專利名稱：重組人白細(xì)胞介素－4，其編碼核酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于重組人白細(xì)胞介素-4，及其編碼核酸。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素-4(IL-4)是一種促進(jìn)B細(xì)胞增殖的因子，最早曾命名為B細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1(BCGF-1)，有實(shí)驗(yàn)室稱為B細(xì)胞刺激因子-1(BSF-1)、T細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(TCGF-2)。1986年基因克隆成功，國(guó)際統(tǒng)一命名為白細(xì)胞介素-4(interleukin4，IL-4)。
人IL-4基因定位于第5號(hào)染色體，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，約10kb，是現(xiàn)知淋巴因子基因中較大的一個(gè)。成熟人IL-4分子由129氨基酸殘基組成，15kDa，有2個(gè)糖基化點(diǎn)，含有6個(gè)半胱氨酸，參與分子內(nèi)二硫鍵的組成。
IL-4對(duì)于B細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和造細(xì)胞都有免疫調(diào)節(jié)作用。IL-4促進(jìn)SAC或抗IgM預(yù)先刺激B細(xì)胞的增殖，這一生物學(xué)功能已被用來作為檢測(cè)IL-4的生物學(xué)活性。IL-4促進(jìn)B細(xì)胞MHC II類抗原、FcεR II/CD23和CD40的表達(dá)，并增強(qiáng)B細(xì)胞提呈抗原能力，使免疫系統(tǒng)對(duì)小量抗原刺激發(fā)生免疫應(yīng)答。高劑量IL-4能誘導(dǎo)CD4-CD8+或CD4+CD8-或CD4-CD8-胸腺細(xì)胞的增殖。IL-4增強(qiáng)PHA刺激T細(xì)胞釋放GM-CSF和G-CSF。在小鼠實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，多數(shù)情況下IL-4對(duì)CTL和LAK細(xì)胞的分化有正調(diào)節(jié)作用；而對(duì)人的殺傷細(xì)胞則有時(shí)表現(xiàn)為負(fù)調(diào)節(jié)作用，如在人MLC中IL-4選擇性地促進(jìn)Th增殖，同時(shí)伴有CTL、NK和LAK功能的降低。此外IL-4還能抑制IL-2所誘導(dǎo)的NK白血病細(xì)胞LAK活性。最近發(fā)現(xiàn)，用IL-4與T細(xì)胞或B細(xì)胞溫育，可降低高親和力IL-2R位點(diǎn)數(shù)，但不影響低親和力IL-2R的數(shù)量。IL-4還可刺激CD3陰性NK細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)。IL-4能刺激肥大細(xì)胞增殖，并與IL-3有協(xié)同作用，尤其對(duì)于粘膜和結(jié)締組織型肥大細(xì)胞體外生長(zhǎng)是必需的。IL-4能促進(jìn)巨噬細(xì)胞提呈抗原和殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。這可能與調(diào)節(jié)MHC II類抗原和FcR表達(dá)有關(guān)。IL-4與GM-CSF、IL-3和LPS有協(xié)同作用。IL-4可誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞分泌G-CSF和M-CSF，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬、殺傷活性和ADCC作用。IL-4是小鼠巨噬細(xì)胞趨化因子，并促進(jìn)IL-1ra產(chǎn)生，但抑制單核細(xì)胞IL-1、TNF和IL-6的產(chǎn)生。IL-4能協(xié)同CSF刺激造血細(xì)胞的增殖，與G-CSF協(xié)同增強(qiáng)粒細(xì)胞集落形成，協(xié)同紅細(xì)胞生成素(EPO)增強(qiáng)BFU-E的形成。
由于體內(nèi)、體外均證實(shí)IL-4可以抑制IL-1、IL-6和TNF分泌，并促進(jìn)IL-1ra產(chǎn)生，應(yīng)用IL-4可能為治療敗血癥休克提供一種新的方法。因此，獲得生物活性更強(qiáng)的IL-4，通過基因工程人工合成，并盡可能提高其得率，在科研，醫(yī)療，和產(chǎn)業(yè)化方面無疑具有巨大的潛在價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供具有更高生物活性的重組人白細(xì)胞介素-4。
本發(fā)明的目的還在于提供編碼上述重組IL-4，并可在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高表達(dá)的核酸序列。
本發(fā)明的目的還在于提供可實(shí)現(xiàn)上述目的的載體和宿主細(xì)胞。
為例實(shí)現(xiàn)上述各發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施了以下技術(shù)方案。
本發(fā)明提供一種重組人白細(xì)胞介素-4，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，其中第38位的氨基酸選自丙氨酸，甘氨酸和絲氨酸，第72位的氨基酸選自絲氨酸或蘇氨酸，第100位氨基酸選自甘氨酸，丙氨酸和絲氨酸。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與氨基酸之間的關(guān)系，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)某個(gè)氨基酸如上所述地被性質(zhì)相同或者相近的氨基酸取代后，其結(jié)構(gòu)和功能一般不發(fā)生變化，能夠獲得同樣甚至更好的效果。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式之一中，上述重組IL-4中，第38位氨基酸是丙氨酸，第72位是絲氨酸，且第100為是甘氨酸。
本發(fā)明的重組IL-4可用多種方法制備而得，既可以如本發(fā)明所述由重組IL-4編碼核酸表達(dá)而得，也可以通過全化學(xué)合成獲得。有關(guān)蛋白質(zhì)或肽的制備在現(xiàn)有文獻(xiàn)中多有記載，這些方法都適用于本發(fā)明重組IL-4的制備。此外，蛋白質(zhì)的鑒定也是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，在現(xiàn)有文獻(xiàn)中多有記載。因此，根據(jù)本發(fā)明給定的氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)獲得本發(fā)明的重組IL-4。
本發(fā)明還提供一種重組編碼核酸，它編碼權(quán)利要求1所述的重組人白細(xì)胞介素-4，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，其中第112-114位選自GCT、GCA、GCC、GCG、GGT、GGA、GGC、GGG、TCT、TCC、TCA、TCG，第214-21 6位選自TCT、TCC、TCA、TCG、ACT、ACC、ACA、ACG，而且第298-300位選自GGT、GGA、GGC、GGG、GCT、GCA、GCC、GCG、TCT、TCC、TCA、TCG。
本發(fā)明實(shí)施方式之一中，所述重組核酸中的第112-114位是GCT，第214-216位是TCT，而且第298-300位是GGT。
本發(fā)明的重組核酸可用多種方法獲得，其中包括，以公開的天然序列(例如GeneBank登錄號(hào)XM_004053)為模板進(jìn)行定點(diǎn)誘變；或根據(jù)本發(fā)明給定的序列進(jìn)行全合成。這些都已是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。而且，核苷酸序列的鑒定也是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，在現(xiàn)有文獻(xiàn)中多有記載。因此，根據(jù)本發(fā)明給定的核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)制備得到本發(fā)明的編碼IL-4的重組核酸。
本發(fā)明還提供一種載體，其中含有本發(fā)明的重組核酸。在本領(lǐng)域中，通過適當(dāng)?shù)目寺〖夹g(shù)，將目的核酸片段插入合適的載體以實(shí)現(xiàn)保存，擴(kuò)增和/或表達(dá)等目的，已是一般常規(guī)技術(shù)。合適載體的選擇取決于克隆目的，載體容留，與宿主細(xì)胞的相容性，酶切位點(diǎn)等多種因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難根據(jù)具體情況做出適當(dāng)選擇?？捎靡员景l(fā)明的載體例如但不限于pUC18、pUC19、pUC57、pBluescript sk+/sk-。
本發(fā)明實(shí)施方式之一中，所述載體還含有操作性連接于所述重組核酸序列5’端的信號(hào)肽序列，從而使該編碼核酸在大腸桿菌中以分泌的形式表達(dá)。所述信號(hào)肽序列可使用但不限于大腸桿菌OmpA信號(hào)肽(GenBank登錄號(hào)U40577)。
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明重組IL-4編碼核酸的宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌。本發(fā)明實(shí)施方式之一中，所述宿主細(xì)胞是含有本發(fā)明所述載體的大腸桿菌。對(duì)于大腸桿菌的基因工程操作在本領(lǐng)域內(nèi)已相當(dāng)成熟。例如，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過常規(guī)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、微注射等多種方法都可將目的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并結(jié)合常規(guī)篩檢方法，可獲得良好的再現(xiàn)性。


圖1是本發(fā)明所用表達(dá)載體pUC18的酶切圖。
圖2是本發(fā)明重組IL-4對(duì)PBMC促生長(zhǎng)作用與陽性對(duì)照的比較圖。
具體實(shí)施例方式
重組IL-4的氨基酸序列本實(shí)施例的重組IL-4氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，與天然序列(Genbank登錄號(hào)XM-004053)的區(qū)別在于第38位，第72位和第100位上發(fā)生突變。本實(shí)施方式中，第38位由原來的天冬酰胺變?yōu)楸彼?，?2位由原來的谷氨酰胺變?yōu)榻z氨酸，第100位由原來的脯氨酸變?yōu)楦拾彼?。編碼重組IL-4的重組核苷酸序列根據(jù)本實(shí)施例重組IL-4的氨基酸序列，并考慮大腸桿菌密碼子使用的偏愛性，設(shè)計(jì)得到編碼本實(shí)施例重組IL-4的氨基酸序列，如SEQ ID NO2所示。在本實(shí)施方式中，第112-114位是GCT，第214-216位是TCT，而且第298-300位是GGT。核酸的人工合成為了簡(jiǎn)化表達(dá)產(chǎn)物的純化程序，在本實(shí)施例重組編碼核酸的5′端直接操作性連接了一段一段大腸桿菌的信號(hào)肽序列，這樣可使核酸在大腸桿菌中以分泌的形式表達(dá)。本實(shí)施方式選用大腸桿菌ompA基因的信號(hào)肽序列增加的序列如下。大腸桿菌OmpA信號(hào)肽的氨基酸序列如SEQ ID NO3(GenBank登錄號(hào)U40577)所示，其編碼序列如SEQ ID NO4(GenBank Accession NumberU40577)所示。
此外，為了啟動(dòng)翻譯，在該信號(hào)肽序列的5′端增加啟動(dòng)Met密碼子atg。而且，為了便于后續(xù)的克隆操作，在atg的5′端再增加了個(gè)EcoRI位點(diǎn)，在本實(shí)施例重組編碼核酸的3′端增加一個(gè)HindIII位點(diǎn)。至此，本實(shí)施例人工合成的插入片段序列如下所示，記作IL-4/OpmAgaattcatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggcc 69CACAAATGCGACATCACCCTGCAGGAAATCATCAAAACCCTGAACTCTCTGACCGAACAGAAAACCCTGTGCACCGAACT 149GACCGTTACCGACATCTTCGCTGCTTCTAAAGCTACCACCGAAAAAGAAACCTTCTGCCGTGCTGCTACCGTTCTGCGTC 229AGTTCTACTCTCACCACGAAAAAGACACCCGTTGCCTGGGTGCTACCGCTCAGTCTTTCCACCGTCACAAACAGCTGATC 309CGTTTCCTGAAACGTCTGGACCGTAACCTGTGGGGTCTGGCTGGTCTGAACTCTTGCGGTGTTAAAGAAGCTAACCAGTC 389TACCCTGGAAAACTTCCTGGAACGTCTGAAAACCATCATGCGTGAAAAATACTCTAAATGCTCTTCTaagctt456本實(shí)施例采用標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)片段融合PCR制備以上IL-4/OpmA。按照常規(guī)引物設(shè)計(jì)的原則將上述序列及其互補(bǔ)鏈拆分成26個(gè)長(zhǎng)度約為83～88b長(zhǎng)度的寡核苷酸片段作為。這些引物可以自己合成，也可以委托已商業(yè)化的專業(yè)機(jī)構(gòu)合成。例如，本實(shí)施例的引物片段并委托上海生工公司合成。然后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)融合PCR來獲得本實(shí)施例的IL-4/ompA基因片段，具體操作如下(1)反應(yīng)體系在0.2ml PCR管中加入以下各物質(zhì)組分 體積
10×Pfu PCR緩沖液 5μl寡核苷酸引物片段 1μl50×dNTP混合物 1μl50×Pfu DNA聚合酶 1μlPCR專用水 補(bǔ)至40μl總體積 50μl(2)反應(yīng)條件預(yù)變性94℃2min；主循環(huán)95℃1min，60℃40s，72℃1min，循環(huán)35次；后延伸72℃10min。
通過凝膠電泳觀察結(jié)果，由凝膠回收預(yù)定大小的IL-4/ompA片段。然后，按照按照常規(guī)方法，將該片段克隆于質(zhì)粒pGEM-T Easy(Promega)，進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè)序工作已商業(yè)化。例如，本實(shí)施例的測(cè)序工作委托上海基康公司進(jìn)行。根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定了序列完全正確的克隆，記作pIL-4/ompA。表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)施例采用pUC18載體作為表達(dá)載體。將上述pIL-4/ompA片段用EcoRI及HindIII酶切，在1％瓊脂糖電泳上分離，用PROMEGA公司的膠回收試劑盒回收長(zhǎng)度大約0.45kb左右的片段。然后用MBI公司的連接試劑盒把IL-4/ompA基因片段連接于原核表達(dá)載體pUC18載體的上，構(gòu)成pUC18-IL-4/ompA表達(dá)載體。
具體地說，在微量離心管中加入以下各物質(zhì)根據(jù)設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，用EcoRI及HindIII酶切表達(dá)質(zhì)粒pUC18。在微量離心管中加入以下各物質(zhì)pUC18質(zhì)粒DNA 3μg10×限制酶緩沖液 3μlEcoRI和HindIII 15U1mg/ml乙?；疊SA 3μl無核酸酶的水 至40μl37℃孵育4小時(shí)，以DNA標(biāo)記作對(duì)照，電泳，膠回收酶切的質(zhì)粒pUC18，置-20℃保存待用。
用相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，用EcoRI及HindIII酶切攜帶目的核酸的質(zhì)粒pGEM-T Easy即pIL-4/ompA，凝膠回收目的片段IL-4/ompA。
連接酶切表達(dá)質(zhì)粒pUC18及目的片段IL-4/ompA在0.2ml PCR管中加入以下各物10×連接緩沖液 2μl100mM DTT2μl10mM ATP 1μl50ng/μl經(jīng)酶切的pUC182μlT4連接酶 1μl
目標(biāo)片段1μl無核酸酶的水11μl總體積 20μl4C連接過夜。然后，把連接構(gòu)建好的質(zhì)粒pUC18轉(zhuǎn)化入表達(dá)工程菌DH5a中，培養(yǎng)于氨芐青霉素培養(yǎng)皿上。挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。抽提質(zhì)粒，用EcoRI及HindIII酶切鑒定，方法同前。酶切產(chǎn)物在1％瓊脂糖電泳上進(jìn)行鑒定，挑選大小爭(zhēng)取的克隆進(jìn)行測(cè)序。將序列完全正確的克隆記作pUC18-IL-4/ompA。重組IL-4的表達(dá)與純化取pUC18-IL-4/ompA克隆儲(chǔ)備液100μl分別接種到5ml含氨芐青霉素(100ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，260rpm震蕩培養(yǎng)至OD值達(dá)0.4～1.0，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.5～1mmol/L。培養(yǎng)3小時(shí)，從每種培養(yǎng)物中取出1ml轉(zhuǎn)移到離心管中，離心，去上清；裂解菌體進(jìn)行SDS蛋白電泳，用考馬斯亮藍(lán)對(duì)SDS聚丙烯酰胺進(jìn)行染色，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。
用ELISA法檢測(cè)(用CloneTech公司的試劑盒)的結(jié)果表明，該菌株分泌表達(dá)的目的產(chǎn)物占菌體可溶性蛋白的28％，高于本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)目前所能達(dá)到表達(dá)水平，即表達(dá)產(chǎn)物占菌體可溶性蛋白低于10％(該信息來源？文獻(xiàn)出處？)。
采用離子交換層析、疏水層析和分子篩層析進(jìn)行蛋白純化，采用HPLC和SDS-PAGE電泳進(jìn)行重組蛋白的純度測(cè)定，其純度在95％以上。重組IL-4生物活性檢驗(yàn)(一)促人外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)生長(zhǎng)作用用淋巴細(xì)胞分離液(Sigma產(chǎn)品)分離單核細(xì)胞。用預(yù)溫的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞兩次，每次400×g離心10分鐘，去上清。
在含5％的小牛血清和1％(V/V)PHA的RPMI1640培養(yǎng)基、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。500RPM離心收集細(xì)胞，用含有10％小牛血清的DEME培養(yǎng)基配制成5×104細(xì)胞/ml的懸液。
取96孔板，每孔中加入100微升細(xì)胞懸液，100微升系列稀釋的本實(shí)施例重組IL-4待測(cè)樣品(200ng/ml)，以標(biāo)準(zhǔn)品天然人IL-4(購(gòu)自R&D公司)(200ng/ml)為陽性對(duì)照，以不加IL-4作為陰性對(duì)照，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。每處理3個(gè)重復(fù)孔。
MTT檢測(cè)取經(jīng)過上述處理的樣品0.1毫升，加入1/10體積濃度為5mg/ml的MTT溶液，37℃培養(yǎng)30分鐘后在酶標(biāo)儀上讀取570nm處的吸光度。以三個(gè)重復(fù)孔讀數(shù)的平均數(shù)作為計(jì)算和比較的依據(jù)。結(jié)果表明，本實(shí)施例重組IL-4的活性明顯高于對(duì)照樣品。
表重組IL-4活性測(cè)定結(jié)果IL-4濃度(ng/ml)0.1 0.5 1 2.5 5 1015202550100陽性對(duì)照 0.03 0.07 0.09 0.22 0.51 0.87 1.12 1.27 1.38 1.41 1.41待測(cè)樣品 0.31 0.35 0.51 0.89 1.27 1.53 1.75 1.82 1.88 1.89 1.87還根據(jù)以上數(shù)據(jù)制作的圖2。從中可以看出，本實(shí)施例的重組IL-4促進(jìn)PBMC生長(zhǎng)的活性明顯高于陽性對(duì)照。(一)與受體IL-4Rα的親和力為了檢測(cè)3個(gè)氨基酸取代后對(duì)親和力的影響，用固相雜交法檢測(cè)IL-4受體IL-4Rα與IL-4的親和力(Ldzerda，R.L.，et.al.，Human interleukin 4 receptorconfers biological responsiveness and defines a novel receptor superfamily，J.Exp.Med.171861-873(1990))。簡(jiǎn)要地說，即本實(shí)施例重組IL-4和天然IL-4與固定化受體IL-4Rα的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。
具體地說，用預(yù)先包被了鏈霉親和素的96孔板進(jìn)行，然后用生物素標(biāo)記的bio-IL-4Rα與96孔板上的鏈霉親和素結(jié)合，用含有2％Tween-20的PBS洗滌20次。然后在每個(gè)孔中加入100μl HRP標(biāo)記的天然IL-4(100ng/ml)，4℃下溫育過夜后，用含有2％Tween-20的PBS洗滌20次。加入100μl未經(jīng)標(biāo)記的本實(shí)施例重組IL-4/，4℃溫育過夜后，用含有2％Tween-20的PBS洗滌20次。
MTT檢測(cè)取經(jīng)過上述處理的樣品0.1毫升，加入1/10體積濃度為5mg/ml的MTT溶液，37℃培養(yǎng)30分鐘后在酶標(biāo)儀上讀取570nm處的吸光度。以三個(gè)重復(fù)孔讀數(shù)的平均數(shù)作為計(jì)算和比較的依據(jù)。
結(jié)果經(jīng)上述測(cè)定和計(jì)算，陽性對(duì)照對(duì)IL-4Rα的親和力常數(shù)Kd＝75pM，而本實(shí)施例重組IL-4R的Kd＝0.35pM。改造后其親和力提高了213倍。
序列表<110>上海中信國(guó)健藥業(yè)有限公司<120>重組人白細(xì)胞介素-4，其編碼核酸及其應(yīng)用<130>020766<160>4<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>129<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(38)..(38)<223>Xaa＝Ala，Gly，Ser<220><221>misc_feature<222>(72)..(72)<223>Xaa＝Ser，Thr<220><221>misc_feature<222>(100)..(100)<223>Xaa＝Gly，Ala，Ser<400>1His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser1 5 10 15Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile20 25 30Phe Ala Ala Ser Lys Xaa Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala35 40 45Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg50 55 60Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Xaa Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile65 70 75 80Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu85 90 95Asn Ser Cys Xaa Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe100 105 110Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser115 120 125Ser<210>2<211>387<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<220><221>misc_feature<222>(112)..(114)<223>nnn＝GCT，GCA，GCC，GCG，GGT，GGA，GGC，GGG，TCT，TCC，TCA，TCG<220><221>misc_feature<222>(214)..(216)<223>nnn＝TCT，TCC，TCA，TCG，ACT，ACC，ACA，ACG<220><221>misc_feature<222>(298)..(300)<223>nnn＝GGT，GGA，GGC，GGG，GCT，GCA，GCC，GCG，TCT，TCC，TCA，TCG<400>2cacaaatgcg acatcaccct gcaggaaatc atcaaaaccc tgaactctct gaccgaacag 60aaaaccctgt gcaccgaact gaccgttacc gacatcttcg ctgcttctaa annnaccacc 120gaaaaagaaa ccttctgccg tgctgctacc gttctgcgtc agttctactc tcaccacgaa 180aaagacaccc gttgcctggg tgctaccgct cagnnnttcc accgtcacaa acagctgatc 240cgtttcctga aacgtctgga ccgtaacctg tggggtctgg ctggtctgaa ctcttgcnnn 300gttaaagaag ctaaccagtc taccctggaa aacttcctgg aacgtctgaa aaccatcatg 360cgtgaaaaat actctaaatg ctcttct 387<210>3<211>20<212>PRT<213>大腸桿菌(E.Coli.)<400>3Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr1 5 10 15Val Ala Gln Ala20<210>4<211>60<212>DNA<213>大腸桿菌(E.Coli.)<400>4aaaaagacag ctatcgcgat tgcagtggca ctggctggtt tcgctaccgt agcgcaggcc60
權(quán)利要求
1.一種重組人白細(xì)胞介素-4，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，其中第38位的氨基酸選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸，第72位的氨基酸選自絲氨酸和蘇氨酸，第100位氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人白細(xì)胞介素-4，其中第38位氨基酸是丙氨酸，第72位是絲氨酸，且第100為是甘氨酸。
3.一種重組核酸，它編碼權(quán)利要求1所述的重組人白細(xì)胞介素-4，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，其中第112-114位選自GCT、GCA、GCC、GCG、GGT、GGA、GGC、GGG、TCT、TCC、TCA、TCG，第214-216位選自TCT、TCC、TCA、TCG、ACT、ACC、ACA、ACG，而且第298-300位選自GGT、GGA、GGC、GGG、GCT、GCA、GCC、GCG、TCT、TCC、TCA、TCG。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組核酸，其中，第112-114位是GCT，第214-216位是TCT，而且第298-300位是GGT。
5.一種載體，其中含有權(quán)利要求3或4所述的重組核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，還含有操作性連接于所述重組核苷酸序列5′端的大腸桿菌OmpA信號(hào)肽。
7.一種重組宿主細(xì)胞，其中含有權(quán)利要求3或4所述的重組核酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞是大腸桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求6所述的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種重組人白細(xì)胞介素－4，它具有更高的生物活性。本發(fā)明還提供編碼該重組人白細(xì)胞介素－4的核酸，載體，以及表達(dá)該重組蛋白的宿主細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1443776SQ0211097
公開日2003年9月24日 申請(qǐng)日期2002年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月8日
發(fā)明者胡輝, 李春澍, 李晶, 王皓 申請(qǐng)人:上海中信國(guó)健藥業(yè)有限公司