專利名稱：無細胞生產(chǎn)葡糖胺的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從淀粉、麥芽糖糊精或糖原無細胞生產(chǎn)葡糖胺的方法；或者從果糖和氨基基團源無細胞生產(chǎn)葡糖胺的方法。
相關(guān)領(lǐng)域葡糖胺是一種氨基糖，存在于許多天然多糖產(chǎn)物中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)葡糖胺在骨關(guān)節(jié)炎和其他疾病的治療中有著越來越多的用處。葡糖胺傳統(tǒng)地通過將由聚(N-乙酰-D-葡糖胺)組成的甲殼類外甲殼(幾丁質(zhì))水解而產(chǎn)生。然而，原材料的可獲得性正日益受到限制。最近，公開了通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)葡糖胺。美國專利US6372457公開了為了高水平生產(chǎn)葡糖胺，在與葡糖胺或者葡糖胺-6-磷酸相關(guān)的通路中進行了遺傳修飾的微生物發(fā)酵。
本領(lǐng)域中仍然需要采用豐富而廉價的起始材料生產(chǎn)葡糖胺的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種從淀粉、麥芽糖糊精或糖原生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸的無細胞方法，包括將淀粉、麥芽糖糊精或糖原在反應(yīng)混合物中與谷氨酰胺一起溫育，該反應(yīng)混合物中包括含有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脫氨酶活性的細胞提取物。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)葡糖胺的無細胞方法，包括將果糖和氨基基團源在反應(yīng)混合物中一起溫育，該反應(yīng)混合物中包括含有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脫氨酶活性的細胞提取物。
本發(fā)明的又一實施方案涉及一種從淀粉、糖原或麥芽糖糊精生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸的無細胞方法，其中包括將淀粉、糖原或麥芽糖糊精在反應(yīng)混合物中與谷氨酰胺一起溫育，該反應(yīng)混合物中包含磷酸化酶、葡糖磷酸變位酶、葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶(也被稱為磷酸葡糖異構(gòu)酶)、葡糖-1，6-二磷酸以及含有葡糖胺-6-磷酸合酶活性的細胞提取物。
本發(fā)明的另一實施方案涉及一種從淀粉、糖原或麥芽糖糊精生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸的無細胞方法，其中包括將淀粉、糖原或麥芽糖糊精在反應(yīng)混合物中與銨源一起溫育，該反應(yīng)混合物中包含磷酸化酶、葡糖磷酸變位酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶、葡糖-1，6-二磷酸以及含有葡糖胺-6-磷酸脫氨酶活性的細胞提取物。
在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)葡糖胺的無細胞方法，包括將果糖和谷氨酰胺在反應(yīng)混合物中一起溫育，該反應(yīng)混合物中包括含有葡糖胺-6-磷酸合酶活性的細胞提取物。
在又一實施方案中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)葡糖胺的無細胞方法，包括將果糖和銨源在反應(yīng)混合物中一起溫育，該反應(yīng)混合物中包括含有葡糖胺-6-磷酸脫氨酶活性的細胞提取物。
本發(fā)明另外的實施方案涉及一種含有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脫氨酶活性的細胞提取物，其中所述的提取物是通過收集通過30％至60％硫酸銨飽和度進行硫酸銨沉淀所產(chǎn)生的沉淀而制備的。
在又一實施方案中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)葡糖胺的無細胞方法，包括將葡糖胺-6-磷酸和磷酸化酶在反應(yīng)混合物中一起溫育。
發(fā)明詳述從淀粉、麥芽糖糊精或糖原生產(chǎn)葡糖胺的酶促反應(yīng)途徑已經(jīng)被確定。淀粉或糖原的末端葡糖殘基能在磷酸化酶作用下從聚合物中釋放并轉(zhuǎn)移到磷酸分子上，所述磷酸化酶切割糖苷鍵以形成葡糖-1-磷酸。在活化劑葡糖-1，6-二磷酸存在的情況下使用葡糖磷酸變位酶，產(chǎn)物葡糖-1-磷酸被轉(zhuǎn)換成葡糖-6-磷酸，后者用磷酸葡糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化成果糖-6-磷酸。葡糖胺-6-磷酸合酶(葡糖胺果糖-6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶)通過將氨基基團從谷氨酰胺轉(zhuǎn)移給果糖-6-磷酸而形成葡糖胺-6-磷酸。或者，葡糖胺-6-磷酸脫氨酶也可以通過將氨基基團轉(zhuǎn)移給果糖-6-磷酸而形成葡糖胺。最后，磷酸酶催化從葡糖胺-6-磷酸上去除磷酸基團從而產(chǎn)生葡糖胺。從葡糖胺-6-磷酸釋放出來的磷酸可用于磷酸化酶對淀粉、麥芽糖糊精或糖原進一步切割。
葡糖胺-6-磷酸合酶催化由果糖-6-磷酸和谷氨酰胺的氨基基團合成葡糖胺-6-磷酸。由于果糖-6-磷酸的磷酸基團在反應(yīng)期間維持完整并且沒有參與到轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)中，該酶能夠以密切相關(guān)的化合物果糖為底物而發(fā)揮功能。
葡糖胺-6-磷酸脫氨酶也能催化由果糖-6-磷酸和銨合成葡糖胺-6-磷酸。如上所述，果糖-6-磷酸的磷酸基團在反應(yīng)期間維持完整并且沒有參與到轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)中，并且該酶能夠以密切相關(guān)的化合物果糖為底物以低速率發(fā)揮功能。
在本發(fā)明的第一個實施方案中，制備了用于從淀粉、糖原、麥芽糖糊精或其他底物生產(chǎn)葡糖胺的含有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脫氨酶活性的細胞提取物。細胞提取物可以從含有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脫氨酶活性的任何細胞中制備。優(yōu)選的，從已知含有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脫氨酶的細胞中制備。細胞可以是真核或原核細胞。真核細胞可以是哺乳動物細胞或酵母細胞。原核細胞可以是細菌細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，細胞提取物從大腸桿菌細胞中制備。細胞可以是培養(yǎng)的細胞或取自組織或器官的細胞。細胞提取物可以從任意量的細胞中制備，這取決于期望的葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脫氨酶活性的量。
細胞提取物可以通過任何已知能保持酶活性的制備提取物的方法制備。優(yōu)選地，提取物通過以下步驟制備裂解細胞，例如通過超聲裂法，去除細胞的碎片以及通過硫酸銨沉淀對所得提取物進行分級分離，從而至少部分純化葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脫氨酶活性。在優(yōu)選實施方案中，采用的是在30％至60％硫酸銨飽和度下所形成沉淀中發(fā)現(xiàn)的級分。更優(yōu)選的是，既可采用在30％至50％硫酸銨飽和度中所形成沉淀中發(fā)現(xiàn)的級分也可采用在40％至60％硫酸銨飽和度中所形成沉淀中發(fā)現(xiàn)的級分。雖然這些級分有很大程度的重疊，但是在30％至50％硫酸銨飽和度中所形成沉淀中發(fā)現(xiàn)的級分將包含更多脫氨酶的活性，而在40％至60％硫酸銨飽和度中所形成沉淀中發(fā)現(xiàn)的級分將包含較高水平的合酶活性。含有葡糖胺-6-磷酸合酶或脫氨酶活性的沉淀可以重懸浮于任何能保持合酶或脫氨酶活性的緩沖液中。例如緩沖液可以是但不限于，100mM Tris，pH7.5；100mM NaCl或50mMTris，pH7.5；可以用100mM NaCl。
細胞提取物的制備，包括分級分離，可以通過檢測葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脫氨酶活性進行監(jiān)控。酶活可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法檢測。在一個實施方案中，酶活性的測量可以通過采用果糖-6-磷酸和谷氨酰胺或銨源作為底物，并檢測葡糖胺-6-磷酸產(chǎn)生。在另一實施方案中，葡糖胺-6-磷酸合酶的活性可以同谷氨酸脫氫酶的活性聯(lián)系在一起，使得合酶反應(yīng)的產(chǎn)物谷氨酸被脫氨基，同時輔酶NADP+被還原成NADPH。因此合酶的活性可以通過分光光度法在340nm波長下檢測NADPH的產(chǎn)量而被檢測。在這一實施方案中，用于檢測合酶活性的典型反應(yīng)混合物包含100mM磷酸鉀，pH7.5；50mM KCl；5mM果糖-6-磷酸；5mM谷氨酰胺；2mM EDTA；0.5mM NADP+；30U谷氨酸脫氫酶；以及10％大腸桿菌提取物(1mg/ml總蛋白)。
在另一實施方案中，葡糖胺-6-磷酸脫氨酶的檢測采用葡糖胺-6-磷酸作為底物并檢測果糖-6-磷酸。
在另一實施方案中，葡糖胺-6-磷酸的活性可以同葡糖-6-磷酸脫氫酶的活性聯(lián)系在一起，使得果糖-6-磷酸被磷酸葡糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)換成葡糖-6-磷酸，葡糖-6-磷酸被氧化成D-葡糖酸-1，5-內(nèi)酯-6-磷酸，NADP+被還原成NADPH。因此活性可以通過分光光度法在340nm下檢測NADPH的產(chǎn)量而被檢測。在這一實施方案中，用于檢測脫氨酶活性的典型反應(yīng)混合物包含100mM Tris-HCl，pH7.85mM NADP+10mM MgCl25mM葡糖胺-6-磷酸5U磷酸葡糖異構(gòu)酶0.4U葡糖-6-磷酸脫氫酶酶提取物在一個優(yōu)選實施方案中，制備的細胞提取物將具有至少大約0.01U/mg蛋白質(zhì)的葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脫氨酶比活性，更優(yōu)選的為大約0.1U/mg蛋白質(zhì)至大約1.0U/mg蛋白質(zhì)，最優(yōu)選為大約0.2U/mg蛋白質(zhì)的比活性。
在本發(fā)明的又一實施方案中，采用一種無細胞方法利用含有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脫氨酶活性的細胞提取物從淀粉、麥芽糖糊精或糖原中生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸。在這個實施方案中，淀粉、麥芽糖糊精或糖原在含有細胞提取物的反應(yīng)混合物中與谷氨酰胺或銨源一起溫育。淀粉可以是任何淀粉，包括但不限于，可溶淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、米淀粉、木薯淀粉或小麥淀粉。麥芽糖糊精是不甜的、由主要靠(α)-1，4鍵連接的D-葡糖單元組成的天然多糖聚合物。麥芽糖糊精由淀粉的部分水解而形成。淀粉可以是任何淀粉，包括，但不限于，可溶淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、米淀粉、木薯淀粉或小麥淀粉?？梢员槐景l(fā)明采用的麥芽糖糊精包括，但不限于，麥芽糖糊精10。糖原可以是任何來源，包括，但不限于，兔肝、牛肝、貽貝或牡蠣。在反應(yīng)混合物中的細胞提取物優(yōu)選濃度為大約1％至大約20％，更優(yōu)選為大約5％至大約15％，最優(yōu)選為大約10％。在反應(yīng)混合物中的淀粉、麥芽糖糊精或糖原優(yōu)選濃度為大約0.05％至大約2.0％，更優(yōu)選為大約0.1％至大約1.0％，最優(yōu)選為大約0.2％。溫育進行的優(yōu)選溫度為大約20℃至大約50℃，更優(yōu)選為大約25℃至大約40℃，最優(yōu)選為大約30℃。反應(yīng)進行時間優(yōu)選為大約10分鐘至大約2小時，更優(yōu)選為大約30分鐘至大約1.5小時，最優(yōu)選為大約1小時。
在優(yōu)選實施方案中，葡糖胺-6-磷酸合酶以及從淀粉、麥芽糖糊精或糖原中生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸所需要的輔助因子被加入到反應(yīng)混合物中。這包括磷酸化酶、葡糖磷酸變位酶和磷酸葡糖異構(gòu)酶以及活化劑葡糖-1，6-二磷酸中的一種或多種。反應(yīng)混合物中包含磷酸源；淀粉、麥芽糖糊精或糖原、KCl、谷氨酰胺、鎂源；葡糖-1，6-二磷酸；磷酸化酶；葡糖磷酸變位酶；磷酸葡糖異構(gòu)酶和細胞提取物。磷酸源可以包括，但不限于，磷酸鉀、磷酸鈉、磷酸鎂、磷酸鈣、磷酸或磷酸銨。鎂源可以包括，但不限于，氯化鎂、硫酸鎂和檸檬酸鎂。在一個優(yōu)選實施方案中，反應(yīng)混合物包含100mM磷酸鉀，pH7.0；0.2％可溶淀粉；50mM KCl；5mM谷氨酰胺；5mM MgCl2；1mM葡糖-1，6-二磷酸；10U/ml磷酸化酶a；5U/ml葡糖磷酸變位酶；25U/ml磷酸葡糖異構(gòu)酶；以及10％大腸桿菌提取物(1mg/ml總蛋白)。
在另一優(yōu)選實施方案中，葡糖胺-6-磷酸脫氨酶以及從淀粉、麥芽糖糊精或糖原中生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸所需要的輔助因子被加入到反應(yīng)混合物中。這包括磷酸化酶、葡糖磷酸變位酶和磷酸葡糖異構(gòu)酶以及活化劑葡糖-1，6-二磷酸中的一種或多種。反應(yīng)混合物中包含磷酸源；淀粉、麥芽糖糊精或糖原、KCl、銨源、鎂源；葡糖-1，6-二磷酸；磷酸化酶；葡糖磷酸變位酶；磷酸葡糖異構(gòu)酶和細胞提取物。磷酸源可以包括，但不限于，磷酸鉀、磷酸鈉、磷酸鎂、磷酸鈣、磷酸或磷酸銨。鎂源可以包括，但不限于，氯化鎂、硫酸鎂和檸檬酸鎂。銨源可以包括，但不限于，硫酸銨、磷酸銨、氯化銨或氫氧化銨。在一個優(yōu)選實施方案中，反應(yīng)混合物包含100mM磷酸鉀，pH7.5；0.2％麥芽糖糊精10；50mM KCl；50mM硫酸銨；10mM MgCl2；1mM葡糖-1，6-二磷酸；10U/ml磷酸化酶a；16U/ml葡糖磷酸變位酶；25U/ml磷酸葡糖異構(gòu)酶；以及包含葡糖胺-6-磷酸脫氨酶的40-60％硫酸銨沉淀分離液。
在如上所述葡糖胺-6-磷酸生產(chǎn)之后，需要去除磷酸基團以產(chǎn)生葡糖胺。因此，本發(fā)明的進一步實施方案是一種無細胞生產(chǎn)葡糖胺的方法，其中包括將葡糖胺-6-磷酸與磷酸酶在反應(yīng)混合物中溫育。磷酸酶可以是任何能從葡糖胺-6-磷酸有效脫磷酸化的磷酸酶。例子包括蝦堿性磷酸酶、牛腸堿性磷酸酶和細菌堿性磷酸酶。溫育進行的優(yōu)選溫度為大約20℃至大約50℃，更優(yōu)選為大約25℃至大約40℃，最優(yōu)選為大約30℃。反應(yīng)進行時間優(yōu)選為大約10分鐘至大約2小時，更優(yōu)選為大約10分鐘至大約1小時，最優(yōu)選為大約10分鐘。反應(yīng)混合物包含適合去磷酸化步驟發(fā)生的緩沖液，優(yōu)選堿性緩沖液，例如Tris，pH8.5。在具體實施方案中，反應(yīng)混合物包含20mM葡糖胺-6-磷酸；5U/ml蝦堿性磷酸酶；50mM Tris，pH8.5；以及5mM MgCl2。
而在另一優(yōu)選實施方案中，葡糖胺-6-磷酸合酶被用來直接從果糖生產(chǎn)葡糖胺。反應(yīng)混合物包含果糖、谷氨酰胺、KCl以及細胞提取物。在一個優(yōu)選實施方案中，反應(yīng)混合物包含20mM果糖；50mM KCl；5mM谷氨酰胺；以及10％大腸桿菌提取物(1mg/ml總蛋白)。
在進一步優(yōu)選實施方案中，葡糖胺-6-磷酸脫氨酶被用于從果糖直接生產(chǎn)葡糖胺。反應(yīng)混合物包含果糖、銨、KCl以及細胞提取物。在一個優(yōu)選實施方案中，反應(yīng)混合物包含20mM果糖；50mM KCl；250mM硫酸銨；以及10％大腸桿菌提取物(1mg/ml總蛋白)。
本發(fā)明的另一實施方案是一種生產(chǎn)葡糖胺的無細胞方法，其中包括在包含具有葡糖胺-6-磷酸合酶和/或葡糖胺-6-磷酸脫氨酶活性細胞提取物的反應(yīng)混合物中溫育果糖和氨基基團源。在反應(yīng)混合物中細胞提取物的優(yōu)選濃度為大約1％至大約20％，更優(yōu)選為大約5％至大約15％，最優(yōu)選為大約10％。在反應(yīng)混合物中果糖的優(yōu)選濃度為大約1mM至大約100mM，更優(yōu)選為大約10mM至大約50mM，最優(yōu)選為大約20mM。氨基基團源可以是任何能夠貢獻氨基基團給酶反應(yīng)的化合物。例子包括谷氨酰胺和銨鹽。在采用谷氨酰胺時，它在反應(yīng)混合物中的優(yōu)選濃度為大約1mM至大約100mM，更優(yōu)選為大約2mM至大約50mM，最優(yōu)選為大約5mM。在一個優(yōu)選實施方案中，反應(yīng)混合物包含100mM Tris，pH7.5；50mM KCl；20mM果糖；5mM谷氨酰胺；以及10％大腸桿菌提取物(1mg/ml總蛋白)。
溫育進行的優(yōu)選溫度為大約20℃至大約50℃，更優(yōu)選為25℃至大約40℃，最優(yōu)選為30℃。反應(yīng)進行時間優(yōu)選為大約10分鐘至大約2小時，更優(yōu)選為大約15分鐘至大約1小時，最優(yōu)選為大約20分鐘。在采用銨鹽作為氨基基團源時，合適的鹽包括，但不限于，硫酸銨、磷酸銨、氯化銨以及氫氧化銨。存在的銨優(yōu)選濃度為大約10mM至大約1000mM，更優(yōu)選為大約50mM至大約500mM，最優(yōu)選為大約250mM。在優(yōu)選實施方案中，反應(yīng)混合物包含100mM Tris，pH7.5；50mM KCl；20mM果糖；250mM硫酸銨；以及10％大腸桿菌提取物(1mg/ml總蛋白)。
隨后的實施例將說明但并不限制本發(fā)明的方法和組合物。其他在化學(xué)品酶法生產(chǎn)通常遇到的多種條件和參數(shù)的修飾和修改，以及對于本領(lǐng)域人員來說顯而易見的修飾和修改，屬于本發(fā)明的原則和保護范圍之內(nèi)。
實施例1從大腸桿菌細胞中分離和檢測葡糖胺-6-磷酸合酶從冷凍小瓶中拿出的大腸桿菌細胞被接種到含有12L發(fā)酵種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)燒瓶中。培養(yǎng)基中含有以下化學(xué)物質(zhì)(g/L)玉米浸出液，10；KH2PO4，2.5；MgSO4·7H2O，2.0；(NH4)2SO4，0.5；檸檬酸，0.192；FeSO4·7H2O，0.03，MnSO4·H2O，0.021；消泡劑6000K，0.5；右旋葡糖，84。種子發(fā)酵罐在39℃以700rpm的攪拌速度和3.5LPM的氣流操作。發(fā)酵的pH值用21％ NH4OH維持在6.9。在生長24小時后，培養(yǎng)液被離心而沉淀被重懸浮于提取緩沖液中(100mMTris，pH7.5；100mM NaCl)。細胞被離心并且沉淀以O(shè)D660值為大約200的濃度重懸浮于提取緩沖液中。采用聲裂法處理細胞4次，30秒，間隔1分鐘。采用離心分離細胞碎片并且留下懸浮物作為酶提取物。在提取物中加入硫酸銨至226g/L(40％飽和度)，對提取物進行離心。在上清液中加入120g/L硫酸銨(60％飽和度)。離心之后，收集沉淀，并在提取緩沖液中重懸浮。絕大多數(shù)葡糖胺-6-磷酸活性存在于這一部分。
葡糖胺-6-磷酸合酶的活性可以通過與谷氨酸脫氫酶的活性聯(lián)系在一起而被檢測，谷氨酸脫氫酶使合酶反應(yīng)的產(chǎn)物谷氨酸脫氨基，且將輔酶NADP+還原成NADPH。在反應(yīng)中所產(chǎn)生NADPH的量用分光光度計在340nm波長下的吸光率來監(jiān)控。酶比活性的計算基于在加入大腸桿菌提取物之后原始吸收率的變化。檢測中包含如下物質(zhì)100mM磷酸鉀，pH7.5；50mM KCl；5mM果糖-6-磷酸；5mM谷氨酰胺；2mM EDTA；0.5mM NADP；30U谷氨酸脫氫酶；以及10％大腸桿菌提取物(1mg/ml總提取物)。
在粗提取物中有大約0.02U/mg蛋白質(zhì)葡糖胺-6-磷酸合酶活性，在硫酸銨沉淀后有0.2U/mg蛋白質(zhì)的活性。葡糖胺-6-磷酸的產(chǎn)生也通過液相色譜分析而確定。
實施例2結(jié)合酶反應(yīng)從淀粉中生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸在這個實施例中，從淀粉中無細胞生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸是通過在反應(yīng)混合物中結(jié)合幾種酶而完成的。反應(yīng)混合物中包含100mM磷酸鉀，pH7.0；0.2％可溶淀粉50mM KCl；5mM谷氨酰胺；5mM MgCl2；1mM葡糖-1，6-二磷酸；
10U磷酸化酶a(Sigma)；5U葡糖磷酸變位酶(Sigma)；25U磷酸葡糖異構(gòu)酶(Sigma)；以及10％大腸桿菌提取物(1mg/ml總蛋白)。
淀粉通過加熱至沸騰而溶解在水中。反應(yīng)混合物被溫育在30℃水浴中1小時并且分析葡糖胺-6-磷酸。對照組由包含熱失活大腸桿菌提取物或沒有淀粉溶液的反應(yīng)混合物組成。
HPLC數(shù)據(jù)顯示在反應(yīng)中產(chǎn)生了葡糖胺-6-磷酸(175μg/ml)。在反應(yīng)混合物中檢測到葡糖胺-6-磷酸和果糖-6-磷酸。在包含熱失活大腸桿菌提取物或沒有淀粉溶液的對照反應(yīng)中，沒有檢測到葡糖胺-6-磷酸。
實施例3結(jié)合酶反應(yīng)從麥芽糖糊精和谷氨酰胺生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸在這個實施例中，從麥芽糖糊精中無細胞生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸是通過在反應(yīng)混合物中結(jié)合幾種酶而完成的。反應(yīng)混合物中包含100mM磷酸鉀，pH7.5；0.2％麥芽糖糊精1050mM KCl；5mM谷氨酰胺；10mM MgCl2；1mM葡糖-1，6-二磷酸；10U磷酸化酶a(Sigma)；16U葡糖磷酸變位酶(Sigma)；25U磷酸葡糖異構(gòu)酶(Sigma)；100μL 40-60％(NH4)2SO4分離液反應(yīng)在30℃中溫育1小時并分析葡糖胺-6-磷酸。包括了對照反應(yīng)。這些由沒有大腸桿菌提取物和沒有麥芽糖糊精的反應(yīng)組成。HPLC數(shù)據(jù)顯示通過這個反應(yīng)產(chǎn)生了130μg/ml葡糖胺-6-磷酸。對照反應(yīng)沒有產(chǎn)生任何葡糖胺-6-磷酸。當用100μl粗大腸桿菌提取物替換時，對于40-60％硫酸銨分離液產(chǎn)生48μg/ml葡糖胺-6-磷酸。
實施例4結(jié)合酶反應(yīng)從麥芽糖糊精和硫酸銨生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸這個實施例說明從麥芽糖糊精無細胞生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸。反應(yīng)是通過在反應(yīng)混合物中結(jié)合幾種酶而完成的。反應(yīng)中包含100mM磷酸鉀，pH7.5；0.2％麥芽糖糊精1050mM KCl；50mM(NH4)2SO4；10mM MgCl2；1mM葡糖-1，6-二磷酸；10U磷酸化酶a(Sigma)；16U葡糖磷酸變位酶(Sigma)；25U磷酸葡糖異構(gòu)酶(Sigma)；100μL 40-60％(NH4)2SO4分離液加H2O至總體積為1ml反應(yīng)溫育1小時并分析葡糖胺-6-磷酸。對照由沒有大腸桿菌提取物且沒有麥芽糖糊精的反應(yīng)組成。HPLC數(shù)據(jù)顯示在這個反應(yīng)中產(chǎn)生了葡糖胺-6-磷酸(111μg/ml)。在對照反應(yīng)中，沒有產(chǎn)生葡糖胺-6-磷酸。
實施例5通過磷酸酶從葡糖胺-6-磷酸生產(chǎn)葡糖胺在這個實施例中，從葡糖胺-6-磷酸無細胞生產(chǎn)葡糖胺是在以下反應(yīng)混合物中完成的20mM葡糖胺-6-磷酸(Sigma)；5U蝦堿性磷酸酶(Sigma)；
50mM Tris，pH8.5；以及5mM MgCl2；1ml反應(yīng)混合物在30℃中溫育10分鐘并通過HPLC分析葡糖胺。在反應(yīng)混合物中檢測到葡糖胺(2.8mg/ml，13mM)。在沒有包含底物葡糖胺-6-磷酸或沒有磷酸酶的對照組中沒有檢測到葡糖胺。
實施例6從果糖和谷氨酰胺生產(chǎn)葡糖胺建立從果糖和谷氨酰胺生產(chǎn)葡糖胺的酶反應(yīng)。包含100mM TrispH7.5；50mM KCl；20mM果糖；5mM谷氨酰胺；以及0.1ml大腸桿菌提取物(1mg/ml總蛋白)的1ml反應(yīng)體系在30℃中溫育20分鐘，并且樣本被進行葡糖胺分析。采用帶有熱失活大腸桿菌提取物的反應(yīng)體系作為對照。
分析結(jié)果顯示在20分鐘內(nèi)從果糖和谷氨酰胺形成了92.5μg葡糖胺。這個反應(yīng)的比活性為23mmol/min/mg蛋白，比天然底物果糖-6-磷酸和谷氨酰胺的活性低10倍。在帶有熱失活大腸桿菌提取物的對照中沒有檢測到葡糖胺。
實施例7從果糖和銨生產(chǎn)葡糖胺建立從果糖和銨生產(chǎn)葡糖胺的酶反應(yīng)。包含100mM Tris pH7.5；50mM KCl；20mM果糖；250mM硫酸銨；以及0.1ml大腸桿菌提取物(1mg/ml總蛋白)的1ml反應(yīng)體系在30℃中溫育20分鐘。樣本通過HPLC分析葡糖胺產(chǎn)生。采用帶有熱失活大腸桿菌提取物的反應(yīng)體系作為對照。
結(jié)果顯示在20分鐘反應(yīng)內(nèi)從果糖和銨形成了6μg/ml葡糖胺。這個反應(yīng)的比活性為1.5mmol/min/mg蛋白，比天然底物果糖-6-磷酸和谷氨酰胺的活性低130倍。在帶有熱失活大腸桿菌提取物的對照中沒有檢測到葡糖胺。
實施例8將nagB基因克隆入pKK223-3為了構(gòu)建nagB表達質(zhì)粒，在nagB翻譯起始密碼子的前端和nagB翻譯終止密碼子的下游分別插入EcoRI和HindIII限制性酶切位點。用于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的引物為5′-CATCTAGAATTCATGAGACTGATCCCCCTGACTACC-3′(SEQID NO1)和5′-CATCTAAAGCTTCAAGGAGCCAGGGCAGGG-3′(SEQ ID NO2)。PCR反應(yīng)基于來自Invitrogen的PCR反應(yīng)試劑盒的操作規(guī)則來進行。反應(yīng)由1ng大腸桿菌基因組DNA，0.3um每種引物，dNTP混合物(每種dNTP 0.3um)，1mM MgSO4，以及在1X Pfx擴增緩沖液中的1U鉑Pfx DNA聚合酶組成。800-bp PCR產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳回收，用EcoRI和HindIII限制性酶消化，并連接入質(zhì)粒pKK223-3的EcoRI-HindIII位點。然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌DH5a菌株。在LB培養(yǎng)基中生長時，nagB基因產(chǎn)物的過表達通過IPTG誘導(dǎo)。
在含有50mM Tris緩沖液，pH7.8，5mM葡糖胺-6-磷酸，5U葡糖胺-6-磷酸異構(gòu)酶，5U葡糖-6-磷酸脫氫酶，1mM NADP和酶提取物的混合物中檢測葡糖胺-6-磷酸脫氨酶的活性?；钚酝ㄟ^340nm吸收值的變化而跟蹤。在包含nagB表達質(zhì)粒菌株的提取物中葡糖胺-6-磷酸脫氨酶的活性比宿主菌株大腸桿菌DH5a的提取物高大約50倍。
實施例9從果糖和銨生產(chǎn)葡糖胺實施了在砷酸鈉存在的情況下從果糖和銨生產(chǎn)葡糖胺的酶反應(yīng)。1ml反應(yīng)體系中包含以下物質(zhì)100mM HEPES，pH7.2100mM NaAsO4，pH7.2
20mM MgCl2250mM果糖100mM(NH4)2SO4100μl大腸桿菌粗提取物(2.8mg/ml總蛋白)反應(yīng)體系在50℃中溫育24小時并分析葡糖胺的存在。對照由沒有果糖、沒有粗提取物和帶有沸騰過的粗提取物的反應(yīng)體系組成。在沒有果糖的對照中沒有檢測到葡糖胺。沒有粗提取物的對照和帶有沸騰過的提取物的對照中含有大約280μg/ml。采用帶有克隆化過表達葡糖胺-6-磷酸脫氨酶的細胞制成的粗提取物產(chǎn)生大約1300μg/ml。采用來自非轉(zhuǎn)化細胞(即沒有包含克隆化葡糖胺-6-磷酸脫氨酶的細胞)制成的粗提取物結(jié)果為產(chǎn)量是大約290μg/ml葡糖胺。在帶有克隆化過表達葡糖胺-6-磷酸脫氨酶的細胞制成的粗提取物中，果糖轉(zhuǎn)化為葡糖胺的活性大約增加了100倍。
現(xiàn)在已經(jīng)充分描述了本發(fā)明，要理解的是對于本領(lǐng)域人員來說，在寬泛而等價的各種條件，公式和其他參數(shù)之內(nèi)同樣可以實現(xiàn)本發(fā)明而沒有影響本發(fā)明的范圍或任何實施例。這里提到的所有專利和出版物全部引入作為參考。
序列表<110>Bao，WuliBinder，Thomas P.
Hanke，Paul D.
Solheim，Leif<120>葡糖胺的無細胞生產(chǎn)<130>1533.568PC01<150>US 60/414,410<151>2002-09-30<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于構(gòu)建nagB表達質(zhì)粒的引物<400>1catctagaat tcatgagact gatccccctg actacc 36<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于構(gòu)建nagB表達質(zhì)粒的引物<400>2catctaaagc ttcaaggagc cagggcaggg 30
權(quán)利要求
1.一種從淀粉、麥芽糖糊精或糖原生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸的無細胞方法，包括在反應(yīng)混合物中將淀粉、麥芽糖糊精或糖原與谷氨酰胺溫育，該反應(yīng)混合物包括含有葡糖胺-6-磷酸合酶活性的細胞提取物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的細胞提取物含有葡糖胺-6-磷酸合酶。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述提取物是真核細胞或細菌細胞提取物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述細胞提取物是大腸桿菌提取物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞提取物通過裂解細胞、去除細胞碎片并進行硫酸銨沉淀以及收集在40％和60％硫酸銨飽和度之間產(chǎn)生的沉淀而制備。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述淀粉選自由可溶淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、米淀粉和小麥淀粉組成的組中。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述糖原選自由兔肝糖原、牛肝糖原、貽貝糖原和牡蠣糖原組成的組中。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述麥芽糖糊精是麥芽糖糊精10。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)混合物進一步包含磷酸化酶、葡糖磷酸變位酶、葡糖-1，6-二磷酸和磷酸葡糖異構(gòu)酶中的一種或多種。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)混合物包含磷酸源；可溶淀粉；KCl；谷氨酰胺；鎂源；葡糖-1，6-二磷酸；磷酸化酶；葡糖磷酸變位酶；磷酸葡糖異構(gòu)酶；以及大腸桿菌提取物。
11.一種從淀粉、麥芽糖糊精或糖原生產(chǎn)葡糖胺-6-磷酸的無細胞方法，包括在反應(yīng)混合物中將淀粉、麥芽糖糊精或糖原與銨源溫育，該反應(yīng)混合物包括含有葡糖胺-6-磷酸脫氨酶活性的細胞提取物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述細胞提取物含有葡糖胺-6-磷酸脫氨酶。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述提取物是真核細胞或細菌細胞提取物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述細胞提取物是大腸桿菌提取物。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述細胞提取物通過裂解細胞、去除細胞碎片并進行硫酸銨沉淀以及收集在30％和50％硫酸銨飽和度之間產(chǎn)生的沉淀而制備。
16.權(quán)利要求11的方法，其中所述淀粉選自由可溶淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、米淀粉和小麥淀粉組成的組中。
17.權(quán)利要求11的方法，其中所述糖原選自由兔肝糖原、牛肝糖原、貽貝糖原和牡蠣糖原組成的組中。
18.權(quán)利要求11的方法，其中所述麥芽糖糊精是麥芽糖糊精10。
19.權(quán)利要求11的方法，其中所述反應(yīng)混合物進一步包含磷酸化酶、葡糖磷酸變位酶、葡糖-1，6-二磷酸和磷酸葡糖異構(gòu)酶中的一種或多種。
20.權(quán)利要求11的方法，其中所述反應(yīng)混合物包含磷酸源；可溶淀粉；KCl；銨源鎂源；葡糖-1，6-二磷酸；磷酸化酶；葡糖磷酸變位酶；磷酸葡糖異構(gòu)酶；以及大腸桿菌提取物。
21.一種生產(chǎn)葡糖胺的無細胞方法，包括在反應(yīng)混合物中將葡糖胺-6-磷酸與磷酸酶溫育。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述磷酸酶選自由蝦堿性磷酸酶、牛腸堿性磷酸酶和細菌堿性磷酸酶組成的組中。
23.一種從果糖生產(chǎn)葡糖胺的無細胞方法，包括在反應(yīng)混合物中將果糖與谷氨酰胺溫育，所述反應(yīng)混合物包括含有葡糖胺-6-磷酸合酶活性的細胞提取物。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述細胞提取物含有葡糖胺-6-磷酸合酶。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述提取物是真核細胞或細菌細胞提取物。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述細胞提取物是大腸桿菌提取物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述細胞提取物通過裂解細胞、去除細胞碎片并進行硫酸銨沉淀以及收集在40％和60％硫酸銨飽和度之間產(chǎn)生的沉淀而制備。
28.權(quán)利要求23的方法，其中所述反應(yīng)混合物包含果糖；KCl；谷氨酰胺；以及大腸桿菌提取物。
29.一種從果糖生產(chǎn)葡糖胺的無細胞方法，包括在反應(yīng)混合物中將果糖與銨源溫育，所述反應(yīng)混合物包括含有葡糖胺-6-磷酸脫氨酶活性的細胞提取物。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述細胞提取物含有葡糖胺-6-磷酸脫氨酶。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述提取物是真核細胞或細菌細胞提取物。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述細胞提取物是大腸桿菌提取物。
33.權(quán)利要求29的方法，其中所述細胞提取物通過裂解細胞、去除細胞碎片并進行硫酸銨沉淀以及收集在30％和50％硫酸銨飽和度之間產(chǎn)生的沉淀而制備。
34.權(quán)利要求29的方法，其中所述反應(yīng)混合物包含果糖；KCl；銨源；以及大腸桿菌提取物。
全文摘要
公開了從淀粉、麥芽糖糊精或糖原或從果糖和氨基基團源無細胞生產(chǎn)葡糖胺的方法。也公開了含有葡糖胺－6－磷酸合酶活性的細胞提取物以及含有葡糖胺－6－磷酸脫氨酶活性的細胞提取物。
文檔編號C12P19/26GK1685054SQ03823423
公開日2005年10月19日 申請日期2003年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月30日
發(fā)明者W·包, T·P·賓德, P·D·漢克, L·索爾海姆 申請人:阿徹-丹尼爾斯-米德蘭公司