。通過四層紗布過濾混合物，并在4℃下，以10000g的速度離心30分鐘。然后以26000g的速度對(duì)上清液進(jìn)行氯化銫密度梯度離心20小時(shí)。用75％的乙醇洗滌沉淀的RNA，重新懸浮在600微升DEPC處理過的水中，并在-70℃下用0.75毫升95％乙醇和30微升3M乙酸鈉沉淀RNA。在1.2％變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離10微克RNA，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。用隨機(jī)啟動(dòng)的32P-dCTP標(biāo)記的全長香石竹脂酶cDNA(SEQ ID NO1)，在42℃下檢測所述尼龍膜過夜。然后，在室溫下，用含有0.1％SDS的1×SSC洗滌所述膜1次，15分鐘，并在65℃下用含有0.1％SDS的0.2×SSC洗滌3次，每次15分鐘。在-70℃下用所述膜對(duì)X光膠片曝光一夜，結(jié)果示于圖9中。從圖中可以看出，通過乙烯在花和葉中誘導(dǎo)了香石竹脂酶的轉(zhuǎn)錄。實(shí)施例3用香石竹脂酶引物制備番茄PCR產(chǎn)物通過嵌套式PCR，制備來自從番茄葉片中獲得的番茄基因組DNA的部分長度的衰老誘導(dǎo)脂酶序列，使用根據(jù)香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶序列設(shè)計(jì)的一對(duì)寡核苷酸引物。5’引物是19-聚體，其序列為5’-CTCTAGACTATGAGTGGGT(SEQ ID NO7)；3’引物是18聚體，其序列為CGACTGGCACAACCTCCA-3’(SEQ ID NO8)。用番茄基因組DNA進(jìn)行的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是按以下方式完成的。反應(yīng)成分基因組DNA 100ngdNTP(各10mM) 1μl氯化鎂(5mM)+10x緩沖液 5μl引物1和2(各20μM) 0.5μlTaq DNA聚合酶 1.25U反應(yīng)體積 50μl反應(yīng)參數(shù)94℃，3分鐘94℃/1分鐘，48℃/1分鐘，72℃/2分鐘，進(jìn)行45輪72℃/15分鐘。
通過PCR獲得的番茄部分長度序列，具有SEQ ID NO6所示核苷酸序列，和如
圖10所示的推測的氨基酸序列。所述部分長度序列包括一個(gè)內(nèi)含子(
圖10，小寫字母)位于兩個(gè)編碼序列之間。所述番茄序列含有保守的脂酶共有序列ITFTGHSLGA(SEQ ID NO3)。
所述番茄序列與香石竹衰老誘導(dǎo)脂酶序列有53.4％的序列相同性，與擬南芥屬脂酶有43.5％的序列相同性，而后者與香石竹序列有44.3％的序列相同性。實(shí)施例4冷凍對(duì)番茄植物細(xì)胞膜完整性的影響在7-8℃下將番茄植物冷凍48小時(shí)，然后恢復(fù)到室溫，保持24小時(shí)。通過測定電解質(zhì)滲漏量(μMhos)評(píng)估冷凍對(duì)葉片的影響。
具體地講，將1克葉片組織切入50毫升的試管中，用蒸餾水快速漂洗，并加入40毫升去離子水。在所述試管上加蓋，并在室溫下旋轉(zhuǎn)24小時(shí)。以6小時(shí)和24小時(shí)的間隔，獲得對(duì)照和冷凍損害葉片組織能反映電解質(zhì)滲漏的導(dǎo)電性(μMhos)讀數(shù)。由
圖11可以看出，在冷凍損傷的葉片組織中，在回溫期間發(fā)生了反映膜損傷的電解質(zhì)滲漏。
從冷凍番茄葉片中獲得的RNA的Northern印跡分析從未冷凍過的番茄植物(對(duì)照)和恢復(fù)到室溫并保持0、6和24小時(shí)之后的冷凍的番茄植物的15克葉片中分離總RNA。按例3所述方法提取RNA。在1.2％的變性甲醛凝膠上分離來自每一種樣品的10微克RNA，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。用32P-dCTP-標(biāo)記過的探針(SEQ ID NO3)檢測所述尼龍膜，然后在與例3相同的條件下洗滌，結(jié)果示于
圖12中。
從放射性自顯影(
圖12B)上可以看出，通過冷凍誘導(dǎo)了番茄脂酶基因的表達(dá)，并且，基因誘導(dǎo)的形式與冷凍損傷葉片中電解質(zhì)滲漏的增加相關(guān)(
圖11)。
序列表<110>Senesco，Inc.<120>編碼植物脂酶的DNA、轉(zhuǎn)基因植物和控制植物衰老的方法<130>10799/7<140><141><150>09/250,280<151>1999-02-16<150>09/105,812<151>1998-06-26<160>17<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1537<212>DNA<213>香石竹<400>1gcacgagcca ttccaaaact ccttacacca ctcaaaacta ttccaacatg gctgcagaag 60cccaaccttt aggcctctca aagcccggcc caacatggcc cgaactcctc gggtccaacg 120cttgggccgg gctactaaac ccgctcaacg atgagctccg tgagctcctc ctacgctgcg 180gggacttctg ccaggtgaca tacgacacct tcataaacga ccagaactcg tcctactgcg 240gcagcagccg ctacgggaag gcggacctac ttcataagac cgccttcccg gggggcgcag 300accggtttga cgtggtggcg tacttgtacg ccactgcgaa ggtcagcgtc ccagaggcgt 360ttctgctgaa gtcgaggtcg agggagaagt gggataggga atcgaattgg attgggtatg 420tcgtggtgtc gaatgacgag acgagtcggg tggcgggacg aagggaggtg tatgtggtgt 480ggagagggac ttgtagggat tatgagtggg ttgatgttct tggtgctcaa cttgagtctg 540ctcatccttt gttacgcact caacaaacta ctcatgttga aaaggtggaa aatgaggaaa 600agaagagcat tcataaatca agttggtacg actgtttcaa tatcaaccta ctaggttccg 660cgtccaaaga caaaggaaaa ggaagcgacg acgacgatga tgacgacccc aaagtgatgc 720aaggttggat gacaatatac acatcggagg atcccaaatc acccttcaca aaactaagtg 780caagaacaca acttcagacc aaactcaaac aactaatgac aaaatacaaa gacgaaaccc 840taagcataac attcgccggt cacagcctag gcgcgacact atcagtcgtg agcgccttcg 900acatagtgga gaatctcacg accgagatcc cagtcacggc cgtggtcttc gggtgcccaa 960aagtaggcaa caaaaaattc caacaactct tcgactcgta cccaaaccta aatgtcctcc 1020atgtaaggaa tgtcatcgac ctgatccctc tgtatcccgt gaaactcatg ggttacgtga 1080acataggaat cgagctggag atcgactcga ggaagtcgac ctttctaaag gactcgaaaa 1140acccgagtga ttggcataat ttgcaagcaa tattgcatgt tgtaagtggt tggcatgggg 1200ttaaggggga gtttaaggtt gtaaataaga gaagtgttgc attggttaat aagtcatgtg 1260attttcttaa ggaagaatgt ttggttcctc cagcttggtg ggttgtgcag aacaaaggga 1320tggttttgaa taaggatggt gagtgggttt tggctcctcc tgaggaagat cctactcctg 1380aatttgattg ataatatttc atcatgtttt atatttttat aaattttact aaatttacat 1440gacaatttat gggactaagt tacttattta tatgtttatt atatttgaaa tgtgttttaa 1500gttacataaa attgcaatta gttttaaaaa aaaaaaa 1537<210>2<211>447<212>PRT<213>香石竹<400>2Met Ala Ala Glu Ala Gln Pro Leu Gly Leu Ser Lys Pro Gly Pro Thr1 5 10 15Trp Pro Glu Leu Leu Gly Ser Asn Ala Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro20 25 30Leu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Leu Leu Leu Arg Cys Gly Asp Phe Cys35 40 45Gln Val Thr Tyr Asp Thr Phe Ile Asn Asp Gln Asn Ser Ser Tyr Cys50 55 60Gly Ser Ser Arg Tyr Glu Lys Ala Asp Leu Leu His Lys Thr Ala Phe65 70 75 80Pro Gly Gly Ala Asp Arg Phe Asp Val Val Ala Tyr Leu Tyr Ala Thr85 90 95Ala Lys Val Ser Val Pro Glu Ala Phe Leu Leu Lys Ser Arg Ser Arg100 105 110Glu Lys Trp Asp Arg Glu Ser Asn Trp Ile Gly Tyr Val Val Val Ser115 120 125Asn Asp Glu Thr Ser Arg Val Ala Gly Arg Arg Glu Val Tyr Val Val130 135 140Trp Arg Gly Thr Cys Arg Asp Tyr Glu Trp Val Asp Val Leu Gly Ala145 150 155 160Gln Leu Glu Ser Ala His Pro Leu Leu Arg Thr Gln Gln Thr Thr His165 170 175Val Glu Lys Val Glu Asn Glu Glu Lys Lys Ser Ile His Lys Ser Ser180 185 190Trp Tyr Asp Cys Phe Asn Ile Asn Leu Leu Gly Ser Ala Ser Lys Asp195 200 205Lys Gly Lys Gly Ser Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Pro Lys Val Met210 215 220Gln Gly Trp Met Thr Ile Tyr Thr Ser Glu Asp Pro Lys Ser Pro Phe225 230 235 240Thr Lys Leu Ser Ala Arg Thr Gln Leu Gln Thr Lys Leu Lys Gln Leu245 250 255Met Thr Lys Tyr Lys Asp Glu Thr Leu Ser Ile Thr Phe Ala Gly His260 265 270Ser Leu Gly Ala Thr Leu Ser Val Val Ser Ala Phe Asp Ile Val Glu275 280 285Asn Leu Thr Thr Glu Ile Pro Val Thr Ala Val Val Phe Gly Cys Pro290 295 300Lys Val Gly Asn Lys Lys Phe Gln Gln Leu Phe Asp Ser Tyr Pro Asn305 310 315 320Leu Asn Val Leu His Val Arg Asn Val Ile Asp Leu Ile Pro Leu Tyr325 330 335Pro Val Lys Leu Met Gly Tyr Val Asn Ile Gly Ile Glu Leu Glu Ile340 345 350Asp Ser Arg Lys Ser Thr Phe Leu Lys Asp Ser Lys Asn Pro Ser Asp355 360 365Trp His Asn Leu Gln Ala Ile Leu His Val Val Ser Gly Trp His Gly
370 375 380Val Lys Gly Glu Phe Lys Val Val Asn Lys Arg Ser Val Ala Leu Val385 390 395 400Asn Lys Ser Cys Asp Phe Leu Lys Glu Glu Cys Leu Val Pro Pro Ala405 410 415Trp Trp Val Val Gln Asn Lys Gly Met Val Leu Asn Lys Asp Gly Glu420 425 430Trp Val Leu Ala Pro Pro Glu Glu Asp Pro Thr Pro Glu Phe Asp435 440 445<210>3<211>10<212>PRT<213>番茄<400>3Ile Thr Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Ala1 5 10<210>4<211>10<212>PRT<213>香石竹<400>4Ile Thr Phe Ala Gly His Ser Leu Gly Ala1 5 10<210>5<211>19<212>DNA<213>香石竹<400>5acctactagg ttccgcgtc 19<210>6<211>923<212>DNA<213>番茄<220><221>CDS<222>(join(6..513，845..921))<400> 6ctcta gac tat gag tgg gtg gat gtt tta ggt gct cgt cct gat tca 47Asp Tyr Glu Trp Val Asp Val Leu Gly Ala Arg Pro Asp Ser1 5 10gct gac tct ctt ctt cat cct aaa tct ctc caa aaa ggc att aac aac 95Ala Asp Ser Leu Leu His Pro Lys Ser Leu Gln Lys Gly Ile Asn Asn15 20 25 30aag aac gat gag gat gag gac gag gac gag gat gag atc aaa gta atg 143Lys Asn Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Ile Lys Val Met35 40 45gat ggg tgg ctt aag atc tac gtc tca agt aac ccg aag tcg tct ttc 191Asp Gly Trp Leu Lys Ile Tyr Val Ser Ser Asn Pro Lys Ser Ser Phe50 55 60acg aga cta agt gca aga gaa caa ctt caa gca aag att gaa aag tta 239Thr Arg Leu Ser Ala Arg Glu Gln Leu Gln Ala Lys Ile Glu Lys Leu65 70 75aga aat gag tat aaa gat gag aat ttg agc ata act ttt aca ggg cat 287Arg Asn Glu Tyr Lys Asp Glu Asn Leu Ser Ile Thr Phe Thr Gly His80 85 90agt ctt ggt gct agc tta gct gtt tta gct tca ttt gat gtg gtt gaa 335Ser Leu Gly Ala Ser Leu Ala Val Leu Ala Ser Phe Asp Val Val Glu95 100 105 110aat ggt gtg cca gtt gat att cca gta tct gca att gta ttt ggt agt 383Asn Gly Val Pro Val Asp Ile Pro Val Ser Ala Ile Val Phe Gly Ser115 120 125cca caa gtt ggg aat aag gca ttc aat gaa aga atc aag aaa ttc tca 431Pro Gln Val Gly Asn Lys Ala Phe Asn Glu Arg Ile Lys Lys Phe Ser
130 135 140aac ttg aat atc tta cat gtt aag aac aag att gat ctc att acc ctt 479Asn Leu Asn Ile Leu His Val Lys Asn Lys Ile Asp Leu Ile Thr Leu145 150 155tac cca agt gct ctg ttt ggg tat gtg aat tca g gtattgaagg 523Tyr Pro Ser Ala Leu Phe Gly Tyr Val Asn Ser160 165aaaagatcat tacaattttg agctagattt ctcatatcgt cacactcaac taacagttat 583tatatgagaa agtcactttc tttgtgaaaa aattgaatca acttttggaa ataatagtag 643ttgagtgacc atatgagaaa tcaacactct actaacttta tgctataaga gaataggtta 703aggtccatat gtttatactg tctgttcaat tagaatcata aaagtattac tagttaaatt 763tgactacaat cttatgtaga catgaataaa ataaatccta cataaataag atttcctaca 823actttaatga ttcttcaaca g gt ata gag cta gtc atc gat agc aga aag 873Gly Ile Glu Leu Val Ile Asp Ser Arg Lys170 175tct ccg agt tta aag gat tca aaa gac atg ggc gac tgg cac aac ctc 921Ser Pro Ser Leu Lys Asp Ser Lys Asp Met Gly Asp Trp His Asn Leu180 185 190 195ca923<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>7ctctagacta tgagtgggt 19<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>8cgactggcac aacctcca 18<210>9<211>10<212>PRT<213>擬南芥屬種<400>9Ile Thr Thr Cys Gly His Ser Leu Gly Ala1 5 10<210>10<211>10<212>PRT<213>Ipomoea nil<400>10Ile Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ser1 5 10<210>11<211>447<212>PRT<213>香石竹<400> 11Met Ala Ala Glu Ala Gln Pro Leu Gly Leu Ser Lys Pro Gly Pro Thr1 5 10 15Trp Pro Glu Leu Leu Gly Ser Asn Ala Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro20 25 30Leu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Leu Leu Leu Arg Cys Gly Asp Phe Cys
35 40 45Gln Val Thr Tyr Asp Thr Phe Ile Asn Asp Gln Asn Ser Ser Tyr Cys50 55 60Gly Ser Ser Arg Tyr Gly Lys Ala Asp Leu Leu His Lys Thr Ala Phe65 70 75 80Pro Gly Gly Ala Asp Arg Phe Asp Val Val Ala Tyr Leu Tyr Ala Thr85 90 95Ala Lys Val Ser Val Pro Glu Ala Phe Leu Leu Lys Ser Arg Ser Arg100 105 110Glu Lys Trp Asp Arg Glu Ser Asn Trp Ile Gly Tyr Val Val Val Ser115 120 125Asn Asp Glu Thr Ser Arg Val Ala Gly Arg Arg Glu Val Tyr Val Val130 135 140Trp Arg Gly Thr Cys Arg Asp Tyr Glu Trp Val Asp Val Leu Gly Ala145 150 155 160Gln Leu Glu Ser Ala His Pro Leu Leu Arg Thr Gln Gln Thr Thr His165 170 175Val Glu Lys Val Glu Asn Glu Glu Lys Lys Ser Ile His Lys Ser Ser180 185 190Trp Tyr Asp Cys Phe Asn Ile Asn Leu Leu Gly Ser Ala Ser Lys Asp195 200 205Lys Gly Lys Gly Ser Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Pro Lys Val Met210 215 220Gln Gly Trp Met Thr Ile Tyr Thr Ser Glu Asp Pro Lys Ser Pro Phe225 230 235 240Thr Lys Leu Ser Ala Arg Thr Gln Leu Gln Thr Lys Leu Lys Cys Leu245 250 255Met Thr Lys Tyr Lys Asp Glu Thr Leu Ser Ile Thr Phe Ala Gly His260 265 270Ser Leu Gly Ala Thr Leu Ser Val Val Ser Ala Phe Asp Ile Val Glu275 280285Asn Leu Thr Thr Glu Ile Pro Val Thr Ala Val Val Phe Gly Cys Pro290 295 300Lys Val Gly Asn Lys Lys Phe Gln Gln Leu Phe Asp Ser Tyr Pro Asn305 310 315 320Leu Asn Val Leu His Val Arg Asn Val Ile Asp Leu Ile Pro Leu Tyr325 330 335Pro Val Lys Leu Met Gly Tyr Val Asn Ile Gly Ile Glu Leu Glu Ile340 345 350Asp Ser Arg Lys Ser Thr Phe Leu Lys Asp Ser Lys Asn Pro Ser Asp355360 365Trp His Asn Leu Gln Ala Ile Leu His Val Val Ser Gly Trp His Gly370 375 380Val Lys Gly Glu Phe Lys Val Val Asn Lys Arg Ser Val Ala Leu Val385 390 395 400Asn Lys Ser Cys Asp Phe Leu Lys Glu Glu Cys Leu Val Pro Pro Ala405 410 415Trp Trp Val Val Gln Asn Lys Gly Met Val Leu Asn Lys Asp Gly Glu420 425 430Trp Val Leu Ala Pro Pro Glu Glu Asp Pro Thr Pro Glu Phe Asp435440 445<210>12<211>418<212>PRT<213>擬南芥<400>12Met Lys Arg Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Leu Ile Val Thr1 5 10 15Arg Glu Phe Ala Lys Arg Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gln Asn His Trp
20 25 30Lys Gly Met Leu Gln Pro Leu Asp Gln Asp Leu Arg Glu Tyr Ile Ile35 40 45His Tyr Gly Glu Met Ala Gln Ala Gly Tyr Asp Thr Phe Asn Ile Asn50 55 60Thr Glu Ser Gln Phe Ala Gly Ala Ser Ile Tyr Ser Arg Lys Asp Phe65 70 75 80Phe Ala Lys Val Gly Leu Glu Ile Ala His Pro Tyr Thr Lys Tyr Lys85 90 95Val Thr Lys Phe Ile Tyr Ala Thr Ser Asp Ile His Val Pro Glu Ser100 105 110Phe Leu Leu Phe Pro Ile Ser Arg Glu Gly Trp Ser Lys Glu Ser Asn115 120 125Trp Met Gly Tyr Val Ala Val Thr Asp Asp Gln Gly Thr Ala Leu Leu130 135 140Gly Arg Arg Asp Ile Val Val Ser Trp Arg Gly Ser Val Gln Pro Leu145 150 155 160Glu Trp Val Glu Asp Phe Glu Phe Gly Leu Val Asn Ala Ile Lys Ile165 170 175Phe Gly Glu Arg Asn Asp Gln Val Gln Ile His Gln Gly Trp Tyr Ser180 185 190Ile Tyr Met Ser Gln Asp Glu Arg Ser Pro Phe Thr Lys Thr Asn Ala195 200 205Arg Asp Gln Val Leu Arg Glu Val Gly Arg Leu Leu Glu Lys Tyr Lys210 215 220Asp Glu Glu Val Ser Ile Thr Ile Cys Gly His Ser Leu Gly Ala Ala225 230 235 240Leu Ala Thr Asp Ser Ala Ile Asp Ile Val Ala Asn Gly Tyr Asn Arg250 250 255Pro Lys Ser Arg Pro Asp Lys Ser Cys Pro Val Thr Ala Phe Val Phe260 265 270Ala Ser Pro Arg Val Gly Asp Ser Asp Phe Arg Lys Leu Phe Ser Gly275 280 285Leu Glu Asp Ile Arg Val Leu Arg Thr Arg Asn Leu Phe Asp Val Ile290 295 300Pro Ile Tyr Pro Pro Ile Gly Tyr Ser Glu Val Gly Asp Glu Phe Pro305 310 315 320Ile Asp Thr Arg Lys Ser Pro Tyr Met Lys Ser Pro Gly Asn Leu Ala325 330 335Thr Phe His Cys Leu Glu Gly Tyr Leu His Gly Val Ala Gly Thr Gln340 345 350Gly Thr Asn Lys Ala Asp Leu Phe Arg Leu Asp Val Glu Arg Ala Ile355 360 365Gly Leu Val Asn Lys Ser Val Asp Gly Leu Lys Asp Glu Cys Met Val370 375 380Pro Gly Lys Trp Arg Val Leu Lys Asn Lys Gly Ala Gln Gln Asp Asp385 390 395 400Gly Ser Trp Glu Leu Val Asp His Glu Ile Asp Asp Asn Glu Asp Leu405 410 415Asp Phe<210>13<211>401<212>PRT<213>Ipomoea sp.<400>13Met Ser Gly Ile Ala Lys Arg Trp Lys Val Leu Ser Gly Ser Asp Asn1 5 10 15Trp Glu Gly Leu Leu Glu Pro Leu Asp Ser Asp Leu Arg Arg Tyr Leu
20 25 30Ile His Tyr Gly Thr Met Val Ser Pro Ala Thr Asp Ser Phe Ile Asn35 40 45Glu Ala Ala Ser Lys Asn Val Gly Leu Pro Arg Tyr Ala Arg Arg Asn50 55 60Leu Leu Ala Asn Cys Gly Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe Lys Tyr Glu65 70 75 80Val Thr Lys Tyr Phe Tyr Ala Pro Ser Thr Ile Pro Leu Pro Asp Glu85 90 95Gly Tyr Asn Val Arg Ala Thr Arg Ala Asp Ala Val Leu Lys Glu Ser100 105 110Asn Trp Asn Gly Tyr Val Ala Val Ala Thr Asp Glu Gly Lys Val Ala115 120 125Leu Gly Arg Arg Asp Ile Leu Ile Val Trp Arg Gly Thr Ile Arg Lys130 135 140Ser Glu Trp Asn Glu Asn Leu Thr Phe Trp Phe Val Lys Ala Pro Leu145 150 155 160Phe Phe Gly Gln Asn Ser Asp Pro Leu Val His Lys Gly Trp Tyr Asp165 170 175Met Tyr Thr Thr Ile Asn Gln Asp Ser Gln Leu Asn Glu Lys Ser Ala180 185 190Arg Asp Gln Ile Arg Glu Glu Val Ala Arg Leu Val Glu Leu Tyr Lys195 200 205Asp Glu Asp Ile Ser Ile Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ser Ser210 215 220Met Ala Thr Leu Asn Ala Val Asp Leu Ala Ala Asn Pro Ile Asn Asn225 230 235 240Asn Lys Asn Ile Leu Val Thr Ala Phe Leu Tyr Ala Ser Pro Lys Val245 250 255Gly Asp Glu Asn Phe Lys Asn Val Ile Ser Asn Gln Gln Asn Leu Arg260 265 270Ala Leu Arg Ile Ser Asp Val Asn Asp Ile Val Thr Ala Val Pro Pro275 280 285Phe Gly Trp Lys Glu Cys Asp Asn Thr Ala Ile Leu Tyr Gly Asp Val290 295 300Gly Val Gly Leu Val Ile Asp Ser Lys Lys Ser His Tyr Leu Lys Pro305 310 315 320Asp Phe Pro Asn Leu Ser Thr His Asp Leu Met Leu Tyr Met His Ala325 330 335Ile Asp Gly Tyr Gln Gly Ser Gln Gly Gly Phe Glu Arg Gln Glu Asp340 345 350Phe Asp Leu Ala Lys Val Asn Lys Tyr Gly Asp Tyr Leu Lys Ala Glu355 360 365Tyr Pro Ile Pro Ile Gly Trp Phe Asn Ile Lys Asp Lys Gly Met Gln370 375 380Gln Asp Asp Gly Asn Tyr Ile Leu Asp Asp His Glu Val Asp Lys Thr385 390 395 400Phe<210>14<211>448<212>PRT<213>擬南芥<400>14Met Thr Ala Glu Asp Ile Arg Arg Arg Asp Lys Lys Thr Glu Glu Glu1 5 10 15Arg Arg Leu Arg Asp Thr Trp Arg Lys Ile Gln Gly Glu Asp Asp Trp20 25 30Ala Gly Leu Met Asp Pro Met Asp Pro Ile Leu Arg Ser Glu Leu Ile
35 40 45Arg Tyr Gly Glu Met Ala Gln Ala Cys Tyr Asp Ala Phe Asp Phe Asp50 55 60Pro Ala Ser Lys Tyr Cys Gly Thr Ser Arg Phe Thr Arg Leu Glu Phe65 70 75 80Phe Asp Ser Leu Gly Met Ile Asp Ser Gly Tyr Glu Val Ala Arg Tyr85 90 95Leu Tyr Ala Thr Ser Asn Ile Asn Leu Pro Asn Phe Phe Ser Lys Ser100 105 110Arg Trp Ser Lys Val Trp Ser Lys Asn Ala Asn Trp Met Gly Tyr Val115 120 125Ala Val Ser Asp Asp Glu Thr Ser Arg Asn Arg Leu Gly Arg Arg Asp130 135 140Ile Ala Ile Ala Trp Arg Gly Thr Val Thr Lys Leu Glu Trp Ile Ala145 150 155 160Asp Leu Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Val Thr Glu Asn Lys Ile Arg Cys165 170 175Pro Asp Pro Ala Val Lys Val Glu Ser Gly Phe Leu Asp Leu Tyr Thr180 185 190Asp Lys Asp Thr Thr Cys Lys Phe Ala Arg Phe Ser Ala Arg Glu Gln195 200 205Ile Leu Thr Glu Val Lys Arg Leu Val Glu Glu His Gly Asp Asp Asp210 215 220Asp Ser Asp Leu Ser Ile Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala225 230 235 240Leu Ala Ile Leu Ser Ala Tyr Asp Ile Ala Glu Met Arg Leu Asn Arg245 250 255Ser Lys Lys Gly Lys Val Ile Pro Val Thr Ala Val Leu Thr Tyr Gly260 265 270Gly Pro Arg Val Gly Asn Val Arg Phe Arg Glu Arg Met Glu Glu Leu275 280 285Gly Val Lys Val Met Arg Val Val Asn Val His Asp Val Val Pro Lys290 295 300Ser Pro Gly Leu Phe Leu Asn Glu Ser Arg Pro His Ala Leu Met Lys305 310 315 320Ile Ala Glu Gly Leu Pro Trp Cys Tyr Ser His Val Gly Glu Glu Leu325 330 335Ala Leu Asp His Gln Asn Ser Pro Phe Leu Lys Pro Ser Val Asp Val340 345 350Ser Thr Ala His Asn Leu Glu Ala Met Leu His Leu Leu Asp Gly Tyr355 360 365His Gly Lys Gly Glu Arg Phe Val Leu Ser Ser Gly Arg Asp His Ala370 375 380Leu Val Asn Lys Ala Ser Asp Phe Leu Lys Glu His Leu Gln Ile Pro385 390 395 400Pro Phe Trp Arg Gln Asp Ala Asn Lys Gly Met Val Arg Asn Ser Glu405 410 415Gly Arg Trp Ile Gln Ala Glu Arg Leu Arg Phe Glu Asp His His Ser420 425 430Pro Asp Ile His His His Leu Ser Gln Leu Arg Leu Asp His Pro Cys435 440 445<210>15<211>1167<212>DNA<213>擬南芥屬種<220><221>CDS<222>(1)..(1044)<400>15cgg gtc gac cca cgc gtc cgc gaa aac gct tcc gac tac gag gtt gta 48Arg Val Asp Pro Arg Val Arg Glu Asn Ala Ser Asp Tyr Glu Val Val1 5 10 15aac ttc ctc tac gcc aca gct cgt gtt tct ctc ccc gaa ggt ttg ctt 96Asn Phe Leu Tyr Ala Thr Ala Arg Val Ser Leu Pro Glu Gly Leu Leu20 25 30ctc caa tca caa tca aga gat tct tgg gac cgt gag tct aac tgg ttt 144Leu Gln Ser Gln Ser Arg Asp Ser Trp Asp Arg Glu Ser Asn Trp Phe35 40 45ggc tac att gct gtc acg tct gat gaa cgg tct aag gct tta gga cgc 192Gly Tyr Ile Ala Val Thr Ser Asp Glu Arg Ser Lys Ala Leu Gly Arg50 55 60cgt gag atc tat ata gct ttg aga gga acg agc agg aac tat gag tgg 240Arg Glu Ile Tyr Ile Ala Leu Arg Gly Thr Ser Arg Asn Tyr Glu Trp65 70 75 80gtc aat gtt ttg ggt gct agg cca act tca gct gac ccc ttg ctg cac 288Val Asn Val Leu Gly Ala Arg Pro Thr Ser Ala Asp Pro Leu Leu His85 90 95gga ccc gag cag gat ggt tct ggt ggt gta gtt gaa ggt acg act ttt 336Gly Pro Glu Gln Asp Gly Ser Gly Gly Val Val Glu Gly Thr Thr Phe100 105 110gat agt gac agt gaa gat gaa gaa ggg tgt aag gtg atg ctc ggg tgg 384Asp Ser Asp Ser Glu Asp Glu Glu Gly Cys Lys Val Met Leu Gly Trp115 120 125ctc aca atc tat act tct aat cac ccc gaa tcg aaa ttc act aag ctg 432Leu Thr Ile Tyr Thr Ser Asn His Pro Glu Ser Lys Phe Thr Lys Leu130 135 140agt cta cgg tca cag ttg tta gcc aag atc aag gag ctt ctg ttg aag 480Ser Leu Arg Ser Gln Leu Leu Ala Lys Ile Lys Glu Leu Leu Leu Lys145 150 155 160tat aag gac gag aaa ccg agc att gtg ttg act gga cat agc ttg gga 528Tyr Lys Asp Glu Lys Pro Ser Ile Val Leu Thr Gly His Ser Leu Gly165 170 175cct aca gag gct gtt ctg gcc gcc tat gat ata gct gag aac ggt tcc 576Pro Thr Glu Ala Val Leu Ala Ala Tyr Asp Ile Ala Glu Asn Gly Ser180 185 190agt gat gat gtt ccg gtc act gct ata gtc ttt ggt tgt cca cag gta 624Ser Asp Asp Val Pro Val Thr Ala Ile Val Phe Gly Cys Pro Gln Val195 200 205gga aac aag gag ttc aga gac gaa gta atg agt cac aag aac tta aag 672Gly Asn Lys Glu Phe Arg Asp Glu Val Met Ser His Lys Asn Leu Lys210 215 220atc ctc cat gta agg aac acg att gat ctc tta act cga tac cca ggg 720Ile Leu His Val Arg Asn Thr 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1.一種編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的分離的DNA分子，其中，所述DNA分子能在低嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1雜交，或者能夠與SEQ ID NO1雜交的所述分離的DNA分子的功能性衍生物。
2.如權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中，所述DNA分子具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中，所述分離的DNA分子含有SEQ ID NO4的核苷酸序列。
4.一種由能在低嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1雜交的核苷酸序列編碼的分離的衰老誘導(dǎo)脂酶，或所述衰老誘導(dǎo)脂酶的功能性衍生物。
5.如權(quán)利要求4的衰老誘導(dǎo)脂酶，其中，所述脂酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
6.一種用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體，它包括(a)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它大體上互補(bǔ)于(1)編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子的一股鏈的至少一部分，其中，所述編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子能在低嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1雜交，或(2)由所述編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子所編碼的RNA序列的至少一部分；和(b)可操作地連接于所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調(diào)控序列，因此，所述反義寡核苷酸或多核苷酸能在用它轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞中表達(dá)。
7.如權(quán)利要求6的載體，其中，所述調(diào)控序列包括一個(gè)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。
8.如權(quán)利要求6的載體，其中，所述調(diào)控序列包括一個(gè)組成型啟動(dòng)子。
9.如權(quán)利要求6的載體，其中，所述調(diào)控序列包括一個(gè)植物組織專一性啟動(dòng)子。
10.如權(quán)利要求6的載體，其中，所述調(diào)控序列包括一個(gè)衰老誘導(dǎo)植物啟動(dòng)子。
11.如權(quán)利要求6的載體，其中，所述調(diào)控序列包括一個(gè)病毒啟動(dòng)子。
12.如權(quán)利要求11的載體，其中，所述調(diào)控序列包括一個(gè)組成型啟動(dòng)子。
13.一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它所編碼的RNA分子大體上互補(bǔ)于植物衰老誘導(dǎo)脂酶基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分，其中，所述植物基因能在低嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1雜交。
14.如權(quán)利要求13的反義寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述寡核苷酸或多核苷酸包括大約6-大約100個(gè)核苷酸。
15.如權(quán)利要求13的反義寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述植物基因的編碼區(qū)具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
16.如權(quán)利要求13的反義寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述植物基因是香石竹基因。
17.如權(quán)利要求13的反義寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述植物基因是番茄基因。
18.如權(quán)利要求13的反義寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述植物基因是綠豆基因。
19.如權(quán)利要求13的反義寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述反義寡核苷酸或多核苷酸大體上互補(bǔ)于所述RNA轉(zhuǎn)錄物的5’非編碼區(qū)的至少一部分。
20.一種載體，它包括(a)一種編碼衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子，其中，所述DNA分子能在低嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1雜交；和(b)可操作地連接于所述DNA分子上的調(diào)控序列，因此，所述DNA分子能在用它轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞中表達(dá)。
21.一種用權(quán)利要求20的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞。
21.一種用權(quán)利要求6的載體轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞。
22.一種由用權(quán)利要求6的載體轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞再生的植物及其后代。
23.如權(quán)利要求22的植物、植物部分或植物后代。
24.一種抑制植物細(xì)胞中內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶表達(dá)的方法，該方法包括(1)將包括以下部分的載體整合到所述植物的基因組中(A)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它大體上互補(bǔ)于(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子的一股鏈的至少一部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子能與SEQ ID NO1雜交，或(ii)由所述內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子所編碼的RNA序列的至少一部分；和(B)可操作地連接于所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調(diào)控序列，因此，所述反義寡核苷酸或多核苷酸能表達(dá)；和(2)生長所述植物，以便轉(zhuǎn)錄所述反義寡核苷酸或多核苷酸，并且，該轉(zhuǎn)錄物結(jié)合于所述RNA序列上，因此抑制了所述衰老誘導(dǎo)脂酶基因的表達(dá)。
25.如權(quán)利要求24的方法，其中，與所述反義寡核苷酸或多核苷酸大體上互補(bǔ)的DNA部分或RNA部分包括5’非編碼序列。
26.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述抑制會(huì)導(dǎo)致植物衰老的改變。
27.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述抑制會(huì)導(dǎo)致所述植物對(duì)環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的衰老抗性的增強(qiáng)。
28.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述調(diào)控序列包括能在植物中起作用的組成型啟動(dòng)子。
29.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述調(diào)控序列包括組成型啟動(dòng)子。
30.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述調(diào)控序列包括能在植物中起作用的組織專一性啟動(dòng)子。
31.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述調(diào)控序列包括能在植物中起作用的衰老誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
32.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述植物選自結(jié)果實(shí)的植物，開花植物和蔬菜。
33.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述植物是番茄。
34.如權(quán)利要求24的方法，其中，所述植物是香石竹。
35.一種抑制植物細(xì)胞中內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶表達(dá)的方法，該方法包括(1)將包括以下部分的載體整合到所述植物至少一個(gè)細(xì)胞的基因組中(A)一種編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶的分離的DNA分子，其中，所述DNA分子能在低嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1雜交，或能與SEQ ID NO1雜交的所述分離的DNA分子的功能性衍生物；和(B)可操作地連接于所述DNA分子上的調(diào)控序列，因此，由它所編碼的內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶能表達(dá)；和(2)生長所述植物，以便超量表達(dá)所述DNA分子，并且，由外源衰老誘導(dǎo)脂酶抑制了所述內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶基因的表達(dá)。
36.如權(quán)利要求35的方法，其中，所述調(diào)控序列包括組成型啟動(dòng)子。
37.一種改變植物的與年齡相關(guān)的衰老和與環(huán)境脅迫相關(guān)的衰老的方法，該方法包括(1)將包括以下部分的載體整合到所述植物的基因組中(A)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它大體上互補(bǔ)于(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子的一股鏈的至少一部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子能與SEQ ID NO1雜交，或(ii)由所述內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶基因所編碼的RNA序列的至少一部分；和(B)可操作地連接于所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調(diào)控序列，因此，所述反義寡核苷酸或多核苷酸能表達(dá)；和(2)生長所述植物，以便轉(zhuǎn)錄所述反義寡核苷酸或多核苷酸，并且，該轉(zhuǎn)錄物結(jié)合于所述RNA序列上，因此抑制了所述衰老誘導(dǎo)脂酶基因的表達(dá)。
38.一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，包括權(quán)利要求6的載體。
39.一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，包括權(quán)利要求20的載體。
40.一種質(zhì)粒，包括能在原核宿主中起作用的復(fù)制系統(tǒng)和 13的反義寡核苷酸或多核苷酸。
41.一種質(zhì)粒，包括能在農(nóng)桿菌屬中起作用的復(fù)制系統(tǒng)和 13的反義寡核苷酸或多核苷酸。
42.一種由具有受到抑制了的或減弱了的衰老誘導(dǎo)脂酶表達(dá)的細(xì)胞所產(chǎn)生的植物及其后代，所述細(xì)胞包括權(quán)利要求6的載體。
43.一種由具有受到抑制了的或減弱了的衰老誘導(dǎo)脂酶表達(dá)的細(xì)胞所產(chǎn)生的植物及其后代，其中，所述細(xì)胞是通過以下步驟產(chǎn)生的；(1)將包括以下部分的載體整合到所述細(xì)胞的基因組中(A)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它大體上互補(bǔ)于(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子的一股鏈的至少一部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子能與SEQ ID NO1雜交，或(ii)由所述內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶基因所編碼的RNA序列的至少一部分；和(B)可操作地連接于所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調(diào)控序列，因此，所述反義寡核苷酸或多核苷酸能表達(dá)；和(2)生長所述植物，以便轉(zhuǎn)錄所述反義寡核苷酸或多核苷酸，并且，該轉(zhuǎn)錄物結(jié)合于所述RNA上，因此抑制了所述衰老誘導(dǎo)脂酶基因的表達(dá)。
44.如權(quán)利要求43的植物和后代，其中，所述植物是番茄。
45.如權(quán)利要求43的植物和后代，其中，所述植物是香石竹。
46.一種抑制種子衰老的方法，該方法包括(1)將包括以下部分的載體整合到所述植物的基因組中(A)一種反義寡核苷酸或多核苷酸，它大體上互補(bǔ)于(i)編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子的一股鏈的至少一部分，其中，所述編碼內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶的DNA分子能與SEQ ID NO1雜交，或(ii)由所述內(nèi)源衰老誘導(dǎo)脂酶的編碼DNA分子所轉(zhuǎn)錄的RNA序列的至少一部分；和(B)可操作地連接于所述反義寡核苷酸或多核苷酸上的調(diào)控序列；和(2)生長所述植物，以便轉(zhuǎn)錄所述反義寡核苷酸或多核苷酸，并且，該轉(zhuǎn)錄物結(jié)合于所述RNA上，因此抑制了所述衰老誘導(dǎo)脂酶基因的表達(dá)。
全文摘要
通過將編碼衰老誘導(dǎo)脂酶基因或基因片段沿反義方向整合到植物基因組中,實(shí)現(xiàn)了對(duì)植物衰老表達(dá)的調(diào)控。鑒定了編碼衰老誘導(dǎo)脂酶香石竹基因,并將其核苷酸序列用于改變轉(zhuǎn)基因植物的衰老。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1354797SQ00806296
公開日2002年6月19日 申請日期2000年2月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月16日
發(fā)明者J·E·湯普森, T·-W·王, K·胡達(dá)克, Y·洪 申請人:森尼斯科公司