專利名稱：抗乳鐵蛋白單鏈抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗乳鐵蛋白單鏈抗體及其制備方法和用途，是一種針對乳鐵蛋白的特異性單鏈抗體，可用于檢測組織或體液的蛋白表達量。屬于基因工程產(chǎn)品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，干眼是最常見的眼表疾病，是指由于淚液的質(zhì)或量及動力學(xué)的異常，而致淚膜不穩(wěn)定和(或)眼表面損害，并伴有眼部不適癥狀的一類疾病的總稱。干眼的病因復(fù)雜，癥狀多樣，嚴重影響著人們的生活質(zhì)量。一般來說，干眼主要依據(jù)癥狀、淚膜不穩(wěn)定、眼表面損害及淚液的滲透壓增加等進行診斷。診斷方法很多，有Schirmer I及II試驗(ScT I，II)，淚膜破裂時間(Tear Break Up Time，TBUT)，虎紅染色(Rose Bengal，RB)，淚液滲透壓測定，淚液厥樣變(羊齒狀物)試驗(Tear Fernin gTest，TFT)，淚液乳鐵蛋白測定，結(jié)膜印跡細胞檢查，角膜地形圖，血清學(xué)檢查等。但干眼的診斷標準尚有爭議，各個國家和地區(qū)的診斷標準不一，因此尋找統(tǒng)一、簡單、準確的診斷標準是干眼臨床面臨的重要課題。
干眼與淚膜關(guān)系密切，許多關(guān)于干眼診斷的研究從淚液的成分著手。其中乳鐵蛋白(Lactoferrin，LF)是淚液中最重要的抗菌蛋白質(zhì)，具有多種生物學(xué)活性，如抑菌和殺菌作用，調(diào)節(jié)免疫，抗氧化作用，抗病毒活性，調(diào)節(jié)補體活性等。LF主要來源于淚腺的腺泡上皮細胞，其含量在很大程度上可以反映淚腺的分泌功能。國內(nèi)外有大量的文獻證實LF含量降低是診斷干眼最敏感、特異的實驗室指標。但由于各研究中采用的淚液采集方法、刺激方式及強度、檢測方法各不相同，所得診斷截斷值和診斷價值不一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題，即本發(fā)明的目的，是為了提供一種抗乳鐵蛋白單鏈抗體及其制備方法和用途，是以乳鐵蛋白LF為研究靶象，從制備抗LF的單鏈抗體開始，通過檢測乳鐵蛋白的表達量協(xié)助干眼的診斷。
本發(fā)明的技術(shù)問題可以通過如下措施解決抗乳鐵蛋白單鏈抗體，其特征是單鏈抗體基因由下列726個核苷酸(bp)組成
ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTATGCCTTATGGTGATACTACAGCTTACGTAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAATGGGTGGCTTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGGCAACTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTCAGGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGCTAGGGTGTCTCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG所述的單鏈抗體基因由下列242個氨基酸(aa)殘基組成MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIMPYGDTTAYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNGWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRGNSEHZQLFKLVSAETRESPZAPDLQASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQARVSPTTFGQGTKVEIKR所述的單鏈抗體基因含有重鏈可變區(qū)基因(VH)，該基因是由下列354個核苷酸(bp)組成ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTATGCCTTATGGTGATACTACAGCTTACGTAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAATGGGTGGCTTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC所述重鏈可變區(qū)基因(VH)的鏈氨基酸序列由下列118個氨基酸(aa)殘基組成MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIMPYGDTTAYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNGWLFDYWGQGTLVTVSS
所述的單鏈抗體基因含有輕鏈可變區(qū)基因(VL)，該基因是由下列327個核苷酸(bp)組成ACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGGCAACTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTCAGGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGCTAGGGTGTCTCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG輕鏈可變區(qū)基因(VL)輕鏈氨基酸序列(109個氨基酸殘基)TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYQASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQARVSPTTFGQGTKVEIKR如前所述的抗鐵乳蛋白單鏈抗體的制備方法，其特征是1)將LF抗原(Sigma)包被于96孔聚苯乙烯酶標板，4℃過夜；2)棄包被液，用PBS洗滌三次，加入2％MPBS(脫脂奶粉PBS)至孔緣，室溫放置2小時以封閉非特異性結(jié)合位點；3)棄2％MPBS，用PBS洗滌三次；4)加入噬菌體抗體庫(以2％MPBS配制)，室溫孵育2小時；5)棄上清，以0.1％吐溫-20的PBS洗滌10或20次，拍干酶標板，用胰蛋白酶洗脫吸附的噬菌體；6)將洗脫的噬菌體與OD600為0.4的大腸桿菌TG1 37℃靜置水浴半小時；7)稀釋成不同濃度梯度鋪在含100μg/mL氨芐青霉素和1％葡萄糖的TYE平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜；8)次日每塊平板加2mL 2×YT培養(yǎng)液，用玻璃涂棒刮下菌落，接種至含100μg/mL氨芐青霉素和1％葡萄糖的2×YT培養(yǎng)液中，37℃振蕩(250rpm)培養(yǎng)至OD600為0.4時，加入輔助噬菌體M13KO7超感染，37℃靜置水浴半小時；9)離心棄上清，用含100μg/mL氨芐青霉素、50μg/mL卡那霉素和0.1％葡萄糖的2×TY培養(yǎng)液重懸沉淀，30℃過夜振蕩培養(yǎng)；10)離心收集上清，加入PEG/NaCl，混勻后冰浴1小時；
11)離心棄PEG/NaCl，用2mL PBS重懸沉淀，再高速離心收集上清，此即第一輪富集后的噬菌體抗體；12)重復(fù)“吸附-洗滌-洗脫-富集”的篩選過程3-4輪；13)在最后一輪篩選過程中，挑取數(shù)個單菌落培養(yǎng)，同上述用輔助噬菌體M13KO7超感染制備噬菌體抗體；14)用LF包被，以間接法ELISA檢測篩選的噬菌體抗體；挑選與抗原結(jié)合活性最高者感染大腸桿菌HB2151，37℃靜置水浴半小時后稀釋不同濃度梯度鋪在含100μg/mL氨芐青霉素和1％葡萄糖的TYE平板上，37℃倒置過夜培養(yǎng)；15)次日挑取數(shù)個單菌落接種到含有100μg/mL氨芐青霉素和1％葡萄糖的2×TY培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，再按1∶100分別轉(zhuǎn)種到含100μg/mL氨芐青霉素和0.1％葡萄糖的2×TY培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.9，加入IPTG誘導(dǎo)，30℃振蕩過夜培養(yǎng)，離心收取培養(yǎng)上清，即為含抗乳鐵蛋白單鏈抗體的培養(yǎng)上清；在誘導(dǎo)表達時加入不同試劑以提高其表達產(chǎn)量。
16)以LF包被酶標板，用HRP標記的蛋白質(zhì)L采用間接法ELISA檢測培養(yǎng)上清中的抗LF單鏈抗體，選擇顯色最深的菌株進行大量表達；培養(yǎng)上清先用50％飽和度硫酸銨沉淀，離心后重懸沉淀，進一步用His Band Purificaton Kit(Novagin)鎳離子金屬鰲合層析法(IMAC)純化。
免疫活性鑒定證明該單鏈抗體能夠與LF特異性結(jié)合，是目前已知的唯一能與LF結(jié)合的小分子基因工程抗體。將用于制備試劑盒檢測LF的表達量。
如前所述的抗鐵乳蛋白單鏈抗體的用途，其特征是可以應(yīng)用在制備診斷眼部疾病或判斷藥物療效等方面的試劑盒中，包括聯(lián)合應(yīng)用其他抗乳鐵蛋白抗體制備ELISA試劑盒或膠體金標記試劑盒檢測體液中的乳鐵蛋白含量。
本發(fā)明具有如下突出效果(1)本發(fā)明所述的抗體制造方法簡單、快速從淋巴細胞中提取mRNA到構(gòu)建抗體庫，繼而篩選出目的噬菌體抗體，整個過程一般只需要幾周的時間。
(2)本發(fā)明不需要實驗動物或大量的細胞培養(yǎng)就可生產(chǎn)抗體。
(3)本發(fā)明可以繞過免疫制備抗體由于人淋巴細胞庫中天然存在針對各種抗原的特異性細胞，可以直接利用人外周血淋巴細胞構(gòu)建“天然抗體庫”，篩選出目的噬菌體抗體，使制備全人抗體成為可能，尤其是制備自身抗原和其他弱免疫原性抗原的抗體具有獨到的優(yōu)勢。
(4)本發(fā)明可以對抗體基因進行改造，在體外通過基因突變、鏈更替等技術(shù)，可進一步提高抗體的親和力和穩(wěn)定性。
(5)本發(fā)明可大規(guī)模生產(chǎn)，成本低抗體片段可在大腸桿菌中進行分泌型表達，易于分離純化出有生物學(xué)活性的抗體分子，通過發(fā)酵大量生產(chǎn)。
(6)本發(fā)明特別適用在制備診斷眼部疾病或判斷藥物療效等方面的試劑盒中。
具體實施例方式
實施例1、抗LF噬菌體抗體的篩選用PBS稀釋LF至80ug/ml，包被于聚苯乙烯96孔酶標板，4℃過夜。次日棄去包被液，用PBS洗滌三次，加2％MPBS封閉液，于室溫溫育2h。棄去封閉液，用PBS洗滌三次，加入以2％MPBS稀釋的噬菌體抗體庫，室溫靜置1h，再置脫色搖床1h。棄上清，用0.1％吐溫-20的PBS洗滌(第一輪10次，以后每輪20次)，加入胰蛋白酶-PBS洗脫吸附的噬菌體。加入處于對數(shù)生長期的TG1細菌，37℃靜置水浴半小時。取不同濃度鋪在含100μg/mL氨芐青霉素和1％葡萄糖的TYE平板上，37℃過夜培養(yǎng)。次日用2×TY培養(yǎng)液洗脫平板上的菌落，接種至含100μg/mL氨芐青霉素的2×TY培養(yǎng)液，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4時，加入輔助噬菌體M13KO7超感染，37℃靜置水浴半小時。離心棄上清，用含100μg/mL氨芐青霉素、50μg/mL卡那霉素和0.1％葡萄糖的2×TY培養(yǎng)液重懸沉淀，30℃過夜振蕩培養(yǎng)。離心取上清，用PEG/NaCl沉淀，以PBS重懸沉淀即噬菌體抗體。重復(fù)3-4輪“吸附-洗滌-擴增-富集”過程。
2、檢測抗LF噬菌體抗體用PBS稀釋LF至80ug/ml，包被于聚苯乙烯96孔酶標板，4℃過夜。次日棄去包被液，用PBS洗滌三次，加2％MPBS封閉液，于室溫溫育2h。棄去封閉液，用PBS洗滌三次，加入收集的噬菌體抗體與等量的2％MPBS混合液，每孔100μl，室溫孵育1h。棄去樣品液，用含0.1％吐溫-20的PBS洗滌3次后，每孔加100μL的HRP標記的抗M13抗體，室溫孵育1h。用含0.1％吐溫-20的PBS洗滌3次，加100μL的TMB底物，顯色5-10min，加50μL的1M硫酸終止反應(yīng)，讀取OD450-OD630，確定適合進一步表達的噬菌體抗體。
3、單鏈抗體的制備挑選與抗原結(jié)合活性最高的噬菌體抗體，轉(zhuǎn)化對數(shù)生長期的HB2151細菌。在含100g/ml氨芐青霉素和1％葡萄糖的TYE平板上涂板，37℃過夜培養(yǎng)。從平板上挑選單菌落接種至含有100g/ml氨芐青霉素和1％葡萄糖的2×TY培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，再按1∶100分別轉(zhuǎn)種到含100μg/ml氨芐青霉素和0.1％葡萄糖的2×TY培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.9，加入0.1mMIPTG和0.2mM蔗糖(Sucrose)誘導(dǎo)，30℃振蕩過夜培養(yǎng)，離心收取培養(yǎng)上清即為含抗乳鐵蛋白單鏈抗體的培養(yǎng)上清?？扇苄詥捂溈贵w的檢測也以間接法ELISA，酶標抗體用HRP標記的蛋白質(zhì)L。選擇顯色最深的菌株進行大量表達。培養(yǎng)上清用50％飽和度硫酸銨沉淀，離心后沉淀用PBS重懸，進一步用His Band Purificaton Kit(Novagin)鎳離子金屬鰲合層析法(IMAC)純化，最后獲得可溶性抗LF單鏈抗體。
4、抗LF單鏈抗體的鑒定純化前后的抗LF單鏈抗體以SDS-PAGE鑒定其純度，分子量約為31KD。以80ug/ml抗原溶液包被酶標板，酶標抗體用HRP標記的蛋白質(zhì)L，以間接法ELISA鑒定抗體結(jié)合活性。結(jié)果檢測到純化前上清中約4倍稀釋的單鏈抗體，說明表達的抗體具有與抗原結(jié)合的活性。
5、抗LF單鏈抗體基因的序列測定將陽性克隆菌株按1∶100接種至含有100μg/ml氨芐青霉素和1％葡萄糖的2×TY培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。吸1ml菌液至Ep管，12,000g，4℃，離心1min。棄上清，沉淀用100ul溶液I重懸，劇烈振蕩。加入200ul溶液II，快速顛倒離心管5次，放于冰上2min。加入150ul溶液III，倒置管后振蕩10s，使溶液分散均勻，之后置于冰上3-5min。，轉(zhuǎn)移上清至另一管，加入等量酚氯仿，振蕩混勻。12,000g，4℃，離心2min。轉(zhuǎn)移上清至新管，加2倍體積的無水乙醇室溫下沉淀雙鏈DNA，振蕩混勻，室溫放置2min。12,000g，4℃，離心5min。管倒置在濾紙上流盡液體，再吸去所有管壁液體。用1ml70乙醇洗滌DNA沉淀，顛倒管數(shù)次。12,000g，4℃，離心2min。留沉淀，除去管壁液滴，試管開口置于烤箱干燥。用50ul雙蒸水溶解沉淀核酸，溫和振蕩數(shù)秒。提取的質(zhì)粒，委托上海博亞生物技術(shù)有限公司進行DNA序列測定。
如前所述的抗鐵乳蛋白單鏈抗體的制備方法用到的溶液的配方如下所述1)制備2×TY采用16g蛋白胨、10g酵母粉、5g氯化鈉，加蒸餾水定容至1升；2)制備TYE用采15g瓊脂粉、8g氯化鈉、10g蛋白胨、5g酵母粉，加蒸餾水定容至1升；
3)制備PBS采用5.84g氯化鈉、4.72g磷酸氫二餉、2.6g磷酸二氫鈉，加蒸餾水定容至1升；4)制備TMB采用四甲基聯(lián)苯胺，以二甲基亞砜DMSO溶解配制；5)制各溶液I采用50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris-Cl(PH8.0)、10mmol/L EDTA(PH8.0)；6)制備溶液II采用0.2mmol/L氫氧化鈉、1％十二烷基磺酸鈉；7)制備溶液III采用5mol/L乙酸鉀60ml、冰乙酸11.5ml、雙蒸水28.5ml；8)制備酚、氯仿將酚、氯等體積混合后用0.1mol/LTris-Cl(PH7.6)抽提幾次，置棕色瓶中。上面覆蓋等體積的0.1mo1/LTris-Cl(PH7.6)液層。
本實施例中，全系DNA序列由如下87O個堿基構(gòu)成SfiI酶切位點 ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTATGCCTlATGGTGATACTACAGCTTACGTAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGlATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAATGGGTGGCTTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGlATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCAGGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGCTAGGGTGTCTCCTACTACGTTCNotI酶切位點 琥珀密碼子全系氨基酸序列由如下290個氨基酸殘基構(gòu)成MKYLLPTAAAGLLLLAAOPAMAEVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVROAPGKGLEWVSTIMPYGDTTAYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKNGwLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYOQIKPGKAPKLLIYQASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQOARVSPTTFGOGTKVEIKRAAAHHHHHHGGRRTKLISEEDLNGAA*T
單鏈抗體基因含有重鏈可變區(qū)基因(VH)，該基因是由下列354個核苷酸(bp)組成ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTATGCCTTATGGTGATACTACAGCTTACGTAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAATGGGTGGCTTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC所述重鏈可變區(qū)基因序列中，劃線部分為該基因序列的骨架區(qū)，三段非劃線部分為該基因序列的三個互補決定區(qū)。
單鏈抗體基因含有輕鏈可變區(qū)基因(VL)，該基因是由下列327個核苷酸(bp)組成ACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCAGGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGCTAGGGTGTCTCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG所述輕鏈可變區(qū)基因序列中，劃線部分為該基因序列的骨架區(qū)，三段非劃線部分為該基因序列的三個互補決定區(qū)。
權(quán)利要求
1.抗乳鐵蛋白單鏈抗體，其特征在于，單鏈抗體基因由下列726個核苷酸(bp)組成ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTATGCCTTATGGTGATACTACAGCTTACGTAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAATGGGTGGCTTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGGCAACTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTCAGGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGCTAGGGTGTCTCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
2.如權(quán)利要求1所述的抗乳鐵蛋白單鏈抗體，其特征在于基因編碼由下列242個氨基酸(aa)殘基組成MAEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIMPYGDTTAYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNGWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRGNSEHZQLFKLVSAETRESPZAPDLQASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQARVSPTTFGQGTKVEIKR
3.如權(quán)利要求1所述的抗乳鐵蛋白單鏈抗體，其特征在于單鏈抗體基因含有重鏈可變區(qū)基因(VH)，該基因是由下列354個核苷酸(bp)組成ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTATGCCTTATGGTGATACTACAGCTTACGTAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAATGGGTGGCTTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
4.如權(quán)利要求3所述的抗乳鐵蛋白單鏈抗體，其特征在于重鏈氨基酸序列由下列118個氨基酸(aa)殘基組成MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIMPYGDTTAYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNGWLFDYWGQGTLVTVSS
5.如權(quán)利要求1所述的抗乳鐵蛋白單鏈抗體，其特征在于單鏈抗體基因含有輕鏈可變區(qū)基因(VL)，該基因是由下列327個核苷酸(bp)組成ACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGGCAACTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTCAGGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGCTAGGGTGTCTCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
6.如權(quán)利要求3所述的抗乳鐵蛋白單鏈抗體，其特征在于輕鏈氨基酸序列由下列109個氨基酸(aa)殘基組成TDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYQASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQARVSPTTFGQGTKVEIKR
7.如權(quán)利要求1所述的抗鐵乳蛋白單鏈抗體的制備方法，其特征是1)將LF抗原(Sigma)包被于96孔聚苯乙烯酶標板，4℃過夜；2)棄包被液，用PBS洗滌三次，加入2％MPBS至孔緣，室溫放置2小時以封閉非特異性結(jié)合位點，MPBS由脫脂奶粉PBS制成；3)棄2％MPBS，用PBS洗滌三次；4)加入以2％MPBS配制的噬菌體抗體庫，室溫孵育2小時；5)棄上清，以0.1％吐溫-20的PBS洗滌10或20次，拍干酶標板，用胰蛋白酶洗脫吸附的噬菌體；6)將洗脫的噬菌體與OD600為0.4的大腸桿菌TG1 37℃靜置水浴半小時；7)稀釋成不同濃度梯度鋪在含100μg/mL氨芐青霉素和1％葡萄糖的TYE平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜；8)次日每塊平板加2mL 2×YT培養(yǎng)液，用玻璃涂棒刮下菌落，接種至含100μg/mL氨芐青霉素和1％葡萄糖的2×YT培養(yǎng)液中，37℃振蕩(250rpm)培養(yǎng)至OD600為0.4時，加入輔助噬菌體M13K07超感染，37℃靜置水浴半小時；9)離心棄上清，用含100μg/mL氨芐青霉素、50μg/mL卡那霉素和0.1％葡萄糖的2×TY培養(yǎng)液重懸沉淀，30℃過夜振蕩培養(yǎng)；10)離心收集上清，加入PEG/NaCl，混勻后冰浴1小時；11)離心棄PEG/NaCl，用2mL PBS重懸沉淀，再高速離心收集上清，此即第一輪富集后的噬菌體抗體；12)重復(fù)“吸附、洗滌、洗脫、富集”的篩選過程3-4輪；13)在最后一輪篩選過程中，挑取數(shù)個單菌落培養(yǎng)，同上述用輔助噬菌體M13K07超感染制備噬菌體抗體；14)用LF包被，以間接法ELISA檢測篩選的噬菌體抗體；挑選與抗原結(jié)合活性最高者感染大腸桿菌HB2151，37℃靜置水浴半小時后稀釋不同濃度梯度鋪在含100μg/mL氨芐青霉素和1％葡萄糖的TYE平板上，37℃倒置過夜培養(yǎng)；15)次日挑取數(shù)個單菌落接種到含有100μg/mL氨芐青霉素和1％葡萄糖的2×TY培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，再按1∶100分別轉(zhuǎn)種到含100μg/mL氨芐青霉素和0.1％葡萄糖的2×TY培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.9，加入IPTG誘導(dǎo)，30℃振蕩過夜培養(yǎng)，離心收取培養(yǎng)上清，即為含抗乳鐵蛋白單鏈抗體的培養(yǎng)上清；在誘導(dǎo)表達時加入不同試劑以提高其表達產(chǎn)量；16)以LF包被酶標板，用HRP標記的蛋白質(zhì)L采用間接法ELISA檢測培養(yǎng)上清中的抗LF單鏈抗體，選擇顯色最深的菌株進行大量表達；培養(yǎng)上清先用50％飽和度硫酸銨沉淀，離心后重懸沉淀，進一步用His Band Purificaton Kit(Novagin)鎳離子金屬鰲合層析法(IMAC)純化。
8.如權(quán)利要求1所述的抗鐵乳蛋白單鏈抗體的用途，其特征是可以應(yīng)用在制備診斷眼部疾病或判斷藥物療效等方面的試劑盒中，包括聯(lián)合應(yīng)用其他抗乳鐵蛋白抗體制備ELISA試劑盒或膠體金標記試劑盒檢測體液中的乳鐵蛋白含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗乳鐵蛋白單鏈抗體及其制備方法和用途，是一種針對乳鐵蛋白的特異性單鏈抗體，是以乳鐵蛋白LF為研究靶象，從制備抗LF的單鏈抗體開始，通過檢測乳鐵蛋白的表達量協(xié)助干眼的診斷。其制備方法是首先進行抗LF噬菌體抗體的篩選，用離心重懸沉淀用法制得噬菌體抗體，檢測抗LF噬菌體抗體、確定適合進一步表達的噬菌體抗體，單鏈抗體的制備、挑選與抗原結(jié)合活性最高的噬菌體抗體，轉(zhuǎn)化對數(shù)生長期的HB2151細菌，進一步用鎳離子金屬鰲合層析法純化，最后獲得可溶性抗LF單鏈抗體。本發(fā)明應(yīng)用在制備診斷眼部疾病或判斷藥物療效等方面的試劑盒，包括聯(lián)合應(yīng)用其他抗乳鐵蛋白抗體制備ELISA試劑盒或膠體金標記試劑盒檢測體液中的乳鐵蛋白含量。
文檔編號C12N15/12GK1730492SQ200410050958
公開日2006年2月8日 申請日期2004年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月4日
發(fā)明者劉祖國, 虞東芳, 李民友 申請人:中山大學(xué)中山眼科中心