專利名稱：多色熒光物復(fù)合擴(kuò)增str引物設(shè)計(jì)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外一次性擴(kuò)增多個(gè)DNA目的片段的引物設(shè)計(jì)方法。
背景技術(shù)：
短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats，簡(jiǎn)稱STR)是由2-7個(gè)堿基對(duì)作為核心單位，串聯(lián)重復(fù)形成的一類微衛(wèi)星DNA序列，其片段可采用PCR技術(shù)擴(kuò)增。STR主要由于核心重復(fù)單位數(shù)目的變化形成了STR基因座的遺傳多態(tài)性，其等位基因可用銀染、熒光標(biāo)記和放射顯影等技術(shù)分型。人類基因組中，平均每6～10kb就存在有一個(gè)STR基因座，為法醫(yī)個(gè)人識(shí)別和親子鑒定提供了高信息基因座的豐富來(lái)源。
STR基因座具有如下特點(diǎn)(1)在人類基因組中分布廣泛，(2)基因片段一般小于400bp，易于擴(kuò)增并適用于陳舊、降解生物檢材的DNA分析，(3)檢測(cè)的靈敏度比小衛(wèi)星VNTR基因座高十倍，適用于微量檢材的鑒定，(4)同一STR基因座的不同等位基因之間片段長(zhǎng)度差別不大，優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增不明顯。(5)不同STR基因座之間片段長(zhǎng)度差別不大，擴(kuò)增條件相似，可設(shè)計(jì)在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，降低成本和檢材消耗，提高效率，(6)分析方法簡(jiǎn)便、判型準(zhǔn)確，分型程序明確規(guī)范，分型結(jié)果圖形簡(jiǎn)單，有利于實(shí)現(xiàn)DNA分型的標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化，有利于分型結(jié)果的計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存和交換。
復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)，也叫多重PCR(Multiplex PCR，mpxPCR)，就是在一個(gè)反應(yīng)體系中有多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)序列?？纱蠓鹊睾?jiǎn)化操作程序、節(jié)省時(shí)間和試劑，特別是在法醫(yī)學(xué)鑒定中可以用極少量的檢材同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)遺傳標(biāo)志而更顯其優(yōu)越性。然而，隨著擴(kuò)增體系中引物數(shù)量的增加，引物之間的相互影響越嚴(yán)重，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)變得越復(fù)雜，使得復(fù)合擴(kuò)增變得極為困難。目前這種直接混合引物的復(fù)合方法使復(fù)合的基因位點(diǎn)數(shù)目受到限制，已成為進(jìn)一步增加復(fù)合擴(kuò)增位點(diǎn)的頸瓶和難點(diǎn)，因而探索在不降低靈敏度的情況下復(fù)合更多的位點(diǎn)、條件易于優(yōu)化的新方法對(duì)于法醫(yī)復(fù)合擴(kuò)增的進(jìn)一步發(fā)展很有必要。
基于檢測(cè)體系的不同，目前世界上將復(fù)合擴(kuò)增主要可以分為兩大類銀染復(fù)合擴(kuò)增和熒光復(fù)合擴(kuò)增。銀染復(fù)合擴(kuò)增是復(fù)合擴(kuò)增后的產(chǎn)物利用普通電泳槽分離，利用硝酸銀進(jìn)行染色檢測(cè)的方法。此方法較費(fèi)時(shí)、自動(dòng)化程度不高，準(zhǔn)確性、重復(fù)性難以保證。熒光復(fù)合擴(kuò)增是目前世界上用得最普遍的方法。它是在普通的復(fù)合擴(kuò)增的PCR其中一條引物(任何PCR反應(yīng)都必須有兩條引物)的一端加上熒光標(biāo)記物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用自動(dòng)激光熒光遺傳檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。所加的熒光標(biāo)記物可以是多種，例如，與ABI310遺傳分析儀配套的熒光標(biāo)記物就有5FAM，JOE，NED，ROX，VIC，PET，LIZ等。
熒光復(fù)合擴(kuò)增較銀染復(fù)合擴(kuò)增有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)快速、靈敏、省時(shí)、準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高、可重復(fù)性強(qiáng)等?；谝陨蠋讉€(gè)原因，熒光復(fù)合擴(kuò)增已成為目前世界上用得最普遍同時(shí)也是最先進(jìn)的復(fù)合擴(kuò)增方法?，F(xiàn)在，國(guó)內(nèi)外大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行熒光復(fù)合擴(kuò)增都采用試劑盒化的方法，即購(gòu)買試劑公司的熒光復(fù)合擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。目前應(yīng)用最多的是美國(guó)的Applied Biosystems公司和Promega公司的產(chǎn)品。他們的產(chǎn)品主要有以下幾種1.PowerPlexTM1.1(Promega公司)2.PowerPlexTM1.2(Promega公司)3.PowerPlexTM2.1(Promega公司).4.PowerPlexTM16(Promega公司)5.AmpFlSTR(PE AppliedBiosystems公司)6.AmpFlSTR Identifiler(PE Applied Biosystems公司)7.AmpFlSTR Profiler(PE Applied Bioststems公司)8.AmpFlSTR ProfilerPlus(PE Applied Biosystems公司)9.AmpFlSTR SGM Plus(PE AppliedBiosystems公司)10.Y-PlexTM6(Reliagene Technologies公司)。
但這些試劑盒在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用實(shí)踐中仍然存在以下問(wèn)題(1)目前應(yīng)用最多的是美國(guó)的Applied Biosystems公司和Promega公司的產(chǎn)品。AppliedBiosystems公司復(fù)合最多的商業(yè)化熒光復(fù)合擴(kuò)增試劑盒是STRAmpFLSTRIdentifilerTMPCR Amplification Kit，包括15個(gè)STR基因座CSF1PO，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11，vWA，F(xiàn)GA，TH01，TPOX，D2S1338和D19S433；已涵蓋其全部的商業(yè)性STR位點(diǎn)。當(dāng)采用這些試劑盒的客戶做親子鑒定需要增加遺傳標(biāo)記時(shí)則遇到困難。Promega公司情況類似。(2)這些STR基因座都是基于中國(guó)群體以外的群體(主要是白人群體)資料而開(kāi)發(fā)的，其中有些基因座，比如TPOX，在中國(guó)群體的基因頻率分布較差，個(gè)人識(shí)別能力較低。(3)國(guó)外商品化試劑盒價(jià)格昂貴。
本申請(qǐng)人在中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)02133812.4號(hào)中公開(kāi)了一種復(fù)合擴(kuò)增STR的引物設(shè)計(jì)方法，該方法以兩條非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)，作為一對(duì)短引物；同時(shí)，在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物對(duì)的5′端分別加上該對(duì)短引物，得到長(zhǎng)引物對(duì)。上述方法中短引物的選取是關(guān)鍵，在選定短引物之后，一個(gè)待擴(kuò)增的基因座的長(zhǎng)引物也就相應(yīng)被選定。這是因?yàn)?，長(zhǎng)引物中的能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物實(shí)際上就是可以與待擴(kuò)增基因座的人類基因組特異性結(jié)合的原始引物，它由待擴(kuò)增基因座的人類基因組序列所決定，且因待擴(kuò)增基因座的序列的不同而不同。在上述方法中，所設(shè)計(jì)的長(zhǎng)、短引物能夠用于在同一PCR反應(yīng)體系中同時(shí)對(duì)四個(gè)基因座的目的基因進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。在復(fù)合擴(kuò)增的第一階段，利用長(zhǎng)引物擴(kuò)增出同時(shí)帶有目的基因片段和與短引物配對(duì)的非人類基因組序列的產(chǎn)物；而在復(fù)合擴(kuò)增第二階段，則利用一對(duì)短引物對(duì)多個(gè)基因座的目的基因片段同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。利用上述方法設(shè)計(jì)的引物能夠大量擴(kuò)增目的基因片段，且無(wú)需在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中繁瑣地調(diào)整各對(duì)引物的濃度，簡(jiǎn)化了整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，從而具有優(yōu)點(diǎn)。但是，由于上述方法仍然屬于銀染復(fù)合擴(kuò)增方法，在對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，必然存在著前面述及的費(fèi)時(shí)、自動(dòng)化程度不高，準(zhǔn)確性較差等弊病，雖然其對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求不高，符合當(dāng)前中國(guó)大多數(shù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的需要，但卻不能滿足已經(jīng)具有自動(dòng)激光熒光遺傳檢測(cè)儀的實(shí)驗(yàn)室的更高要求。因此，上述現(xiàn)有方法仍然有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在沿用上述現(xiàn)有方法基本思路的基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)出用于熒光復(fù)合擴(kuò)增的短引物。
本發(fā)明的方法是以公共的一條短引物YPA′YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)，與以下四條在5′端分別加有熒光標(biāo)記物F1、F2、F3、F4的短引物YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′之一構(gòu)成短引物對(duì)YPB1′(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)YPB2′(5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)YPB3′(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)YPB4′(5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)；分別在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB1(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)構(gòu)成與短引物對(duì)YPA′、YPB1′配合使用的長(zhǎng)引物對(duì)YPA-P1和YPB1-P2；分別在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB2(5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)構(gòu)成與短引物對(duì)YPA′、YPB2′配合使用的長(zhǎng)引物對(duì)YPA-P1和YPB2-P2；分別在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB3(5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)構(gòu)成與短引物對(duì)YPA′、YPB3′配合使用的長(zhǎng)引物對(duì)YPA-P1和YPB3-P2；分別在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB4(5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)構(gòu)成與短引物對(duì)YPA′、YPB4′配合使用的長(zhǎng)引物對(duì)YPA-P1和YPB4-P2。
在本發(fā)明中，上述熒光標(biāo)記物F1、F2、F3、F4的成份和顏色各不相同，它們均可以直接采用前述與熒光遺傳檢測(cè)儀配套的現(xiàn)有熒光標(biāo)記物，如5FAM、VIC、NED、PET等。
此處，我們選取的4條短引物(YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′)不能形成引物二聚體，都是非人類基因組序列，它們的物理動(dòng)力學(xué)特性相似。
上述1條公共短引物分別與4條短引物構(gòu)成了4對(duì)短引物，即YPA′和YPB1′、YPA′和YPB2′、YPA′和YPB3′、YPA′和YPB4′，而除公共短引物YPA′之外的4條不同的短引物上分別加有不同顏色的熒光標(biāo)記物。
依照前述專利申請(qǐng)所介紹的方法，每對(duì)短引物可擴(kuò)增4個(gè)不同的基因座，那么4對(duì)不同的短引物就可以擴(kuò)增16個(gè)不同的基因座。單對(duì)短引物的復(fù)合擴(kuò)增過(guò)程及原理與前述專利申請(qǐng)完全相同，只是短引物的結(jié)構(gòu)與以前不同，與短引物相對(duì)應(yīng)的長(zhǎng)引物也與以前不同。
同時(shí)，利用前述專利申請(qǐng)介紹的方法，單個(gè)復(fù)合PCR反應(yīng)中可以同時(shí)擴(kuò)增4基因座，此時(shí)體系中有1對(duì)短引物，4對(duì)不同基因座特異性的長(zhǎng)引物。依此類推，如果我們想要擴(kuò)增8個(gè)基因座，就需要2對(duì)不同的短引物和8對(duì)不同基因座特異性的長(zhǎng)引物；同理，當(dāng)擴(kuò)增12個(gè)基因座時(shí)，就需要3對(duì)不同的短引物和12對(duì)不同基因座特異性的長(zhǎng)引物；當(dāng)擴(kuò)增16個(gè)基因座時(shí)，則需要4對(duì)不同的短引物和16對(duì)不同基因座特異性的長(zhǎng)引物。當(dāng)然，此處所使用的短引物對(duì)已不再是前述專利申請(qǐng)中所給出的短引物對(duì)，而是本發(fā)明所給出的短引物對(duì)(每個(gè)短引物對(duì)均由一個(gè)公共短引物和一個(gè)含有熒光標(biāo)記物的短引物構(gòu)成)。同時(shí)，雖然此處所使用的長(zhǎng)引物對(duì)也是按前述專利申請(qǐng)所介紹的方法得到，但其卻是與本發(fā)明所給出的短引物對(duì)相對(duì)應(yīng)的長(zhǎng)引物對(duì)。
利用本發(fā)明中所提供的短引物和與之對(duì)應(yīng)的長(zhǎng)引物對(duì)目的基因座進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA的片段的大小不同、相互分離并含有熒光標(biāo)記物，從而可以利用熒光遺傳檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。
在本發(fā)明中，分別由上述YPA′和YPB1′、YPA′和YPB2′、YPA′和YPB3、YPA′和YPB4′構(gòu)成4對(duì)短引物之后，具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)(1)4對(duì)引物中有一條公共引物YPA′，總的短引物數(shù)目是5條，這5條短引物就能實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)16個(gè)不同的基因座進(jìn)行擴(kuò)增；國(guó)外其他人用8條短引物擴(kuò)增16個(gè)基因座，本發(fā)明方案中的短引物數(shù)目有所下降。而在復(fù)合擴(kuò)增體系中，引物數(shù)越少越有利于PCR的進(jìn)行。(2)上述加有熒光標(biāo)記物的短引物的結(jié)構(gòu)相似，每條引物間只相差5個(gè)堿基，引物間相互的反應(yīng)的可能性相對(duì)較小，有利于復(fù)合PCR的進(jìn)行。
我們是按照如下原則設(shè)計(jì)公共引物序列的(1)公共引物與人類基因組無(wú)同源性；(2)不低于特異引物的退火溫度；(3)公共引物之間及其與特異引物之間不形成引物二聚體；(4)不形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
另外，本發(fā)明在公共短引物YPA′的5′端設(shè)置了序列GTTCTT。設(shè)置該段序列的目的是(1)由于引物對(duì)中的另外一條短引物的5′端都加上了熒光標(biāo)記物，因此加入該段序列可以平衡各個(gè)引物對(duì)。(2)實(shí)驗(yàn)證明，設(shè)置該段序列有利于復(fù)合擴(kuò)增的進(jìn)行，結(jié)果更好。
在本發(fā)明中，實(shí)際上是將上述公共短引物YPA′中的熒光標(biāo)記物去掉，就得到長(zhǎng)引物中使用的基因組序列YPA。另外，將短引物YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′中的序列GTTCTT去掉，就得到長(zhǎng)引物中使用的基因組序列YPB1、YPB2、YPB3、YPB4。
與前述專利申請(qǐng)相同的是，在本發(fā)明中，長(zhǎng)引物中能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2實(shí)際上就是可以與待擴(kuò)增基因座的人類基因組特異性結(jié)合的原始引物。亦即是說(shuō)，引物P1、P2的序列由待擴(kuò)增基因座的人類基因組序列所決定，且因待擴(kuò)增基因座的序列的不同而不同。同時(shí)，對(duì)于給定的待擴(kuò)增基因座來(lái)說(shuō)，其原始引物均已在互聯(lián)網(wǎng)上GDB基因數(shù)據(jù)庫(kù)中公布，公眾可以方便地從該基因數(shù)據(jù)庫(kù)查到與待擴(kuò)增基因座相對(duì)應(yīng)的原始引物。
與前述現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物可以在同一反應(yīng)體系中同時(shí)對(duì)16個(gè)不同的基因座進(jìn)行擴(kuò)增，各短引物的結(jié)構(gòu)相似，每條引物間只相差5個(gè)堿基，總的短引物數(shù)目?jī)H為5條，引物間相互的反應(yīng)的可能性相對(duì)較小，有利于復(fù)合PCR的進(jìn)行，從而能夠高效率地大量擴(kuò)增目的基因片段，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重現(xiàn)性極高。
本發(fā)明的內(nèi)容結(jié)合以下實(shí)施例作更進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實(shí)施例中所涉及的內(nèi)容。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1在本實(shí)施例中，我們選用以下四個(gè)基因座DYS434，A10，DYS438，DYS439為一組，標(biāo)記一種顏色的熒光。短引物對(duì)為YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB1′(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)在本實(shí)施例的YPB1′中，熒光標(biāo)記物F1為市售的現(xiàn)有紅色熒光標(biāo)記物ROX，其分子式為 長(zhǎng)引物YPA-P1和YPB1-P2為分別在能夠與基因座DYS434、A10、DYS438和DYS439的原始引物P1、P2的5′端加上YPA、YPB1而得到的基因組序列。互聯(lián)網(wǎng)上GDB基因數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的DYS434基因座的原始引物P15’-CACTCCCTGAGTGCTGGATT-3’P25’-GGAGATGAATGAATGGATGGA-3’A10基因座的原始引物P15’-CCTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA-3’P25’-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT-3’DYS438基因座的原始引物P15’-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA-3’P25’-GTGGCAGACGCCTATAATCC-3’DYS439基因座的原始引物P15’-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT-3’P25’-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT-3’在長(zhǎng)引物YPA-P1和YPB1-P2中，YPA和YPB1為YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB1(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)
與之相對(duì)應(yīng)，本實(shí)施例中的DYS434、A10、DYS438和DYS439基因座長(zhǎng)引物如下表所示基因座 長(zhǎng)引物DYS4345′YPA-CACTCCCTGAGTGCTGGATT5′YPB1-GGAGATGAATGAATGGATGGAA10 5′YPA-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT5′YPB1-CCTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATADYS4385′YPA-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA5′YPB1-GTGGCAGACGCCTATAATCCDYS4395′YPA-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT5′YPB1-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT亦即是說(shuō)，對(duì)應(yīng)于上述各基因座，本實(shí)施例中采用的長(zhǎng)引物為DYS434基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CACTCCCTGAGTGCTGGATT-3′YPB1-P25′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GGATGAATGAATGGATGGA-3′A10基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA-3’YPB1-P25-′TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT-3’DYS438基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA-3’YPB1-P25′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GTGGCAGACGCCTATAATCC-3’DYS439基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT-3’YPB1-P25′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT-3’為進(jìn)一步說(shuō)明本實(shí)例中所設(shè)計(jì)引物的使用方法和使用效果，下面繼續(xù)說(shuō)明本實(shí)施例中所設(shè)計(jì)的引物用于復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的具體過(guò)程。
復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)在Taq酶(華美，國(guó)產(chǎn))PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行總體積37.5μl，DNA模板約3ng、dNTP 7.5μL(0.2mMol/l)、Taq酶(華美，國(guó)產(chǎn))3u、10Xbuffer 3.75μl、Mg2+3μl(2.25mmol/L)、BSA 3.751μl、引物混合物(*)2.8μL。
以下為擴(kuò)增參數(shù)(注當(dāng)體系升溫到94℃時(shí)開(kāi)始加Taq酶)94℃3分鐘94℃30秒56℃1分鐘72℃30秒4個(gè)循環(huán)90℃30秒56℃30秒72℃30秒22個(gè)循環(huán)60℃4 30分鐘4℃ 保存在具體進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增時(shí)，每一個(gè)復(fù)合擴(kuò)增體系在擴(kuò)增中實(shí)際包含兩個(gè)連續(xù)的反應(yīng)過(guò)程。
第一個(gè)過(guò)程基因組模板DNA在94℃變性3分鐘后，94℃30秒、58℃50秒和72℃30秒循環(huán)10個(gè)周期。這個(gè)過(guò)程是5’端加有非人類基因組序列的位點(diǎn)特異性引物在起作用，啟動(dòng)復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)，將四個(gè)目標(biāo)靶序列擴(kuò)增，同時(shí)將非人類基因組序列整合到所擴(kuò)增的片段上。
第二個(gè)過(guò)程上一過(guò)程的擴(kuò)增產(chǎn)物做為PCR反應(yīng)的模板DNA，90℃30秒、58℃50秒和72℃30秒循環(huán)22個(gè)周期。這一過(guò)程以非人類基因組公共序列主起引發(fā)延伸的作用，使得擴(kuò)增反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。這一過(guò)程中雖然擴(kuò)增的目標(biāo)靶序列長(zhǎng)度有所不同，但只有一對(duì)引物在起作用，實(shí)際上是將四重復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)轉(zhuǎn)變成了“一重?cái)U(kuò)增反應(yīng)”。最后72℃保溫7分鐘。
上述復(fù)合擴(kuò)增后所得到的PCR產(chǎn)物利用ABI310遺傳分析儀(PE美國(guó))檢測(cè)分析。PCR產(chǎn)物0.4μl，GS500 ROX size standard 0.2μl，Hi-DiTMformamide13μl，混勻編號(hào)，放入自動(dòng)進(jìn)樣盤。電進(jìn)樣15000V、5s。電泳15000v，24分鐘。Date Collection軟件收集數(shù)據(jù)，Genescan3.7分析數(shù)據(jù)，用修改過(guò)的ABI AmpFISTR PLUS kit Kazam macro在Genetype3.7自動(dòng)分型。等位基因的辨認(rèn)通過(guò)與等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物比較來(lái)確認(rèn)，窗口范圍+/-0.5bp。
其間，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離用T＝8％、C＝5％長(zhǎng)度20cm的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。1×TBE作電泳緩沖液，取2μl擴(kuò)增產(chǎn)物加等量載樣緩沖液，以GeneRulerTM50bp作為DNA分子堿基數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)，以自制等位基因ladder作為分型標(biāo)準(zhǔn)物。恒壓750V電泳2個(gè)小時(shí)。
實(shí)施例2在本實(shí)施例中，我們選用以下四個(gè)基因座DYS453、DYS513、DYS19和DYS463為一組，標(biāo)記一種顏色的熒光。
短引物對(duì)為YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB2′(5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)在本實(shí)施例的YPB2′中，熒光標(biāo)記物F2為市售的現(xiàn)有黃色熒光標(biāo)記物NED，其分子式為 長(zhǎng)引物YPA-P1和YPB2-P2為分別在能夠與基因座DYS453、DYS513、DYS19和DYS463的原始引物P1、P2的5′端加上YPA、YPB2而得到的基因組序列?；ヂ?lián)網(wǎng)上GDB基因數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的DYS453基因座的原始引物P15′-GGGTAACAGAACAAGACAGT-3′P25′-CTAAAAGTATGGATATTCTTCG-3′DYS513基因座的原始引物P15′-ATTGATCCATCCGTCTGTCC-3′P25′-GTTGGATGAAGGGAGAGCAG-3′DYS19基因座的原始引物
P15′-CTACTGAGTTTCTGTTATAGT-3′P25′-ATGGCATGTAGTGAGGACA-3′DYS463基因座的原始引物P15′-AATTCTAGGTTTGAGCAAAGACA-3′P25′-ATGAGGTTGTGTGACTTGACTG-3′在長(zhǎng)引物YPA-P1和YPB2-P2中，YPA和YPB2為YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB2(5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)與之相對(duì)應(yīng)，本實(shí)施例中的DYS453、DYS513、DYS19和DYS463基因座長(zhǎng)引物分別為DYS453基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGGTAACAGAACAAGACAGT-3′YPB2-P25′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-CTAAAAGTATGGATATTCTTCG-3′DYS513基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-ATTGATCCATCCGTCTGCC-3′YPB2-P25′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-GTTGGATAAGGGAGAGCAG-3′DYS19基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CTACTGAGTTTCTGTTATAGT-3′YPB2-P25′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-ATGGCATGTAGTGAGGACA-3′DYS463基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-AATTCTAGGTTTGAGCAAAGAGA-3′YPB2-P25′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-ATGAGGTTGTGTGACTTGACTG-3′本實(shí)例中所設(shè)計(jì)引物的使用方法和使用效果與實(shí)施例1相類似，擴(kuò)增體系及擴(kuò)增參數(shù)也與實(shí)施例1相同，故從略。
實(shí)施例3在本實(shí)施例中，我們選用以下四個(gè)基因座DYS456、DYS520、DYS447和DYS552為一組，標(biāo)記一種顏色的熒光。
短引物對(duì)為YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)
YPB3′(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)在本實(shí)施例的YPB3′中，熒光標(biāo)記物F3為市售的現(xiàn)有綠色熒光標(biāo)記物JOE，其分子式為 長(zhǎng)引物YPA-P1和YPB3-P2為分別在能夠與基因座DYS456、DYS520、DYS447和DYS552的原始引物P1、P2的5′端加上YPA、YPB3而得到的基因組序列?；ヂ?lián)網(wǎng)上GDB基因數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的DYS456基因座的原始引物P15’-CCCATCAACTCAGCCCAAAAC-3’P25’-GGACCTTGTGATAATGTAAGATA-3’DYS520基因座的原始引物P15’-AACAGCCTGCCCAACATAGT-3’P25’-ACCATCATGCCCTGCAATA-3’DYS447基因座的原始引物P15’-GGGCTTGCTTTGCGTTATCT-3’P25’-GGTCACAGCATGGCTTGGTT-3’DYS552基因座的原始引物P15’-CCATAGTGCCGAGGTCAAGT-3’P25’-AACACCTGATGCCTGGTTG-3’在長(zhǎng)引物YPA-P1和YPB3-P2中，YPA和YPB3為YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB3(5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)與之相對(duì)應(yīng)，本實(shí)施例中的DYS456、DYS520、DYS447和DYS552基因座長(zhǎng)引物分別為DYS456基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CCCATCAACTCAGCCCAAAAC-3′YPB3-P25′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-GGACCTTGTGATAATGTAAGATA-3′DYS520基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-AACAGCCTGCCCAACATAGT-3′YPB3-P25′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-ACCATCATGCCCTGCAACA-3′DYS447基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGGCTTGCTTTGCGTTATCT-3′YPB3-P25′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-GGTCACAGCATGGCTTGGTT-3′DYS552基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CCATAGTGCCGAGGTCAAGT-3′YPB3-P25′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-AACACCTGATGCCTGGTTG-3′本實(shí)例中所設(shè)計(jì)引物的使用方法和使用效果與實(shí)施例1相類似，擴(kuò)增體系及擴(kuò)增參數(shù)也與實(shí)施例1相同，從略。
實(shí)施例4在本實(shí)施例中，我們選用以下四個(gè)基因座DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510為一組，標(biāo)記一種顏色的熒光。
短引物對(duì)為YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB4′(5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)；在本實(shí)施例的YPB4′中，熒光標(biāo)記物F4為市售的現(xiàn)有藍(lán)色熒光標(biāo)記物FAM，其分子式為
長(zhǎng)引物YPA-P1和YPB4-P2為分別在能夠與基因座DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510的原始引物P1、P2的5′端加上YPA、YPB4而得到的基因組序列?；ヂ?lián)網(wǎng)上GDB基因數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的DYS523基因座的原始引物P15′-GGTCAGCAGTGAAAGATAGGC-3′P25′-TCCATCCATCCATCTACCTG-3′DYS443基因座原始引物P15′-TTTCATTGGCCACCTGACATTAC-3′P25′-CGCTTCCATTTACACTTCCTGTG-3′YGATA-A8基因座原始引物P15′-CGGCATCTATCTATGTGTCTGTC-3′P25′-AGTAGATACAAAGAGAGCATAGACAAAT-3′DYS510基因座原始引物P15′-TTTTTCCTCCCTTACCACAGA-3′P25′-TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA-3′在長(zhǎng)引物YPA-P1和YPB4-P2中，YPA和YPB4為YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB4(5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)與之相對(duì)應(yīng)，本實(shí)施例中的DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510基因座長(zhǎng)引物分別為DYS523基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGTCAGCAGTGAAAGATAGGC-3′YPB4-P25′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-TCCATCCATCCATCTACCTG-3′DYS443基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TTTCATTGGCCACCTGACATTAC-3′YPB4-P25′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-CGCTTCCATTTACACTTCCTGTG-3′Y-GATA-A8基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CGGCATCTATCTATGTGTCTGTC-3′YPB4-P25′TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-AGTAGATACAAAGAGAGCATAGACAAAT-3′
DYS510基因座長(zhǎng)引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TTTTTCCTCCCTTACCACAGA-3′YPB4-P25′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA-3′本實(shí)例中所設(shè)計(jì)引物的使用方法和使用效果與實(shí)施例1相類似，擴(kuò)增體系及擴(kuò)增參數(shù)也與實(shí)施例1相同，從略。
需要說(shuō)明的是，也可以將以上實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3和實(shí)施例4中所給出的長(zhǎng)、短引物放在一個(gè)擴(kuò)增體系中使用，利用它們?cè)谕惑w系中同時(shí)對(duì)實(shí)施例1、2、3、4中所涉及的16個(gè)不同的基因座進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。同時(shí)，各短引物中的熒光標(biāo)記物可以互換，如在實(shí)施例1中，YPB1′中的熒光標(biāo)記物F1采用的是市售的現(xiàn)有熒光標(biāo)記物ROX，但該熒光標(biāo)記物F1也可采用實(shí)施例2中所給出的熒光標(biāo)記物NED、實(shí)施例3中所給出的熒光標(biāo)記物JOE和實(shí)施例4中所給出的熒光標(biāo)記物FAM。依次類推，實(shí)施例2、3、4中的熒光標(biāo)記物F2、F3、F4也可進(jìn)行更換。
權(quán)利要求
1.一種多色熒光物復(fù)合擴(kuò)增STR引物設(shè)計(jì)方法，其特征是以公共的一條短引物YPA′YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)，與以下四條在5′端分別加有熒光標(biāo)記物F1、F2、F3、F4的短引物YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′之一構(gòu)成短引物對(duì)YPB1′(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)YPB2′(5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)YPB3′(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)YPB4′(5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)；分別在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB1(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)構(gòu)成與短引物對(duì)YPA′、YPB1′配合使用的長(zhǎng)引物對(duì)YPA-P1和YPB1-P2；分別在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB2(5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)構(gòu)成與短引物對(duì)YPA′、YPB2′配合使用的長(zhǎng)引物對(duì)YPA-P1和YPB2-P2；分別在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB3(5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)構(gòu)成與短引物對(duì)YPA′、YPB3′配合使用的長(zhǎng)引物對(duì)YPA-P1和YPB3-P2；分別在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB4(5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)構(gòu)成與短引物對(duì)YPA′、YPB4′配合使用的長(zhǎng)引物對(duì)YPA-P1和YPB4-P2。
全文摘要
一種多色熒光物復(fù)合擴(kuò)增STR的引物設(shè)計(jì)方法，其特征是以公共的一條短引物YPA′與四條在5′端分別加有熒光標(biāo)記物F1、F2、F3、F4的短引物YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′之一構(gòu)成短引物對(duì)；分別在能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列構(gòu)成與短引物對(duì)配合使用的長(zhǎng)引物對(duì)。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物可以在同一反應(yīng)體系中同時(shí)對(duì)16個(gè)不同的基因座進(jìn)行擴(kuò)增，各短引物的結(jié)構(gòu)相似，每條引物間只相差5個(gè)堿基，總的短引物數(shù)目?jī)H為5條，引物間相互的反應(yīng)的可能性相對(duì)較小，有利于復(fù)合PCR的進(jìn)行，從而能夠高效率地大量擴(kuò)增目的基因片段，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重現(xiàn)性極高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1477207SQ0313537
公開(kāi)日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2003年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月9日
發(fā)明者侯一平, 吳謹(jǐn), 應(yīng)斌武, 張, 李英碧, 石美森, 顏靜 申請(qǐng)人:四川大學(xué)