專利名稱：真菌菌株和從該真菌菌株中獲得甘露醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與植物紅樹伴生的(mangrove-associated)國際保藏編號(hào)為MTCC5109的真菌新月彎孢菌Culvularia lunata和一種從與植物紅樹伴生的真菌Culvularia lunata中獲得高產(chǎn)量純甘露醇的簡便并且有效的方法，所述的方法包括的步驟是將所述植物樹葉切成小碎片并將其置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)皿上培養(yǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)基的溫度保持在26-47℃的范圍之間并且鹽度保持在4-32ppt的范圍內(nèi)并在間歇刺激條件下培養(yǎng)約17-19天以獲得菌絲體膜(mat)，將該菌絲體膜超聲使細(xì)胞裂解，反復(fù)使用甲醇從被超聲的菌膜中抽提粗提物，濃縮所得的粗抽提物，用極性升高的溶劑處理所得到的已經(jīng)濃縮了的粗抽提物，在處理后獲得含有粗甘露醇的白色粉狀殘留物的水溶液組分，通過色譜層析提純所得到的粗甘露醇以獲得約占總粗提取物75％的純甘露醇。
背景技術(shù)：
D-甘露醇是六-碳糖醇或多元醇，其甜度約為蔗糖的一半，廣泛存在于自然界的各種有機(jī)體中包括植物，藻類，真菌，和一些細(xì)菌中。自然界中不存在L-甘露醇。
在多種水果和蔬菜中發(fā)現(xiàn)了低含量的甘露醇。目前，甘露醇的工業(yè)生產(chǎn)是通過催化氫化果糖/葡萄糖(1∶1)的混合物如轉(zhuǎn)化糖獲得的。在高溫高壓下使用阮尼鎳作催化劑并且使用氫氣(Makkee et al.，1985)。該方法的缺點(diǎn)是被氫化的混合物的組分包括僅約25％的甘露醇并且剩余的75％是山梨醇。該生產(chǎn)工藝使甘露醇的生產(chǎn)成本相對(duì)高。
眾所周知甘露醇在植物和人類中均具有多種應(yīng)用。Jennings(1984)指出多元醇包括甘露醇在真菌體內(nèi)具有多種功能作為碳?xì)浠衔锏膬?chǔ)備庫，作為轉(zhuǎn)運(yùn)(translocatory)化合物，作為滲透調(diào)節(jié)化合物，如在輔酶調(diào)節(jié)，儲(chǔ)存或還原力(reducing power)方面，并且也已經(jīng)證實(shí)多元醇能夠抑制活性氧(ROS)?；钚匝跏菃畏肿硬⒅苯訁⑴c植物防御體系以抵抗病原體。越來越多的證據(jù)表明至少一些植物致病真菌應(yīng)用甘露醇抑制ROS介導(dǎo)的植物防御體系(Jennings et al 1998)。
甘露醇是有價(jià)值的營養(yǎng)甜味劑因?yàn)樗鼰o毒，在處于晶體狀態(tài)時(shí)不吸水并且對(duì)牙齒沒有腐蝕作用(Debord et al 1987；Dwivedi 1987)。甘露醇不能誘發(fā)高血糖癥，這使得糖尿病人能夠使用它(Griffin and Lynch，1972)。它被用作無糖型口香糖和藥物制劑中的甜味劑(sweet builder)(Soetaert，1991)。
甘露醇的其它用途是在澳大利亞將它用于治療雪卡毒素(ciguatra)中毒(Lewis，1992)。在緊急情況下，甘露醇用于治療頭部創(chuàng)傷以降低腦水腫和顱內(nèi)壓。在尿少或在食物中毒強(qiáng)迫排尿的情況下人類食用甘露醇可誘導(dǎo)排尿(促進(jìn)尿排泄)。高劑量的甘露醇可以起到使人放松的作用。
已經(jīng)知道有些微生物可產(chǎn)生甘露醇。在細(xì)菌中，異質(zhì)發(fā)酵的菌屬屬于明串珠菌菌屬(Leuconostoc)，乳球菌菌屬(Oenococcus)，和乳桿菌菌屬(Lactobacillus)似乎在生產(chǎn)甘露醇方面都是最有效的(Niklas et al 2002)。一些絲狀菌(霉)也產(chǎn)生甘露醇式的葡萄糖。較早期報(bào)道的甘露醇來自于真菌菌株如黑曲霉(Aspergillus niger)(Muraleedharan，1988)，與棉塵伴生的真菌黑霉(viz.Altemaria altemate)，多主枝孢霉(Cladosporium herbarum)，紫附球菌(Epicoccum purpurascens)和Fusariumpallidoroseum(Domelsmith et al 1998)，木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)(Songet al 2002)和頭孢霉屬(Cephalosporium sp.)(Bi et al 2001)。
事實(shí)證明將糖轉(zhuǎn)化成甘露醇的現(xiàn)有技術(shù)的生物技術(shù)方法沒有達(dá)到完全的滿意，因?yàn)樗鼈儾荒芴峁┳銐虻霓D(zhuǎn)化產(chǎn)量，因此工業(yè)生產(chǎn)方法仍然基于氫化反應(yīng)。因此，需要改進(jìn)將果糖和其他的底物生物轉(zhuǎn)化為甘露醇以提供工業(yè)上節(jié)約的和可接受的工藝。
我們開發(fā)的真菌菌種，NIO-FM1E#001顯示了相當(dāng)好的產(chǎn)量(約占總粗提物的70％)并且是生產(chǎn)甘露醇的一種相對(duì)簡便和節(jié)約的工藝。由于已有報(bào)道甘露醇在應(yīng)答環(huán)境刺激下可以積累(Kets et al 1996；Stoop and Pharr，1994)，在熱和鹽刺激條件下培養(yǎng)該真菌，NIO-FM1E#001可獲得最大產(chǎn)量的多元醇(polyol)。
因此，本專利描述了制備甘露醇的節(jié)約的工藝和生產(chǎn)甘露醇的新型的真菌源(NIO-FM1E#001)。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是分離一種國際保藏編號(hào)MTCC5109的與植物紅樹伴生的真菌新月彎孢菌(Culvularia lunata)。
本發(fā)明的另一個(gè)主要目的是分離一種快速生長的真菌。
本發(fā)明的仍然的另一個(gè)主要目的是開發(fā)了一種從與植物紅樹伴生的真菌新月彎孢菌(Culvularia lunata)中獲得高產(chǎn)量的純甘露醇的簡便和有效的方法。
本發(fā)明的仍然的另一個(gè)主要目的是通過色譜層析分離一種純化的粗甘露醇以獲得約占總的粗抽提物的75％的純甘露醇。
本發(fā)明的仍然的另一個(gè)目的是使用刺激條件分離高百分率產(chǎn)量的甘露醇。
本發(fā)明的仍然的另一個(gè)目的是確定甘露醇的新來源。
本發(fā)明的仍然的另一個(gè)目的是確定一種易分離和培養(yǎng)的新的真菌菌株。
本發(fā)明的仍然的另一個(gè)目的是所使用的發(fā)酵基質(zhì)能得到最大產(chǎn)量并且其成本低。
本發(fā)明的仍然的另一個(gè)目的是開發(fā)了一種分離甘露醇的方法，其中二級(jí)代謝產(chǎn)物易于從主化合物中分離出來。
本發(fā)明的仍然的另一個(gè)目的是開發(fā)了一種使用常溫和常壓并且在甘露醇的生產(chǎn)中不使用催化劑從真菌中分離純甘露醇的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種與植物紅樹伴生的國際保藏編號(hào)為MTCC5109的真菌新月彎孢菌(Culvularia lunata)和從與植物紅樹伴生的真菌(Culvularia lunata)中獲得高產(chǎn)量的純甘露醇的簡便并且有效的方法，所述的方法包括的步驟是將植物樹葉切成小碎片并將其置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)皿上培養(yǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)基的溫度保持在26-47℃之間的范圍內(nèi)并且鹽度保持在4-32ppt之間的范圍內(nèi)并間歇刺激約17-19天以獲得菌絲體膜，將該菌絲體膜超聲使細(xì)胞裂解，反復(fù)使用甲醇從被超聲的菌膜中抽提粗提取物，濃縮所得的粗抽提物，用極性升高的溶劑處理所得到的已經(jīng)濃縮了的粗抽提物，在處理后得到含有粗甘露醇的白色粉末殘留物的水溶液組分，通過色譜層析提純所得到的粗甘露醇以獲得占總粗提取物約75％的純甘露醇。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及一種與植物紅樹伴生的國際保藏編號(hào)為MTCC5109的真菌新月彎孢菌(Culvularia lunata)和從與植物紅樹伴生的真菌Culvularia lunata中獲得高產(chǎn)量純甘露醇的簡便并且有效的方法，所述的方法包括的步驟是將植物樹葉切成小碎片并將其置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)皿上培養(yǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)基的溫度保持在26-47℃之間的范圍內(nèi)并且鹽度保持在4-32ppt之間的范圍內(nèi)并間歇刺激約17-19天以獲得菌絲體膜，將該菌絲體膜超聲使細(xì)胞裂解，反復(fù)使用甲醇從被超聲的菌膜中抽提粗提物，濃縮所得的粗抽提物，用極性升高的溶劑處理所得到的已經(jīng)濃縮了的粗抽提物，在處理后獲得含有粗甘露醇白色粉狀的殘留物的水溶液組分，通過色譜層析提純所得到的粗甘露醇以獲得占總粗提取物約75％的純甘露醇。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中與紅樹伴生的真菌是國際保藏編號(hào)為MTCC5109的新月彎孢菌(Culvularia lunata)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中在權(quán)利要求1中所述的是真菌，其中紅樹植物是Acanthus illicifolius。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中真菌是快速生長的真菌。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中在權(quán)利要求1中所述的真菌，其中的真菌的顏色是褐色至黑褐色，背面是黑色的。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中在權(quán)利要求1中所述的真菌，其中的真菌具有帶有三個(gè)或多個(gè)橫隔膜的淡褐色的孢子并在合軸延伸的彎曲狀的分生孢子柄內(nèi)通過孔(孢子孔)在頂端形成。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中在權(quán)利要求1中所述的真菌，其中的真菌顯示圓柱或略微彎曲形狀的孢子，其中一個(gè)中心細(xì)胞是較大和較深色的。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中從與植物紅樹伴生的國際保藏編號(hào)為MTCC5109的真菌Culvularia lunata中獲得高產(chǎn)量的純甘露醇的簡便并且有效的方法，所述的方法包括的步驟有·采集植物紅樹的樹葉，·在無菌的海水中將樹葉漂洗干凈并將它們保存在無菌的潮濕的培養(yǎng)室中約兩個(gè)星期，·將樹葉切成小碎片并將其置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)皿上培養(yǎng)48小時(shí)，·在無菌的條件下將單獨(dú)的菌落轉(zhuǎn)移到無菌的新的PDA培養(yǎng)皿內(nèi)以獲得純菌種，·將被分離的真菌菌種在PDA斜面上培養(yǎng)約7天以獲得菌絲體，·將菌絲體轉(zhuǎn)移到具有海水和蒸餾水的新鮮的PDB內(nèi)，并用淀粉和糖作為碳源，·在26-32℃之間的溫度范圍內(nèi)將菌種培養(yǎng)約3-6天以獲得接種體，·將具有接種體并含有海水和蒸餾水的PDB進(jìn)行培養(yǎng)，·將培養(yǎng)物溫度保持在26-47℃之間并且鹽度保持在4-32ppt之間并間歇給予刺激條件培養(yǎng)約17-19天以獲得菌絲體薄膜，·將菌絲體薄膜超聲使細(xì)胞裂解，·反復(fù)使用甲醇從被超聲的菌絲體膜中抽提粗提取物，·濃縮所得到的粗抽提物，·用極性升高的溶劑處理所得到的已濃縮過的粗抽提物，·處理后得到含有粗甘露醇的白色粉末殘留物的水溶液組分，·通過色譜層析純化所得到的粗甘露醇以獲得純甘露醇，含量約為總的粗抽提物的75％。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中在權(quán)利要求7中所述的方法，其中的植物是Acanthus illicifolius。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中的淀粉的濃度范圍是3-5g/l之間。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中的葡萄糖的濃度范圍是18-22g/l之間。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中海水和蒸餾水的比例范圍是1∶5至5∶1之間，優(yōu)選1∶1。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中的刺激條件是溫度范圍為40-45℃之間。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中的刺激條件是鹽度范圍在15-17ppt之間。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中的刺激條件導(dǎo)致產(chǎn)生高百分比產(chǎn)量的甘露醇。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中樹葉是活的幼葉。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中使用真空蒸發(fā)器在28-32℃之間的溫度范圍內(nèi)濃縮粗提取物。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中極性升高的溶劑是石油醚，氯仿，和乙酸乙酯。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中的色譜層析是在G-10載體上進(jìn)行。
本發(fā)明涉及一種與紅樹伴生的真菌NIO-FM1#001，它是生產(chǎn)甘露醇的一種新型來源并且本發(fā)明涉及生產(chǎn)甘露醇的一種簡便和節(jié)約的提取和純化方法。將真菌菌種從Acanthus illicifolius的活的幼葉中分離出來。被分離的菌種在海水蒸餾水(1∶1)中并在含有馬鈴薯淀粉和葡萄糖作為碳源的馬鈴薯葡萄糖肉湯中生長。為了得到最佳的生長，發(fā)酵介質(zhì)經(jīng)過熱和鹽應(yīng)激條件的處理。通過最少的提取和純化步驟從菌絲體薄膜中獲得多元醇。將糖乙?；⑶移浣Y(jié)構(gòu)通過使用光譜技術(shù)，使用質(zhì)譜，高磁場NMR光譜，DEPT和COSY試驗(yàn)得到確定。
與紅樹伴生的真菌，Culvularia lunata，NIO-FM1#001，作為生產(chǎn)甘露醇的一種新來源并且是提取和純化甘露醇的一種簡便的和節(jié)約的方法。
真菌，NIO-FM1#001與紅樹Acanthus illicifolius伴生，并使用下列的步驟分離。
a.將新鮮的幼葉收集在無菌的聚乙烯袋內(nèi)。
b.在無菌的海水中將樹葉漂洗干凈并將其置于潮濕的無菌培養(yǎng)室中兩個(gè)星期。
c.然后在無菌解剖刀的幫助下將樹葉切碎并將碎片置于無菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)皿上。
d.在48小時(shí)之后在無菌的條件下將單獨(dú)的菌落挑出并將其轉(zhuǎn)移到無菌的PDA培養(yǎng)皿上以獲得純菌種。
真菌的接種體通過下述步驟制備。
a.將純的已被分離出來的真菌菌種在PDA斜面上培養(yǎng)7天。
b.將支持菌絲生長的瓊脂填充物(plug)無菌切割并將其轉(zhuǎn)移到含有25ml馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)的100ml厄倫美氏錐形瓶內(nèi)(Erlenmeyer flasks)。
c.培養(yǎng)介質(zhì)使用馬鈴薯淀粉(4g/l)和葡萄糖(20g/l)作為碳源。
d.發(fā)酵肉湯在海水∶蒸餾水(1∶1)中制備。
e.在旋轉(zhuǎn)振蕩器上在28-30℃之間將錐形瓶培養(yǎng)4至5天。
所用的接種液在發(fā)酵介質(zhì)的生長包括下列步驟。
a.將接種液在無菌條件下倒入5升的厄倫美氏錐形瓶內(nèi)，該錐形瓶內(nèi)含有由1∶1海水∶蒸餾水制備的1升的PDB。
b.在接種期間發(fā)酵介質(zhì)的溫度是在28-45℃之間。
c.發(fā)酵介質(zhì)的培養(yǎng)溫度是在28-45℃之間。
d.發(fā)酵介質(zhì)的鹽度是在5-30ppt之間。
e.發(fā)酵介質(zhì)在旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)18天。
f.通過使發(fā)酵介質(zhì)的接種溫度保持在40-45℃之間給予溫度刺激。
g.如權(quán)利要求1中所述的另一個(gè)優(yōu)選的權(quán)利要求中，發(fā)酵介質(zhì)的培養(yǎng)溫度在28-30℃之間。
h.如權(quán)利要求1中所述的仍然的另一個(gè)優(yōu)選的權(quán)利要求中，鹽度刺激是通過使發(fā)酵介質(zhì)的鹽度保持在15-17ppt之間實(shí)現(xiàn)的。
如權(quán)利要求1中所述的方法，抽提包括如下的步驟。
·將干的菌絲體薄膜超聲并反復(fù)使用甲醇抽提。
·在30℃的溫度下通過旋轉(zhuǎn)式真空蒸發(fā)器濃縮用有機(jī)溶液抽提出來的粗提取物。
·用石油醚，氯仿和乙酸乙酯處理所得到的粗抽提物以分離出石油醚組分，氯仿組分和乙酸乙酯組分。
·殘留白色粉末的水溶液組分含有粗的多元醇(約占總的粗提取物的70％)。
粗的水溶液提取物的NMR光譜證實(shí)多元醇為甘露醇。甘露醇的乙酰化使多元醇為六乙?；?hexacetate)的多元醇，它被進(jìn)一步用于結(jié)構(gòu)測定。
將粗甘露醇在G-10載體上進(jìn)行色譜層析用于純化。
如權(quán)利要求1中所述的一個(gè)優(yōu)選的權(quán)利要求中，所用的溶液體系是甲醇∶水(95∶5)。
因此，本發(fā)明描述了一種與紅樹伴生的真菌Culvularia lunata，NIO-FM1#001，它是制備甘露醇的一種新來源并且本發(fā)明描述了提取和純化甘露醇的一種簡便和節(jié)約的工藝。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備甘露醇的真菌與紅樹，Acanthus illicifolius的幼葉伴生，并由下列步驟分離。
-將新鮮的幼葉收集在無菌的聚乙烯袋內(nèi)。
-在無菌的海水中將樹葉漂洗干凈并將其置于潮濕的無菌培養(yǎng)室中兩個(gè)星期。
-使用無菌解剖刀將樹葉切碎并在無菌的條件下將碎葉置于PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)皿上(HiMedia Laboratories Ltd)。
-在48小時(shí)之后將菌落挑出并再將其置于PDA培養(yǎng)皿上直到獲得菌種的純分離物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，真菌菌種的接種體通過下述步驟制備。
-先將菌種在PDA斜面上培養(yǎng)7天。
-將支持菌絲生長的瓊脂填充物無菌切割并將其轉(zhuǎn)移到含有25ml PDB(馬鈴薯葡萄糖肉湯)的100ml厄倫美氏錐形瓶內(nèi)。
-將培養(yǎng)介質(zhì)在海水∶蒸餾水(1∶1)中制備。
-馬鈴薯淀粉(4g/l)和葡萄糖(20g/l)被用用作碳源。
-在旋轉(zhuǎn)振蕩器上在28-30℃之間將錐形瓶培養(yǎng)4至5天。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，上述的接種體用于接種到5升的厄倫美氏錐形瓶內(nèi)，該錐形瓶內(nèi)含有由1∶1海水∶蒸餾水制備的1升的馬鈴薯葡萄糖肉湯。
-在接種期間發(fā)酵介質(zhì)的溫度是在28-45℃之間。
-接種之后，將發(fā)酵介質(zhì)置于旋轉(zhuǎn)振蕩器上在28-45℃之間培養(yǎng)18天。
-所使用的介質(zhì)的鹽度是在5-30ppt之間。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過使接種期間發(fā)酵介質(zhì)的溫度保持在40-45℃之間給予溫度刺激。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵介質(zhì)的培養(yǎng)溫度保持在28-30℃之間。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，鹽刺激是通過使發(fā)酵介質(zhì)的鹽度保持在15-17ppt之間提供給培養(yǎng)物。
在仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過過濾回收真菌菌絲體，在冷凍干燥機(jī)中干燥并且在超聲使細(xì)胞裂解后用甲醇反復(fù)抽提。用有機(jī)溶劑抽提的粗提取物在30℃的溫度下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。用石油醚處理所得到的粗提取物以除去石油醚組分，用氯仿處理以除去氯仿組分并最后用乙酸乙酯處理以除去乙酸乙酯組分。最后留在錐形瓶內(nèi)的水溶液組分中含有粗的白色粉末，它構(gòu)成了大約70％的總的粗提取物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述白色粉末的NMR顯示它含有多元醇，并且將其NMR光譜數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)物比較顯示該多元醇是甘露醇。用嘧啶和乙酸酐使甘露醇乙?；玫搅阴；?hexacetate)甘露醇，其光譜值進(jìn)一步確定了甘露醇的存在。
在本發(fā)明的仍然的另一個(gè)實(shí)施方案中，將粗甘露醇在G-10載體上進(jìn)行色譜層析用于提純。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的流動(dòng)相包括甲醇∶水(95∶5)以得到純甘露醇。
附圖的簡要描述

圖1表示的是提取和純化甘露醇的流程圖。
借助下面實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述并且不能解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1紅樹植物，Acanthus illicifolius的樹葉來自于印度的果阿海岸的新瓜利母。該真菌菌種棲息在Acanthus illicifolius上，但對(duì)宿主不會(huì)造成明顯的傷害。該真菌是從健康的幼葉中分離出來的，其中所述的健康的幼葉上看不出真菌感染的癥狀。
將Acanthus的新鮮的幼葉收集之后，將它們裝入無菌聚乙烯塑料袋內(nèi)轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室。將樹葉用無菌的經(jīng)過濾的海水漂洗以去除所粘的雜質(zhì)顆粒和沉砂物質(zhì)。接著將樹葉在無菌培養(yǎng)室中放置兩個(gè)星期。兩星期末，用無菌解剖刀將樹葉切碎并將碎片置于PDA培養(yǎng)皿上。將單獨(dú)的菌落在無菌條件下挑出并將其反復(fù)轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)皿上以得到純菌種。
實(shí)施例-2被分離的菌種被鑒定為Curvularia lunata，NIO-FM1E#001。NIO-FM1E#001菌落生長快，顏色為褐色到黑褐色，背面為黑色。孢子是淡褐色并具有三個(gè)或更多個(gè)的橫隔膜并且在合軸延伸的彎曲的孢子內(nèi)通過孔(孢子孔)在頂端形成。孢子是圓柱或略微彎曲的，其中一個(gè)中心細(xì)胞是較大和較深色的。
被純化的菌種在PDA斜面上生長7天。將支持菌絲體生長的瓊脂填充物切割并將其在無菌的條件下轉(zhuǎn)移到含有25ml馬鈴薯葡萄糖肉湯(HiMedia Laboratories Ltd)的100ml厄倫美氏錐形瓶內(nèi)，其中馬鈴薯葡萄糖肉湯在海水∶蒸餾水(1∶1)中制備。肉湯中的碳源是馬鈴薯淀粉4g/l和葡萄糖20g/l。錐形瓶在上在振蕩條件下在28-30℃之間培養(yǎng)4-5天。從上述錐形瓶中得到的次級(jí)培養(yǎng)物(subculture)在無菌條件下被轉(zhuǎn)移到含有1升上述培養(yǎng)介質(zhì)的5升培養(yǎng)瓶中。接種是在使發(fā)酵介質(zhì)的溫度保持在40-45℃之間進(jìn)行的。接種之后，培養(yǎng)瓶在振蕩條件下在28-30℃之間培養(yǎng)18天。
實(shí)施例3在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，通過過濾將菌絲體回收并在冷凍干燥器中進(jìn)行干燥以確定生物量。用甲醇抽提干燥的菌膜(餅)幾次并反復(fù)超聲菌餅以使細(xì)胞裂解。在真空蒸發(fā)的條件下將所獲得的濾液濃縮以使它于有機(jī)溶劑分離。這樣就獲得了樣品的粗提取物。將得到的粗提取物連續(xù)的用極性升高的溶劑如石油醚，氯仿和乙酸乙酯處理以分別分離出石油醚組分，氯仿組分和乙酸乙酯組分。最后的水溶液組分含有白色粉末的糖醇，它構(gòu)成了約70％總的粗提取物。
實(shí)施例4使用甲醇∶水(95∶5％)作為洗脫劑在G-10載體上對(duì)白色粗粉末進(jìn)行色譜層析，使之與任何可能的鹽雜質(zhì)分離。通過將其NMR數(shù)據(jù)與在Aldrich Catalogue，Vol.1，289c報(bào)道的光譜的比較對(duì)得到的純甘露醇進(jìn)行鑒定。
實(shí)施例5將上述甘露醇的亞組分進(jìn)行乙?；玫蕉嘣嫉囊阴；苌锊⑶彝ㄟ^各種光譜方法進(jìn)一步鑒定其結(jié)構(gòu)。
為了乙?；瑢⒏事洞?30mg)溶解在嘧啶(2ml)中，向其中加入3ml乙酸乙酐的嘧啶溶液并過夜。將混合物置于氯仿中并用稀釋的HCl洗滌以除去嘧啶。接著用蒸餾水洗滌。蒸發(fā)掉氯仿并且將殘留物在硅膠上進(jìn)行色譜層析得到35mg的六乙?；事洞迹浣Y(jié)構(gòu)通過光譜方法以及與報(bào)道過的光譜數(shù)據(jù)(Fairbanks and Sinary，1995)的比較得到確定。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.這是甘露醇的一種新來源。
2.它是一種常見的真菌(發(fā)現(xiàn)依附在Acanthus illicifolius的紅樹葉上，來自于果阿海岸)。
3.易于分離和培養(yǎng)。
4.為獲得最大產(chǎn)量而使用的發(fā)酵介質(zhì)的成本低廉。
5.發(fā)酵條件可行并在實(shí)驗(yàn)室中易于進(jìn)行。
6.二級(jí)代謝產(chǎn)物易于從主化合物中分離出來。
7.使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)保存并在需要時(shí)活化。
8.與現(xiàn)有的甘露醇的商業(yè)制備比較本發(fā)明的從真菌菌膜中提取甘露醇和純化甘露醇的工藝包括簡便的技術(shù)。
9.我們使用常溫和常壓并且在制備甘露醇中不用催化劑。目前商業(yè)上，甘露醇仍然使用氫氣在高溫和高壓以及阮尼鎳做催化劑的條件下通過催化氫化50∶50的果糖∶葡萄糖混合物制備。
10.我們制備了高產(chǎn)量的甘露醇(約70％的粗提取物)且沒有其他的多元醇雜質(zhì)。目前商業(yè)上，果糖糖漿或轉(zhuǎn)化糖的氫化得到另外一種糖醇，山梨醇的共產(chǎn)物，并且甘露醇的產(chǎn)量僅為25％。
11.在本發(fā)明中，使用G-10作為載體對(duì)粗甘露醇進(jìn)行色譜層析，使用甲醇∶水(95∶5)作為洗脫劑用于最終的純化。另一個(gè)方面，目前的甘露醇的商業(yè)制備中的純化步驟是繁瑣的。
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權(quán)利要求
1.一種與植物紅樹伴生的國際保藏編號(hào)為MTCC 5109的真菌新月彎孢菌(Culvularia lunata)。
2.如權(quán)利要求1中所述的真菌，其中所述的紅樹植物是Acanthus illicifolius。
3.如權(quán)利要求1中所述的真菌，其中所述的真菌是快速生長的真菌。
4.如權(quán)利要求1中所述的真菌，其中所述的真菌的顏色是褐色至黑褐色，背面為黑色。
5.如權(quán)利要求1中所述的真菌，其中所述的真菌具有帶有三個(gè)或多個(gè)橫隔膜的淡褐色的孢子并在合軸延伸的彎曲狀的分生孢子柄內(nèi)通過孔(孢子孔)在頂端形成。
6.如權(quán)利要求1中所述的真菌，其中所述的真菌顯示圓柱或略微彎曲形狀的孢子，其中一個(gè)中心細(xì)胞是較大和較深色的。
7.一種從與植物紅樹伴生的國際保藏編號(hào)為MTCC5109的真菌Culvularia lunata中獲得高產(chǎn)量的純甘露醇的簡便并且有效的方法，所述的方法包括的步驟有a.采集植物紅樹的樹葉，b.在無菌的海水中將樹葉漂洗并將它們保存在潮濕的無菌培養(yǎng)室中約兩個(gè)星期，c.將樹葉切成小碎片并將其置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)皿上培養(yǎng)約48小時(shí)，d.在無菌條件下將單獨(dú)的菌落轉(zhuǎn)移到無菌的新的PDA培養(yǎng)皿內(nèi)以獲得純菌種，e.將被分離的真菌菌種在PDA斜面上培養(yǎng)約7天以獲得菌絲體，f.將菌絲體轉(zhuǎn)移到具有海水和蒸餾水的新鮮的PDB內(nèi)，并用淀粉和糖作為碳源，g.在26-32℃之間的溫度范圍內(nèi)將菌種培養(yǎng)約3-6天以獲得接種體，h.將具有接種體并含有海水和蒸餾水的PDB進(jìn)行培養(yǎng)，i.將培養(yǎng)物保持溫度在26-47℃范圍之間并且鹽度保持在4-32ppt范圍之間并間歇給予刺激條件培養(yǎng)約17-19天以獲得菌絲體薄膜，j.將所獲得的菌絲體薄膜超聲使細(xì)胞裂解，k.反復(fù)使用甲醇從被超聲的菌絲體膜中抽提粗抽提物，l.濃縮所得到的粗抽提物，m.用極性升高的溶劑處理所得到的已濃縮過的粗抽提物，n.處理后得到含有粗甘露醇的白色粉末殘留物的水溶液組分，o.通過色譜層析純化所得到的粗甘露醇以獲得純甘露醇，含量約為總的粗抽提物的75％。
8.如權(quán)利要求7中所述的方法，其中所述的植物是Acanthus illicifolius。
9.如權(quán)利要求7中所述的方法，其中所述的淀粉的濃度范圍是3-5g/l之間。
10.如權(quán)利要求7中所述的方法，其中所述的葡萄糖的濃度范圍是18-22g/l之間。
11.如權(quán)利要求7中所述的方法，其中所述的海水和蒸餾水的比例范圍是1∶5至5∶1之間，優(yōu)選1∶1。
12.如權(quán)利要求7中所述的方法，其中所述的刺激條件是溫度范圍為40-45℃之間。
13.如權(quán)利要求7中所述的方法，其中所述的刺激條件是鹽度范圍在15-17ppt之間。
14.如權(quán)利要求7中所述的方法，其中所述的刺激條件導(dǎo)致產(chǎn)生高百分比產(chǎn)量的甘露醇。
15.如權(quán)利要求7中所述的方法，其中所述的樹葉是活的幼葉。
16.如權(quán)利要求7中所述的方法，其中使用真空蒸發(fā)器在28-32℃之間的溫度范圍內(nèi)濃縮粗提取物。
17.如權(quán)利要求7中所述的方法，其中所述的極性升高的溶劑是石油醚，氯仿，和乙酸乙酯。
18.如權(quán)利要求7中所述的方法，其中所述的色譜層析是在G-10載體上進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與植物紅樹伴生的國際保藏編號(hào)為MTCC5109的真菌新月彎孢菌(Culvularia lunata)，和一種從與植物紅樹伴生的真菌新月彎孢菌(Culvularia lunata)中獲得高產(chǎn)量純甘露醇的簡便并且有效的方法，所述的方法包括的步驟是將所述植物樹葉切成小碎片并將其置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)皿上培養(yǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)基的溫度保持在26－47℃的范圍之間并且鹽度保持在4－32ppt的范圍內(nèi)并在間歇刺激條件下培養(yǎng)17－19天以獲得菌絲體膜，將該菌絲體膜超聲使細(xì)胞裂解，反復(fù)使用甲醇從被超聲的菌膜中抽提粗抽提物，濃縮所得的粗抽提物，用極性升高的溶劑處理所得到的已經(jīng)濃縮了的粗抽提物，在處理后獲得含有粗甘露醇的白色粉狀殘留物的水溶液組分，通過色譜層析提純所得到的粗甘露醇以獲得約占總粗抽提物75％的純甘露醇。
文檔編號(hào)C12P7/18GK1788076SQ200380110351
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2003年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月19日
發(fā)明者普拉布哈·德維, 潺卓肯特·喬萬德·奈克, 索里瑪比·瓦希杜拉, 里塞特·德'蘇扎, 伊利·羅德里格斯, 阿沙·派克蒂 申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會(huì)