專利名稱：突變型雞Myostatin和該基因的檢測方法及在雞育種中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雞遺傳育種改良的生物技術(shù)，具體說是肌肉生長抑制素(Myostatin)基因單核苷酸多態(tài)性檢測分析方法及在雞遺傳育種改良中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國是一個家禽生產(chǎn)的大國，禽蛋生產(chǎn)量列世界首位，禽肉產(chǎn)量列世界第二位。然而，從我國家禽良種覆蓋率來看仍然偏低，優(yōu)良雞種，尤其是蛋雞和白羽肉雞主要是以進(jìn)口品種為主，因此畜牧生產(chǎn)的總體效益不高。由于對肉雞生長速度過高追求，帶來的問題是肉雞的脂肪含量越來越高，品質(zhì)越來越差，沉積過多的脂肪，影響了飼料轉(zhuǎn)化率，蛋雞生產(chǎn)也存在蛋料比偏低的問題，而利用分子遺傳學(xué)及標(biāo)記輔助選擇育種方法相結(jié)合，無疑對解決上面的問題提供了最佳的途徑。對于我國的肉雞生產(chǎn)，主要有快大型的肉雞和優(yōu)質(zhì)雞的生產(chǎn)?？齑笮偷娜怆u品種基本上是由國外進(jìn)口的雞種為主，年產(chǎn)量為20億只。而作為我國最具有特色的優(yōu)質(zhì)雞，具有良好的發(fā)展勢頭，由我國的南方開始向全國擴展。肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)又稱GDF-8(Growth Differentiation Factor 8)，是McPherron等(1997)首先從小鼠骨骼肌cDNA文庫中克隆的一個新基因。蛋白質(zhì)同源性比較證明，肌肉生長抑制素屬于TGF-β(Transforming Growth Factorβ，轉(zhuǎn)化生長因子β)超家族中的一個新成員但不屬于已發(fā)現(xiàn)的亞家族。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肌肉生長抑制素主要在小鼠的骨骼肌中表達(dá)，而且利用基因敲除技術(shù)研究它的功能發(fā)現(xiàn)，MSTN基因敲除鼠的骨骼肌是正常野生型小鼠的3倍以上，其肩、臀部的肌肉明顯肥大，整個身體的骨骼肌都比野生型的小鼠大得多，單塊肌肉的重量約為野生小鼠的2～3倍，從而導(dǎo)致了體重的增加。突變型小鼠骨骼肌纖維的數(shù)目比野生小鼠高出86％(P＜0.01)，表明突變小鼠骨骼肌肥大的原因既有肌細(xì)胞的增生，也有肌纖維的肥大。但在其他生長發(fā)育性狀上沒有發(fā)現(xiàn)任何表現(xiàn)型的差異。以上結(jié)果表明，MSTN在調(diào)控骨骼肌肉的生長發(fā)育中起著十分重要的作用。MSTN的功能也在比利時藍(lán)牛得到了驗證。經(jīng)長期遺傳選育的比利時藍(lán)牛具有十分強壯的骨骼肌，比其他品種高20％。對雙肌牛品種比利時藍(lán)牛(Belgian Blue)和皮爾蒙特牛(Piedmontese)MSTN基因的分子生物學(xué)分析證明，比利時藍(lán)雙肌牛在MSTN基因外顯子III缺失11bp，造成移碼突變，使得從缺失后面的第14個密碼子開始停止翻譯，其結(jié)果是C-端僅7個氨基酸得到翻譯其余102個氨基酸全部丟失，無法產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的肌肉生長抑制素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明研制一種準(zhǔn)確、簡單、迅速、直接檢測Myostatin基因單核苷酸多態(tài)性方法，利用該方法可以對種雞進(jìn)行遺傳標(biāo)記輔助選擇育種，從而可以從根本上解決傳統(tǒng)遺傳育種中由于對肉雞生長速度過高追求，帶來的問題(如，肉雞的脂肪含量越來越高，品質(zhì)越來越差，沉積過多的脂肪，影響了飼料轉(zhuǎn)化率，蛋雞生產(chǎn)也存在蛋料比偏低等)。本發(fā)明的突變型雞的Myostatin基因的核苷酸多態(tài)性為G→A(304位)，A→G(322位)，C→T(334位)，G→A(167位)，7263A→A。本發(fā)明的突變型雞的Myostatin基因的檢測方法的具體步驟是第一步PCR引物的設(shè)計根據(jù)本實驗室克隆的雞Myostatin基因組全序列設(shè)計了3對引物如下P60 5′-TCCTATCAGG AAACCTATC-3′P61 5′-ACCTCAAGGAAAATTCTGAG-3′P93 5′-CAACTTTCAGTAATAATGGAA-3′P94 5′-TGATAGGTTTTCCTGATAGGTA-3′P80 5′-CTAAACGTAGTAAAACAAAAGGCAGC-3′P81 5′-AACATTTATTTACAAAATATTGATG-3′第二步雞基因組DNA的提?。坏谌絇CR擴增，PCR擴增反應(yīng)體系為10×PCR buffer 2.5μl，10mmol/LdNTPs 2μl，20μmol/L上游引物1μl，20μmol/L下游引物1μl，Taq酶1.0U，15ng/μl DNA模板4.0μl，ddH2O 13.3μl。PCR程序為94℃ 5min 1個循環(huán)；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s共35個循環(huán)；72℃ 8min 1個循環(huán)；4℃保溫。
第四步SSCP分析，1μl PCR產(chǎn)物和5μl Loading buffer(98％甲酰胺、0.025％溴酚藍(lán)、0.025％二甲苯青、10mmol/L EDTA(pH8.0)、10％甘油)混合，98℃變性10min，冰浴5min，經(jīng)14％非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis＝29∶1)電泳分析(10V/cm、10h)后銀染顯色。
上述雞基因組DNA的小量提取步驟操作簡便、所需儀器藥品投入少，適于養(yǎng)雞現(xiàn)場使用；上述PCR反應(yīng)體系為本發(fā)明的一部分，是檢測雞Myostatin基因單核苷酸多態(tài)性的優(yōu)化PCR方法。
本發(fā)明的結(jié)果一、利用上述本發(fā)明的方法發(fā)現(xiàn)了雞Myostatin基因單核苷酸多態(tài)性。
采用引物P80/P81進(jìn)行PCR-SSCP分析，我們發(fā)現(xiàn)3種基因型(圖1)。發(fā)現(xiàn)該片段中有3個核苷酸發(fā)生了突變，分別是G→A(304位)，A→G(322位)，C→T(334位)，這些突變導(dǎo)致了Myostatin 5’-調(diào)控區(qū)呈現(xiàn)出多態(tài)性(圖2)。將與GenBank具有相同序列的定義為AA型，突變型定義為BB型。
利用引物P93/P94，對該PCR產(chǎn)物的SSCP分析，我們發(fā)現(xiàn)3種基因型(圖3)。將兩種純合基因型片段進(jìn)行回收、克隆和測序比較發(fā)現(xiàn)該片段中有1個核苷酸是G→A(167位)發(fā)生了突變(圖4)。同樣，將與與GenBank具有相同序列的定義為FF型，突變型定義為EE型。
用引物P80/P81進(jìn)行PCR-SSCP分析，我們發(fā)現(xiàn)3種基因型(圖5)。對兩種純合基因型的片段進(jìn)行回收、克隆、測序比較發(fā)現(xiàn)，該片段中第7263位核苷酸A突變?yōu)門，因而造成Myostatin 3’-調(diào)控區(qū)的多態(tài)性(圖6)。將與GenBank具有相同序列的定義為CC型，突變型定義為DD型。
二.發(fā)現(xiàn)了Myostatin基因單核苷酸多態(tài)性與生產(chǎn)性能間的關(guān)系我們對所發(fā)現(xiàn)的Myostatin單核苷酸多態(tài)性與初生重、屠體重、胸肌重、腿肌重、肝重和腹脂重等性狀的關(guān)系進(jìn)行了最小二乘方差分析。我們發(fā)現(xiàn)，P60/61位點基因型對12周齡腹脂重、腹脂率、初生重、胸肌率有影響(P＜0.05)AA型與BB型的腹脂重差異顯著(P＜0.05)；AA和AB型腹脂率顯著高于BB型(P＜0.05)；AA型的初生重顯著高于BB型(P＜0.05)；AA型胸肌率顯著高于AB型(P＜0.05)(表1)。P93/94位點與胸肌重有顯著相關(guān)(P＜0.05)EF型比EE型具有更高的胸肌重(表2)。P80/P81位點與胸肌重(P＜0.05)和胸肌率(P＜0.01)相關(guān)CC型與DD型之間的胸肌重差異顯著(P＜0.05)，CC型的胸肌重較高；CC型、DD型之間的胸肌率差異極顯著(P＜0.01)，CC型和CD型之間差異顯著(P＜0.05)，CC型比CD和DD型的胸肌率高，而CD型的胸肌率也比DD型的高(P＜0.05(表3)。
表1 P60/61引物不同基因型對初生重、腹脂重和腹脂率的影響基因型 個體數(shù) 基因型頻率腹脂重腹脂率 初生重胸肌率116 0.340 52.55± 0.0354±30.79± 0.0613±AA3.38a0.0022a0.28a0.001a187 0.548 49.10± 0.0353±30.35± 0.0592±AB3.32ab0.0022a0.21ab0.001b380.111 43.34± 0.0294±29.51± 0.0586±BB5.02b0.0038b0.45b0.0015ab注均值比較時同一列字母相同者差異不顯著(P＞0.05)
表2 P93/94引物不同基因型對初生重、腹脂重和腹脂率的影響基因型 個體數(shù) 基因型頻率 胸肌重EE170 0.49986.70±3.32bEF131 0.38493.23±3.50aFF40 0.11790.16±4.56ab注均值比較時同一列字母相同者差異不顯著(P＞0.05)表3 p80/81引物不同基因型對胸肌重和胸肌率的影響基因型頻率胸肌重 胸肌率CC2130.617 95.37±1.57a0.0634±0.00058aCD1260.365 89.93±2.12ab0.0614±0.00078bDD6 0.017 84.49±7.29b0.0544 ±0.00269c注均值比較時同一列字母相同者差異不顯著(P＞0.05)無論是快大型雞還是優(yōu)質(zhì)雞的育種，肌肉重和肌肉率都是很重要的選擇指標(biāo)，而直接對其測定不能實現(xiàn)，我們發(fā)明的雞肌肉性狀Myostatin基因的多態(tài)性標(biāo)記，可以作為肉雞育種中肌肉性狀和脂肪性狀的選擇標(biāo)記，在提高雞的肌肉生長速度的同時，在一定程度上達(dá)到降低脂肪含量的目的。本方法只要檢測基因型，通過提高肌肉率的優(yōu)勢，就可以提高群體的增重速度。檢測方法簡單、基因型容易判斷，因此具有推廣價值。
本發(fā)明的突變型雞Myostatin基因的檢測方法在雞選擇育種中的應(yīng)用的具體步驟是第一步PCR引物的設(shè)計根據(jù)本實驗室克隆的雞Myostatin基因組全序列設(shè)計了3對引物如下P60 5′-TCCTATCAGG AAACCTATC-3′P61 5′-ACCTCAAGGAAAATTCTGAG-3′P93 5′-CAACTTTCAGTAATAATGGAA-3′P94 5′-TGATAGGTTTTCCTGATAGGTA-3′P80 5′-CTAAACGTAGTAAAACAAAAGGCAGC-3′P81 5′-AACATTTATTTACAAAATATTGATG-3′第二步雞基因組DNA的提??；
第三步PCR擴增，PCR擴增反應(yīng)體系為10×PCR buffer 2.5μl，10mmol/LdNTPs 2μl，20μmol/L上游引物1μl，20μmol/L下游引物1μl，Taq酶1.0U，15ng/μl DNA模板4.0μl，ddH2O 13.3μl。PCR程序為94℃5min 1個循環(huán)；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s共35個循環(huán)；72℃ 8min 1個循環(huán)；4℃保溫。
第四步SSCP分析，1μl PCR產(chǎn)物和5μl Loading buffer(98％甲酰胺、0.025％溴酚藍(lán)、0.025％二甲苯青、10mmol/L EDTA(pH8.0)、10％甘油)混合，98℃變性10min，冰浴5min，經(jīng)14％非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis＝29∶1)電泳分析(10V/cm、10h)后銀染顯色。
第五步驟1、用引物P80/P81進(jìn)行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型AA ATGGATTCCTCGTGTTTGCAATGTATTTATTACGTATTBB ATAGATTCCTCGTGTTTGCAGTGTATTTATTATGTATT2、用引物P93/P94進(jìn)行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型EE ATTTTGATACTAAAGGGTCCAATAGTTAFF ATTTTGATACTAGAGGGTCCAATAGTTA3、用引物P80/P81進(jìn)行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型CC TTGCTACAGAAATTGTTAAAAAACDD TTGCTACAGATATTGTTAAAAAAC第六步驟根據(jù)各基因型的以下特性選擇需要的種雞，腹脂重、腹脂率、初生重、胸肌率AA＞AB＞BB胸肌重EF＞FF＞EE胸肌重、胸肌率CC＞CD＞DD。
禽肉已取代牛肉成為世界第二大消費肉類，據(jù)FAO統(tǒng)計，1993-1995年度全球平均每年人均消費禽肉9.1kg，而到2005年將增至13.7kg，發(fā)展中國家的消費將從5.7kg增加到10.2kg，這其中亞洲的增長是最快的。我國是一個家禽生產(chǎn)的大國，禽蛋、禽肉生產(chǎn)量列世界首位。雞肉和雞蛋生產(chǎn)在我國畜牧業(yè)生產(chǎn)中有著重要地位。然而，從我國家禽良種覆蓋率來看仍然偏低，優(yōu)良雞種，尤其是蛋雞和白羽肉雞主要是以進(jìn)口品種為主，因此畜牧生產(chǎn)的總體效益不高。由于對肉雞生長速度過高追求，帶來的問題是肉雞的脂肪含量越來越高，品質(zhì)越來越差，沉積過多的脂肪，影響了飼料轉(zhuǎn)化率，蛋雞生產(chǎn)也存在蛋料比偏低的問題，而利用分子遺傳學(xué)及標(biāo)記輔助選擇育種方法相結(jié)合，無疑對解決上面的問題提供了最佳的途徑。對于我國的肉雞生產(chǎn)，主要有快大型的肉雞和優(yōu)質(zhì)雞的生產(chǎn)?？齑笮偷娜怆u品種基本上是由國外進(jìn)口的雞種為主，年產(chǎn)量為20億只，出口40萬噸，創(chuàng)匯7億美元。優(yōu)質(zhì)雞是我國優(yōu)秀地方雞種選育而成的，具有肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美的特點，具有良好的發(fā)展勢頭，優(yōu)質(zhì)肉雞的生產(chǎn)和消費已從局部地區(qū)向全國各地擴散，并有部分出口，年出欄量達(dá)到15億只，年出口3000萬只活雞，種雞飼養(yǎng)量為2000萬套。全國優(yōu)質(zhì)肉雞生產(chǎn)的發(fā)展速度達(dá)到年增25％-30％，市場潛力巨大。
本發(fā)明的雞的育種方法是一種準(zhǔn)確、簡單、迅速、直接檢測Myostatin基因單核苷酸多態(tài)性方法，利用該方法可以對種雞進(jìn)行遺傳標(biāo)記輔助選擇育種，從而可以從根本上解決傳統(tǒng)遺傳育種中由于對肉雞生長速度過高追求，帶來的問題(如，肉雞的脂肪含量越來越高，品質(zhì)越來越差，沉積過多的脂肪，影響了飼料轉(zhuǎn)化率，蛋雞生產(chǎn)也存在蛋料比偏低等)。因為，無論是快大型雞還是優(yōu)質(zhì)雞的育種，肌肉重和肌肉率都是很重要的選擇指標(biāo)，而直接對其測定不能實現(xiàn)，我們發(fā)明的雞肌肉性狀Myostatin基因的多態(tài)性標(biāo)記，可以作為肉雞育種中肌肉性狀和脂肪性狀的選擇標(biāo)記，在提高雞的肌肉生長速度的同時，在一定程度上達(dá)到降低脂肪含量的目的。本方法只要檢測基因型，通過提高肌肉率的優(yōu)勢，就可以提高群體的增重速度。檢測方法簡單、基因型容易判斷，因此具有推廣價值。


圖1是Myostatin基因5’-調(diào)控區(qū)的SNPs分析(P60/61)，圖2是AA型和BB型Myostatin基因序列比較表(P60/P61)，圖3是雞Myostatin基因5’-調(diào)控區(qū)的SNPs分析(P93/P94)，圖4是EE型和EF型Myostatin基因序列比較表(P93/P94)，圖5是雞Myostatin基因3’-調(diào)控區(qū)的SNPs分析(P80/P81)，圖6是CC型和DD型Myostatin基因序列比較表(P80/P81)。
具體實施例方式
一突變型雞的Myostatin基因的檢測方法的具體步驟是第一步PCR引物的設(shè)計根據(jù)本實驗室克隆的雞Myostatin基因組全序列設(shè)計了3對引物如下P60 5′-TCCTATCAGGAAAACCTATC-3′P61 5′-ACCTCAAGGAAAATTCTGAG-3′P93 5′-CAACTTTCAGTAATAATGGAA-3′P94 5′-TGATAGGTTTTCCTGATAGGTA-3′P80 5′-CTAAACGTAGTAAAACAAAAGGCAGC-3′P81 5′-AACATTTATTTACAAAATATTGATG-3′第二步雞基因組DNA的小量提取，本方法操作簡便、所需儀器藥品投入少，便于在養(yǎng)雞現(xiàn)場使用，其具體步驟如下取20μl新鮮血液，加ACD抗凝，加入600μl禽裂解液，加入蛋白酶K至終濃度為100-200μg/ml，混勻55℃消化6～10hr，直至溶液中不再有粘稠的團塊，將溶液冷卻至室溫，加入等體積苯酚，反復(fù)顛倒離心管，直至兩相混合形成乳濁液，12,000rpm，室溫離心10min。取上清，再用等體積酚∶氯仿、氯仿各抽提1次。取上清加1/10體積NaAc(3M，pH5.2)和2倍體積無水乙醇沉淀DNA。將DNA挑出放到1.5ml離心管中，用70％乙醇洗兩次。將DNA干燥后(注意不能太干)溶于適量TE或滅菌雙蒸水中。
第三步PCR擴增，本PCR反應(yīng)體系為本發(fā)明的一部分，是檢測雞Myostatin基因單核苷酸多態(tài)性的優(yōu)化PCR方法，反應(yīng)步驟如下PCR擴增反應(yīng)體系為10×PCR buffer 2.5μl，10mmol/L dNTPs 2μl，20μmol/L上游引物1μl，20μmol/L下游引物1μl，Taq酶1.0U，15ng/μl DNA模板4.0μl，ddH2O 13.3μl。PCR程序為94℃ 5min 1個循環(huán)；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s共35個循環(huán)；72℃ 8min 1個循環(huán)；4℃保溫。
第四步SSCP分析，1μl PCR產(chǎn)物和5μl Loading buffer(98％甲酰胺、0.025％溴酚藍(lán)、0.025％二甲苯青、10mmol/L EDTA(pH8.0)、10％甘油)混合，98℃變性10min，冰浴5min，經(jīng)14％非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis＝29∶1)電泳分析(10V/cm、10h)后銀染顯色。
銀染方法電泳結(jié)束后關(guān)上電泳儀，放出電泳液，小心取下凝膠，置于70％乙醇中，水浴震蕩器緩慢搖勻固定10-15min；去離子水洗膠2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液(100ml銀染液NH3·H2O 1ml；3.6％NaOH 2.1ml；20％AgNO31.8ml；加去離子水至100ml)染色30min。去離子水洗膠3遍，每次2min，洗去多余的染色液；用200ml顯色液(200ml顯色液1％檸檬酸鈉1ml；甲醛100ul；加去離子水至200ml)顯色，約10-30min，當(dāng)DNA帶的強度合適時，倒掉顯色液；去離子水洗掉多余的顯色液，保鮮膜封好，掃描照相或保存。
具體實施方式
二雞的育種方法第一步PCR引物的設(shè)計根據(jù)本實驗室克隆的雞Myostatin基因組全序列設(shè)計了3對引物如下P60 5′-TCCTATCAGGAAAACCTATC-3′P61 5′-ACCTCAAGGAAAATTCTGAG-3′P93 5′-CAACTTTCAGTAATAATGGAA-3′P94 5′-TGATAGGTTTTCCTGATAGGTA-3′P80 5′-CTAAACGTAGTAAAACAAAAGGCAGC-3′P81 5′-AACATTTATTTTACAAAATATTGATG-3′
第二步雞基因組DNA的提取，取20μl新鮮血液，加ACD抗凝，加入600μl禽裂解液，加入蛋白酶K至終濃度為100-200μg/ml，混勻55℃消化6～10hr，直至溶液中不再有粘稠的團塊，將溶液冷卻至室溫，加入等體積苯酚，反復(fù)顛倒離心管，直至兩相混合形成乳濁液，12,000rpm，室溫離心10min。取上清，再用等體積酚∶氯仿、氯仿各抽提1次。取上清加1/10體積NaAc(3M，pH5.2)和2倍體積無水乙醇沉淀DNA。將DNA挑出放到1.5ml離心管中，用70％乙醇洗兩次。將DNA干燥后(注意不能太干)溶于適量TE或滅菌雙蒸水中。
第三步PCR擴增，PCR擴增反應(yīng)體系為10×PCR buffer 2.5μl，10mmol/LdNTPs 2μl，20μmol/L上游引物1μl，20μmol/L下游引物1μl，Taq酶1.0U，15ng/μl DNA模板4.0μl，ddH2O 13.3μl。PCR程序為94℃ 5min 1個循環(huán)；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s共35個循環(huán)；72℃ 8min 1個循環(huán)；4℃保溫。
第四步SSCP分析，1μl PCR產(chǎn)物和5μl Loading buffer(98％甲酰胺、0.025％溴酚藍(lán)、0.025％二甲苯青、10mmol/L EDTA(pH8.0)、10％甘油)混合，98℃變性10min，冰浴5min，經(jīng)14％非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis＝29∶1)電泳分析(10V/cm、10h)后銀染顯色。
第五步驟1、用引物P80/P81進(jìn)行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型AA ATGGATTCCTCGTGTTTGCAATGTATTTATTACGTATTBB ATAGATTCCTCGTGTTTGCAGTGTATTTATTATGTATT2、用引物P93/P94進(jìn)行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型EE ATTTTGATACTAAAGGGTCCAATAGTTAFF ATTTTGATACTAGAGGGTCCAATAGTTA3、用引物P80/P81進(jìn)行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型CC TTGCTACAGAAATTGTTAAAAAACDD TTGCTACAGATATTGTTAAAAAAC第六步驟根據(jù)各基因型的以下特性選擇需要的種雞，腹脂重、腹脂率、初生重、胸肌率AA＞AB＞BB胸肌重EF＞FF＞EE胸肌重、胸肌率CC＞CD＞DD。
本實施方式選擇具有BB、EF和CC型基因的雞為種雞進(jìn)行育種。這種雞具有腹脂率低、胸肌率高的特點。
本發(fā)明的突變型雞的Myostatin基因與基因庫的Myostatin基因的核甘酸序列對比如下
一、Myostatin基因5’啟動子中的單核苷酸多態(tài)性基因庫序列 ACTATTTCTGTGTAATATTAGAGTTAAGTAGCTCATGATATTCCTTAAAAATACCTCTCCTACTAAAAGTCTCTCAGTATCTAATTTGCT 90突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 90基因庫序列 GCCCAGGATTTTGCTGACTAGGCAAACTTGCTTTACTTAATAAGCGTCCACACTTCAGTAATGAATTTTGATACTAGAGGGTCCAATAGT 180突變型序列 ----------------------------------------------------------------------------A------------- 180基因庫序列 TAGCACTTATAGTCACACGTGTACAAAATGTTTATTCCTGCTCACCTAGTACCTATCAGGAAAACCTATCATGATTTTCTGAAATCTGAG 270突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 270基因庫序列 CTGCTTAATGCACGTGAACTGTTGAACAAGCATGGATTCCTCGTGTTTGCAATGTATTTATTATGTATTTTTTTCCCCTCCTCCTAACAG 360突變型序列 ---------------------------------A-----------------G-----------C-------------------------- 360基因庫序列 AAATCCCTCAGAATTTTCCTTGAGGTAGTACAAACTTTCAGCCACAATAGTGATAGAATCCTAAAGGAACCCTAAAAGAGAGCTCTGCCT 450突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 450基因庫序列 CAATTCATAGTCCAACTATGCGTTCAGTGTATATTTAAGAATGATAGTGCTGTCTTCCAGCACTGCTGCCCATAGTACTTGGAAATATAT 540突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 540基因庫序列 CCTTTCAGTATGTGAAGACGTATCCTCTACGAAGCCACCAGATAAATCAGTTCACCCTTGGCTGTAATCAAATGCTGTCTAGTGACTTGT 630突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 630基因庫序列 GATCGACAGGGCTTTAACCTCTGACAGCTAGATTCATTGTTGGGACAACAACCAATCGTCGGTTTTGACGACATGAGCCTAATCAAAGTT 720突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 720基因庫序列 GGAGTATAAAAGCCCCCTTGGCATATATAAGGCACACCAGTGTGGCAAGCCGTCTCTCAGATTGCATTTGCTGTCCCGGATCTGTTTAGA 810突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 810基因庫序列 ACTGAAAGAAAAGGGGAAAGGGAGAGGGGGGGGAAAAAAGGCAAAAAGATGCAGTGAGGTGTAAGAAAAAATGCAAAAGCTAGCAGTCTA 900突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 900基因庫序列 TGTTTATATTTACCTGTTCATGCAGATCGCGGTTGATCCGGTGGCTCTGGATGGCAGTAG960突變型序列 ------------------------------------------------------------960二、Myostatin基因3’非編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性基因庫序列 GGTGCTCATGAATTTTGGCTGACGTGAGACCCCTTCGATAAATTGTGGAAGCCACCAAAAAAAAAAGCTATATCCCCTCATCCATCTTTG 6450突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 6450基因庫序列 AAACTGTGAAATTACGTACGCTAGGCATTGCCAACATCCATATACTGTACAACTGTACAGACCACATATATCACAACATGAGCTGCAGAA 6540突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 6540基因庫序列 TGTGAACTTAAAGACAGTAGAGTTACCTAAGGGCTGGCTTTGAAACAACGGACAAAGAAGCTACAATCAAAATCACCGGATTTAACAAAT 6630突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 6630
基因庫序列 GGGTTTCTTACACTGTGAGGGAATCAATATTCAGTCATTCAGACACAAATTTATATGCAGTTTTCAACATATGTTGGTAATCAAAAGTAA 6720突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 6720基因庫序列 GCTCCTTCTCCTCTGAGGACAGAAGGAGCGGGCTATTAAATCAACTTCTTCACAGCTACACTTAATATTGTATTTACAGCAAAATATATA 6810突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 6810基因庫序列 CTGGTAACGTATACACCACTACACATTACCACCAGAATCATCCTTGAACACTTGAATATATAGTGCAGAGTTATGATAAGATGAAATTCC 6900突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 6900基因庫序列 ACGTAAATGGACAAATCCTGAAGTTAGGGATGGTATAGTGTATTTAGCAGTGTTTCCATTCCTTTTTTTCGTTAGTATGTTAGTAATCAA 6990突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 6990基因庫序列 TGGCAATGGTGCTACGTAAGCAGGCTGAGTAAATAGAAAGATAGTTATCTAAGTGAAAGAATTTAGAGTAATAATGAATTTGCCCTATCC 7080突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 7080基因庫序列 TCAGGTACACTATTCAACATTCACAAGAAAAGGATTTTTTTTAAACAAAAGGTGAATAGTTTTCTAAACGTAGTAAAACAAAAGGCAGCA 7170突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 7170基因庫序列 CGGAAGTCTGATGTTCAAACCATAATCCCATATCGTAATCTGCCTTTGCAACGTTACCGTTTGCACTATGATAAGCCAATGCAAATAGTT 7260突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 7260基因庫序列 GGTTGCTACAGAAATTGTTAAAAAACCACTTTGATATAACTGACTTGTGTAATATGTATGCATCAATATTTTGTAAATAAATGTTTATTT 7350突變型序列 ------------T----------------------------------------------------------------------------- 7350基因庫序列 TTTAATCTGTTCGTATACATTCATTACAAAAAAAGAGTAATGGTAACCTGTCCTTTAGTTTAATAAACAAACCCAGGTTTTCTCTTCATA 7440突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 7440基因庫序列 ACATAATTTCCTGGTTTTTAACAGTAATATGAAAGAACAGTGCAACAGAGTAAACCACAGGTAGAGAATTATACCACATTTTGTATGTTT 7530突變型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 7530基因庫序列 GGTTTTTTTTTTTTAACATTGGCATGA 7557突變型序列 --------------------------- 755權(quán)利要求
1.突變型雞Myostatin，其特征在于突變型雞的Myostatin基因的核苷酸多態(tài)性為G→A(304位)，A→G(322位)，C→T(334位)，G→A(167位)，7263A→A。
2.突變型雞Myostatin基因的檢測方法，其特征在于具體步驟是第一步PCR引物的設(shè)計根據(jù)本實驗室克隆的雞Myostatin基因組全序列設(shè)計了3對引物如下P60 5′-TCCTATCAGGAAAACCTATC-3′P61 5′-ACCTCAAGGAAAATTCTGAG-3′P93 5′-CAACTTTCAGTAATAATGGAA-3′P94 5′-TGATAGGTTTTCCTGATAGGTA-3′P80 5′-CTAAACGTAGTAAAACAAAAGGCAGC-3′P81 5′-AACATTTATTTACAAAATATTGATG-3′第二步雞基因組DNA的提取；第三步PCR擴增，PCR擴增反應(yīng)體系為10×PCR buffer 2.5μl，10mmol/LdNTPs 2μl，20μmol/L上游引物1μl，20μmol/L下游引物1μl，Taq酶1.0U，15ng/μl DNA模板4.0μl，ddH2O 13.3μl；PCR程序為94℃5min 1個循環(huán)；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s共35個循環(huán)；72℃ 8min 1個循環(huán)；4℃保溫；第四步SSCP分析，1μl PCR產(chǎn)物和5μl Loading buffer混合，98℃變性10min，冰浴5min，經(jīng)14％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析后銀染顯色。
3.突變型雞Myostatin基因的檢測方法在雞育種中的應(yīng)用，其特征在于第一步PCR引物的設(shè)計根據(jù)本實驗室克隆的雞Myostatin基因組全序列設(shè)計了3對引物如下P60 5′-TCCTATCAGGAAAACCTATC-3′P61 5′-ACCTCAAGGAAAATTCTGAG-3′P93 5′-CAACTTTCAGTAATAATGGAA-3′P94 5′-TGATAGGTTTTCCTGATAGGTA-3′P80 5′-CTAAACGTAGTAAAACAAAAGGCAGC-3′P81 5′-AACATTTATTTACAAAATATTGATG-3′第二步雞基因組DNA的提取；第三步PCR擴增，PCR擴增反應(yīng)體系為10×PCR buffer 2.5μl，10mmol/LdNTPs 2μl，20μmol/L上游引物1μl，20μmol/L下游引物1μl，Taq酶1.0U，15ng/μl DNA模板4.0μl，ddH2O 13.3μl；PCR程序為94℃ 5min 1個循環(huán)；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s共35個循環(huán)；72℃ 8min 1個循環(huán)；4℃保溫；第四步SSCP分析，1μl PCR產(chǎn)物和5μl Loading buffer混合，98℃變性10min，冰浴5min，經(jīng)14％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析后銀染顯色；第五步驟(1)、用引物P80/P81進(jìn)行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型AA ATGGATTCCTCGTGTTTGCAATGTATTTATTACGTATTBB ATAGATTCCTCGTGTTTGCAGTGTATTTATTATGTATT(2)、用引物P93/P94進(jìn)行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型EE ATTTTGATACTAAAGGGTCCAATAGTTAFF ATTTTGATACTAGAGGGTCCAATAGTTA(3)、用引物P80/P81進(jìn)行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型CC TTGCTACAGAAATTGTTAAAAAACDD TTGCTACAGATATTGTTAAAAAAC第六步驟根據(jù)各基因型的以下特性選擇需要的種雞，腹脂重、腹脂率、初生重、胸肌率AA＞AB＞BB胸肌重EF＞FF＞EE胸肌重、胸肌率CC＞CD＞DD。
全文摘要
突變型雞Myostatin和該基因的檢測方法及在雞育種中的應(yīng)用，它涉及雞遺傳育種改良的生物技術(shù)。該突變型雞的Myostatin基因的核苷酸多態(tài)性為G→A(304位)，A→G(322位)，C→T(334位)，G→A(167位)，7263A→A。檢測方法是一、PCR引物的設(shè)計，二、雞基因組DNA的提??；三、PCR擴增；四、SSCP分析。本發(fā)明的育種方法除包括上述步驟外還要進(jìn)行如下步驟五、對被提取基因進(jìn)行分析；六、根據(jù)各基因的特性選擇種雞。本發(fā)明是一種準(zhǔn)確、簡單、迅速、直接檢測Myostatin基因單核苷酸多態(tài)性方法，利用該方法可以對種雞進(jìn)行遺傳標(biāo)記輔助選擇育種，從而可以從根本上解決傳統(tǒng)遺傳育種中由于對肉雞生長速度過高追求，帶來的問題。
文檔編號C12P19/34GK1514020SQ0313241
公開日2004年7月21日 申請日期2003年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月30日
發(fā)明者朱大海, 顧志良, 李暉, 李寧 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)