專利名稱：一種判斷腫瘤細胞對順鉑敏感度的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種判斷腫瘤細胞對順鉑敏感度的方法。
由于rRNA的轉錄活性與細胞增殖的活性，所以，UBF的表達情況直接影響細胞增殖的活性。
順鉑Cis-platin(又簡稱為CDDP)是為無機金屬——鉑的絡合物，在體內能與DNA結合，形成交叉鍵，從而破壞DNA的功能不能再復制，為一細胞周期非特異性藥物。它具有很廣的抗瘤譜，可用于食道癌、肺癌、鼻咽癌、膀胱癌、宮頸癌、前列腺癌、惡性淋巴瘤、軟組織肉瘤、頭頸部腫瘤及睪丸腫瘤等。但由于癌癥患者的個體差異，許多癌癥患者對于順鉑有一定的耐藥性，因此，盲目使用順鉑，會對病人機體產生損害。
本發(fā)明公開的判斷順鉑對腫瘤細胞敏感度的方法是通過檢測患者腫瘤細胞中UBF含量和IC50值來判斷腫瘤細胞對順鉑的敏感程度的。
本發(fā)明測定UBF含量的方法為提取細胞的總蛋白至少100μg，按照常規(guī)方法進行Western實驗。
本發(fā)明所述的IC50(50％inhibition concentration)是指抑制細胞增殖50％的藥物濃度，其測定方法為以無菌PBS為溶劑將藥物濃度配制到0.2-10mM，加入細胞上清液中，24小時后，洗去上清，細胞在無藥物的環(huán)境中再生長24小時，用常規(guī)MTT法進行測定藥物順鉑對此細胞的半有效抑制濃度。本發(fā)明所述的順鉑IC50指藥物為順鉑時的IC50。
本發(fā)明人經一系列試驗證實UBF與腫瘤細胞生長和增殖有密切關聯(lián)，而順鉑與細胞DNA結合的產物可通過抑制細胞內UBF的表達來抑制腫瘤細胞的生長，因此通過對用藥前后UBF含量的測定可反映腫瘤細胞對順鉑的敏感程度，即順鉑治療腫瘤的有效性。
本發(fā)明經下述實驗證明，順鉑是通過抑制細胞內UBF的表達來抑制腫瘤細胞的生長1、考察UBF含量有明顯差異的腫瘤細胞對順鉑敏感程度的不同選取幾種高度表達UBF的腫瘤細胞和不表達(或低度表達)UBF的細胞進行比較，測試各自的順鉑IC50值。結果顯示，高度表達UBF的腫瘤細胞的順鉑IC50值遠遠低于不表達(或低度表達)UBF的細胞的順鉑IC50值。
2、考察增加細胞內的UBF表達導致細胞對順鉑敏感程度的變化選取幾乎不表達UBF的細胞，將UBF基因轉染進此細胞內，分別測定經此處理的細胞與未經此處理的細胞的順鉑IC50值。結果顯示，轉染過UBF基因的細胞的順鉑IC50值明顯小于未經此處理的細胞的順鉑IC50值。
3、考察抑制細胞內的UBF表達導致細胞對順鉑敏感程度的變化選取經過UBF反義核苷酸處理和未經過UBF反義核苷酸處理的同一種細胞(此細胞可表達UBF)，測試各自的順鉑IC50值。結果顯示，經過UBF反義核苷酸處理的細胞的順鉑IC50值大大高于未經過UBF反義核苷酸處理的細胞的順鉑IC50值。
上述的“UBF反義核苷酸”是與體內UBF基因互補的一小段核苷酸序列，通常含有20個左右的核苷酸，由于序列的互補性，它可以與UBF基因特異結合，阻斷UBF基因的功能。主要是影響UBF基因的轉錄和/或翻譯，抑制該基因編碼的蛋白質的表達。
本發(fā)明通過檢測患者腫瘤細胞中UBF含量的不同可提示腫瘤細胞對順鉑的敏感程度，當細胞的順鉑IC50值較小時，說明順鉑對該腫瘤細胞具有較強的抑制作用，提示臨床使用順鉑來治療腫瘤效果較好。反之，當細胞的順鉑IC50值較大時，說明順鉑對該腫瘤細胞抑制作用較弱，應尋找其他更有效的藥物，避免盲目用藥。
本發(fā)明判斷腫瘤細胞對順鉑敏感度的方法，也可用于其他作用于UBF的抗腫瘤藥物的篩選，指導臨床針對不同的腫瘤選擇療效最好，特異性最強的抗腫瘤藥物。
細胞培養(yǎng)至少兩天后，分別提取兩種細胞的總蛋白，取100μg蛋白，使用抗UBF的單克隆抗體按常規(guī)方法進行WESTERN實驗。以ACTIN作為對照。實驗結果如

圖1。
實驗結果以ACTIN為參照進行數據分析，可知，在兩個細胞ACTIN含量相同的情況下，肝癌細胞BEL-7404中UBF蛋白含量為胃癌細胞MKN45的3.52倍。實施例2、考察UBF含量有明顯差異的腫瘤細胞對順鉑敏感程度的不同肝癌細胞株BEL-7404、肺成纖維細胞株HLF由中科院上海細胞庫提供。
用同樣的細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)上述兩種細胞，并測定其順鉑IC50值。結果如圖2實驗結果表明，UBF表達越高的細胞對順鉑的IC50值越低，即UBF表達越高的細胞對順鉑的敏感程度越高，換而言之，用順鉑治療UBF表達越高的腫瘤細胞，效果越好。實施例3、增加細胞UBF表達量導致細胞對順鉑敏感程度的變化肺成纖維細胞株HLF由中科院上海細胞庫提供；載體由Invitrogen公司提供。
制備UBF的PCR產物，用限制性內切酶NotI and Hsp92II對其消化，并克隆到pGEM-5Z(+)載體中(PCR和克隆的方法見《分子克隆實驗指南(第三版)》)。
選取幾乎不表達UBF的肺成纖維細胞株HLF，用含有UBF基因片段的載體分別轉染到兩瓶相同的HLF細胞(P1、P2)。同時將未插入UBF基因片段的空pGEM-5Z(+)載體轉染至其HLF細胞作為對照(N1)。(轉染的方法見《分子克隆實驗指南(第三版)》)對上述三瓶細胞同時施以順鉑的作用，測定其順鉑IC50值。結果如圖3。
由于HLF細胞幾乎不表達UBF蛋白，所以經過UBF質粒轉染后的HLF細胞(P1、P2)其UBF的表達增加，而轉染空質粒的HLF細胞(N1)幾乎不表達UBF。對上述細胞施以順鉑后發(fā)現(xiàn)，表達UBF的細胞，其IC50明顯低于不表達UBF的細胞，也就是說增加細胞中UBF的表達，可增加細胞對順鉑的敏感程度。實施例4、抑制細胞UBF表達量導致細胞對順鉑敏感程度的變化肝癌細胞株SMMC-7721由中科院上海細胞庫提供；各個基因片段由上海Sangon公司合成。
選取UBF高表達的肝癌細胞SMMC-7721，設計UBF的反義核苷酸AS，對該細胞進行處理，同時隨機設計三段基因片段SE，SH，MI作為對照，(四個序列見表1)也對SMMC-7721細胞進行處理，C表示陰性對照，即對SMMC-7721細胞不進行任何處理。處理方式各個核苷酸序列(AS、SH、SE、MI)標記熒光素，并溶解在1M PBS中，制備出0.5-5μM的濃度。將各溶液分別加入SMMC-7721細胞的上清液中。
表1
其中，AS是UBF基因的反向互補序列；SH與AS的各堿基數目一致，但堿基排布不同；SE是AS的反向互補序列；MI與AS相比，出現(xiàn)幾個堿基的隨機錯配。
對上述細胞同時施以順鉑，測定其順鉑IC50值。結果如圖4。SMMC-7721本來為UBF高表達的肝癌細胞，用AS處理后就大大抑制了其UBF的表達。其他用SE、SH、MI處理的SMMC-7721，其UBF的表達幾乎未得到抑制。對上述細胞施以順鉑后發(fā)現(xiàn)，UBF表達量明顯降低的細胞，其IC50值有明顯增加，是其它細胞的2-4倍。也就是說降低細胞中UBF的表達，可降低細胞對順鉑的敏感程度。
權利要求
1.一種判斷腫瘤細胞對順鉑敏感度的方法，其特征在于該方法是通過檢測患者腫瘤細胞中UBF含量和用順鉑后的細胞IC50值來判斷腫瘤細胞對順鉑的敏感程度。
2.一種如權利要求1所述的判斷腫瘤細胞對順鉑敏感度的方法，其特征在于該方法是依據順鉑與細胞DNA結合的產物通過抑制細胞內UBF的表達來抑制腫瘤細胞的生長的原理。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種判斷腫瘤細胞對順鉑敏感度的方法。方法是通過檢測患者腫瘤細胞中的UBF含量和用順鉑后的細胞IC
文檔編號C12Q1/02GK1443853SQ02110990
公開日2003年9月24日 申請日期2002年3月8日 優(yōu)先權日2002年3月8日
發(fā)明者胡賡熙 申請人:胡賡熙