專利名稱：一種肝癌靶向雙重組凋亡蛋白表達(dá)序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)，涉及基因表達(dá)調(diào)控，具體地說(shuō)，涉及一種特異性針對(duì)甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌的重組凋亡促進(jìn)蛋白表達(dá)的DNA的設(shè)計(jì)、制備及其在甲胎蛋白陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞內(nèi) 特異表達(dá)、其產(chǎn)物可以有效地誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。本發(fā)明可用于制備靶向性腫瘤基因治療 藥物。
背景技術(shù)：
復(fù)制缺陷型腺病毒是腺病毒載體中最經(jīng)典的一種形式，它是一類不能在細(xì)胞內(nèi)增 殖的腺病毒，僅起到運(yùn)輸載體的作用，能攜帶外源基因靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)外源基因的 表達(dá)產(chǎn)物影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而起到基因治療的作用。根據(jù)復(fù)制缺陷型腺病毒的作用機(jī)理， 要想提高它的治療效果，就必須著重在三個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)一是提高腺病毒攜帶外源基因 的能力，二是利用合適的構(gòu)建策略使病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向性，三是選擇合適的抗癌基 因。為了提高腺病毒載體攜帶外源基因的能力，經(jīng)過(guò)數(shù)十年的努力，到目前為止，已發(fā) 展出了不同類型的腺病毒載體，根據(jù)病毒基因置換程度可分為第一代、第二代和第三代腺 病毒載體。所謂第一代腺病毒載體即復(fù)制缺陷型腺病毒，是將外源基因替代病毒復(fù)制所必 需的El基因區(qū)域，可去除或不去除E3基因區(qū)域。這種腺病毒最多可容納約8. 2kb的外源 基因，可同時(shí)感染靜止期和增殖期的細(xì)胞，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用并成功構(gòu)建出了一系列載體。第二 代腺病毒載體是在第一代的基礎(chǔ)上又去除了 E2基因區(qū)域，可去除或不去除E4區(qū)域。這類 腺病毒由于E2病毒基因的缺失或突變，減弱了病毒蛋白的表達(dá)，并且加入了可以調(diào)控基因 表達(dá)的因子，消除了復(fù)制DNA和產(chǎn)生可復(fù)制腺病毒的可能性。另外，E4基因編碼的產(chǎn)物參 與了病毒復(fù)制的多個(gè)環(huán)節(jié)，它的去除可影響病毒的復(fù)制從而不激發(fā)免疫反應(yīng)。但是，這些改 進(jìn)方式的效果如何，目前仍有爭(zhēng)議。為了獲得更適合于基因治療的腺病毒載體，第三代腺病 毒載體應(yīng)運(yùn)而生。第三代腺病毒又稱輔助病毒載體，它去除了所有的編碼病毒基因，只保留 兩端的ITRs和包裝信號(hào)，在產(chǎn)生有效病毒顆粒過(guò)程中需要輔助病毒和合適的互補(bǔ)包裝細(xì) 胞。它不僅繼承了前述腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn)，還具有其獨(dú)特性的優(yōu)點(diǎn)，如外源DNA的裝載容量 大大提高，可達(dá)37kb ；缺失全部的腺病毒蛋白編碼序列，感染之后不會(huì)有病毒蛋白表達(dá)，安 全性得到提高；外源基因的表達(dá)時(shí)相明顯延長(zhǎng)；血清型是由輔助病毒決定的，采用不同血 清型的輔助病毒，可以實(shí)現(xiàn)載體血清型轉(zhuǎn)換，因此可以實(shí)現(xiàn)反復(fù)應(yīng)用，而無(wú)需擔(dān)心機(jī)體所產(chǎn) 生的抗腺病毒中和抗體的影響。雖然第三代腺病毒優(yōu)點(diǎn)明顯，其生產(chǎn)過(guò)程卻是困擾其應(yīng)用 發(fā)展的一大因素，生產(chǎn)技術(shù)方面仍存在難題，目前還只停留在研究階段。如何對(duì)腺病毒載體進(jìn)行改造使其對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向性？目前的策略主要包括 靶向性導(dǎo)入和靶向性轉(zhuǎn)錄兩個(gè)方面。通過(guò)改造病毒衣殼蛋白或利用雙功能連接物增加腺 病毒感染腫瘤細(xì)胞的能力，使病毒靶向?qū)氲郊?xì)胞內(nèi)；也可以利用組織或腫瘤特異性基因 的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子等調(diào)控序列(hTERT、C0X2、PSA等包括組織特異性啟動(dòng)子(AFP啟動(dòng)子用 于肝癌、PSA啟動(dòng)子用于前列腺癌、CEA啟動(dòng)子用于腸癌和廣譜的腫瘤特異性啟動(dòng)子hTERT啟動(dòng)子)，均取得了一定效果。為增強(qiáng)腺病毒殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，必須將外源的抗癌基 因?qū)氲侥[瘤細(xì)胞內(nèi)。常用的抗癌基因包括腫瘤抑制基因(P53，Rb，LFIRE，LPTL，Cyld, PTEN, MnSOD等)、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因(TRAIL，Smac, IL-24, Caspase_3等)、免疫調(diào)節(jié)因子 (GM-CSF, IL-2, IL-12, CD40L, MIP_3a 等)、血管生成抑制因子(K5, PEDF，SFLKl, sFlt-1， VEGF，內(nèi)皮抑素等)和自殺基因(tk，cd等)。這些外源基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠通過(guò)各種途徑 影響腫瘤細(xì)胞正常的新陳代謝，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
在本專利中，改造后的甲胎蛋白(a-fetoprotein，AFP)啟動(dòng)子被引入到腺病毒載 體中。在非病理狀態(tài)下，AFP在正常組織中是不表達(dá)的，只在胎兒肝中特異性激活，而在肝癌 細(xì)胞和組織中，AFP往往被活化而呈高表達(dá)的狀態(tài)，臨床上人血清中AFP水平已經(jīng)用來(lái)指導(dǎo) 肝癌的早期診斷、判斷療效和預(yù)后。因此，AFP啟動(dòng)子作為一種腫瘤選擇性啟動(dòng)子，是比較適 合用來(lái)調(diào)控外源基因在肝癌細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)的。鑒于AFP在不同細(xì)胞和組織內(nèi)的表達(dá)水 平的差異，有研究者仔細(xì)分析了 AFP增強(qiáng)子的序列，通過(guò)比較AFP基因上游不同長(zhǎng)度的序列 調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)存在于-4. Ikb至-3. 3kb 一段長(zhǎng)約821bp的序列對(duì)下游基 因的轉(zhuǎn)錄有較強(qiáng)的增強(qiáng)作用，再進(jìn)一步分析這段序列的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它包含domain A(-4120 至-3756)、domain B (-3492至-3300)和間隔部分(-3755至-3493)三個(gè)部分，通過(guò)比較 domain A(365bp)、domainB(192bp)、間隔部分(263bp)及全長(zhǎng)(821bp)四種序列對(duì)下游基 因表達(dá)的增強(qiáng)效率，發(fā)現(xiàn)同時(shí)包含domain A、domain B和間隔部分這種全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)效 率是最高的。因此，本專利采用了這段長(zhǎng)821bp的序列作為AFP增強(qiáng)子，同時(shí)與AFP啟動(dòng)子 連接，構(gòu)成了 AFP增強(qiáng)子/啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，用來(lái)調(diào)控腺病毒載體中外源基因的表達(dá)。 同時(shí)，本專利引入了熱門(mén)的具有較強(qiáng)促凋亡作用的雙重凋亡蛋白Caspase-3和Granzyme B 作為載入基因克隆入腺病毒載體的AFP啟動(dòng)子后?，F(xiàn)在一般認(rèn)為caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò) 程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分。caspase-3在細(xì)胞凋亡 中起著不可替代的作用，caspase-3基因轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)Sf9細(xì)胞后引起細(xì)胞凋亡，這個(gè)過(guò)程可以 被BCL-2阻斷；在發(fā)生凋亡的細(xì)胞提取液中去除caspase-3后，這些提取液就失去了誘導(dǎo)細(xì) 胞凋亡的能力；再加入純化的caspase-3它就又恢復(fù)了致凋亡的功能。顆粒酶是外源性的 絲氨酸蛋白酶，來(lái)自細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞(CTLs)和自然殺傷細(xì)胞(NK)釋放的細(xì)胞漿顆粒。這 些顆粒含有顆粒酶原及其它蛋白酶原，包括穿孔蛋白。由于CTL細(xì)胞與靶細(xì)胞結(jié)合(經(jīng)靶 細(xì)胞表面的CTL受體和MHC分子的抗原結(jié)合)，顆粒的內(nèi)容物釋放，顆粒酶進(jìn)入了靶細(xì)胞，穿 孔蛋白進(jìn)入了靶細(xì)胞通過(guò)在細(xì)胞膜的聚合形成了靶細(xì)胞膜的小孔，使細(xì)胞膜穿孔，最后穿 孔蛋白使顆粒酶的膜穿孔引起顆粒酶的釋放。在細(xì)胞漿內(nèi)，顆粒酶B能通過(guò)三種不同的途 徑激起細(xì)胞的死亡，首先激起caspases的鏈鎖反應(yīng)，引起靶細(xì)胞DNA降解活動(dòng)，然后裂解。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肝癌靶向雙重組凋亡蛋白表達(dá)序列，是一種人工核酸分 子，是一種特異性AFP啟動(dòng)子調(diào)控Caspase 3和Granzyme B兩個(gè)凋亡蛋白表達(dá)的DNA序 列，具有SEQ ID No:l所示的核苷酸序列，其中第7位至第827位為人AFP基因轉(zhuǎn)錄起始 點(diǎn)上游第-4113位至第-3292位，該區(qū)域含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子和肝細(xì)胞核因子結(jié)合位點(diǎn)； 第831位至第1012位為人AFP基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游第-182位至第-1位，該區(qū)域含有AFP 的基本啟動(dòng)子功能；從第1位至第1012位的1012bp片段組成重組的AFP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列；第1019位至第2175位為重組人Caspase 3，第2176至3125位為重組人Granzyme B ；第3126位至第3474位為牛生長(zhǎng)激素基因多聚腺苷酸信號(hào)區(qū)，為基因表達(dá)提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該DNA序列在制備治療AFP陽(yáng)性的肝癌的靶向基因藥 物中的應(yīng)用。該DNA序列在導(dǎo)入AFP陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞后，可以在細(xì)胞中表達(dá)重組的促進(jìn)細(xì) 胞凋亡的Caspase 3和Granzyme B，有效地誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。所述DNA序列可用于構(gòu)建 靶向性基因治療藥物的載體，該DNA序列中的重組AFP表達(dá)調(diào)控元件可用于調(diào)控其它基因 的表達(dá)、重組的Caspase 3和Granzyme B序列可以用于其它表達(dá)載體達(dá)到誘導(dǎo)相應(yīng)細(xì)胞凋 亡目的。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)及效果利用本發(fā)明提供的表達(dá)元件可以制備的基因治療藥物，其特點(diǎn)在于以肝癌細(xì)胞特 異性表達(dá)的胚胎性抗原AFP為腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)調(diào)控手段、以重組的活化型細(xì)胞凋亡相 關(guān)蛋白Caspase 3和Granzyme B兩個(gè)蛋白為目的基因，有效地誘導(dǎo)AFP陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞的凋亡。本申請(qǐng)中，利用AFP增強(qiáng)子/啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的靶向調(diào)控作用，使外源基因 只在AFP陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)靶向而高效的抗腫瘤效果；構(gòu)建了重組活化型 Caspase-3分子，并將它應(yīng)用于對(duì)靶細(xì)胞的促凋亡作用；引入了顆粒酶B，將顆粒酶B與重組 活化型Caspase-3融合，介導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡。


圖1為載體構(gòu)建示意圖。圖2為病毒體外細(xì)胞殺傷試驗(yàn)。圖3為Ad5_reCASP3GB的體內(nèi)抗瘤活性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明 目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1 人甲胎蛋白增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的克隆及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的構(gòu)建自新鮮的正常人血中抽提基因組DNA，利用特征性引物應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng) (Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù)擴(kuò)增人甲胎蛋白增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，從而構(gòu)建包含 了 AFP增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。AFP增強(qiáng)子的上下游引物序列分別為Seq No. 2 5' -AGA TCT CAG ATT GAA TTA TTT GCC TGT CA-3'Seq No. 3 5' -GGA TCC TAG GAA GTT TTC GCA ATA ATA C-3'AFP啟動(dòng)子的上下游引物序列分別為Seq No. 4 5' -GGA TCC AAA TCA TGC TGA AAT TCT TTT ATA CTC-3'Seq No. 5 5' -AGA TCT GCC CCA AAG AGC TCT GTG T_3，。以Seq No. 2和Seq No. 3為引物從基因組中擴(kuò)增AFP增強(qiáng)子，PCR擴(kuò)增條件是預(yù) 變性 95°C 5min，接著(95°C 30s，52°C 30s，72°C 30s)擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin,回收821bp片斷，此即為AFP增強(qiáng)子片斷；以SeqNo. 4和Seq No. 5為引物從基因組中擴(kuò)增 AFP啟動(dòng)子，PCR擴(kuò)增條件是預(yù)變性95°C 5min，接著(95°C 30s，52°C 30s，72°C 30s)擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，回收180bp片斷，此即為AFP啟動(dòng)子片斷；最后，以Seq No. 2 和Seq No. 5為引物，以上述擴(kuò)增片斷為模板，擴(kuò)增包含了 AFP增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 元件。其序列結(jié)果見(jiàn)附件序列.經(jīng)與Genbank標(biāo)準(zhǔn)序列NT_006216. 14比對(duì)，結(jié)果表明該轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件序列正確。實(shí)施例2 重組活化Caspase-3基因的構(gòu)建、Granzyme B基因的克隆及腺病毒穿梭 質(zhì)粒的構(gòu)建(引物序列詳見(jiàn)附件)以 Pl(Seq No. 6)和 P2 (Seq No. 7)以及 PI (Seq No. 6)和 P7 (Seq No. 12)為引物， 從pCDNA4/HisMax A vector中擴(kuò)增SP163序列，此序列可增強(qiáng)所調(diào)控基因的蛋白表達(dá)水 平；以P3(SEQ NO. 8)和P4(SEQ NO. 9)為引物，從人基因組DNA中擴(kuò)增Caspase-3小亞基單 位；以P5(SEQ NO. 10)和P6(SEQ NO. 11)為引物，從人基因組DNA中擴(kuò)增Caspase-3大亞基 單位；以P8 (SEQ N0. 13)和P9 (SEQ N0. 14)為引物，從人基因組DNA中擴(kuò)增Granzyme B基 因序列。通過(guò)連接反應(yīng)，將所擴(kuò)增的基因片斷與AFP轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及Poly A尾連接，構(gòu)建 成完成的表達(dá)框。構(gòu)建過(guò)程示意參見(jiàn)圖1，通過(guò)酶切連接反應(yīng)，將上述的三種表達(dá)框分別插 入到腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC312中，從而成功構(gòu)建了由AFP增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)控，且分別含有 人重組活化Caspase-3基因序列和Granzyme B基因序列、人重組活化Caspase-3基因序列 或Granzyme B基因序列的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒載體。利用AdMax System腺病毒包裝試 劑盒，將腺病毒穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒同源重組，從而成功獲得三種復(fù)制缺陷型腺病毒，分別 命名為 Ad5-reCASP3GB、Ad5-reCASP3 和 Ad5_GB。Pl(SeqNo.6)::5，-AGA TCT GGC TAA CTA GAG AAC CCA-3，
P2(SeqNo.7)5，--CCA CTG TCT GTC TCA ATC ATG GTT TCGGAGGCCGTCCGG--3，
P3 (SEQNO.8)::5，-CCG GAC GGC CTC CGAAAC CAT GAT TGAGACAGACAGTGG--3，
P4 (SEQNO.9)5，--GGA TCC CCC ATC AAC TTC ATC GTG ATAAAAATAGAGTTC--3，
P5 (SEQNO.10)5’ -AGATCT CCC ATG GAG AAC ACT GAAAACTCAG-3/
P6 (SEQNO.11)5’ -GGA TCC GTC ATC ATC AAC ACC TCA GTC T--3'
P7(SeqNo.12)5’ -GCC TCA TGT CCC CCG ATG ATC ATG GTT TCG GAG GCC GTC
CGG-3，P8 (SEQ NO. 13) :5，—CCG GAC GGC CTC CGA AAC CAT GAT CAT CGG GGG ACA TGA GGC-3，P9 (SEQ NO. 14) :5，-GGA TCC TTA GTA GCG TTT CAT GGT TT_3'實(shí)施例3腺病毒Ad5-reCASP3GB、Ad5_reCASP3和Ad5_GB對(duì)肝癌細(xì)胞和非肝癌細(xì) 胞的殺傷效果取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞H印3B、H印G2、SMMC7721和非肝癌細(xì)胞Bcap37，按 2X103細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)使其貼壁。用培養(yǎng)基稀釋腺病毒至 適當(dāng)濃度，將 Ad5-reCASP3GB、Ad5_reCASP3 和 Ad5_GB 和 Ad5_GFP 以 M0I 為 200pfu/cell、 100pfu/cell、50pfu/cell、10pfu/cell、lpfu/cell 和 Opfu/cell 感染細(xì)胞。在病毒感染 4天后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4hr，中止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)上清 液，每孔加入DMS0 200ul，振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。選擇570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔0D值。計(jì)算存活率細(xì)胞存活率=(病毒作用組0D值/病毒未作用 組0D值)X100%。本試驗(yàn)每組設(shè)立5復(fù)孔，重復(fù)3遍。其結(jié)果參見(jiàn)圖2。其中，圖2A為 Ad5-reCASP3GB、Ad5-reCASP3Ad5-GB 和 Ad5_GFP 作用于 Hep3B ；圖 2B 為 Ad5_reCASP3GB、 Ad5-reCASP3Ad5-GB 和 Ad5_GFP 作用于 H印G2 ；圖 2C 為 Ad5-reCASP3GB、Ad5-reCASP3Ad5_GB 和 Ad5-GFP 作用于 SMMC7721 ；圖 2D 為 Ad5_reCASP3GB、Ad5-reCASP3Ad5_GB 和 Ad5_GFP 作 用于 Bcap37。由圖2可知，復(fù)制缺陷型腺病毒Ad5-reCASP3GB、Ad5-reCASP3、Ad5-GB對(duì)多種AFP 陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞0fep3B、IfepG2、SMMC7721)均有強(qiáng)大的殺傷效果，在M0I為lOpfu/cell時(shí) 就能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但對(duì)AFP陰性的乳腺癌細(xì)胞(Bcap37)卻無(wú)殺傷效果，在 M0I為200pfu/cell時(shí)，細(xì)胞存活率仍在90%以上；Ad5_GFP不論對(duì)AFP陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞和 AFP陰性的乳腺癌細(xì)胞均無(wú)殺傷效果。實(shí)施例4 復(fù)制缺陷型腺病毒Ad5_reCASP3GB的體內(nèi)抗瘤活性收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞株Ifep3B細(xì)胞在BALB/c-nu裸鼠(六周齡，雄性)右 背部皮下植瘤(濃度為2.5\107/!111，200111/只)。取瘤體直徑長(zhǎng)至4 5mm的成瘤裸鼠 24只隨機(jī)分為三組Ad5-reCASP3GB治療組(8只)、Ad5_GFP治療組(8只)和PBS對(duì)照組 (8只)。以瘤內(nèi)注射的方式對(duì)各組分別進(jìn)行處理，在首次病毒注射前記錄瘤體初始大小，以 首次治療時(shí)間記為第1天，分別在第1天、第4天、第7天注射2X 108pfu/100ul/只的病毒 量，PBS對(duì)照組在相同時(shí)間點(diǎn)注射lOOul/只的PBS。在首次病毒注射后，每3天或4天測(cè)量 瘤體大小一次，共8次。瘤體體積計(jì)算公式V = (aXb2)/2, a 瘤體長(zhǎng)徑(mm)b 瘤體短徑 (mm)。其結(jié)果見(jiàn)圖3所示。由上圖可見(jiàn)，復(fù)制缺陷型腺病毒Ad5_reCASP3GB在裸鼠體內(nèi)有很好的抗瘤活性， 與對(duì)照組(PBS組)和Ad5-GFP治療組相比，Ad5-miRNA5G治療組的瘤體生長(zhǎng)被得到了顯著 地抑制(P < 0. 01)。本發(fā)明涉及的序列
<160>14
<210>1
<211>3474
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 一種肝癌靶向雙重組凋亡蛋白表達(dá)序列及應(yīng)用
<400>1
agatctcagattgaattatttgcctgtcatacagctaataattgaccataagacaattag60
gttttgaatctttctaataccaaagttcagtttactgttccatgttgctt120
ctgagtggcttcacagacttatgaaaaagtaaacggaatcagaattacatcaatgcaaaa180
gcattgctgtgaactctgtacttaggactaaactttgagcaataacacatatagattgag240
gattgtttgctgttagtatacaaactctggttcaaagctcctctttattgcttgtcttgg300
aaaatttgctgttcttcatggtttctcttttcactgctatctatttttctcaaccactca360
catggctacaataactgtctgcaagcttatgattcccaaatatctatctctagcctcaat420
tacctagcaa
0098]agacggcccc
0099]aagatcgaaa
0100]tgggggaccc
0101]gtaacaaggt
0102]cctgcaccaa
0103]gatccggatc
0104]gctcgagtct
0105]ccagccatct
0106]cactgtcctt
0107]tattctgggg
0108]gcatgctggg
0109]<210>2
0110]<211>29
0111]<212>DNA
0112]<213>人工序列
0113]<220>
0114]<223>擴(kuò)增AFP增強(qiáng)子DNA序列的上游引物
0115]<400>2
0116]AGATCTCAGA TTGAATTATT TGCCTGTCA
0117]<210>3
0118]<211>28
0119]<212>DNA
0120]<213>人工序列
0121]<220>
0122]<223>擴(kuò)增AFP增強(qiáng)子DNA序列的下游引物
0123]<400>3
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0125]<210>4
0126]<211>33
0127]<212>DNA
0128]<213>人工序列
0129]<220>
0130]<223>擴(kuò)增AFP啟動(dòng)子DNA序列的上游引物
0131]<400>4
0132]GGATCCAAAT CATGCTGAAA TTCTTTTATA CTC
0133]<210>5
0134]<211>25
0135]<212>DNA
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28
33
<213>人工序列<220><223>擴(kuò)增AFP啟動(dòng)子DNA序列的下游引物<400>5AGATCTGCCC CAAAGAGCTC TGTGT25<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>擴(kuò)增SP163序列的上游引物P1<400>6AGATCTGGCT AACTAGAGAA CCCA24<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>擴(kuò)增SP163序列的下游引物P2<400>7CCACTGTCTG TCTCAATCAT GGTTTCGGAG GCCGTCCGG39<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>擴(kuò)增Caspase-3小亞基單位DNA序列的上游引物P3<400>8CCGGACGGCC TCCGAAACCA TGATTGAGAC AGACAGTGG39<210>9<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>擴(kuò)增Caspase-3小亞基單位DNA序列的下游引物P4<400>9GGATCCCCCA TCAACTTCAT CGTGATAAAA ATAGAGTTC39<210>10<211>31
<212>DNA<213>人工序列<220><223>擴(kuò)增Caspase-3大亞基單位DNA序列的上游引物P5<400>10AGATCTCCCA TGGAGAACAC TGAAAACTCAG31<210>11
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>擴(kuò)增Caspase-3大亞基單位DNA序列的下游引物P6<400>11GGATCCGTCA TCATCAACAC CTCAGTCT28<210>12<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>擴(kuò)增SP163序列的下游引物P7<400>12GCCTCATGTC CCCCGATGAT CATGGTTTCG GAGGCCGTCC GG42<210>13<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>擴(kuò)增Granzyme B基因DNA序列的上游引物P8<400>13CCGGACGGCC TCCGAAACCA TGATCATCGG GGGACATGAG GC42<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>擴(kuò)增Granzyme B基因DNA序列的下游引物P9<400>14GGATCCTTAG TAGCGTTTTCA TGGTTT2權(quán)利要求
一種肝癌靶向雙重組凋亡蛋白表達(dá)序列，是一種特異性AFP啟動(dòng)子調(diào)控Caspase 3和Granzyme B兩個(gè)凋亡蛋白表達(dá)的DNA序列，具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列，其中第7位至第827位為人AFP基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游第-4113位至第-3292位，第831位至第1012位為人AFP基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游第-182位至第-1位，從第1位至第1012位的1012bp片段組成重組的AFP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)調(diào)控序列，第1019位至第2175位為重組人Caspase 3，第2176至3125位為重組人Granzyme B，第3126位至第3474位為牛生長(zhǎng)激素基因多聚腺苷酸信號(hào)區(qū)，為基因表達(dá)提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
2.權(quán)利要求1所述的一種肝癌靶向雙重組凋亡蛋白表達(dá)序列在制備治療AFP陽(yáng)性的肝 癌的靶向基因藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種肝癌靶向雙重組凋亡蛋白表達(dá)序列，是一種特異性AFP啟動(dòng)子調(diào)控Caspase 3和Granzyme B兩個(gè)凋亡蛋白表達(dá)的DNA序列，具有SEQID No1所示的核苷酸序列。本發(fā)明利用AFP增強(qiáng)子/啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的靶向調(diào)控作用，使外源基因只在AFP陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)靶向而高效的抗腫瘤效果；構(gòu)建了重組活化型Caspase-3分子，并將它應(yīng)用于對(duì)靶細(xì)胞的促凋亡作用；引入了顆粒酶B，將顆粒酶B與重組活化型Caspase-3融合，介導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡?？稍谥苽渲委烝FP陽(yáng)性的肝癌的靶向基因藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101812448SQ20101003979
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日
發(fā)明者曹江, 毛晨宇, 滕理送, 王浩浩, 陳喆, 陳萍 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)