專利名稱：原發(fā)性癌和轉(zhuǎn)移性癌的治療的制作方法
背景技術(shù)：
本申請要求以序列號(hào)60/443,095、名稱為″轉(zhuǎn)移癌的治療″、申請日為2003年1月28日的美國臨時(shí)專利申請為優(yōu)先權(quán)，在此作為參考引入其全部內(nèi)容。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的免疫療法。本發(fā)明的免疫治療劑和方法涉及同時(shí)或序貫地對治療區(qū)給予生理應(yīng)激(例如熱)和基因工程溶瘤病毒，導(dǎo)致隨后的局部地和遠(yuǎn)側(cè)的腫瘤消退。
癌癥可以定義為一種在人或動(dòng)物體內(nèi)任意部位的惡性的贅生物。癌癥局部或到機(jī)體遠(yuǎn)端部分地?cái)U(kuò)展，被稱為轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移的一個(gè)例子是細(xì)胞經(jīng)由血流或淋巴液從惡性腫瘤遷移。有多種以細(xì)胞不受控制的生長為特征的癌癥，破壞機(jī)體組織或代謝(例如肝癌、乳腺癌、白血病等等)，其中增殖破壞相鄰的組織，并最終由于脈管和器官的物理阻塞而導(dǎo)致機(jī)體的死亡(Hanahan和Weinberg(2000).The hallmark ofcancer.Cell 100.57-70)。因而，癌細(xì)胞的兩個(gè)主要特征是它們的永生性和它們具有形成轉(zhuǎn)移的能力。
I.可利用的癌癥的治療。盡管人們已經(jīng)知道癌癥數(shù)千年，但是最近才有允許癌癥的可能的治療的現(xiàn)代的技術(shù)知識(shí)。此外，正在認(rèn)識(shí)這種多變的疾病的作用機(jī)理，到可能指導(dǎo)分子干預(yù)的程度。目前，臨床上可利用的對癌癥的治療是外科手術(shù)、放射治療、熱療、化療、基因治療、免疫療法及其他。
外科手術(shù)目前，最有效的癌癥的治療仍然是外科手術(shù)與放射治療、化療、免疫療法、熱療等結(jié)合。當(dāng)癌癥被早期確診時(shí)，外科治療后的各種類型的癌癥病人的5年生存率可以高達(dá)80％。令人遺憾地，在大多數(shù)情況下，當(dāng)病人被確診時(shí)，疾病已經(jīng)發(fā)展為晚期(III期或IV期)。晚期癌細(xì)胞一般已經(jīng)通過血或淋巴管轉(zhuǎn)移到遍及機(jī)體的遠(yuǎn)端的位置，而外科治療對控制該疾病既不實(shí)用又沒有效果。另一個(gè)外科治療的障礙是外科手術(shù)不能應(yīng)用于廣泛的米珠樣轉(zhuǎn)移的癌癥。此外外科治療的缺點(diǎn)是機(jī)體的并發(fā)癥和實(shí)行外科手術(shù)的病人增加的癌癥轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)。
放射治療放射治療是一種用于縮小或消滅單個(gè)的不能通過外科手術(shù)安全地或完全地除去的腫瘤的治療。它也用于治療那些未受化療影響的腫瘤。放射治療采用比產(chǎn)生胸部X射線的水平還要高成千上萬倍的輻射。這種強(qiáng)輻射摧毀了細(xì)胞分裂和生長的能力。正常和癌細(xì)胞都受到影響，但是該放射治療是用來使殺死腫瘤的效果達(dá)到最大，而使殺死正常組織的效應(yīng)減到最小。使殺死腫瘤的效果最大是放射治療在一系列治療中給予，而不是唯一的治療的一個(gè)原因。除了癌細(xì)胞之外，一些正常細(xì)胞也將被輻射殺死。由于這些正常細(xì)胞被殺死，一些副作用會(huì)很明顯。通常這些副作用是臨時(shí)的，并且殺死癌細(xì)胞的益處勝過這些副作用。然而值得注意的是，放射治療僅僅殺死那些已經(jīng)被輻射到的區(qū)域的癌細(xì)胞，但是并不影響遠(yuǎn)離該放射區(qū)域的癌細(xì)胞。而且，一些癌細(xì)胞的特異性的生物學(xué)特征(例如，對輻射的抗性，腫瘤的大小，腫瘤中乏氧細(xì)胞的比例)可以產(chǎn)生對放射治療不敏感的特殊的腫瘤。
高溫治療高溫療法或熱療法通過現(xiàn)有技術(shù)已知的方式提高全身或局部區(qū)域的溫度。提高局部區(qū)域溫度的高溫治療技術(shù)主要是在不同能量范圍內(nèi)的照射(例如，超聲、微波、射頻等等)。盡管高溫治療癌癥的機(jī)理沒有被充分地認(rèn)識(shí)，高溫單獨(dú)或與其他治療如放射治療和化療結(jié)合已經(jīng)顯示了具有抗腫瘤效應(yīng)(Falk和Issels(2001)Hyperthermia in oncology.Int.J.Hyperthermia 171-18)。盡管不想被理論束縛，高溫改變了癌細(xì)胞的微環(huán)境，并導(dǎo)致變性和壞死/凋亡。目前，使高溫條件最佳化仍然存在困難。例如，高溫治療對深層的惡性腫瘤是很困難的，并且在腫瘤中和直接相鄰的組織中的實(shí)際溫度分配的計(jì)量可能不一致。而且，現(xiàn)有技術(shù)并未顯示高溫對治療那些遠(yuǎn)離施加熱療位點(diǎn)的腫瘤是有效的。
化療化療是利用抗癌(細(xì)胞毒素)藥品而摧毀癌細(xì)胞。目前，有50多種不同的可利用的化療藥品。盡管一些化療藥品單獨(dú)給藥，常?？梢詭追N藥品聯(lián)合(即聯(lián)合化療)。這種特異療法的類型取決于許多情況，包括腫瘤的類型，和它從起源點(diǎn)擴(kuò)展到什么程度。化療殺死快速分裂的癌細(xì)胞以及快速分裂的正常細(xì)胞，如血細(xì)胞、皮膚細(xì)胞和胃腸細(xì)胞。因此，該化學(xué)藥品治療癌癥的應(yīng)用伴隨著嚴(yán)重的副作用。也發(fā)現(xiàn)化療對治療轉(zhuǎn)移癌癥不是很有效。即便是在高劑量時(shí)，凋亡抗性的癌細(xì)胞對化學(xué)藥品不敏感，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的化學(xué)藥品的機(jī)理都是誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。
基因治療基因治療作為一種新型的癌癥治療方法已經(jīng)迅速地發(fā)展起來。有許多類型的載體可以傳遞特異性靶向癌細(xì)胞的治療性基因。這些載體包括腺病毒載體、腺伴隨病毒和脂質(zhì)體(Anderson(1998)Human gene therapy.Nature 39225-30)。然而，這些載體的多種副作用和低下的傳遞效率仍然沒有克服。因此，基因治療的臨床應(yīng)用受到限制。十年前已經(jīng)揭示了利用溶瘤病毒治療腫瘤的構(gòu)思(Barker和Berk(1987)Adenovirus proteins from E1B reading frames arerequired for transformation of rodent cells by viral infectionand DNA transfection.Virology 156107-21)。從那以來，溶瘤病毒的臨床應(yīng)用已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，并且大約十二種不同的溶瘤病毒已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)(Kirn等人(2001)Replication-selective virustherapy for cancerBiological principle，risk management andfuture directions.Nature 7781-787)。這些溶瘤病毒中的腺病毒dl1520已經(jīng)被最好地研究。與野生型腺病毒相反，dl1520是一種腺病毒變體，其中在E1b區(qū)一段827bp的片段被刪除，以致dl1520不表達(dá)E1b-55kDa蛋白。該變體腺病毒dl1520不在正常細(xì)胞中復(fù)制，但在抑癌基因p53功能障礙的癌細(xì)胞中選擇性地復(fù)制，并且最后裂解癌細(xì)胞。臨床試驗(yàn)已經(jīng)顯示了(1)溶瘤病毒對病人和環(huán)境是安全的；(2)變體腺病毒dl1520抑制腫瘤生長的效應(yīng)沒有預(yù)期的好；(3)溶瘤細(xì)胞病毒dl1520與化學(xué)抗癌藥品的聯(lián)合治療對治療癌癥有一定程度的效果(Ries和Kirn(2002)ONYX-015mechanisms of action and clinicalpotential of areplication-selective adenovirus.BritishJournal of cancer 865-11)。通過基于病毒的療法來治療腫瘤疾病的方法和組合物在美國專利5,677,178(″McCormick′178專利″)，名稱為″治療和預(yù)防腫瘤的細(xì)胞病毒″，1997年10月14日頒發(fā)，McCormick等為發(fā)明人。在McCormick′178專利中，提供了通過基于病毒的療法來治療腫瘤疾病的方法和組合物。將一種缺乏結(jié)合和/或失活p53或RB的病毒蛋白的突變病毒給予具有包括缺乏p53和/或RB功能的細(xì)胞的腫瘤病人。該突變病毒能夠在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量產(chǎn)生復(fù)制表型，但是基本上不能在具有實(shí)質(zhì)上正常的p53和/或RB功能的非復(fù)制、非腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生復(fù)制表型。在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制表型的優(yōu)先產(chǎn)生導(dǎo)致直接或通過在表達(dá)病毒復(fù)制表型的細(xì)胞中表達(dá)細(xì)胞毒素基因而優(yōu)先殺死腫瘤細(xì)胞。然而，一直沒有現(xiàn)有技術(shù)證明基因工程的溶瘤病毒對治療在遠(yuǎn)離給與病毒的位點(diǎn)的腫瘤是有效的。
免疫治療大約90％的癌癥病人死于轉(zhuǎn)移灶，而實(shí)際上沒有對癌癥轉(zhuǎn)移的有效治療。免疫療法通常是為了降低對過敏原的敏感性，使敏感病人暴露于逐漸增長量的過敏原的一種過程。免疫療法治療癌癥的構(gòu)思基于類似的研究，該研究揭示了免疫系統(tǒng)在保護(hù)機(jī)體抗癌中和在和已經(jīng)發(fā)展的癌癥的斗爭中起著重要作用。盡管這些后者的功能沒有透徹地了解，有跡象支持免疫系統(tǒng)對減慢腫瘤的生長和擴(kuò)散的作用。盡管化療殺死快速分裂的癌細(xì)胞以及快速分裂的正常細(xì)胞，但其能夠在一定程度上抑制癌癥的轉(zhuǎn)移。然而，化療嚴(yán)重的毒性對大多數(shù)的病人是無法忍受的。長久以來已經(jīng)認(rèn)為病人擁有的免疫防御系統(tǒng)對對抗癌癥轉(zhuǎn)移是最好的方法。目前，最常用的免疫療法可以分成三類(1)通過給予如白細(xì)胞介素、干擾素等等的細(xì)胞因子的免疫操縱；(2)用特異性地針對一種或幾種癌癥相關(guān)抗原(″CRA′s″)的單克隆抗體的免疫療法；以及(3)用CRA′s的疫苗接種(Ying等人(2001)Innovative cancer vaccine strategies based on theidentification of tumor-associated antigen.BioDrugs15819-31)。
免疫操縱。干擾素屬于一組稱為細(xì)胞因子的蛋白質(zhì)，他們是通過體內(nèi)(或在實(shí)驗(yàn)室中)的白細(xì)胞對感染、炎癥或刺激的應(yīng)答而天然產(chǎn)生的。α干擾素是首先顯示抗腫瘤效應(yīng)的細(xì)胞因子之一，它能夠直接減緩腫瘤的生長，而且促進(jìn)激活免疫系統(tǒng)。α干擾素已經(jīng)由FDA批準(zhǔn)，并且現(xiàn)在通常用于許多癌癥的治療，包括多發(fā)性骨髓瘤、慢性粒性白血病、毛細(xì)胞白血病和惡性黑色素瘤。β干擾素和γ干擾素是其他類型的已經(jīng)被研究的干擾素。其他的具有抗腫瘤活性的細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素(例如IL-2)和腫瘤壞死因子。IL-2經(jīng)常用于治療腎癌和黑色素瘤。由于細(xì)胞因子調(diào)節(jié)特異性免疫應(yīng)答的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而不是直接操縱免疫系統(tǒng)特異性地對抗癌癥，當(dāng)細(xì)胞因子用于治療癌癥時(shí)，通常會(huì)觀察到不需要的副作用。這些細(xì)胞因子，包括許多干擾素和白細(xì)胞介素的一些問題是它們的副作用，包括不適感和感冒樣綜合征。當(dāng)給與高劑量時(shí)，副作用可能大大地增強(qiáng)。
單克隆抗體。另一個(gè)重要的生物療法包括抗癌細(xì)胞或癌癥相關(guān)靶標(biāo)的抗體。單克隆抗體是針對特定的靶標(biāo)(″抗原″)的人工抗體，在實(shí)驗(yàn)室中生產(chǎn)。最初的方法涉及雜交瘤細(xì)胞(兩個(gè)不同類型的細(xì)胞的融合)，其如發(fā)揮抗體產(chǎn)生工廠的作用。這一領(lǐng)域內(nèi)的一個(gè)主要進(jìn)步是改造這些最初由小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體成為″人源化″抗體的能力，與我們的天然抗體更相似。更新的技術(shù)甚至可用于從包含人抗體基因的基因工程小鼠或細(xì)菌中產(chǎn)生人抗體。單克隆抗體已經(jīng)被廣泛的用于癌癥的科學(xué)研究以及癌癥的診斷。作為癌癥的治療方法，可以把單克隆抗體注射到病人體內(nèi)，以找到癌細(xì)胞，可能導(dǎo)致癌細(xì)胞活性的破壞或增強(qiáng)針對癌癥的免疫反應(yīng)。自從20世紀(jì)70年代最初的單克隆抗體的發(fā)明以來，這一策略已經(jīng)有很大的重要性。在許多年的臨床試驗(yàn)之后，研究人員已經(jīng)表明改善的單克隆抗體可以有效地用于幫助治療某些癌癥。稱為rituximab(″Rituxan″)的抗體可以用于非霍奇金淋巴瘤的治療，而trastuzumab(″Herceptin″)用于某些乳腺癌。其他的新的單克隆抗體正在進(jìn)行活性測試。然而，使用特異性類型的癌癥相關(guān)抗原(″CRA″)的單克隆抗體的一個(gè)缺點(diǎn)是CRA的類型和每種CRA的數(shù)量可能在不同的病人中有差異。甚至對相同的病人，在不同的發(fā)展階段，CRA的類型和每種CRA的數(shù)量也可能是不同的。因此，用單克隆抗體治療癌癥至少有兩個(gè)缺點(diǎn)。首先，如果單克隆抗體只靶向少數(shù)幾個(gè)CRA，效果會(huì)受到損害。由于大多數(shù)的癌癥被認(rèn)為是多基因相關(guān)的，這一點(diǎn)是一大障礙。其次，不同的病人具有不同的CRA′s，一種或一組特異的單克隆抗體將僅僅對有限的癌癥病人有效。
癌癥疫苗。雖然如干擾素和單克隆抗體的免疫治療已經(jīng)成為標(biāo)準(zhǔn)腫瘤治療的一部分，但是許多其他類型的免疫療法，比如腫瘤疫苗，仍然是試驗(yàn)性的。通常，疫苗已經(jīng)通過預(yù)防許多重要的傳染病的發(fā)展，包括骨髓灰白質(zhì)炎、水痘和白喉，使公共衛(wèi)生發(fā)生了巨大變革。然而，建立有效的疫苗來防止癌癥或者治療癌癥病人要難得多。盡管幾十年的實(shí)驗(yàn)工作，發(fā)展腫瘤疫苗的努力仍然沒有取得成功的結(jié)果。盡管如此，免疫學(xué)和癌癥生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的新發(fā)展已經(jīng)產(chǎn)生了顯著增加的興趣，已經(jīng)導(dǎo)致比先前可利用的疫苗更復(fù)雜和有前途的疫苗策略。目前，存在制造癌癥疫苗的三種基本策略(1)用一種或者一組腫瘤相關(guān)抗原(″CRA″)接種；(2)用同一病人的癌組織的溶解物脈沖的樹突細(xì)胞(″DC″)接種病人；(3)用從同一個(gè)病人分離的熱休克蛋白(″HSP″)和CRA′s復(fù)合體接種病人。
(1)用CRA接種。癌癥疫苗一般由癌癥相關(guān)抗原(″CRA″)源以及進(jìn)一步促進(jìn)對CRA的免疫反應(yīng)的其它組分一起組成。發(fā)現(xiàn)更好的CRA以及按增強(qiáng)病人對抗具有CRA的癌細(xì)胞的免疫系統(tǒng)的方法包裝抗原是一種挑戰(zhàn)。逐漸地已經(jīng)表明癌癥疫苗能夠改善針對特定抗原的免疫應(yīng)答。這一免疫學(xué)效應(yīng)的結(jié)果并不總是足夠逆轉(zhuǎn)癌癥的進(jìn)展，然而，癌癥疫苗已經(jīng)通常被很好耐受，并且在一些情況下，它們可以提供有益的抗癌效果。例如，在惡性淋巴瘤中，許多實(shí)驗(yàn)室研究已經(jīng)表明使用稱為″獨(dú)特型″的淋巴瘤相關(guān)蛋白質(zhì)接種可以促進(jìn)小鼠的免疫系統(tǒng)從而足以幫助它們抵抗淋巴瘤的發(fā)展。在臨床試驗(yàn)中，獨(dú)特型疫苗繼續(xù)被校驗(yàn)，并且已經(jīng)與一些淋巴瘤病人的臨床效益指征相關(guān)聯(lián)。在惡性黑色素瘤中，已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中采用了多種疫苗策略，并且一些已經(jīng)發(fā)現(xiàn)促進(jìn)針對腫瘤的免疫應(yīng)答。
用一種或一組CRA′s預(yù)防接種病人的不利情況與使用單克隆抗體治療癌癥是一樣的(1)如果只有幾種CRA′s被靶向，效力會(huì)大打折扣；以及(2)不同的病人具有不同的CRA′s，并且(3)所得的疫苗僅僅對有限的腫瘤病人有效。
(2)用腫瘤組織的裂解物脈沖的樹突細(xì)胞(″DC″)接種病人。許多新的疫苗構(gòu)建策略和免疫刺激可以導(dǎo)致臨床上有益的癌癥疫苗的出現(xiàn)。一個(gè)正在黑素瘤及其它癌癥中試驗(yàn)的激動(dòng)人心的新方法的例子是樹突細(xì)胞疫苗的應(yīng)用。樹突細(xì)胞(″DC″)有助于“開啟”免疫應(yīng)答。樹突細(xì)胞是一種以其活化自然T細(xì)胞的潛能為特征的抗原呈遞細(xì)胞(″APC″)(Banchereau，J.等(2000)Immunobiology of dendriticcells.Annu.Rev.Immunol.18767-81)。通過給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中CRA′s脈沖的DCs，縮小了這些動(dòng)物的腫瘤(Fong和Engleman(2000)Dendritic cells in cancer immunotherapy.Annu.Rev.Immunol.18245-273)。人類病人也顯示出同樣的結(jié)果(Nestle等(1998)Vaccination of melanoma patients with peptide-or tumorlysate-pulsed dendritic cells.Nat.Med.4328-332)。DC也可以與癌細(xì)胞融合，而CRA′s被脈沖入DCs(Gong等(1997)Induction ofanti-tumor activity by immunization with fusion of dendriticand carcinoma cells.Nat.Med.3558-561)。已經(jīng)顯示用CRA′s脈沖的DC′s具有抑制轉(zhuǎn)移性癌癥的能力(Kugler(2000)等Regression of human metastatic renal cell carcinoma aftervaccination with tumor cell-dendritic cell.Nat.Med.6332-336)。這一疫苗接種技術(shù)是一種四步方法(1)從病人分離DC′s和分離的DC′s的離體增殖；(2)DC′s成熟狀態(tài)的離體操作；(3)Dc′s與來自同一個(gè)病人的CRA′s的離體孵育；(4)由CRA′s脈沖的DC′s回輸至同一病人。因此，用來自同一病人的癌組織溶解物脈沖的DC′s的疫苗接種對治療局部的癌癥以及轉(zhuǎn)移性癌具有巨大的潛力，伴隨著低風(fēng)險(xiǎn)的有害毒性。因?yàn)楦鱾€(gè)病人的整套CRA′s呈現(xiàn)于同樣病人的免疫系統(tǒng)，這樣的疫苗已經(jīng)被稱為″個(gè)體化疫苗″。然而，個(gè)體化疫苗的缺點(diǎn)是(1)高成本，(2)耗時(shí)，(3)復(fù)雜和冗長的離體制備程序，經(jīng)常被污染中斷，并且(4)需要針對每個(gè)個(gè)體病人定制疫苗，(即不可能建立一種基于這些個(gè)體化疫苗的構(gòu)想的藥物)(Srivastava和Jaikaria(2001)Methods of purification ofheat shock protein-peptide complexes for use as vaccinesagainst cancers and infectious diseases.Methods Mol.Biol.156175-186)。
(3)用復(fù)合了熱休克蛋白(″HSP″)的CRA進(jìn)行疫苗接種。一組熱休克蛋白(″HSP″)或由任何的環(huán)境刺激包括物理、化學(xué)和生物學(xué)刺激導(dǎo)致的應(yīng)激蛋白的升高的表達(dá)，被定義為熱休克反應(yīng)或應(yīng)激反應(yīng)。Srivastava等發(fā)現(xiàn)(1)熱休克蛋白、特別是HSP70，可以結(jié)合癌癥的特異性蛋白的肽段而形成復(fù)合體，并且這些復(fù)合體可以離體純化；(2)這些純化的復(fù)合體的輸注導(dǎo)致作為CRA′s與HSP復(fù)合體的肽段在體內(nèi)遷移到DC；(3)DC向免疫系統(tǒng)呈遞這些CRA′s并且誘導(dǎo)抗癌的免疫性(Basu和Srivastava(2000)Heat shock proteinsthe fountainheadof innate and adaptive immune responses.Cell Stress &Chaperones 5443-451)。
Haviv等人報(bào)道HSP70能夠提高溶瘤病毒殺滅培養(yǎng)的癌細(xì)胞的能力(Haviv等人(2001)Heat shock and Heat shock protein 70i enhancethe oncolytic effect of replicative Adenovirus.Cancer Research618361-8365)。然而對它們的體外試驗(yàn)無法確定HSP70是否可以提高溶瘤病毒治療癌癥的效應(yīng)，而不損傷動(dòng)物或人的正常的生物功能。而且，由于它們僅僅對培養(yǎng)癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H460和H157)，它們不能表明含有高水平的HSP70的癌癥細(xì)胞的病毒癌細(xì)胞溶解將誘導(dǎo)全身性的抗癌免疫應(yīng)答，從而治療局部的和轉(zhuǎn)移性的癌癥。
開發(fā)可以導(dǎo)致每個(gè)癌癥病人的整套的CRA′s向他/她的免疫系統(tǒng)呈遞的單個(gè)藥劑，并且因此誘導(dǎo)抗癌免疫是誘人的。近來，Chen和Hu開發(fā)了一種病毒藥劑，可以向幾乎每個(gè)癌癥病人自己的免疫系統(tǒng)呈遞他/或她的整套CRA′s，并且誘導(dǎo)針對他/她自身癌癥的免疫應(yīng)答(中國專利申請01141696.3&Pct/cn01/01616)。動(dòng)物試驗(yàn)已經(jīng)表明這種病毒藥劑對抑制治療的腫瘤的生長是有效的。這一病毒藥劑是一種攜帶外源性的HSP70基因的溶瘤腺病毒。盡管不想被理論束縛，溶瘤病毒可以溶解癌細(xì)胞，病毒表達(dá)的HSP70可以俘獲CRA。已經(jīng)感染溶瘤病毒的癌細(xì)胞溶解后，與HSP70復(fù)合的CRA呈遞于DCs，并且隨后引起抗癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答。盡管不想被理論束縛，熱休克反應(yīng)是一種復(fù)合多步程序，其中HSP70可能只是負(fù)責(zé)CRA-HSP復(fù)合物的適宜地呈遞的通路上的一個(gè)關(guān)鍵蛋白。因此，可能需要在治療組織中誘導(dǎo)全部的熱休克蛋白，例如HSP60、HSP70、HSP90、HSP110等等，以得到成功地治療轉(zhuǎn)移性的癌癥的充足的免疫應(yīng)答。
II.現(xiàn)行的提高內(nèi)源性HSP表達(dá)的技術(shù)盡管不想被理論束縛，為了提高內(nèi)源HSP的表達(dá)，有幾種已知的環(huán)境刺激可以誘導(dǎo)熱休克級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這些刺激包括高溫、醇(alcohol)、能量代謝的抑制劑、重金屬、氧化應(yīng)激、炎癥等等(Zylicz等人(2001)HSP70 interactions withthe p53 tumor suppressor protein.The EMBO Journal204634-4638)。已經(jīng)觀察到發(fā)熱感染和同時(shí)發(fā)生的癌癥的癥狀緩解之間的相關(guān)性，并且近期出版物將這種相關(guān)歸結(jié)于HSP的表達(dá)(Hobohm(2001)Fever and cancer in perspective.Cancer ImmunolImmunother.50391-396)。其他的無毒的化學(xué)制劑例如谷氨酰胺和氨基酸類似物也可以提高HSPs的表達(dá)水平(Wischmeyer(2002)Glutamine and Heat Shock Protein expression.Nutrition18225-228；van Rijn等(2000)Heat shock responses by cellstreated with azetidine-2-carboxylic acid.Int J Hyperthermia16305-318)。另外線粒體解偶聯(lián)劑例如albendazole提高體溫，由此提高HSP的表達(dá)(Wallen等人(1997)Oxidants differentiallyregulate the heat shock response.Int J Hyperthermia13517-24)。
總之，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)表明可能利用不同的技術(shù)和治療在有限的能力內(nèi)治療癌癥，然而許多這些治療具有一些顯著的缺點(diǎn)。這里描述的本發(fā)明的一個(gè)方面涉及將適時(shí)的高溫應(yīng)用于惡性腫瘤，其中也給與基因工程的溶瘤病毒，加熱和病毒的結(jié)合引發(fā)針對癌癥的免疫應(yīng)答。因此，高溫和病毒癌細(xì)胞溶解的結(jié)合對抑制局部治療的腫瘤以及遠(yuǎn)端的未治療的轉(zhuǎn)移性病灶是有效的。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及與病毒癌細(xì)胞溶解結(jié)合的提高內(nèi)源性HSP表達(dá)的其它刺激(例如物理、化學(xué)或生物學(xué)的)，其中局部療法縮小了局部的和遠(yuǎn)端的腫瘤。
發(fā)明簡述概括地說，本發(fā)明涉及在具有至少一個(gè)腫瘤位點(diǎn)的病人中除去腫瘤細(xì)胞的組合物和方法。更具體地說，該方法包括在細(xì)胞裂解條件下，將在至少一個(gè)腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞與一種裂解劑在體內(nèi)接觸，形成治療的(treated)腫瘤；并在體內(nèi)對治療的腫瘤施加充分的刺激，形成刺激(stimulated)腫瘤。
本發(fā)明的一個(gè)方面是縮小腫瘤的方法，包括下列步驟將裂解劑導(dǎo)入腫瘤；一旦最大量的裂解過程發(fā)生，對腫瘤施加第一段時(shí)間的刺激。應(yīng)用于腫瘤的刺激通常可以提高腫瘤內(nèi)熱休克蛋白(″HSP″)的水平。第一段時(shí)間通常為大約15分鐘到90分鐘。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，縮小腫瘤的方法包括下列方法步驟(1)將裂解劑導(dǎo)入腫瘤，進(jìn)行第一輪數(shù)(例如大約1-10輪)；(2)從最先導(dǎo)入裂解劑的第二天開始，向腫瘤施加第一段時(shí)間的刺激(例如大約15-90分鐘)，每天可以重復(fù)第二輪數(shù)(例如大約1-20輪)。
這里描述的方法可以用于特定類型的腫瘤。盡管不想被理論束縛，由缺陷抑癌基因(例如有缺陷的p53)、活化的癌基因(例如ras或myc)組成的腫瘤是這種治療方法的良好的候選者。舉例說明，然而并非僅限于此，在這里描述的發(fā)明可用于鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌(ovarian cancer)、惡性肝癌、食管癌、肺癌、直腸癌、胃癌、卵巢癌(carcinoma of ovarium)、腹水或黑色素瘤。在特定的具體實(shí)施方式
中，裂解劑包括溶瘤病毒(例如腺病毒(adenovirus)、單純皰疹病毒(herpes simplex virus)、呼腸孤病毒(reovirus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(pollovirus)、麻疹病毒(measles virus)、或水泡性口膜炎病毒(vesicular stomatis virus))，或溶瘤細(xì)菌(例如沙門氏菌屬(Salmonella)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、志賀氏菌屬(Shigella)、利斯特氏菌屬(Listeria)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、或梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium))或任一類型的溶瘤藥劑。該溶瘤病毒/溶瘤細(xì)菌可以是野生型或基因工程形式。另外，該裂解劑可以包括治療性的基因(例如凋亡基因、腫瘤壞死基因、腫瘤細(xì)胞饑餓至死基因、細(xì)胞溶解基因、負(fù)I-κ-β、caspase、γ球蛋白、hα-1抗胰蛋白酶、或腺病毒的E1a)。
刺激腫瘤的方法步驟包括局部的高溫；全身性高溫；高頻的電磁脈沖；射頻透熱法；超聲透熱法；缺氧、輻射、醇、谷氨酰胺、感染、或任何種類的物理、化學(xué)或生物學(xué)刺激。在一個(gè)特定的具體實(shí)施方式
中，局部的高溫在高于正常體溫大約1到大約7攝氏度的范圍內(nèi)。通常，刺激提高了刺激的腫瘤中的熱休克蛋白(例如Hsp30、Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp94、Hsp96或Hsp110)。遵循本發(fā)明的方法可以實(shí)現(xiàn)病人腫瘤的縮小。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是在受試者中縮小未治療的腫瘤(或轉(zhuǎn)移)的方法，包括下列步驟向腫瘤中(″治療的腫瘤″)導(dǎo)入裂解劑。一旦溶解過程已經(jīng)發(fā)生，則將刺激應(yīng)用于治療的腫瘤。應(yīng)用于治療的腫瘤的刺激能夠提高該治療的腫瘤內(nèi)的熱休克蛋白(″HSP″)的水平。在一種優(yōu)選的方案中，縮小未治療的腫瘤的方法包括下列方法步驟(1)將裂解劑導(dǎo)入腫瘤(治療的腫瘤)，進(jìn)行第一輪數(shù)(例如大約1-10輪)；(2)從最先導(dǎo)入裂解劑的第二天開始，向治療的腫瘤施加第一段時(shí)間的刺激(例如大約15-90分鐘)，每天可以重復(fù)進(jìn)行第二輪數(shù)(例如大約1-20輪)。不想被理論束縛，導(dǎo)入裂解劑和施加刺激的同步化引發(fā)的的特異性免疫縮小了未治療的腫瘤。發(fā)明人已經(jīng)考慮將這里描述的方法用于特定類型的遠(yuǎn)端腫瘤。不想被理論束縛，由缺陷p53抑癌基因(例如有缺陷的p53)、活化的癌基因(例如ras或myc)組成的腫瘤是這種治療方法的良好的候選者。舉例說明，然而并非僅限于此，在這里描述的發(fā)明可用于鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌(ovarian cancer)、惡性肝腫瘤、食管癌、肺癌、直腸癌、胃癌、卵巢癌(carcinoma of ovarium)、腹水或黑色素瘤。在特定的具體實(shí)施方式
中，裂解劑包括溶瘤病毒(例如腺病毒(adenovirus)、單純皰疹病毒(herpes simplex virus)、呼腸孤病毒(reovirus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)、麻疹病毒(measles virus)、或水泡性口膜炎病毒(vesicular stomatis virus))，或溶瘤細(xì)菌(例如沙門氏菌屬(Salmonella)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、志賀氏菌屬(Shigella)、利斯特氏菌屬(Listeria)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、或梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium))或任一類型的溶瘤藥劑。該溶瘤病毒/溶瘤細(xì)菌可以是野生型或基因工程形式。另外，該裂解劑可以包括治療性的基因(例如凋亡基因、腫瘤壞死基因、腫瘤細(xì)胞饑餓至死基因、細(xì)胞溶解基因、負(fù)I-κ-β、caspase、γ球蛋白、hα-1抗胰蛋白酶、或腺病毒的E1a)。
發(fā)明涉及刺激第一腫瘤的方法步驟，包括局部的高溫；全身性高溫；高頻的電磁脈沖；射頻透熱法；超聲透熱法；缺氧、輻射、醇、谷氨酰胺、感染或任何種類的刺激。在一個(gè)特定的具體實(shí)施方式
中，局部的高溫在高于正常體溫大約1到大約7攝氏度的范圍內(nèi)。通常，刺激提高了刺激的腫瘤中的熱休克蛋白(例如Hsp30、Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp94、Hsp96或Hsp110)。遵循本發(fā)明的方法，可以實(shí)現(xiàn)病人未治療腫瘤的縮小。
附圖簡述

圖1顯示了遺傳修飾的S98腺病毒的圖譜；圖2顯示了正常細(xì)胞中遺傳修飾的S98腺病毒的復(fù)制，其中MOI為感染復(fù)數(shù)的縮寫。
圖3顯示了采用5種劑量水平的H101(SEQID#1)腫瘤內(nèi)注射劑量的增加曲線；以及圖4顯示了參加確定劑量增加曲線的研究的腫瘤病人的數(shù)目和類型。
發(fā)明詳述這里采用的所有技術(shù)術(shù)語指學(xué)術(shù)界通常認(rèn)同的定義。為保證這里采用的術(shù)語不被誤解，這些術(shù)語的定義如下所述這里采用的術(shù)語″佐劑″指可以和抗原共同使用的物質(zhì)，或其本身可以用作抗原引發(fā)免疫反應(yīng)。
這里采用的術(shù)語″抗原″指引發(fā)免疫應(yīng)答的一種物質(zhì)，包括抗體產(chǎn)生、特異免疫細(xì)胞的活化、或這兩者的結(jié)合?？乖梢允且环N生物學(xué)大分子、生物學(xué)大分子的一部分、生物體的碎片等等。
這里采用的術(shù)語″抗原呈遞細(xì)胞″指一種功能是向T細(xì)胞和B細(xì)胞處理和呈遞抗原的細(xì)胞。這類細(xì)胞包括樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞。
這里采用的術(shù)語″癌癥″指能夠轉(zhuǎn)移和永生化地增殖的惡性腫瘤。癌癥是一組通過影響的組織分類的疾病，包括，但不僅限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌(ovarian cancer)、惡性肝癌、食管癌、肺癌、直腸癌、鼻咽癌、胃癌、胸膜積液、卵巢癌(carcinoma of ovarium)、腹水和惡性黑色素瘤。
這里采用的術(shù)語″癌癥基因治療″指采用攜帶治療性的基因的載體感染癌細(xì)胞，從而摧毀癌細(xì)胞。治療性的基因包括涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞裂解作用、細(xì)胞自殺等等的基因。這些治療性的基因也包括負(fù)i-κ-β基因、caspase基因、γ球蛋白基因、α-1抗胰蛋白酶基因、或溶瘤腺病毒的E1a基因等等。
這里采用的術(shù)語″癌相關(guān)抗原″指表現(xiàn)出癌細(xì)胞的獨(dú)特特征的抗原。癌相關(guān)抗原縮寫為CRA。
這里采用的術(shù)語″癌疫苗″指CRA或已經(jīng)遭遇CRA的免疫細(xì)胞。CRA可以是代表癌細(xì)胞的獨(dú)特的特征的分子或這類分子的一部分。在良好地操作的組合物中，癌癥疫苗可以引發(fā)病人的抗癌免疫反應(yīng)。
這里采用的術(shù)語″侶伴蛋白″指介導(dǎo)其他蛋白的正確的折疊、裝配、修補(bǔ)、穿膜易位和降解，同時(shí)并非它們的功能組分的一組無關(guān)蛋白。一個(gè)具體實(shí)施方式
描述了作為一種類型的侶伴蛋白的″Hsp70″多基因家族。在本發(fā)明特定的具體實(shí)施方式
中表征了特定類型的侶伴蛋白的優(yōu)勢，但是并非限于它們。
這里采用的術(shù)語″外源基因″或″轉(zhuǎn)基因″指編碼在特定位點(diǎn)插入基因治療載體的目的蛋白的DNA序列。外源基因可以來自載體本身，但是已經(jīng)在載體的基因組重排。然而，外源基因更多是來自另一個(gè)生物體的基因組的DNA片段。該外源基因序列可以通過化學(xué)/生物化學(xué)合成、通過從天然來源純化、或通過任何其它方法制備。
這里采用的術(shù)語″熱休克蛋白″指在從細(xì)菌到人的幾乎所有種類的生物體中普遍表達(dá)的蛋白質(zhì)家族。它們也命名為″應(yīng)激蛋白″，縮寫為HSP。HSP的表達(dá)通過環(huán)境的刺激和發(fā)育的影響而調(diào)控，例如，高溫、缺氧、醇、葡萄糖饑餓(對葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，或GRP，也是HSP的亞群)、組織損傷、感染等等。HSP在蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮重要的作用。它們可以向細(xì)胞膜上具有HSP的受體的DC細(xì)胞輸送免疫原。在升溫處理之后單獨(dú)或聯(lián)合地升高表達(dá)水平的熱休克蛋白包括但不僅限于Hsp30、Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp94、Hsp96和Hsp110。
這里采用的術(shù)語″Hsp70″指一種侶伴蛋白的多基因家族，而所有成員都具有四個(gè)共同的特征高度保守序列、大約70kDa的分子量、ATP酶活性和與展開的多肽鏈結(jié)合和釋放疏水性片段的能力。
這里采用的術(shù)語″裂解劑″指能夠裂解腫瘤細(xì)胞的組合物。
這里采用的應(yīng)用于對象的術(shù)語″天然產(chǎn)生″指事物可以在自然界中發(fā)現(xiàn)的事實(shí)。例如，存在于生物體(包括病毒)可以從天然來源中分離出來，而沒有通過在實(shí)驗(yàn)室中人工修飾的多肽或多核苷酸序列是天然產(chǎn)生的。這里使用的術(shù)語″重組體″指部分通過人工修飾而產(chǎn)生的多核苷酸構(gòu)建體(例如，和腺病毒基因組)。
這里采用的術(shù)語″未治療的腫瘤″指未直接施加溶瘤劑和提高HSP表達(dá)的環(huán)境刺激的腫瘤，無論是原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤。未治療的腫瘤可以遠(yuǎn)離溶瘤劑和提高HSP表達(dá)的環(huán)境刺激的應(yīng)用位點(diǎn)。術(shù)語″遠(yuǎn)端腫瘤″也可以互換使用。
這里采用的術(shù)語″溶瘤細(xì)菌″指可以在癌細(xì)胞中無限地復(fù)制的基因工程細(xì)菌，以便殺死這些癌細(xì)胞。例如鼠傷寒沙門氏菌YS72(Salmonella typhimuriumYS72)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、志賀桿菌(Shigella)、利斯特氏菌屬(Listeria)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、或梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、其他例子在Bermudes等人的文章中有所描述(Bermudes等人(2002)Livebacteria as anticancer agents and tumor-selective proteindelivery vectors.Curr Opin Drug Discov Devel.5(2)194-9.)，這里將其全部內(nèi)容作為參考引入。
這里采用的術(shù)語″溶瘤技術(shù)″指各種能夠誘導(dǎo)包括凋亡和壞死的腫瘤細(xì)胞的裂解或死亡的有效的步驟。這些步驟包括溶瘤病毒、溶瘤細(xì)菌和導(dǎo)致癌細(xì)胞的裂解或死亡的任何其他藥劑的應(yīng)用。
這里采用的術(shù)語″溶瘤病毒″指可以在癌細(xì)胞中無限地復(fù)制的基因工程病毒，以便殺死這些癌細(xì)胞。腺病毒dl1520是一個(gè)溶瘤病毒的例子。
這里采用的術(shù)語″p53功能″指具有基本上正常水平的由p53基因編碼的多肽的性質(zhì)(即，相對于同樣組織類型的非腫瘤細(xì)胞)，其中p53多肽能夠與野生型腺病毒的E1b p55蛋白結(jié)合。例如，由于產(chǎn)生失活(即突變)形式的p53或由于實(shí)質(zhì)上減少或全部損失了p53多肽的表達(dá)可以喪失p53的功能。同時(shí)，包含編碼野生型p53蛋白的p53等位基因的腫瘤細(xì)胞中可能實(shí)質(zhì)上缺乏p53功能。例如，p53基因座外的遺傳改變，如導(dǎo)致p53的亞細(xì)胞處理或定位異常的突變(例如，導(dǎo)致p53主要在細(xì)胞質(zhì)中而不是細(xì)胞核中定位)可以導(dǎo)致p53功能喪失。
這里采用的術(shù)語″序列同一性百分比″指在一個(gè)對比窗口中比較兩個(gè)最佳比對的序列，當(dāng)與一個(gè)被比較的兩個(gè)序列的最佳比對的參考序列比較時(shí)，其中該序列在比較窗口的部分可以包含添加或缺失(即″缺口″)。通過確定發(fā)生在兩個(gè)序列中的同樣的堿基的位點(diǎn)的數(shù)目產(chǎn)生匹配位點(diǎn)的數(shù)目而計(jì)算同一性百分比，由該窗口的位點(diǎn)總數(shù)除匹配位點(diǎn)的數(shù)目，將結(jié)果乘100而產(chǎn)生序列同一性的百分比。然后總同一性確定為所有覆蓋全部查詢序列的窗口的平均同一性。盡管不想被理論束縛，將會(huì)使用如GAP、BESTFIT、BLASTA、FASTA和TFASTA的計(jì)算機(jī)軟件包來確定序列同源性。
這里采用的術(shù)語″RB功能″指具有基本上正常水平的由RB基因編碼的多肽的性質(zhì)(即，相對于同樣組織類型的非腫瘤細(xì)胞)，其中RB多肽能夠與野生型腺病毒的E1a蛋白結(jié)合。例如，由于產(chǎn)生失活(即突變)形式的RB或由于實(shí)質(zhì)上減少或全部損失了RB多肽的表達(dá)可以喪失RB的功能。同時(shí)，包含編碼野生型RB蛋白的RB等位基因的腫瘤細(xì)胞中可能實(shí)質(zhì)上缺乏RB功能。例如，RB基因座外的遺傳改變，如導(dǎo)致RB的亞細(xì)胞處理或定位異常的突變可以導(dǎo)致RB功能喪失。
這里采用的術(shù)語″復(fù)制缺陷病毒″指在支持病毒復(fù)制表型表達(dá)的預(yù)先確定的細(xì)胞群(例如實(shí)質(zhì)上缺乏p53和/或RB功能的細(xì)胞)中優(yōu)先抑制細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)凋亡的病毒，實(shí)質(zhì)上在含有正常p53和RB功能水平的以非復(fù)制、非轉(zhuǎn)化為特征的細(xì)胞中不能阻止細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡或表達(dá)復(fù)制表型。一般地，復(fù)制缺陷病毒在含有正常RB和/或p53功能的細(xì)胞上顯示出顯著減少的噬菌斑效率。
這里采用的術(shù)語″復(fù)制表型″指感染了如復(fù)制缺陷腺病毒的病毒的細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)下列表型特征。(1)晚期基因產(chǎn)物的充分表達(dá)，如衣殼蛋白(例如腺病毒五鄰體堿基(penton base)多肽)或從病毒晚期基因啟動(dòng)子啟動(dòng)的RNA轉(zhuǎn)錄本，(2)病毒基因組的復(fù)制或復(fù)制中間產(chǎn)物的形成，(3)病毒衣殼裝配或病毒粒子的包裝，(4)在感染細(xì)胞中細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的出現(xiàn)，(5)病毒溶菌周期的完成，和(6)其他的表型的變更，通常依賴于感染了編碼功能性癌蛋白的野生型復(fù)制完全DNA病毒的非腫瘤細(xì)胞中p53或RB功能的去除。復(fù)制表型包括至少一個(gè)所列的表型特征，優(yōu)選多于一個(gè)表型特征。
術(shù)語″S-98″和″H101″可以互換使用。
這里采用的術(shù)語″刺激″指在生物體、器官、細(xì)胞或其一部分中引起或改變活性的任何作用或藥劑(agent)。通常，在具體的實(shí)施方案中描述的刺激″除了″源于將細(xì)胞裂解劑導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞的變化或沖擊。一個(gè)這里描述的具體實(shí)施方案采用了外部高溫作為刺激物。另一個(gè)這里描述的實(shí)施方案采用了全身性高溫作為刺激物。在又一個(gè)的實(shí)施方案中，采用的刺激提高了腫瘤細(xì)胞中的侶伴蛋白的水平。在本發(fā)明特定的具體實(shí)施方式
中表征了一定類型的刺激的優(yōu)勢，但是并非僅限于此。
這里采用的術(shù)語″治療的腫瘤″指直接采用溶瘤劑和環(huán)境刺激提高HSP的表達(dá)的指定的腫瘤，無論是原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤。在一些具體實(shí)施方案中，″第一腫瘤″與治療的腫瘤的意義相同。
這里采用的術(shù)語″T淋巴細(xì)胞″指來源于胸腺的一種細(xì)胞，能夠參與一系列的免疫應(yīng)答。
概括地說，本發(fā)明涉及在有至少一個(gè)腫瘤位點(diǎn)的受試者中除去腫瘤細(xì)胞的組合物和方法。更具體地說，該方法包括細(xì)胞裂解條件下，將至少一個(gè)腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞與裂解劑在體內(nèi)接觸，形成治療的腫瘤；而且對治療的腫瘤施加充分的體內(nèi)刺激，形成刺激的腫瘤。盡管不想被理論束縛，刺激腫瘤與施加刺激前相比，以增加的水平表達(dá)至少一種侶伴蛋白。侶伴蛋白質(zhì)可以包括熱休克蛋白(″HSP″)，其與來自裂解的腫瘤細(xì)胞的CRA結(jié)合，并且向受試者的免疫系統(tǒng)呈遞該CRA，由此警告受試者的免疫系統(tǒng)正在生長的腫瘤的存在。
本發(fā)明涉及在各種癌細(xì)胞溶解和不同的提高HSPs的表達(dá)的技術(shù)之間的同步化。更具體的，本發(fā)明涉及(1)在指定的癌癥中由病毒、細(xì)菌、或任何種類的藥劑進(jìn)行癌細(xì)胞溶解；(2)適時(shí)的應(yīng)用任意種類的物理、化學(xué)或生物學(xué)刺激，例如高溫、谷氨酰胺，可提高給予溶瘤劑的腫瘤中HSP的表達(dá)，以便充足的HSP俘獲了足夠的CRA，形成HSP-CRA復(fù)合體；(3)提高的HSP的表達(dá)和癌細(xì)胞溶解的同步化導(dǎo)致HSP-CRA的充分的釋放，其中釋放的CRA精確地代表了病人的整套CRA；(4)足夠的量的HSP-CRA則自發(fā)地呈現(xiàn)于DC細(xì)胞，并且最終呈遞于免疫系統(tǒng)；(5)呈遞給免疫系統(tǒng)的HSP-CRA的信號(hào)是免疫原性的，足夠引起抗癌免疫應(yīng)答；(6)這一癌癥的免疫治療可以用于治療的腫瘤和未治療的腫瘤，不論它是原發(fā)還是轉(zhuǎn)移性的癌癥。
溶瘤技術(shù)。選擇性的作用于癌細(xì)胞而具有對正常組織毒性有限的新的癌癥治療方法的開發(fā)對于腫瘤學(xué)研究人員是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。例如對腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境有選擇性的病毒的微生物已經(jīng)被作為潛在的武器研究了數(shù)十年。無論提供直接的破壞腫瘤的效果或傳遞破壞腫瘤的分子，遺傳修飾的非致病菌作為潛在的抗癌藥劑已經(jīng)開始出現(xiàn)。減毒的沙門氏菌屬(Salmonella)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)能夠選擇性地在腫瘤內(nèi)擴(kuò)增，并且抑制它們的生長，代表了癌癥治療的新方法。由于它們對腫瘤組織的選擇性，這些細(xì)菌也是向腫瘤遞送治療性蛋白的理想載體。VNP20009，一種鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的減毒株，以及它的衍生物，表達(dá)大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD)的TAPET-CD尤其有前途，并且目前正在癌癥病人中進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)(Bermudes等人(2002)Live bacteria as anticancer agents and tumor-selective proteindelivery vectors.Curr Opin Drug Discov Devel.5(2)194-9.)。溶瘤細(xì)菌的其它例子可以舉例說明為，然而并非限于沙門氏菌屬(Salmonella)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、志賀氏菌屬(Shigella)、利斯特氏菌屬(Listeria)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、和梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)。
為了溶解癌細(xì)胞，可以采用任何可以在癌細(xì)胞中選擇性地復(fù)制的病毒、細(xì)菌或其它藥劑。本發(fā)明中涉及的溶瘤病毒可以是單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV-1)、腺病毒(adenovirus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，″NDV″)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)、麻疹病毒(measles virus)、水泡性口膜炎病毒(vesicular stomatitis virus，″VSV″)等等。
盡管不想被理論束縛，在先報(bào)告已經(jīng)表明p53基因的突變是癌癥病人最常見的基因突變之一。p53基因的突變存在于一半以上的癌癥病例。以該基因有突變的癌癥為靶標(biāo)的溶瘤技術(shù)之一是由編碼蛋白質(zhì)E1b-55KD的人Ad5腺病毒的E1b區(qū)域有改變的修飾的溶瘤病毒。溶瘤腺病毒在有p53基因突變的癌細(xì)胞中選擇性地復(fù)制，因而高度特異性地溶解癌細(xì)胞。本發(fā)明采用2種在編碼蛋白質(zhì)E1b-55kd的E1b區(qū)有改變的變體Ad5病毒S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)作為例子。
另外，當(dāng)由合適的載體選擇性地輸送給癌細(xì)胞時(shí)，許多治療性的基因，例如，但并不限于凋亡基因、細(xì)胞裂解基因、腫瘤壞死基因、腫瘤細(xì)胞饑餓至死基因、負(fù)I-κ-β基因、caspase基因、γ球蛋白基因、hα-1抗胰蛋白酶基因、或腺病毒的E1a基因等等，均可用于腫瘤細(xì)胞裂解的目的。
提高HSP表達(dá)的技術(shù)。盡管不想被理論束縛，已經(jīng)表明局部的高溫和全身高溫可以提高人和動(dòng)物HSP的表達(dá)(Li等人，(1995)Heat shockproteins，thermotolerance，and their relevance to clinicalhyperthermia.Int.J.Hyperthermia 11(4)459-488)。因此，5到90分鐘的局部高溫(溫度范圍38℃到45℃)和全身高溫(體溫低于42℃)與腫瘤細(xì)胞溶解同步用于治療局部的和轉(zhuǎn)移性的癌癥。
由于其高效、深度滲透、劑量易于控制和操作簡便，高頻的電磁輻射例如射頻(0.1-100MHz)透熱法和微波(100-2,450MHz)透熱法是最常使用的局部高溫。射頻透熱法適合于深層的腫瘤，微波透熱法適合淺表的腫瘤。另外超聲透熱法可同時(shí)用于淺表的和深層的腫瘤，但它不適于大多數(shù)的骨或充氣空腔后的腫瘤，例如腸或肺。值得注意的是，本發(fā)明中，高溫并非用于直接殺死局部的和遠(yuǎn)端的癌細(xì)胞，而是誘導(dǎo)HSP的高表達(dá)。另外，本發(fā)明選擇的高溫?zé)岑熂夹g(shù)應(yīng)當(dāng)沒有溶瘤微生物的溶瘤效率的限制，例如溶瘤病毒、溶瘤細(xì)菌及其他基因治療的載體。
盡管不想被理論束縛，其它增加HSP表達(dá)的選擇的例證為缺氧、輻射、醇、某些能量代謝的抑制劑、谷氨酰胺和任何能提高局部的或全身體溫的對人體安全的藥劑，但并非僅限于此。任何可以上調(diào)HSP的表達(dá)的生物學(xué)方式，例如熱休克轉(zhuǎn)錄因子、感染等等，同時(shí)可以與癌細(xì)胞溶解同步應(yīng)用，以引發(fā)抗癌免疫。
癌細(xì)胞溶解和增高HSP表達(dá)的同步化。本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)程序可以是上述兩種技術(shù)的任意同步化。與一或多個(gè)溶瘤技術(shù)同步化的提高HSP表達(dá)的一種技術(shù)將引發(fā)為了治療原發(fā)和轉(zhuǎn)移性癌的抗癌細(xì)胞免疫應(yīng)答。
原發(fā)和轉(zhuǎn)移癌的最佳化治療的一個(gè)方面包括高溫和有E1b-55KD改變的變體腺病毒的癌細(xì)胞溶解的同步化。高溫增加了HSP的表達(dá)，有E1b-55KD改變的變體腺病毒選擇性地裂解癌細(xì)胞。當(dāng)溶瘤腺病毒高水平裂解癌細(xì)胞時(shí)，功能HSP的量也應(yīng)當(dāng)處于高水平，只有當(dāng)這二個(gè)″高水平″同步化時(shí)，充足的HSP-CRA才顯示對免疫系統(tǒng)足夠的免疫原性信號(hào)，以便引發(fā)抗癌免疫應(yīng)答。
盡管不想被理論束縛，已經(jīng)表明(1)提高HSP表達(dá)的最佳條件是在38℃到45℃的溫度范圍內(nèi)，及15到90分鐘的時(shí)間范圍內(nèi)(Li和Mak(1985)Induction of heat shock protein synthesis in murinetumors during the development of thermotolerance.Cancer Res.45(8)3816-3824)；(2)提高的HSP的表達(dá)在升溫處理結(jié)束之后幾分鐘開始，并且提高的HSP水平可以持續(xù)24到48小時(shí)(Li(1984)Thermal biology and physiology in clinical hyperthermiacurrent status and further needs.Cancer Res.(Suppl.)44(8)48865-48935)；(3)本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)確定溶瘤腺病毒的最大溶瘤效果出現(xiàn)在病毒注射后的4到10天。因此，本發(fā)明人已經(jīng)制定了使病毒癌細(xì)胞溶解和HSP的提高最大限度地同步化的程序。該簡要的規(guī)程包括大概的步驟將溶瘤腺病毒注射入腫瘤中，一天一次，注射5天；然后對注射病毒的腫瘤施加高溫，溫度范圍為38℃到45℃，15到90分鐘。從第一次病毒注射后的第二天開始高溫處理，持續(xù)8到16天。
本發(fā)明的一個(gè)方面包括一種注射入癌癥病人的腫瘤的E1b-55KD變異的溶瘤腺病毒S98-001(SEQID#1)，以及溫度范圍為38℃到45℃的射頻透熱法(波長為4-24μm，穿透范圍為4-5mm)也施加于同一腫瘤15到90分鐘，以控制治療腫瘤的生長和未治療腫瘤的生長。
為了傳遞溶瘤劑或提高HSP表達(dá)的藥劑，可以采用不同的路線，例如腫瘤內(nèi)注射、腸胃外給藥，包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下注射、口服及其他全身給藥，包括透皮給藥、鼻內(nèi)給藥和栓劑。該組合物可以是片劑、丸劑、膠囊、半固體、粉末、緩釋劑、溶液、懸浮液、氣霧劑或任何其它適當(dāng)?shù)男问健？梢酝ㄟ^組合物或藥物制劑引發(fā)抗癌免疫，包括癌細(xì)胞溶解藥劑和增加HSP表達(dá)的藥劑，例如，溶瘤病毒和谷氨酰胺劑型。用于該組合物的賦形劑可以是任何固體、液體、半固體、或氣霧劑中的氣體。
實(shí)施例為論證本發(fā)明的優(yōu)選方案，包括下列實(shí)施例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明人介紹的隨后的實(shí)施例中揭示的在本發(fā)明的實(shí)踐中運(yùn)行良好的技術(shù)，因而可以認(rèn)為是對其實(shí)踐制定的優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員按照本公開應(yīng)該理解在揭示的特定具體實(shí)施方式
中可以產(chǎn)生許多變化，不改變本發(fā)明的精髓和范圍而仍然獲得類似的或同樣的結(jié)果。
實(shí)施例1腺病毒通常是一種雙鏈DNA基因組病毒，在人或動(dòng)物中引起呼吸系統(tǒng)、腸道和眼睛的感染。導(dǎo)致普通感冒的病毒是一種腺病毒。本發(fā)明的溶瘤病毒包括基因工程腺病毒Ad5變體。本發(fā)明采用Ad5病毒的特定基因工程變體，包括S98-001(SeqID#1)或S98-002(SeqID#2)。盡管不想被理論束縛，眾所周知人體感染野生型Ad5是可以自愈的。另外，Ad5腺病毒已經(jīng)慣常地用作基因治療的載體，因?yàn)闆]有報(bào)道說Ad5基因組的DNA片段可以整合入人細(xì)胞的基因組。因此，本發(fā)明也采用注射特定的溶瘤病毒和高溫的同步化以抑制注射部位和遠(yuǎn)離病毒注射部位的癌癥。盡管溶瘤Ad5變體被用作特定的實(shí)例，其它裂解劑包括溶瘤病毒(例如腺病毒(adenovirus)、單純皰疹病毒(herpes simplexvirus)、呼腸孤病毒(reovirus)、新城疫病毒(Newcastle diseasevirus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)、麻疹病毒(measles virus)、或水泡性口膜炎病毒(vesicular stomatis virus))，或溶瘤細(xì)菌(例如沙門氏菌屬(Salmonella)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、志賀氏菌屬(Shigella)、利斯特氏菌屬(Listeria)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、或梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium))或任一類型的溶瘤劑。該溶瘤病毒/溶瘤細(xì)菌可以是野生型或基因工程形式。另外，該裂解劑可以包括治療性的基因(例如凋亡基因、腫瘤壞死基因、腫瘤細(xì)胞饑餓至死基因、細(xì)胞裂解基因、負(fù)I-κ-β、caspase、γ球蛋白、hα-1抗胰蛋白酶或腺病毒的E1a。
基因工程腺病毒變體S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)。野生型Ad5(SEQID#3)的基因組由大約35,935bps組成。Ad5的基因工程突變株和變體與S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)具有最少95％的同源性，可以在癌細(xì)胞中選擇性地復(fù)制，被認(rèn)為是本發(fā)明的實(shí)例(圖1)。當(dāng)比較野生型Ad5(SEQID#3)與變體S98-001(SEQID#1)的時(shí)候，一個(gè)區(qū)別是變體的E1b區(qū)域2025位點(diǎn)的額外的TGA終止密碼子，S98-001(SEQID#1)還具有二個(gè)缺失一個(gè)位于2,501和3,328位點(diǎn)之間的E1b區(qū)；另一個(gè)位于27,865和30,995位點(diǎn)之間，包括整個(gè)E3區(qū)。55KD的蛋白由E1b區(qū)的DNA序列編碼，該蛋白被命名為E1b-55KD。在正常細(xì)胞中，E1b-55KD與抑癌基因p53編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合并使其失活，導(dǎo)致病毒復(fù)制開始。在S98-001(SEQID#1)中，E1b區(qū)的二個(gè)改變導(dǎo)致變體E1b-55KD蛋白的表達(dá)，該變體E1b-55KD蛋白與P53蛋白具有很低的結(jié)合親合力。因此，S98-001(SEQID#1)不能在正常細(xì)胞中復(fù)制。然而，S98-001(SEQID#1)在P53蛋白質(zhì)功能障礙的癌細(xì)胞中迅速地復(fù)制。E3區(qū)的功能涉及腺病毒逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視的能力。S98-001(SEQID#1)E3區(qū)的完全缺失使免疫系統(tǒng)易于識(shí)別和除去該病毒。因此，與僅僅具有E1b-55KD區(qū)改變的變體Ad5病毒相比，S98-001(SEQID#1)很少會(huì)傳染和裂解正常細(xì)胞。已經(jīng)表明S98-001(SEQID#1)的癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間細(xì)胞裂解的比例在大約100∶1到1,000∶1范圍內(nèi)。由于S98-001(SEQID#1)僅裂解癌細(xì)胞，它是一種溶瘤病毒。
S98-002(SEQID#2)是另一遺傳修飾的變體Ad5。S98-002(SEQID#2)具有二個(gè)缺失一個(gè)在E1b-55KD編碼區(qū)，在位點(diǎn)2501和位點(diǎn)3328之間；另一個(gè)位于27,865和30,995位點(diǎn)之間，包括整個(gè)E3區(qū)域。制備Ad5變體S98-002(SEQID#2)的目的表明能夠產(chǎn)生腺病毒的另外的具體實(shí)施方案。Ad5的變體DNA序列不能整合入基因組，但Ad5變體S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)在癌細(xì)胞中選擇性地復(fù)制。因此，人和動(dòng)物的應(yīng)用S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)是安全的。
制備溶瘤Ad5變體。(1)S98病毒的構(gòu)建。pXC-1和pBHG11從Microbix Biosystem購買獲得。pXC-1包含5型(Ad5)序列(bp22-5,790)。PBHG11包含具有二個(gè)缺失的Ad5序列E1區(qū)編碼病毒殼體蛋白包裝信號(hào)的bp188～1339；以及E3區(qū)的缺失(bp27,865～30,995)。PBHG11沒有傳染性。然而，pXC-1和pBHG11的共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生基于同源重組的傳染性病毒。
為了用PCR法擴(kuò)增pXC-1的Ad5 DNA片段的bp1,338～2,501，采用下列2個(gè)寡核苷酸引物HZ1(SeqID#4)(5′-CTATCCTGAGACGCCCGAC-3′)以及，HZ2(SeqID#5)(5′-GATCGGATCCAGGTCTCCAGTAAGTGGTAGCTGC-3′；下劃線為Bg1II位點(diǎn))。
然后將該合成DNA序列克隆入pGEM-T載體(Promega)，以便獲得質(zhì)粒HZ102。通過將HZ102 Xbal/Bgl II消化片段與pXC-1Xbal/Bgl II消化片段連接來構(gòu)建HZ103。為了在pXC-1的bp2025建立終止密碼子，用快速位點(diǎn)定向誘變(Quick Change Site DirectedMutagenesis)Strategene)產(chǎn)生質(zhì)粒HZ104。該步驟采用的兩個(gè)引物為HZ3(SeqID#6)(5′-AAAGGATAAATGGAGTAAAGAAACC-3′)以及，HZ4(SeqID#7)(5′-CAGATGGGTTTGTTCATTTATCC-3′)。
已經(jīng)通過DNA測序證實(shí)了HZ104變化的序列。將HZ104Xbal/Bgl II消化片段與pXC-1 Xbal/Bgl II消化片段連接，以產(chǎn)生HZ105。
使用二個(gè)重疊質(zhì)粒通過同源重組產(chǎn)生S98病毒，然后挑選噬菌斑并且在HYH細(xì)胞中擴(kuò)增。因?yàn)镠YH正常地表達(dá)E1A和E1B蛋白，所有的S98病毒能夠在HYH細(xì)胞中有效地形成噬菌斑。使用QIAamp DNA Blood Kit(Qiagen)純化病毒DNA，并且用PCR和Southern印跡進(jìn)行分析。
pBHG11和HZ105共轉(zhuǎn)染細(xì)胞系293產(chǎn)生S98-001(SEQID#1)。pBHG11和HZ103共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生S98-002(SEQID#2)，pBHG11和pXC-1的共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生S98-100。
S98-100沒有E1b區(qū)的改變，因此盡管它的E3區(qū)已經(jīng)刪除，它仍正常表達(dá)E1b-55KD。因此，S98-100與野生型腺病毒一樣復(fù)制，即，S98-100不僅在癌細(xì)胞中復(fù)制，而且在正常細(xì)胞中復(fù)制。因此，S98-100應(yīng)該被認(rèn)為是野生型S98。S98-100用作確定S98病毒的溶瘤特異性的陽性對照。
E1b區(qū)的二個(gè)改變，一個(gè)位于2025位點(diǎn)的額外的TGA終止密碼子以及一個(gè)位點(diǎn)2501和位點(diǎn)3328之間的缺失，使S98-001(SEQID#1)丟失了部分DNA序列，該序列編碼蛋白質(zhì)495R(蛋白E1b-55KD)以及蛋白495R合成相關(guān)mRNA-13S、14S和14.5S。另一方面，在E1b區(qū)位點(diǎn)2501和位點(diǎn)3328之間的缺失使S98-002(SEQID#2)丟失了部分DNA序列，該序列編碼495R蛋白(蛋白E1b-55KD)。因此，S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)都在抑癌基因p53功能障礙的癌細(xì)胞中選擇性地復(fù)制。
體外噬菌斑形成測試。用體外噬菌斑形成測試確定S98病毒在p53缺陷的細(xì)胞中的生長能力。用于該系列的測試的細(xì)胞系是OVCAR-3(卵巢癌細(xì)胞系，p53缺陷)、Hep3B(肝癌細(xì)胞系，p53缺陷)、U373(神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，p53缺陷)、SW620(結(jié)腸癌細(xì)胞系，p53缺陷)、RKO(結(jié)腸癌細(xì)胞系，野生型p53)、HBL-100(正常乳腺細(xì)胞系，野生型p53)。
由于S98-100在癌細(xì)胞以及正常細(xì)胞中正常地復(fù)制，用S98-100作為確定S98病毒的溶瘤特異性的陽性對照。同樣地，由于所有S98病毒都在HYH細(xì)胞中有效地形成噬菌斑，用HYH作為測試細(xì)胞系的陽性對照。為定量的比較S98病毒的復(fù)制程度，S98-100病毒在HYH細(xì)胞培養(yǎng)中形成的噬菌斑被定義為100。其它任何類型的細(xì)胞系中的其它S98病毒(″S98-XXX病毒″)的噬菌斑數(shù)目(″Z″)可以表示為細(xì)胞系(″Z″)中由S98-XXX病毒形成的噬菌斑數(shù)目與HYH細(xì)胞中S98-100噬菌斑數(shù)目的百分比。該百分比可以表示為 因此根據(jù)定義，大量病毒噬菌斑代表快速的病毒復(fù)制。表1表示能夠通過噬菌斑形成測試而檢測基因工程S98腺病毒在p53缺陷的人癌細(xì)胞中的選擇性復(fù)制。例如，表1中所顯示的，S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)在p53缺陷的細(xì)胞系中比在沒有p53缺陷的細(xì)胞系中顯著加快地復(fù)制。例如，S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)在OVCAR-3(卵巢癌細(xì)胞系，p53缺陷)、Hep3B(肝癌細(xì)胞系，p53缺陷)、U373(神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，p53缺陷)和SW620(結(jié)腸癌細(xì)胞系，p53缺陷)中的復(fù)制比在RKO(結(jié)腸癌細(xì)胞系，野生型p53)和HBL-100(正常乳腺細(xì)胞系，野生型p53)中的復(fù)制更迅速得多。盡管不想被理論束縛，與S98-100相比，S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)在有正常p53的細(xì)胞中的噬菌斑形成是非常有限的。例如，S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)的噬菌斑數(shù)目分別僅為RKO(結(jié)腸癌細(xì)胞系，野生型p53)的S98-100的噬菌斑數(shù)目的1/470和1/250。類似地，HBL-100(正常乳腺細(xì)胞系，野生型p53)中S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)的噬菌斑數(shù)目分別僅僅為S98-100的1/3000和1/1000。
這些噬菌斑形成測試的結(jié)果顯示(1)S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)在p53缺陷的癌細(xì)胞中選擇性地復(fù)制；(2)和與野生型腺病毒具有類似的復(fù)制率的S98-100對比，在有功能的p53的細(xì)胞中，S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)的復(fù)制率極低。
體外毒性試驗(yàn)。這一系列的測試的目的是確定S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)對正常細(xì)胞的毒性。選擇人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(hMVEC)進(jìn)行這些試驗(yàn)。hMVEC來源于人肺組織，是一種不再生的原代細(xì)胞。用S98病毒以逐漸升高的感染復(fù)數(shù)(″MOI″)感染細(xì)胞，連續(xù)地記錄細(xì)胞培養(yǎng)物的病理狀況。結(jié)果表明在0.01的MOI的病毒感染后10天中野生型腺病毒完全裂解了培養(yǎng)的hMVEC的單層細(xì)胞，相反地，直到S98-001(SEQID#1)或S98-002(SEQID#2)以0.01、0.1、1.0和10的MOI感染的第10天，也沒有觀察到病理變化。因此，S98-001(SEQID#1)和S98-002(SEQID#2)對正常細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)比野生型腺病毒小。
實(shí)施例2
為了確定用本發(fā)明的組合物和方法治療的動(dòng)物(例如包括人)的有效劑量規(guī)程，使用H101(SEQID#1)的5種劑量水平。由腫瘤內(nèi)注射給予具有晚期實(shí)體瘤的病人重組腺病毒。一個(gè)目標(biāo)是確定最大耐藥量(″MTD″)和腫瘤內(nèi)注射H101(SEQID#1)的安全性。使用的5種水平的H101(SEQID#1)在表2中表示，圖3中顯示了劑量增加曲線。每一5個(gè)獨(dú)立的劑量水平包括3個(gè)病人。由2個(gè)病人發(fā)生DLT的劑量確定為MTD，其中DLT包括由于H101(SEQID#1)產(chǎn)生的流行性感冒樣4級(jí)毒性、在H101(SEQID#1)注射部位的局部反應(yīng)4級(jí)毒性，或由于H101(SEQID#1)產(chǎn)生的其它3級(jí)嚴(yán)重性的任意毒性。如果三個(gè)病人的一個(gè)產(chǎn)生DLT，那一組總共將要治療6名病人。
表2
圖4顯示了登記的15名具有不同類型腫瘤的病人。在注射H101(SEQID#1)的腫瘤中進(jìn)行腫瘤評定的效力評價(jià)，因?yàn)樗蔷植孔⑸涞漠a(chǎn)物，采用非常規(guī)測量，在1.5×1012(病毒粒子)的水平下具有部分響應(yīng)(″PR″)；在5.0×1011(病毒粒子)水平下最小量反應(yīng)(″MR″)。
還確定了在H101(SEQID#1)給藥之后的免疫反應(yīng)和H101排泄的環(huán)境影響污染。給與H101后采取的全部樣品，包括咽拭物、尿都是陰性的。給與H101的4天后采取的血漿樣品也是陰性的。盡管不想被理論束縛，這些資料表明H101(SEQID#1)不存在于循環(huán)系統(tǒng)或尿中。
實(shí)施例3
使用與高溫同步的溶瘤病毒S98-001(SEQ ID#1)治療癌癥病人。病人的出生日期是1943年6月10日。1990年確診為鼻咽癌。在用放療治療一段時(shí)期之后，原發(fā)腫瘤的發(fā)展被臨床控制。然而，在這些年期間，在右頸和鎖骨上區(qū)域的兩個(gè)腫瘤慢慢地發(fā)展。在2001年底，這兩個(gè)腫瘤通過放療(鈷-60，DT 34 Gy/17F/24d)與高溫結(jié)合治療。令人遺憾地，這些治療沒有抑制兩個(gè)腫瘤的進(jìn)展。該病人在2002年2月初住院治療，在給予與高溫同步的溶瘤病毒S98-001(SEQID#1)治療前，對該病人進(jìn)行了體格檢查。病人的一般體格狀況良好，但他的鼻咽組織結(jié)節(jié)狀增厚且輕微充血。兩個(gè)腫瘤的表面是粗糙、增厚和硬化的。兩個(gè)腫瘤分別有47×26×22mm3大小和33×25×6mm3大小，分別用No.1腫瘤和No.2腫瘤表示。對這位病人進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測，這些檢測的結(jié)果如下血Rt-正常；尿Rt-正常；大便Rt-正常；肝和腎功能-除GLO24.2、ALT 45外，正常；細(xì)胞免疫學(xué)-除CD3 60、CD4 39外，正常；胸部X射線-正常；超聲波-除輕微脾腫大外，正常；ECG-右束支完全阻滯；CT-在右側(cè)頸部和鎖骨上有大腫瘤，邊界不清楚。
病人被診斷為晚期鼻咽癌，有右側(cè)的肩部和右側(cè)頸部的轉(zhuǎn)移。征得病人同意后，用與高溫同步的S98-001(SEQID#1)腫瘤內(nèi)給藥進(jìn)行治療。在治療過程中，對病人的No.1腫瘤以1.0×1012病毒粒子的劑量進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射S98-001(SEQID#1)，從開始的第一天連續(xù)注射5天。與此相反，No.2腫瘤沒有給與S98-001(SEQID#1)。接著No.1腫瘤在41-44℃局部加熱90分鐘，從治療過程的第二天開始連續(xù)進(jìn)行13天。用波長為4-24μm和穿透性為4-5mm的頻譜發(fā)生器進(jìn)行高溫加熱。在加熱No.1腫瘤時(shí)，將No.2腫瘤隔離，確保沒有對該腫瘤施加高溫治療。在這一過程的第二十二天，再度檢查病人的體格狀況。發(fā)現(xiàn)盡管包括注射S98-001(SEQID#1)和局部高溫的治療僅僅施加于No.1腫瘤，但No.1腫瘤(治療的腫瘤)和No.2腫瘤(未治療的腫瘤)都明顯地消退。更進(jìn)一步的測量揭示No.1腫瘤的大小從47×26×22mm3消退為44×18×10mm3(縮小70.5％)。更重要地，No.2腫瘤(未治療的腫瘤)也從33×25×6mm3退化為23×17×5mm3(縮小了52.6％)。
盡管不想被理論束縛，本發(fā)明的優(yōu)勢總結(jié)如下(1)將病人的CRA完全暴露于高溫誘導(dǎo)的HSP，隨后，由溶瘤病毒裂解癌細(xì)胞，HSP和DCs介導(dǎo)整套CRA呈遞于免疫系統(tǒng)。(2)同步的HSP表達(dá)和溶瘤病毒的癌細(xì)胞裂解確保了向免疫系統(tǒng)呈遞足夠的CRA′s信號(hào)以便引發(fā)抗癌免疫應(yīng)答；(3)完全的體內(nèi)過程避免早先論述的個(gè)體疫苗接種的繁瑣過程；(4)單獨(dú)的藥劑(溶瘤病毒)與高溫同步化引發(fā)針對每個(gè)癌癥病人的個(gè)體腫瘤的整套的CRA的免疫反應(yīng)；(5)此免疫治療對原發(fā)以及轉(zhuǎn)移性癌癥都是有效的。
這一病例表明與高溫同步化的癌細(xì)胞溶解對直接施用該治療的腫瘤是有效的。另外，該方法對第一個(gè)腫瘤已經(jīng)被″治療″的遠(yuǎn)端腫瘤也是有效的，但對未治療的或遠(yuǎn)端的腫瘤既沒有應(yīng)用注射S98-001(SEQID#1)也沒有應(yīng)用高溫。
實(shí)施例4軟骨肉瘤。女性病人生于1982年。2001年4月，在她的左腰部發(fā)現(xiàn)了腫瘤，手術(shù)后她被診斷為″軟組織肉瘤″。2001年10月，腫瘤復(fù)發(fā)并且尺寸增大。2002年2月，通過身體檢查確定該腫瘤的尺寸是21cm×35cm。腫瘤活組織檢查的病理學(xué)表明它是惡性腫瘤并且大致是未分化軟骨肉瘤。CT表明腫瘤大小是15cm×11cm，附近有一些肋骨侵蝕。另外，發(fā)現(xiàn)右肺上葉有2個(gè)0.6×0.8cm大小的轉(zhuǎn)移性病變。用放射療法治療后，2002年3月的CT表明腫瘤大小13cm×11cm，其中附近的肋骨被侵蝕，并且在右肺的上葉檢測到2個(gè)1.0×1.0cm大小的轉(zhuǎn)移性的病變。2002年3月，用化療治療病人，方案是IFO 2g d1～3+E-ADM 40mgd1～3+DTIC 200mg d1～5。副作用太過嚴(yán)重，病人難以忍受。征得病人的同意，從2002年7月通過與高溫同步的S98-001腫瘤內(nèi)給藥對她進(jìn)行治療。在治療的周期中，左腰的腫瘤以5.0×1011病毒粒子腫瘤內(nèi)注射S98-001，從該周期的第一天開始連續(xù)注射5天。采用大約5MHz到大約15MHz范圍內(nèi)頻率操作的射頻高溫體系，然后注射的病變在41-44℃局部加熱70分鐘，從周期的第六天開始連續(xù)7天。2002年12月，CT表明腫瘤的大小是8.0cm×6.0cm(或66％的縮小)，其中一些附近的肋骨被侵蝕。發(fā)現(xiàn)右肺上葉有2個(gè)1.0×1.0cm大小的轉(zhuǎn)移性病變。在2003年7月，CT表明2個(gè)右肺上葉的轉(zhuǎn)移性的病變消失。這一病例表明與高溫同步化的癌細(xì)胞溶解對直接施用該治療的原發(fā)腫瘤是有效的。另外，這一實(shí)施例表明本發(fā)明的組合物和方法對遠(yuǎn)端的腫瘤(轉(zhuǎn)移性病灶)也是有效的，其中沒有直接給該遠(yuǎn)端的腫瘤注射S98-001，并且沒有施加高溫。
實(shí)施例5非小細(xì)胞肺癌。男性病人生于1933年。2002年12月，病理學(xué)檢測后被診斷為右肺腺癌。分期為T3N1M1/IV，KPS分?jǐn)?shù)為60。CT掃描發(fā)現(xiàn)肺上葉的腫塊，大小為(3cm×2cm)，以及左肺下葉較低位置的轉(zhuǎn)移性病變，大小為(1cm×1cm)。征得病人的同意，從2003年1月用與高溫同步的S98-001腫瘤內(nèi)給藥對他進(jìn)行治療。在一個(gè)治療周期中，在周期的第一天和第八天，對右肺的腫瘤以1.5×1012的病毒粒子進(jìn)行S98-001腫瘤內(nèi)注射。采用大約5MHz到大約15MHz范圍內(nèi)頻率操作的射頻高溫體系，在注射后對注射的病變在41-44℃局部地加熱連續(xù)2天。在2個(gè)周期的治療后，CT掃描表明在左肺下葉低處的轉(zhuǎn)移病變消失，注射的病變穩(wěn)定不變。2003年10月的CT表明左肺下葉低處的轉(zhuǎn)移性的病變消失，顯示了完全性反應(yīng)(″CR″)，其中注射的病變的病人反應(yīng)具有(3cm×1cm，大小減少了50％)的大小，是一種部分反應(yīng)(″PR″)。這一病例表明與高溫同步化的癌細(xì)胞溶解對直接施用該治療的腫瘤是有效的。另外，該方法對遠(yuǎn)端的腫塊也有效。
實(shí)施例6結(jié)腸癌。男性病人生于1983年。2001年4月根治性手術(shù)(radicalsurgery)后，他被診斷為″結(jié)腸癌(乙狀結(jié)腸)，侵入小腸和盆腔，Duke′s D和中等分化腺癌″。手術(shù)之后，從2001年7月到2002年4月，他用化療治療，其中采用了5-FU、CDDP、MMC和左旋咪唑、capecitabine、CPT-11、Taxus chinensis化合物和Coixlachryma job ioil。在2002年10月，發(fā)現(xiàn)在其腹壁有一轉(zhuǎn)移性病變，大小為3.5cm×5.0cm，伴隨著不完全性腸梗阻的癥狀。征得病人的同意，從2002年11月12日到11月18日，用與高溫同步的S98-001腫瘤內(nèi)給藥對他進(jìn)行治療。在一個(gè)周期的治療中，向原發(fā)腫瘤內(nèi)注射1.5×1012病毒粒子的S98-001。然后在注射后對注射的病變在41-44℃局部加熱70分鐘，連續(xù)加熱2天。從2002年11月21日，用處方5-FU0.324h d1～5+DDP 5mg d1～5+CPT-11 0.1 d1，8進(jìn)行4個(gè)周期的低劑量的化療。一周期包括3個(gè)星期。2002年10月28日，CT顯示腹壁病變有3.5×5.0cm大小，直腸區(qū)域腫塊1.2cm×1.0cm(治療前)。2002年12月30日，顯示腹壁病變已經(jīng)減小為3.7cm×2.0cm并且直腸區(qū)域腫塊有1.2×1.0cm大小，2003年2月11日的CT顯示腹壁病變已經(jīng)減少為2cm×2.5cm，而直腸區(qū)域的腫塊已經(jīng)減少為1.2cm×1.4cm。2003年1月20日的CT以及2003年2月21日的該區(qū)域的精密穿刺活檢顯示腹壁病變和直腸區(qū)域的腫塊都只是肉芽組織的增殖，而沒有發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。該病人的癥狀減輕而進(jìn)行正常的飲食。這一病例表明與高溫同步化的癌細(xì)胞溶解對直接施用該治療的腫瘤是有效的。另外，該方法對遠(yuǎn)端的腫塊也有效。
盡管不想被理論束縛，本發(fā)明的組合物和方法的優(yōu)點(diǎn)概述如下(1)將病人的CRA完全暴露于高溫誘導(dǎo)的HSP，隨后，由溶瘤病毒裂解癌細(xì)胞，HSP和DCs介導(dǎo)整套CRA呈遞于免疫系統(tǒng)；(2)同步的HSP表達(dá)和溶瘤病毒的癌細(xì)胞溶解確保了向免疫系統(tǒng)呈遞足夠CRA′s的信號(hào)以便引發(fā)抗癌免疫應(yīng)答；(3)完全的體內(nèi)處理避免早先論述的個(gè)別疫苗接種的繁瑣過程；(4)單獨(dú)的藥劑(溶瘤病毒)與高溫的同步化引發(fā)針對每個(gè)癌癥病人的個(gè)體腫瘤的整套的CRA的免疫反應(yīng)；(5)此免疫治療對原發(fā)以及轉(zhuǎn)移性癌癥都是有效的。
引用文獻(xiàn)下列美國專利文件和出版物在這里作為參考引入。
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權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.在具有至少一個(gè)腫瘤位點(diǎn)的受試者中除去腫瘤細(xì)胞的方法，該方法包括(a)在裂解條件下，將裂解劑與至少一個(gè)腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)接觸，形成治療的腫瘤；以及(b)對治療的腫瘤施加充分的體內(nèi)剌激，形成剌激的腫瘤，其中所述的受試者是人或動(dòng)物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將裂解劑與腫瘤細(xì)胞接觸發(fā)生在施加體內(nèi)刺激以前；或在裂解劑與腫瘤細(xì)胞接觸以前施加體內(nèi)刺激；或裂解劑與腫瘤細(xì)胞接觸以及施加體內(nèi)剌激同時(shí)發(fā)生。
3.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括裂解劑與至少一個(gè)腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)接觸之后，但在施加體內(nèi)剌激以前，等第一段時(shí)間。
4.權(quán)利要求3的方法，進(jìn)一步包括重復(fù)第一輪數(shù)的下列方法步驟(a)將裂解劑與治療的腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)接觸；等一段時(shí)間；以及(b)對治療的腫瘤施加體內(nèi)刺激。
5.權(quán)利要求4的方法，其中第一輪數(shù)在1到大約5輪的范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求4的方法，其中第一段時(shí)間為大約1到大約10天。
7.權(quán)利要求4的方法，進(jìn)一步包括向治療的腫瘤施加第二輪數(shù)的體內(nèi)剌激。
8.權(quán)利要求7的方法，其中第二輪數(shù)在大約1到大約16輪的范圍內(nèi)。
瘤以提高的水平表達(dá)至少一種侶伴蛋白，且其中該侶伴蛋白包括熱休克蛋白(″HSP)。
28.權(quán)利要27方法，其中熱休克蛋白為HSP70、Hsp30、Hsp60、Hsp90、Hsp94、Hsp96或Hsp110。
29.在具有至少第一腫瘤和遠(yuǎn)端腫瘤的受試者中除去腫瘤細(xì)胞的方法，該方法包括(a)在裂解條件下，將裂解劑與第一腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)接觸，形成治療的腫瘤，裂解劑不與遠(yuǎn)端腫瘤接觸；以及(b)對治療的第一腫瘤施加體內(nèi)刺激，形成剌激的第一腫瘤，遠(yuǎn)端腫瘤不被剌激，其中所述的受試者是人或動(dòng)物。
30.權(quán)利要29的方法，其中將裂解劑與第一腫瘤的腫瘤細(xì)胞接觸發(fā)生在施加體內(nèi)剌激以前；或向腫瘤施加體內(nèi)刺激發(fā)生在裂解劑與腫瘤細(xì)胞接觸以前；或裂解劑與腫瘤細(xì)胞接觸以及施加體內(nèi)刺激同時(shí)發(fā)生。
31.權(quán)利要29的方法，進(jìn)一步包括裂解劑與至少一個(gè)腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)接觸之后，但在施加體內(nèi)剌激以前，等第一段時(shí)間。
32.權(quán)利要31的方法，進(jìn)一步包括重復(fù)第一輪數(shù)的下列方法步驟(a)將裂解劑與第一腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)接觸；等一段時(shí)間；以及(b)對治療的第一腫瘤施加體內(nèi)刺激。
33.權(quán)利要求32的方法，其中第一輪數(shù)在1到大約5輪的范圍內(nèi)。
34.權(quán)利要求32的方法，其中第一段時(shí)間為大1到大約10夭。
權(quán)利要求
1.在具有至少一個(gè)腫瘤位點(diǎn)的受試者中除去腫瘤細(xì)胞的方法，該方法包括(a)在裂解條件下，將裂解劑與至少一個(gè)腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)接觸，形成治療的腫瘤；以及(b)對治療的腫瘤施加充分的體內(nèi)刺激，形成刺激的腫瘤。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將裂解劑與腫瘤細(xì)胞接觸發(fā)生在施加體內(nèi)刺激以前；或在裂解劑與腫瘤細(xì)胞接觸以前施加體內(nèi)刺激；或裂解劑與腫瘤細(xì)胞接觸以及施加體內(nèi)刺激同時(shí)發(fā)生。
3.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括裂解劑與至少一個(gè)腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)接觸之后，但在施加體內(nèi)刺激以前，等第一段時(shí)間。
4.權(quán)利要求3的方法，進(jìn)一步包括重復(fù)第一輪數(shù)的下列方法步驟(a)將裂解劑與治療的腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)接觸；等一段時(shí)間；以及(b)對治療的腫瘤施加體內(nèi)刺激。
5.權(quán)利要求4的方法，其中第一輪數(shù)在1到大約5輪的范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求4的方法，其中第一段時(shí)間為大約1到大約10天。
7.利要求4的方法，進(jìn)一步包括向治療的腫瘤施加第二輪數(shù)的體內(nèi)刺激。
8.利要求7的方法，其中第二輪數(shù)在大約1到大約16輪的范圍內(nèi)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中施加刺激大約15分鐘到大約90分鐘。
10.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤包括鼻咽癌、軟骨肉瘤、結(jié)腸癌、Dukes’s D和非小細(xì)胞肺癌。
11.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤細(xì)胞是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌(ovarian cancer)、惡性肝癌、食管癌、小細(xì)胞肺癌、肺癌、直腸癌、胃癌、卵巢癌(carcinoma of ovarium)、腹水或黑色素瘤的細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1的方法，其中裂解劑包括在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的分離的溶瘤病毒，該病毒在非腫瘤細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制受到抑制；其中裂解條件包含感染性條件。
13.權(quán)利要求12的方法，其中分離的溶瘤病毒包括不含功能性病毒癌蛋白的腺病毒；其中腫瘤細(xì)胞缺乏功能性的p53或功能性的RB基因產(chǎn)物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中功能性的病毒癌蛋白包括p53或RB結(jié)合蛋白。
15.權(quán)利要求1的方法，其中裂解劑包括具有與SeqID#1有至少95％同一性或與SeqID#2有至少95％同一性的序列的分離的溶瘤病毒；裂解條件包括感染性條件。
16.權(quán)利要求1的方法，其中分離的溶瘤病毒是分離的單純皰疹病毒、分離的呼腸孤病毒、分離的新城疫病毒、分離的脊髓灰質(zhì)炎病毒、分離的麻疹病毒、或分離的水皰性口膜炎病毒。
17.權(quán)利要求1的方法，其中的裂解劑包括溶瘤細(xì)菌。
18.權(quán)利要求17的方法，其中的溶瘤細(xì)菌是沙門氏菌屬、雙歧桿菌屬、志賀氏菌屬、利斯特氏菌屬、耶爾森氏菌屬或梭狀芽孢桿菌屬。
19.權(quán)利要求1的方法，其中裂解劑包括分離的核酸表達(dá)構(gòu)建體，其編碼下列基因，包括凋亡基因、細(xì)胞溶解基因、腫瘤壞死因子基因、負(fù)I-κ-β基因、caspase基因、γ球蛋白基因或hα-1抗胰蛋白酶，其中編碼的基因用于溶解腫瘤的目的。
20.權(quán)利要求1的方法，其中體內(nèi)刺激包括在高于受試者的正常體溫大約1到大約7攝氏度范圍內(nèi)的局部高溫。
21.權(quán)利要求1的方法，其中體內(nèi)刺激包括高頻電磁脈沖。
22.權(quán)利要求1的方法，其中體內(nèi)刺激包括射頻透熱法，其中射頻在0.1到100MHz的范圍內(nèi)。
23.權(quán)利要求1的方法，其中體內(nèi)刺激包括微波透熱法，其中微波在100到2,450MHz的范圍內(nèi)。
24.權(quán)利要求1的方法，其中刺激包括超聲透熱法。
25.權(quán)利要求1的方法，其中體內(nèi)刺激包括全身性高溫。
26.權(quán)利要求1的方法，其中刺激是缺氧、輻射、醇或谷氨酰胺處理或感染。
27.權(quán)利要求1的方法，其中與施加刺激前的腫瘤相比，刺激的腫瘤以提高的水平表達(dá)至少一種侶伴蛋白，且其中該侶伴蛋白包括熱休克蛋白(″HSP″)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中熱休克蛋白為HSP70、Hsp30、Hsp60、Hsp90、Hsp94、Hsp96或Hsp110。
29.在具有至少第一腫瘤和遠(yuǎn)端腫瘤的受試者中除去腫瘤細(xì)胞的方法，該方法包括(a)在裂解條件下，將裂解劑與第一腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)接觸，形成治療的腫瘤，裂解劑不與遠(yuǎn)端腫瘤接觸；以及(b)對治療的第一腫瘤施加體內(nèi)刺激，形成刺激的第一腫瘤，遠(yuǎn)端腫瘤不被刺激。
30.權(quán)利要求29的方法，其中將裂解劑與第一腫瘤的腫瘤細(xì)胞接觸發(fā)生在施加體內(nèi)刺激以前；或向腫瘤施加體內(nèi)刺激發(fā)生在裂解劑與腫瘤細(xì)胞接觸以前；或裂解劑與腫瘤細(xì)胞接觸以及施加體內(nèi)刺激同時(shí)發(fā)生。
31.權(quán)利要求29的方法，進(jìn)一步包括裂解劑與至少一個(gè)腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)接觸之后，但在施加體內(nèi)刺激以前，等第一段時(shí)間。
32.權(quán)利要求31的方法，進(jìn)一步包括重復(fù)第一輪數(shù)的下列方法步驟(a)將裂解劑與第一腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)接觸；等一段時(shí)間；以及(b)對治療的第一腫瘤施加體內(nèi)刺激。
33.權(quán)利要求32的方法，其中第一輪數(shù)在1到大約5輪的范圍內(nèi)。
34.權(quán)利要求32的方法，其中第一段時(shí)間為大約1到大約10天。
35.權(quán)利要求32的方法，進(jìn)一步包括向治療的第一腫瘤重復(fù)施加第二輪數(shù)的體內(nèi)刺激。
36.權(quán)利要求32的方法，其中第二輪數(shù)在1到大約16輪的范圍內(nèi)。
37.權(quán)利要求29的方法，其中施加刺激大約15分鐘到大約90分鐘。
38.權(quán)利要求29的方法，其中第一腫瘤是鼻咽癌、軟骨肉瘤、結(jié)腸癌、Dukes’s D或非小細(xì)胞肺癌，且遠(yuǎn)端腫瘤含有其轉(zhuǎn)移。
39.權(quán)利要求29的方法，其中第一腫瘤的腫瘤細(xì)胞是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌(ovarian cancer)、惡性肝癌、食管癌、小細(xì)胞肺癌、肺癌、直腸癌、胃癌、卵巢癌(carcinoma of ovarium)、腹水或黑色素瘤的細(xì)胞；且遠(yuǎn)端腫瘤含有其轉(zhuǎn)移。
40.權(quán)利要求29的方法，其中裂解劑包括在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的分離的溶瘤病毒，其在非腫瘤細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制受到抑制；其中裂解條件包括感染性條件。
41.權(quán)利要求40的方法，其中分離的溶瘤病毒包括不含功能性病毒癌蛋白的腺病毒；并且其中腫瘤細(xì)胞缺乏功能性的p53或功能性的RB基因產(chǎn)物。
42.權(quán)利要求41的方法，其中功能性的病毒癌蛋白包括p53或RB結(jié)合蛋白。
43.權(quán)利要求29的方法，其中裂解劑包括具有與SeqID#1有至少95％同一性或與SeqID#2有至少95％同一性的序列的分離的溶瘤病毒；裂解條件包括感染性條件。
44.權(quán)利要求29的方法，其中分離的溶瘤病毒是分離的單純皰疹病毒、分離的呼腸孤病毒、分離的新城疫病毒、分離的脊髓灰質(zhì)炎病毒、分離的麻疹病毒或分離的水皰性口膜炎病毒。
45.權(quán)利要求29的方法，其中裂解劑包括溶瘤細(xì)菌。
46.權(quán)利要求45的方法，其中溶瘤細(xì)菌是沙門氏菌屬、雙歧桿菌屬、志賀氏菌屬、利斯特氏菌屬、耶爾森氏菌屬或梭狀芽孢桿菌屬。
47.權(quán)利要求29的方法，其中裂解劑包括分離的核酸表達(dá)構(gòu)建體，其編碼下列基因，包括凋亡基因、細(xì)胞溶解基因、腫瘤壞死因子基因、負(fù)I-κ-β基因、caspase基因、γ球蛋白基因或hα-1抗胰蛋白酶，其中編碼的基因用于溶解腫瘤的目的。
48.權(quán)利要求29的方法，其中體內(nèi)刺激包括在高于受試者的正常體溫大約1到大約7攝氏度范圍內(nèi)的局部高溫。
49.權(quán)利要求29的方法，其中體內(nèi)刺激包括高頻電磁脈沖。
50.權(quán)利要求29的方法，其中體內(nèi)刺激包括射頻透熱法，其中射頻在0.1到100MHz的范圍內(nèi)。
51.權(quán)利要求29的方法，其中體內(nèi)刺激包括微波透熱法，其中微波在100到2,450MHz的范圍內(nèi)。
52.權(quán)利要求29的方法，其中刺激包括超聲透熱法。
53.權(quán)利要求29的方法，其中體內(nèi)刺激包括全身性高溫。
54.權(quán)利要求29的方法，其中刺激是缺氧、輻射、醇或谷氨酰胺處理或感染。
55.權(quán)利要求29的方法，其中與施加刺激前的腫瘤相比，刺激的第一腫瘤以提高的水平表達(dá)至少一種侶伴蛋白，且其中該侶伴蛋白包括熱休克蛋白(″HSP″)。
56.權(quán)利要求55的方法，其中熱休克蛋白為HSP70、Hsp30、Hsp60、Hsp90、Hsp94、Hsp96或Hsp110。
57.在具有遠(yuǎn)端鼻咽癌和第一鼻咽癌的受試者中縮小遠(yuǎn)端鼻咽癌的方法，包括(a)將分離的溶瘤腺病毒與第一鼻咽癌接觸，形成治療的癌；(b)等待第一段時(shí)間；(c)向該治療的癌施加第二段時(shí)間的刺激；該刺激在高于受試者的正常體溫大約1至大約7攝氏度的范圍內(nèi)升高了治療的癌的局部溫度；(d)重復(fù)第一輪數(shù)的步驟(a)、(b)和(c)；且(e)重復(fù)第二輪數(shù)的步驟(c)；其中，第一段時(shí)間在大約1到10天的范圍內(nèi)；第二段時(shí)間為大約15分鐘到大約90分鐘；第一輪數(shù)在1到大約5輪的范圍內(nèi)；第二輪數(shù)在大約1到大約16輪的范圍內(nèi)。
58.權(quán)利要求57的方法，其中分離的溶瘤腺病毒包含SeqID#1或SeqID#2。
59.權(quán)利要求57的方法，其中刺激定位于治療的癌且刺激選自由下列組成的組高頻電磁脈沖；0.1到100Mhz范圍內(nèi)的射頻透熱法；100到2,450MHz范圍內(nèi)的微波透熱法；或超聲透熱法，其中刺激提高了第一腫瘤中的侶伴蛋白的水平，且該侶伴蛋白為Hsp70、Hsp30、Hsp60、Hsp90、Hsp94、Hsp96或Hsp110。
60.分離的核酸，包含與SeqID#1有至少95％同一性的序列，或SEQID#1的簡并變體。
61.分離的核酸，包含與SeqID#2有至少95％同一性的序列，或SEQID#2的簡并變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及在有至少一個(gè)腫瘤位點(diǎn)的患者中除去腫瘤細(xì)胞的組合物和方法。更具體地，該方法包括在細(xì)胞溶解條件下，將至少一個(gè)腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞溶解劑在體內(nèi)接觸，形成治療的腫瘤；并對該治療的腫瘤施加充分的體內(nèi)刺激物，形成刺激的腫瘤。包括在患者中縮小局部腫瘤或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移腫瘤，或同時(shí)縮小兩者的組合物和方法。在一個(gè)優(yōu)選方案中，在患者中縮小腫瘤的方法包括用細(xì)胞溶解劑與刺激的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)接觸。針對該腫瘤細(xì)胞上的刺激能夠增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的伴侶蛋白的水平。細(xì)胞溶解劑和腫瘤細(xì)胞刺激的聯(lián)合導(dǎo)致直接治療的腫瘤的縮小，其中該刺激同時(shí)地或者順序地施加。而且，通過向第一腫瘤(“治療的腫瘤”或“局部腫瘤”)內(nèi)的刺激的腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入細(xì)胞溶解劑，也減小了未直接治療的遠(yuǎn)端或轉(zhuǎn)移性腫瘤。為了使腫瘤縮小的效果最佳化，重復(fù)包括向腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入細(xì)胞溶解劑和進(jìn)行刺激的優(yōu)選的方法步驟。
文檔編號(hào)C12N7/00GK1780632SQ200480005146
公開日2006年5月31日 申請日期2004年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月28日
發(fā)明者胡放, 吳波 申請人:上海三維生物技術(shù)有限公司