專利名稱：一種基于dna適配器的基因多態(tài)性測定法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于一種基因多態(tài)性測定方法，具體說是一種利用酶切技術、酶聯(lián)技術和等位基因擴增技術測定基因多態(tài)性的方法，可用于檢測基因組DNA的多態(tài)性和基因突變等。
為了解決這一問題，有多種方法，其中常用的方法是先用PCR法預擴增長鏈DNA，然后將之作為模板再擴增成小的片段[1]。然而這種方法不是一個通用方法，不適用于同時擴增復雜基因組中的不同部分。另一種方法[2]是通過兩輪PCR擴增來實現(xiàn)，第一輪是用低濃度的基因特異性引物來擴增，各引物的5′端含有相同的錨定部分，第二輪是采用高濃度的通用型短引物來擴增，該引物與上述基因特異性引物的錨定部分序列相同。然而不管怎樣，這種用常規(guī)PCR方法進行多重擴增的片段數(shù)仍然在10左右，并且需要精心設計引物，不能用于常規(guī)檢測。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提出一種用n+1個引物進行n-重PCR擴增反應的方法，使得n-重PCR擴增的通量及準確性得到進一步提高。
本發(fā)明的技術解決方案一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測定法，其特征在于(a)采用限制性內切酶將長的DNA鏈切割成含有酶切切口的短的DNA片段；(b)在連接酶的存在下用雙鏈部分互補的DNA適配器與(a)中短的DNA片段連接；(c)用一個通用引物和一個等位基因特異性引物對(b)中經與DNA適配器連接的DNA片段進行PCR擴增；(d)采用適當?shù)姆椒z測(c)中經PCR擴增的DNA片段。
上述的長的DNA鏈，其中DNA鏈是指基因組DNA或mRNA反轉錄后的雙鏈cDNA。
所述的DNA適配器中，其由兩條DNA單鏈組成，其中一端互補，另一端不互補，是一分叉型結構；其雙鏈互補的一端含有與權利要求項1(a)中所述的限制性內切酶位點一致的序列；其雙鏈不互補一端中的5′端鏈含有8個堿基以上的不互補序列。
所述的通用引物，其序列與DNA適配器的不互補端中5′端鏈的序列相同。
所述的等位基因特異性引物，其3′端正好位于單堿基多態(tài)性位點或突變點。
所述的適當方法，包括電泳分離方法和色譜分離方法等，電泳分離方法包括毛細管電泳，芯片電泳，凝膠電泳等。
所述的基因多態(tài)性檢測方法，每個基因多態(tài)性位點的檢測由兩次PCR擴增完成，兩次擴增所用引物對中的等位基因特異性引物的3′端分別用于確定等位基因的兩種類型?；蛘撸總€基因多態(tài)性位點的檢測可在單管中由一次PCR擴增完成；擴增所用引物為三個，其中兩個引物為等位基因特異性引物，其5′端分別標記有發(fā)射波長不同的熒光染料，另一個為通用引物；兩個等位基因特異性引物分別用于確定等位基因的兩種類型?；蛘?，用n個不同的等位基因特異性引物和1個通用引物進行多重PCR擴增。
本發(fā)明的主要特點是可以同時進行多個等位基因位點的分析。由于擴增中采用了一個共用引物P1，當進行n重等位基因擴增時，在單管中僅需加入n+1個引物，因此可以大大減少多重PCR擴增反應中多個引物的相互作用，使擴增效率顯著提高，也可以減少優(yōu)化多重PCR擴增反應條件的時間。
圖2是用本發(fā)明的方法檢測基因多態(tài)性位點CYP2D6*10的凝膠電泳圖譜。
如

圖1所示，假設某段基因組DNA 1上有兩個待測等位基因位點2和3，利用限制性內切酶，如Mbo I(切點序列為“GATC”)，將1切成末端含有酶切位點的DNA短片段，如分別含有2和3的DNA片段4和5。在酶解產物中，加入一個由兩條鏈組成的DNA適配器6，6的一端為含有酶切切口的粘性端，另一端為分叉型結構，其中5′端的不互補部分鏈較長，約含有10-30個堿基，在連接酶的作用下，6與4和5分別連接成DNA片段7和8。為了同時測定等位基因的兩個類型，取含有DNA片段7和8的酶連產物適量，分別加于兩支PCR用擴增小管中，分別記為管A和管B，其中管A中加入與等位基因位點2和3的一種類型相互補的特異性引物P2和引物P3。由于等位基因通常僅有兩種可能的類型，故在管B中加入與等位基因位點2和3的另一種類型相互補的特異性引物P2’和P3’。在管A和管B中同時加入PCR擴增必需的另一條共用引物P1，P1的序列與DNA適配器6分叉端一條鏈的5′端序列完全一致。在加入必要的PCR擴增試劑后，進行PCR反應，如果3為雜合子，2為純合子，P2為與2相匹配的特異性引物，則在管A中含有兩條DNA擴增產物9和10；在管B中僅有擴增片段10。最后采用分離方法，如瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)了如圖1中所示的凝膠電泳圖像11和12。根據(jù)DNA條帶的大小就可快速判斷2和3的基因多態(tài)性類型。
由于等位基因擴增的特異性有時不夠理想，如果出現(xiàn)這種情況，可通過改變特異性引物3’端的序列來提高擴增反應的特異性。實施例1 凝膠電泳法測定CYP2D6基因多態(tài)性位點CYP2D6*10按照本發(fā)明中的方法，測定了CYP2D6基因中的一個多態(tài)性位點CYP2D6*10。該位點的堿基類型為C/T，為了說明本法的每一步操作過程，并用電泳結果表示，首先用一對引物擴增基因組DNA，產生含有該位點的片段，引物P1和P2的序列分別為5′-AACACAGCAGGTTCACTCACAG-3′和5′-CCCAGACTA CAG GTC CTA GTC C-3′。擴增DNA的片段長度為1009bp，如圖2中的槽1結果所示。將該片段用限制性內切酶Mbo I切割，應產生918bp和95bp的兩條DNA片段。根據(jù)圖2中槽2的檢測結果，酶切成功，產生了918bp的DNA片段。由于95bp太短，未能在電泳中產生可觀察到的清晰條帶，在本例中僅使用918bp的片段進行測定。
用DNA連接酶(DNA ligase)將上述酶解產物與DNA適配器相連接。DNA適配器的兩條鏈的序列分別為5’-ccc cac ttc ttg ttc tct cat cag gcg cat cac t cg-3’和5’-gatccg agt gat gcg cta ag-3’，連接后產生約950bp的條帶，如圖2中槽3的檢測結果所示。再將連接產物分成兩份，在其中一份中加入一條共用引物P3(序列為5’-ccc cacttc ttg ttc tct cat-3’)和一條用于特異性擴增CYP2D6*10等位基因C型的引物P4(序列為5’-acg ctg ggc tgc acg cta ct-3’)，經過PCR反應，產生一條鏈長為670bp的DNA片段，如圖2中的槽4結果所示；在另一份連接產物中加入一條共用引物P3和一條用于特異性擴增CYP2D6*10等位基因T型的引物P5(序列為5’-acg ctg ggc tgcacg cta cc-3’)，在PCR擴增反應中未見DNA條帶。
當以基因組DNA為模板直接測定時，其實驗步驟為取50-200μg基因組DNA(預先用試劑盒將血液中的DNA提取出來)，加入到20μl試管中，另加入MbOI內切酶10U(Takara)，反應緩沖液(10倍，Takara)2μl，加水至20μl，在37℃水浴中保溫反應2小時。將該反應液在75℃保溫15min，使內切酶去活。取酶切液2μl至PCR反應試管中，加入DNA適配器(由20pmol的5’-ccc cac ttc ttg ttc tct catcag gcg cat cac t cg-3’和20pmol的5’-gat ccg agt gat gcg cta ag-3’退火產物組成)，2μl 25％的PEG-8000，2μl 5mmol/LATP溶液，1μl 100mmol/L DTT溶液，T4DNA連接酶20U，加水至20μl，在16℃水浴中保溫2小時。取此連接產物各2μl置兩支PCR反應管中，在一支中加入20pmol P4和20pmol共用引物P3；在另一支中加入20pmol P5和20pmol P3，然后在兩管中均加入2.5μl 10倍緩沖液，1.5μl 50mmol/L MgCl2溶液，2μl 2.5mmol/L的dNTP溶液和1.25μl 0.5U/μl Taq聚合酶(Takara)，加水至25μl，在PCR擴增儀(PT-225，MJ Research，美國)上擴增，反應條件為94℃5min，然后按下列程序循環(huán)反應35次94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1min。最后在72℃繼續(xù)延伸反應7min，于4℃保存。在2％瓊脂糖凝膠電泳上點樣分析。實施例2兩重基因多態(tài)性位點的同時測定在本實施例中，以同時測定基因多態(tài)性位點CYP2D6*10和ABCA1基因中的I823M為例來闡述本專利的特點。測定CYP2D6*10等位基因類型的兩條特異性引物的序列分別為P4和這P5，序列同實施例1。測定ABC1基因I823M等位基因類型的兩條特異性引物的序列分別為P65’-gtt cca acc aga aga gat ta-3’和P75’-gtt cca acc aga aga gat tg-3’。
按照實施例1的相同方法制備酶連產物，各取2μl該溶液分別置2支PCR反應管中，在管1中加入20pmol的P4、P6和共用引物P3。在管2中加入20pmol的P5、P7和共用引物P3，按實施例1的方法在兩管中加入PCR擴增反應的試劑，并在PCR擴增儀上進行擴增反應，將擴增反應產物點樣于1.5％瓊脂糖凝膠上進行電泳。根據(jù)兩管中PCR擴增產物條帶的有無和長短判定兩種等位基因的類型。
參考文獻[1]Van Orsouw NJ，Zhang X，Wei JY，Johns DR，Vijg J.Mutational scanning ofmitochondrial DNA by two-dimensional electrophoresis，Genomics.1998，15；52(1)27-36.[2]Shuber AP，Grondin VJ，Klinger KW.A simplified procedure for developingmultiplex PCRs.Genome Res.1995，5(5)488-93.
權利要求
1.一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測定法，其特征在于(a)采用限制性內切酶將長的DNA鏈切割成含有酶切切口的短的DNA片段；(b)在連接酶的存在下用雙鏈部分互補的DNA適配器與(a)中短的DNA片段連接；(c)用一個通用引物和一個等位基因特異性引物對(b)中經與DNA適配器連接的DNA片段進行PCR擴增；(d)采用適當?shù)姆椒z測(c)中經PCR擴增的DNA片段。
2.如權利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測定法，其特征在于所述的長的DNA鏈，其中DNA鏈是指基因組DNA或mRNA反轉錄后的雙鏈cDNA。
3.如權利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測定法，其特征在于所述的DNA適配器中，其由兩條DNA單鏈組成，其中一端互補，另一端不互補，是一分叉型結構。
4.如權利要求3所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測定法，其特征在于所述的DNA適配器中，其雙鏈互補的一端含有與權利要求項1(a)中所述的限制性內切酶位點一致的序列。
5.如權利要求3所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測定法，其特征在于所述的DNA適配器中，其雙鏈不互補一端中的5′端鏈含有8個堿基以上的不互補序列。
6.如權利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測定法，其特征在于所述的通用引物，其序列與權利要求5中所述的DNA適配器的不互補端中5′端鏈的序列相同。
7.如權利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測定法，其特征在于所述的等位基因特異性引物，其3′端正好位于單堿基多態(tài)性位點或突變點。
8.如權利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測定法，其特征在于所述的適當方法，包括電泳分離方法和色譜分離方法等。
9.如權利要求8所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測定法，其特征在于所述的電泳分離方法，包括毛細管電泳，芯片電泳，凝膠電泳等。
10.如權利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測定法，其特征在于所述的基因多態(tài)性檢測方法，每個基因多態(tài)性位點的檢測由兩次PCR擴增完成，兩次擴增所用引物對中的等位基因特異性引物的3′端分別用于確定等位基因的兩種類型。
11.如權利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測定法，其特征在于所述的基因多態(tài)性檢測方法，每個基因多態(tài)性位點的檢測可在單管中由一次PCR擴增完成；擴增所用引物為三個，其中兩個引物為等位基因特異性引物，其5′端分別標記有發(fā)射波長不同的熒光染料，另一個為通用引物；兩個等位基因特異性引物分別用于確定等位基因的兩種類型。
12.如權利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測定法，其特征在于所述的基因多態(tài)性檢測方法，用n個不同的等位基因特異性引物和1個通用引物進行多重PCR擴增。
全文摘要
本發(fā)明一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測定法，屬于一種檢測DNA單核苷酸多態(tài)性的方法。具體來說由以下四步組成(1)用內切酶消化基因組DNA，將DNA長鏈切割成含有粘性切口的短片段；(2)設計DNA適配器，并將其與上述含有粘性切口的短DNA片段連接；(3)采用等位基因特異性引物和一個通用引物進行PCR擴增；(4)用電泳或色譜法分離上述經PCR擴增的DNA片段；(5)根據(jù)DNA片段的長度判斷等位基因的類型或基因的突變類型。
文檔編號C12Q1/68GK1473944SQ0313228
公開日2004年2月11日 申請日期2003年8月8日 優(yōu)先權日2003年8月8日
發(fā)明者周國華 申請人:周國華, 中國人民解放軍南京軍區(qū)聯(lián)勤部軍事醫(yī)學研究所