專利名稱：生產(chǎn)具有良好農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值的甘藍型油菜雙低恢復(fù)系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生Ogura胞質(zhì)雄性不育(cms)的甘藍型油菜(Brassica napus)雙低恢復(fù)系的方法，所述甘藍型油菜呈現(xiàn)出攜帶Rfo恢復(fù)基因的蘿卜漸滲物(introgression)，其中缺失蘿卜Pgi-2等位基因并重組入甘藍(Brassica oleracea)的Pgi-2基因，所述甘藍型油菜還具有良好農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo傳遞率和高營養(yǎng)勢。本發(fā)明還涉及形成甘藍型油菜雜交種子及其后代的方法以及選擇標志物的用途。
培育油菜籽(Brassica napus L.)Ogu-INRA胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic MaleSterility，cms)系統(tǒng)的恢復(fù)系一直是幾年的主要目標。繁雜的回交和系譜育種對于提高雌性可育性并獲得雙低恢復(fù)系是必要的。所謂“雙低”品種是油中的芥酸低且煉油后剩余固體食物中芥子油苷(glucosinolate)低的那些品種。然而，大規(guī)模的蘿卜基因漸滲導(dǎo)致繁育這些系時仍遇到一些困難(基因漸滲重排，可能與負性性狀連鎖)。
因此發(fā)明人為自己設(shè)定目標提供新的改進的具有良好農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值的雙低恢復(fù)系。
通過生產(chǎn)油菜籽中Ogu-INRA cms的重組雙低恢復(fù)系的新方法而實現(xiàn)這個目標。
本發(fā)明第一個目標涉及生產(chǎn)Ogura胞質(zhì)雄性不育(cms)的甘藍型油菜雙低恢復(fù)系的方法，所述甘藍型油菜呈現(xiàn)出攜帶Rfo恢復(fù)基因的蘿卜漸滲物，其中缺失蘿卜Pgi-2等位基因并重組入甘藍的Pgi-2基因，所述甘藍型油菜還具有良好農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo傳遞率和高營養(yǎng)勢，所述方法包括以下步驟a)將含缺失蘿卜插入物的春性甘藍型油菜的雙低cms系與春性Drakkar的雙低系雜交，以形成甘藍型油菜的雜合恢復(fù)植株，b)減數(shù)分裂前用γ射線輻照由步驟a)獲得的雜合恢復(fù)植株，c)將步驟b)所得花的花粉與cms雙低春性Wesroona系雜交，d)測試后代的營養(yǎng)勢、雌性可育性和cms基因傳遞率，e)選擇后代品系。
本發(fā)明中，術(shù)語“品系”表示基本純合的并可經(jīng)自花傳粉繁殖的植物。
根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟b)的輻照劑量是6mn期間65Gray。
根據(jù)本發(fā)明方法實施方案的一種有利形式，步驟a)中春性甘藍型油菜的雙低cms系是R211。
R211是INRA春性恢復(fù)系。
Drakkar是法國春性注冊品種。
Wesroona是澳大利亞春性注冊品種。
根據(jù)本發(fā)明方法實施方案的一種有利形式，用選自PGIol、PGIUNT、PGIint、BolJon和CP418的五個標志物的組合進行測試。
本發(fā)明的另一個目標涉及Ogura cms的甘藍型油菜雙低恢復(fù)系，所述甘藍型油菜呈現(xiàn)出Rfo插入，其中缺失蘿卜Pgi-2等位基因并重組入甘藍的Pgi-2基因，所述甘藍型油菜還具有良好農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo傳遞率和高營養(yǎng)勢。
根據(jù)一種有利形式的實施方案，所述雙低恢復(fù)系呈現(xiàn)出選自PGIol、PGIUNT、PGIint、BolJon和CP418的五個標志物的獨特組合。
本發(fā)明另一個目標涉及形成甘藍型油菜植物及其后代的方法，它們通過以下步驟獲得a)提供根據(jù)權(quán)利要求1生產(chǎn)并繁育成純合的恢復(fù)系，b)將所述恢復(fù)系作為傳粉者用于雜交生產(chǎn)領(lǐng)域，c)將cms不育植物作為生產(chǎn)雜交種種子的植物用于雜交生產(chǎn)領(lǐng)域，和d)從所述雄性不育植物收獲雜交種種子。
本發(fā)明另一個目標涉及由根據(jù)本發(fā)明方法獲得的甘藍型油菜的種子。
本發(fā)明的另一個目標涉及甘藍型油菜的種子，其于2003年7月4日以參考編號NCIMB41183保藏于NCIMB Limited，23St Machar Drive，Aberdeen，Scotland，AB243RY，UK。
本發(fā)明的另一個目標涉及至少四個標志物PGIol、PGIint、BolJon和CP418的組合、或其中包含至少一個多態(tài)性位點的任意部分用于表征Ogura cms的甘藍型油菜重組恢復(fù)系的用途，所述甘藍型油菜呈現(xiàn)Rfo插入，其中缺失蘿卜Pgi-2等位基因并重組入甘藍的Pgi-2基因，所述甘藍型油菜還具有良好農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo傳遞率和高營養(yǎng)勢。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述組合是五種標志物PGIol、PGIUNT、PGIint、BolJon和CP418的組合。
在本發(fā)明中，表述“其中包含至少一個多態(tài)性位點的任意部分”表示顯示出甘藍型序列和蕪菁(B.rapa)型序列之間至少一種差異的序列的任意部分。
這些標志物在關(guān)于R2000品系的以下附圖和序列表中被示出。
根據(jù)一種有利形式的實施方案，本發(fā)明涉及—標志物PGIol，用引物PGIol U和PGIol L擴增(PGIol U5′TCATTTGATTGTTGCGCCTG3′；PGIol L5′TGTACATCAGACCCGGTAGAAAA3′)—標志物PGIint，用引物PGIint U和PGIint L擴增(PGIint U5′CAGCACTAATCTTGCGGTATG3′；PGlint L5′CAATAACCCTAAAAGCACCTG3′)—標志物PGIUNT，用引物PGIol U和PGIintL擴增(PGIol U5′TCATTTGATTGTTGCGCCTG3′；PGIint L5′CAATAACCCTAAAAGCACCTG3′)—標志物BolJon，用引物BolJon U和BolJon L擴增(BolJon U5′GATCCGATTCTTCTCCTGTTG3；BolJon L5′GCCTACTCCTCAAATCACTCT3′)—標志物CP418，用引物SG129U和pCP418L擴增(SG129U參見Giancola et al，2003 Theor Appl.Genet.(in press)pCP418L5′AATTTCTCCATCACAAGGACC3′)本發(fā)明的另一個目標涉及標志物PGIol、PGIUNT、PGIint、BolJon和CP418，它們的序列如下
PGIol R2000標志物TCATTTGATT GTTGCGCCTG TCGCCTTGTT GTGTTATGAT GAATGAACAG CAGTCATTTA 60ACATGTGGTT AACTTAACAG GGCTCCGGCT GTTGCAAAAC ACATGGTTGC TGTCAGCACT 120AATCTTGCGG TATGAATTTG TGATTAAATT TGTTTGTTTG TGACTCTTTC TTCATTGTTC 180GTTTTCGTAC AATAAACCGA ATGTATAATC TTTTTACAAA CTGAATTTTC TACCGGGTCT 240GATGTACA 248PGIUNT R2000標志物TCATTTGATT GTTGCGCCTG TCGCCTTGTT GTGTTATGAT GAATGAACAG CAGTCATTTA 60ACATGTGGTT AACTTAACAG GGCTCCGGCT GTTGCAAAAC ACATGGTTGC TGTCAGCACT 120AATCTTGCGG TATGAATTTG TGATTAAATT TGTTTGTTTG TGACTCTTTC TTCATTGTTC 180GTTTTCGTAC AATAAACCGA ATGTATAATC TTTTACAAAC TGAATTTTCT ACCGGGTCTG 240ATGTACAATG CTAGTCTCCA TGTTCTTGGG GATCATGATT TATTTTCTAC ATGTATTCAG 300ACAGTACAGA AGAAAGTGTT CAAAACTCTG GATGTTTTAA TTTACAGTTA GTGGAGAAGT 360TCGGCATTGA TCCGAACAAT GCATTTGCAT TTTGGGACTG GGTTGGTGGA AGGTACAGTG 420GTAAGTGCTT GTTTATTTGG TTGTATAAAT TTCTCGTCCA TTTCCGCTTG CTTAGTGTAT 480AACTGAAATT CTTTTGCAGT TTGCAGTGCT GTTGGAGTCT TACCATTGTC TCTACAGTAT 540GGCTTCTCTG TGGTTGAGAA GTACGGTACC TTCTACTTTA TCAGCCATCT CATAAAATGT 600CTTAGGCATA TTCTTTCTAT TTTATTTCCC TCTTAATGAT TTCTTCTTTT TTTTATTGCA 660TTCCCGTTTT ATTTTCAAAA GTTGTTACTG TCTCTAAATC AAGAAGAAAC CTTCTTAGTA 720GATCCAGCTG ATATTCAGCC TTTTTTAAAT TGGACTGCAG GTTTTTAAAG GGGAGCTTCA 780AGCATTGATA AGCATTTCCA GTCCACACCG TTTGAGAAGA ATATACCCGT GAGTTGCATT 840AGTTGTGTGA TTATACAGTT TTCTTGTCTT TTTGCTATGT CCATCAACAC TAGAGATTCG 900TGAAGTTATT AGTGTAGTCA ACGCATAGGG AGAGGTGATT GGTGACTTTT GGACGATTTC 960AGGTGCTTTA GGGTTATTG 979PGIint R2000標志物CAGCACTAAT CTTGCGGTAT GAATTTGTGA TTAAATTTGT TTGTTTGTGA CTCTTTCTTC 60ATTGTTCGTT TTCGTACAAT AAACCGAATG TATAATCTTT TACAAACTGA ATTTTCTACC 120GGGTCTGATG TACAATGCTA GTCTCCATGT TCTTGGGGAT CATGATTTAT TTTCTACATG 180TATTCAGACA GTACAGAAGA AAGTGTTCAA AACTCTGGAT GTTTTAATTT ACAGTTAGTG 240GAGAAGTTCG GCATTGATCC GAACAATGCA TTTGCATTTT GGGACTGGGT TGGTGGAAGG 300TACAGTGGTA AGTGCTTGTT TATTTGGTTG TATAAATTTC TCGTCCATTT CCGCTTGCTT 360AGTGTATAAC TGAAATTCTT TTGCAGTTTG CAGTGCTGTT GGAGTCTTAC CATTGTCTCT 420ACAGTATGGC TTCTCTGTGG TTGAGAAGTA CGGTACCTTC TACTTTATCA GCCATCTCAT 480AAAATGTCTT AGGCATATTC TTTCTATTTT ATTTCCCTCT TAATGATTTC TTCTTTTTTT 540TATTGCATTC CCGTTTTATT TTCAAAAGTT GTTACTGTCT CTAAATCAAG AAGAAACCTT 600CTTAGTAGAT CCAGCTGATA TTCAGCCTTT TTTAAATTGG ACTGCAGGTT TTTAAAGGGG 660AGCTTCAAGC ATTGATAAGC ATTTCCAGTC CACACCGTTT GAGAAGAATA TACCCGTGAG 720TTGCATTAGT TGTGTGATTA TACAGTTTTC TTGTCTTTTT GCTATGTCCA TCAACACTAG 780AGATTCGTGA AGTTATTAGT GTAGTCAACG CATAGGGAGA GGTGATTGGT GACTTTTGGA 840CGATTTCAGG TGCTTTAGGG TTATTG 866
BolJon R2000標志物GATCCGATTC TTCTCCTGTT GAGATCAGCT CCAAACATCA AACAACTTGT ACACAAATAT 60CTTTACTTGC TAAATGGAAC ATGACAAGAG ATAGAAAATC TTGCTCATAG TATTGTACAA 120GGGATAACAG TGTAGAAAAC AAACCGTCTG TAAGATTTTC TCCCTGATCC TCTCACTTAA 180CCAGTAGGCG TTTTTCACAT TGAAGCGCAT ATCTACTTTG GTATTCACTG AATAAAAAAA 240GAAAGCTGGT AACATGTGAA GGATATACAA GCATTGATAC ACCAAGTAGT CACAAACTAC 300ATTATAAAGG TCAGACCTTT GTTCACATTC TGGCCTCCAG GACCACCGCT TCTAGCAAAG 360TTAAGCGTAA CATGGTCTGC ACGTATACAA ATGAAAATGT TTCTATCAAA ATCCTATAAA 420ATAGAGCTCT ATAACATTGT CGATACATAG TTTCACTAAC TCTGCAAGTA CTAAACACAT 480ATACAAACAA AACTATGCGA ACAGATCAAA ACTACTACAG AACACAGTTC TATGACACTG 540TCGATAGTAA CATCCTCTGC AAGTACCAAA GAGATAGCAA ATGAAACTAT GTAAACAAAT 600CAAAATTCTA AATTTCTCCA TCACAAGGAC CTACAGAATA GAGTTATCAT AACATTTTCT 660GTAAATATTT CCATCAAAAT GACTAGAGAA CAGAGTTCTT ATAACATTAT CTGTAAATGT 720TCCAACAAAA CCACTACATA GCAGAGTTCT TATAACATTG TCTGTAAATG TCCAATCAAA 780ACCACTACAG AACAAAGCTC CTATAACATT GTTTATACAA AGTTTCACTA AATCTACAAA 840CTTTCCCCGT AAATGAGCTT AATATCACCC AAAGATGTTT CAATCAGATA AAGAGTACGA 900CATCGTTTTG AGATTAGAAC AAACTGAAAC TTACGTAGAG TGATTTGAGG AGTAGGC 957CP418L R2000標志物AATTTCTCCA TCACAAGGAC CTACAGAATA GAGTTATCAT AACATTTTCT GTAAATATTT 60CCATCAAAAT GACTAGAGAA CAGAGTTCTT ATAACATTAT CTGTAAATGT TCCAACAAAA 120CCACTACATA GCAGAGTTCT TATAACATTG TCTGTAAATG TCCAATCAAA ACCACTACAG 180AACAAAGCTC CTATAACATT GTTTATACAA AGTTTCACTA AATCTACAAA CTTTCCCCGT 240AAATGAGCTT AATATCACCC AAAGATGTTT CAATCAGATA AAGAGTAACG ACATCGTTTT 300GAGATTAGAA CAAACTGAAA CTTACGTAGA GTGATTTGAG GAGTAGGCTC GTTGCCAGCA 360GAGCTAGCTC TCTCCTCCGC CTCATGAAGC ATCTGTTGCA CCTGAGACAA CCGTGACGAA 420ACTTTCCGAT CACCGCCACC AGAATTCGAC GCCGCGCATC GGAAGGATCC GAATCGGGAA 480CTGAGTGAAC CCGAGCGATC CCGGGAGTGC GACGGAGCGA TGGGAAAAGA GAGTGGCACG 540ATTTCGACGA AGAGTGGAAG AGGAGAGGGT GGTGGATAAA CTCGCGTATG ATCAAGTTCG 600TCATCGTCCT GATTGCCGCC ATTTTTTTTG TCAGGGCGCT CTGTGGCTTA GAAGTTTCCG 660ATGTCAATGA AC 672在下面的附圖中，使用以下縮寫DraDrakkarRel-15-1，E38，R15 R2000Hete，Hel，R211.Drakkar雜合R211*DrakkarDarm DarmorBol 甘藍Bra，B.rap 蕪菁GCPA 18-A 19，Wes，Aust WesroonaSam，SamlPGIolSunt5SamouraiRRH1，ba2c RRH1rav，N.WR 雜交種甘藍型油菜*野生蘿卜
—

圖1表示γ射線輻照和F2產(chǎn)生。
—圖2表示‘R211’和‘R2000’上產(chǎn)生的種子。
—圖3表示不同品系每個莢中的種子數(shù)。
—圖4表示PGIol引物在數(shù)據(jù)庫中PGI序列片段上的定位。在該圖中PGIol —引物PGIol U(在SGAP中稱為BnPGIch 1U)—引物PGIol L(在SGAP中稱為Bn PGIch 1L)PGIint—引物PGIint U—引物PGIint L(位于序列以外)—圖5表示PGI-2基因(PGIol)、PCR標記物和SG34、接近Rfo的PCR標記物的電泳凝膠。
—圖6表示用PGIol引物經(jīng)PCR擴增的Pgi-2DNA片段。
—圖7表示PCR產(chǎn)物PGIol經(jīng)Msel消化的結(jié)果。
圖中Sam和Darm具有75bp帶。
Drak、R211.Dk和R2000顯示70bp帶(丙烯酰胺15％)。
8與Samourai相似(75bp)；與Drakkar(70bp)混合使得顯示兩條帶。
—圖8表示PGIUNT標志物的電泳瓊脂糖凝膠。
圖中PGIUNT帶(約980bp)存在于甘藍、蕪菁(B.rapa cv Asko)，除‘R211’以外的保持系和恢復(fù)系。
在蘿卜和擬南芥中擴增不到。
在多種蕓苔屬基因型中僅擴增一條帶。片段大小相似但序列不同。
—圖9表示PGIint PCR標志物的電泳凝膠。
圖中蘿卜品系7的PGIint約為950bp。該帶與恢復(fù)系RRH1和R113的相同。未在R211中發(fā)現(xiàn)。也未在R2000中發(fā)現(xiàn)。然而PGIint帶與多種蕓苔屬物種中的約870bp具有相似大小但序列不同。
—圖10表示BolJon PCR標志物的電泳凝膠。
圖11表示CP418標志物的電泳凝膠。
圖中，CP418帶(約670bp)對所述甘藍基因組是特異的。它存在于甘藍、甘藍型油菜(Samourai，Drakkar，Pactol和雜合的R2111*Dk)。它不存在于恢復(fù)的油菜籽(RRH，R113和R211)。它存在于所述純合的R2000。
—圖12表示標志物總結(jié)表。
—圖13(13(a)，13(b))表示擬南芥、蘿卜、蕪菁、甘藍和R2000之間的PGIol標志物序列匹配。
—圖14(14(a)，14(b)，14(c)，14(d))表示擬南芥、蘿卜、蕪菁、甘藍和R2000之間的PGIint-UNT標志物序列匹配。
—圖15(15(a)，15(b)，15(c))表示擬南芥、蘿卜、蕪菁、甘藍和R2000之間的CP418L標志物序列匹配。
—圖16(16et 16bis)表示擬南芥、蘿卜、蕪菁BolJon標志物。
對擬南芥的DB序列(AC007190end-AC011000begining)、甘薷EMBH959102end和EMBH448336begining以及甘藍型油菜中SG129標志物帶1和2的代表性共有序列(分別在Drakkar和Samourai中)進行匹配。
從位點836bp開始，AC07190-AC11000和GCPATpBOJ序列不再與蕓苔屬序列緊密同源。
分別從858bp位點到900bp和981位點，所述蘿卜和蕪菁(GCPconsen RsRfBOJ和BR)序列仍然與甘藍型油菜序列緊密同源。
蘿卜中，在蕓苔屬序列上向下僅發(fā)現(xiàn)部分同源。
在蕪菁(B.rapa species cv Asko)中，在78bp缺失后，其BolJon序列的左側(cè)，與甘藍和蕪菁(B.rapa)從1057bp位點到BolJon L引物的甘藍型油菜序列可再次匹配。
—圖17(17et 17bis)表示Pgi-2引物在擬南芥MJB21.12序列上的定位。
—圖18表示BolJon引物在mipsAt162850基因以及AC007190和AC011000擬南芥克隆的重疊區(qū)上的定位。與擬南芥BolJonPCR產(chǎn)物(740bp)的匹配被表示出。
然而應(yīng)該明白，給出所述實例只是為了舉例說明本發(fā)明目的，而絕不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
實施例I產(chǎn)生Ogura胞質(zhì)雄性不育(cms)的甘藍型油菜雙低恢復(fù)系的方法，所述甘藍型油菜呈現(xiàn)出攜帶Rfo恢復(fù)基因的蘿卜漸滲物，其中缺失蘿卜Pgi-2等位基因并重組入甘藍的Pgi-2基因，所述甘藍型油菜還具有良好農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo傳遞率和高營養(yǎng)勢。
材料和方法基因型缺失蘿卜插入物的“R211”與春性低GLS油菜“Drakkar”雜交產(chǎn)生F1子代(‘R211*Dk’)。春性GLS cms系‘Wesroona’(澳大利亞來源)用于后續(xù)的雜交。在分子分析中用作對照來源于攜帶完全(‘RRH1’)或不完全(‘R113’)基因漸滲的‘Samourai’的冬性恢復(fù)系、以及歐洲蘿卜品系7、亞洲恢復(fù)蘿卜D81、雜交種甘藍型油菜*野生蘿卜、甘藍、和B.rapa cv Asko、擬南芥。
γ射線輻照在受控區(qū)域用Co60源的γ射線處理整株開花中的植株。減數(shù)分裂前給予65Gray亞致死劑量。
測交和F2產(chǎn)生去除大于2mm的花蕾后將輻照植株轉(zhuǎn)移入防蟲溫室。輻照過的F1子代用于手工授粉cms‘Wesroona’品系。使恢復(fù)系來源的F1’植株產(chǎn)生F2家族，單獨收獲并與非輻照對照一起精確播種于試驗田中(圖1)。
表型選擇在兩年田間試驗中對1200個F2子代和44個對照(82330引用植株)進行三個視覺標準評分(1到5分)，1-營養(yǎng)勢，2-F2分離中可育/不育植株比例的正規(guī)性，和3-雌性可育性(生莢和結(jié)種)。
從大田或溫室中獲得所選家族的自交后代并產(chǎn)生純合系(F4)，供進一步分析。
同工酶分析按下文操作(Delourne R.and Eber F.1992.Theor Appl Genet85222-228)，標志物開發(fā)根據(jù)(Fourmann M et al 2002.Theor Appl.Genet.1051196-1206)經(jīng)測序驗證PCR產(chǎn)物。用BlastNcbi和Uk Crop Net Brassica DB和Multialin軟件INRA Toulouse進行匹配分析。
方法我們選擇已經(jīng)表現(xiàn)出基因漸滲的缺失的一種低GLS春性純合恢復(fù)系‘R211’(Delourme R.and Eber F.1992.Theor Appl Genet 85222-228.Delourme R et al 1998.Theor Appl Genet 97129-134.Delourme R.et al 1999.10thIht.Rapeseed CongressCanberra.)。在Rfo兩側(cè)缺少幾個分子標志物，如spATCHIA(Fourmann M et al 2002.Theor Appl.Genet.1051196-1206)，spSG91(Giancola S et al 2003 Theor Appl.Genet.(in press))。‘R211’丟失蘿卜基因的Pgi-2等位基因的同工酶表達，也丟失甘藍基因組Pgi-2等位基因(1，2)之一的表達。進而，純合‘R211’表現(xiàn)連鎖的負性性狀如低營養(yǎng)勢和結(jié)種(seed set)極差。我們假設(shè)這些植株缺乏油菜染色體片段。來源于這些材料的F2代中的可育比例低于預(yù)期(64％，而不是75％)。我們從這種‘R211’系啟動了項目，并試圖進行來自該缺失系的攜帶漸滲物的Rfo和來自雙低甘藍型油菜品系的油菜同源染色體之間的重組。
已知電離輻射誘導(dǎo)通過雙鏈斷裂隨后異常重連接斷裂末端而進行的染色體重排。在即將減數(shù)分裂之前使用γ射線輻照來源于‘R211’的雜合F1，從而誘導(dǎo)染色體斷裂，以使缺失的蘿卜漸滲物重組入油菜基因組中。
結(jié)果在測試的1200個F2家族中，很少家族在三個標準方面有最好得分。
只有一個，即‘R2000’被證明每個自交后代產(chǎn)生正常比例的可育植株，并具有穩(wěn)定恢復(fù)良好的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟性狀如良好的雌性可育性，與‘R211’比較還正常結(jié)種(圖2和3)。這個家族從以65Gray/h劑量流的6mn輻照處理中獲得。
芥子油苷分析確認了它的低含量。
圖2(‘R211’和‘R2000’上產(chǎn)生的種子)中R2000顯示正?；ㄐ?，具有正常外觀結(jié)構(gòu)。
圖3(每莢種子數(shù))中，我們觀察—最佳‘R2000’F4家族的自花傳粉(自交)和測交—‘Pactol’cms系、油菜和‘R211’對照。
實施例II在Pgi-2基因中選擇標志物PGI同工酶分析‘R2000’代，表達甘藍基因組的油菜Pgi-2等位基因，該基因原本在‘R211’中丟失。
定義三個PCR標志物用于表征所述R2000家族，與已知恢復(fù)系油菜RRH1和R113比較。
1)開發(fā)來自所述BrassicaDB序列的PGIol標志物，特異性針對所述蕓苔屬(Brassica)基因組。在蘿卜和擬南芥中都沒有擴增，而僅在蕓苔屬中擴增到一個24gbp的帶。
2)PGIint標志物擴增所述Pgi-2基因的較長部分，使得明確區(qū)分所述多種測試物種蕓苔屬物種(Brassica)、蘿卜屬物種(Raphanus)和阿布屬物種(Arabidopsis)。所述物種蕪菁和甘藍無法由瓊脂糖凝膠上的此帶大小區(qū)分，但可由它們的PGIINT帶序列區(qū)分。
3)PGIUnt標志物，PGI ol U和PGI int L引物的組合。這個標志物具有PGIol標志物的特異性，但對于PGIint擴增更長部分。
II.1PGIol標志物用PGIol引物，‘R211’親代品系不顯示擴增，而所述春性測試系顯示248bp帶。其DNA序列與蕓苔屬物種中Crop Net UK DB以及我們組以前的工作(稱為SGAP序列)的PGI-2序列同源(引物SG PGI chou的位置，圖4)。
它是克隆MJB21-12在阿布屬物種(NCBI DB)的染色體V(34543bp)上的同源基因。
PGIol加SG34設(shè)定純合性測試在混合PCR中組合使用兩組引物，PGIol標記在純合恢復(fù)植株中缺少的Pgi-2基因，而SG34(S.Giancola et al.，Giancola S et al 2003 Theor Appl.Genet.(in press))是與Rfo基因非常臨近的標志物，用于區(qū)分在來源于‘R211’的F2代中分離的可育植株中間的純合和雜合植株?？梢允褂门cRfo基因臨近或Rfo基因中的任何其它標志物，代替使用SG34。
只有一個家族R2000在純合和雜合子代中沒有區(qū)別
Pgi-2基因存在于R2000純合子中，這與純合親代R211不同。
圖5(PGIol和SG34PCR標志物)中純合‘R2000’家族已恢復(fù)PGIol帶。
確認了所述帶DNA序列與已知阿布屬和蕓苔屬Pgi-2序列的同源性。對照基因型(Drakkar，Pactol和Samourai，Darmor)在凝膠上具有相同模式。這個常見帶的序列允許確認它們的高度同源性，因為除了一個堿基替換以外它們基本相似。
純合‘R2000’家族已恢復(fù)甘藍型PGIol帶。它與Samourai組的已知恢復(fù)系不同。Pgi-2的這個擴增部分非常保守，在多種基因型中幾乎沒有任何差異。研究了Pgi-2的更長部分。
II.2PGIUNT和PGIint標志物PCR產(chǎn)物的電泳模式PGIUNT標志物在Pgi-2序列進一步向下設(shè)計第二個反向引物PGIint L，以擴增所述基因的保守和可變區(qū)。當與PGIol U引物一起使用時，它只在蕓苔屬基因組中擴增980bp帶。
R211不顯示任何帶，純合‘R2000’顯示PGIUNT帶，這與Drakkar親代相同。
圖8(PGIUNT標志物)中PGIint標志物擴增PGIUNT的片段。上游引物PGIint允許在所有測試物種中擴增，允許明確區(qū)分阿布屬物種、蘿卜屬物種和蕓苔屬物種。蕪菁和甘藍無法由瓊脂糖凝膠上的此帶大小區(qū)分，但可由它們的PGIint序列區(qū)分。除了‘R211’系，所有測試的恢復(fù)基因型都表現(xiàn)歐洲蘿卜的帶和與所述蕪菁序列同源的一條蕓苔屬帶。
純合‘R2000’不顯示所述蘿卜PGIint帶，這與缺失的‘R211’親代系相同，但顯示與所述甘藍序列同源的一條蕓苔屬帶。
PGIint標志物的電泳表示于圖9。
序列分析比較數(shù)據(jù)庫中的PGI序列。
已知約490bp的PGI片段。
我們實驗室小組中已研究了來自不同基因型(甘藍、蕪菁、甘藍型油菜)的約490bp片段的序列，一些序列被M.Fouramnn給予Brassica Crop Net DBEMAF25875-25788(4)。這些序列非常保守。
比較蕪菁和甘藍物種的PGI序列(圖13和14)從甘藍和蕪菁中的測試基因型中我們已經(jīng)獲得PGI序列，這些PGI序列之間的比較顯示它們有21個堿基替換的區(qū)別。這些替換允許區(qū)分PGIint序列和油菜的其它測試基因型，它們與蕪菁(B.rapa cv Asko)(RRH1和R113)或甘藍(Drakkar、R211*DK以及R2000)同源。
實施例III在臨近Rfo區(qū)域選擇標志物測定蘿卜基因插入物中Rfo基因周圍的標志物，以利于克隆Rfo基因(Desloires Set al 2003 EMBO reports4，6588-594)。其中SG129PCR標志物位置與Rfo非常臨近(Giancola S et al 2003 Theor Appl.Genet.(in press))它在甘藍型油菜的甘藍和蕪菁基因組中同時擴增不同帶，但在瓊脂糖凝膠上非常難以看到所述蘿卜帶。
目標SG129序列是克隆(AC011OOO，在F16P17基因座)在擬南芥中的同源基因。這個克隆與擬南芥相鄰重疊群克隆(AC07190)重疊。
從Brassica Crop Net DB，我們發(fā)現(xiàn)與所述A011000起始匹配的一個甘藍克隆(EMBH448336，764bp)，和與ACO7190末端匹配、在擬南芥圖譜上距離約300bp的第二個甘藍克隆(EMBH53971)。
我們設(shè)計了兩個甘藍克隆之間的新PCR標志物BolJon。我們證實了它可以在此處比較的不同基因型中擴增特異性PCR帶。
在圖16(BolJon PCR產(chǎn)物的電泳凝膠)中—在阿布屬物種中擴增到BolJon 815bp帶，它與所述重疊群的重疊片段同源。
—在蕓苔屬二倍體物種中，BolJon標志物顯示不同的帶甘藍中的950bp帶和蕪菁中的870bp帶。它表明所述甘藍克隆(EMBH53971和EMBH448336)在蕓苔屬基因組中序列連續(xù)，因為它對應(yīng)阿布屬物種的同源序列。
—在甘藍型油菜中，這兩條帶在保持系Samourai或Drakkar中同時擴增。
—在蘿卜品系7中，擴增到一條約630bp長的BolJon帶。所述恢復(fù)蘿卜cmsRd81中的帶稍小。
—在所有恢復(fù)油菜品系中，一條BolJon帶與蘿卜品系7中的大小相同。BolJon是蘿卜基因漸滲的標志物。
—純合恢復(fù)的油菜品系‘RRH1’、‘R113’和‘R211’只顯示所述蕪菁帶和630bp蘿卜帶，這提示當蘿卜染色體片段插入油菜甘藍的結(jié)構(gòu)基因組中時，目標基因的甘藍同源基因缺失或被修飾，。
‘R2000’純合植物顯示蘿卜型PCR BolJon，以及所述兩條蕓苔屬BolJon帶，還已經(jīng)恢復(fù)了‘R211’和其它恢復(fù)系中丟失的所述甘藍帶。
我們設(shè)計了引物pCP418L，在所述測試物種中對甘藍基因組特異。和引物SG129U一起，它在甘藍物種中只擴增一條PCR帶(670bp)(圖17)。
在蕪菁、蘿卜、阿布屬物種中都沒有擴增，但在甘藍型油菜保持系中有清晰的CP418帶。其序列與EMBH448336序列嚴格同源。這個標志物是非常保守的DNA序列，除了有或無，不允許基因型之間的多態(tài)性。
在RRH1、R113和R211中沒有CP418帶，與先前一樣這表明在蘿卜插入以后目標基因的甘藍同源基因缺失或者被修飾。
‘R2000’純合植物顯示CP418帶，還已經(jīng)恢復(fù)甘藍特異性帶。
本發(fā)明中，選擇了一個具有良好雌性可育性的新型重組低GLS恢復(fù)系。‘R211’品系的低價值允許在大田中選擇罕見的重組事件并表征‘R2000’家族。
當與已經(jīng)分析的恢復(fù)系油菜比較時，純合‘R2000’表現(xiàn)PGIol、PGIUNT、PGIint和BolJon標志物的獨特組合PGIinT標志物顯示純合恢復(fù)的油菜品系RRH1和R113呈現(xiàn)所述歐洲蘿卜帶，以及與蕪菁基因組同源的一條蕓苔屬帶?！甊2000’不顯示蘿卜帶，如同其親代缺失品系R211一樣而丟失，但顯示一條與甘藍同源的蕓苔屬帶。在R211和Drakkar遺傳背景中用該標志物擴增不到蕪菁基因組中的同源PGIint序列。
BolJon標志物顯示包括‘R211’在內(nèi)的純合恢復(fù)油菜品系呈現(xiàn)出歐洲蘿卜帶并僅加上蕪菁帶?！甊2000’顯示‘R211’的兩條帶加上恢復(fù)甘藍的BolJon帶。
CP418標志物顯示‘R2000’恢復(fù)了這個保守的甘藍片段。
我們的假設(shè)是重組事件發(fā)生在產(chǎn)生‘R2000’植株的花粉母細胞中。然后所述缺失的蘿卜漸滲物被整合到正常同源的染色體片段中，其中攜帶甘藍型Pgi-2基因和BolJon目標序列，其特征是這些標志物，它們可能來自存在于輻照的雜合’R211*DK’中的Drakkar‘00’基因組。
觀察到的BolJon模式提示重組事件導(dǎo)致‘R2000’家族中的獨特重復(fù)區(qū)域，一個來自蘿卜而一個來自甘藍。
序列表<110>國家農(nóng)藝研究院(INRA)<120>生產(chǎn)具有良好農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值的甘藍型油菜雙低恢復(fù)系的方法<130>D21413<160>5<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>248<212>DNA<213>甘藍型油菜<220>
<223>PGIo1標志物<400>1tcatttgatt gttgcgcctg tcgccttgtt gtgttatgat gaatgaacag cagtcattta 60acatgtggtt aacttaacag ggctccggct gttgcaaaac acatggttgc tgtcagcact120aatcttgcgg tatgaatttg tgattaaatt tgtttgtttg tgactctttc ttcattgttc180gttttcgtac aataaaccga atgtataatc tttttacaaa ctgaattttc taccgggtct240gatgtaca 248<210>2<211>979<212>DNA<213>甘藍型油菜<220>
<223>PGI-UNT標志物<400>2tcatttgatt gttgcgcctg tcgccttgtt gtgttatgat gaatgaacag cagtcattta 60acatgtggtt aacttaacag ggctccggct gttgcaaaac acatggttgc tgtcagcact120aatcttgcgg tatgaatttg tgattaaatt tgtttgtttg tgactctttc ttcattgttc180gttttcgtac aataaaccga atgtataatc ttttacaaac tgaattttct accgggtctg240atgtacaatg ctagtctcca tgttcttggg gatcatgatt tattttctac atgtattcag300acagtacaga agaaagtgtt caaaactctg gatgttttaa tttacagtta gtggagaagt360tcggcattga tccgaacaat gcatttgcat tttgggactg ggttggtgga aggtacagtg420gtaagtgctt gtttatttgg ttgtataaat ttctcgtcca tttccgcttg cttagtgtat480aactgaaatt cttttgcagt ttgcagtgct gttggagtct taccattgtc tctacagtat540ggcttctctg tggttgagaa gtacggtacc ttctacttta tcagccatct cataaaatgt600cttaggcata ttctttctat tttatttccc tcttaatgat ttcttctttt ttttattgca660ttcccgtttt attttcaaaa gttgttactg tctctaaatc aagaagaaac cttcttagta720gatccagctg atattcagcc ttttttaaat tggactgcag gtttttaaag gggagcttca780agcattgata agcatttcca gtccacaccg tttgagaaga atatacccgt gagttgcatt840agttgtgtga ttatacagtt ttcttgtctt tttgctatgt ccatcaacac tagagattcg900tgaagttatt agtgtagtca acgcataggg agaggtgatt ggtgactttt ggacgatttc960aggtgcttta gggttattg 979<210>3<211>866<212>DNA<213>甘藍型油菜
<220>
<223>PGI-int標志物<400>3cagcactaat cttgcggtat gaatttgtga ttaaatttgt ttgtttgtga ctctttcttc 60attgttcgtt ttcgtacaat aaaccgaatg tataatcttt tacaaactga attttctacc120gggtctgatg tacaatgcta gtctccatgt tcttggggat catgatttat tttctacatg180tattcagaca gtacagaaga aagtgttcaa aactctggat gttttaattt acagttagtg240gagaagttcg gcattgatcc gaacaatgca tttgcatttt gggactgggt tggtggaagg300tacagtggta agtgcttgtt tatttggttg tataaatttc tcgtccattt ccgcttgctt360agtgtataac tgaaattctt ttgcagtttg cagtgctgtt ggagtcttac cattgtctct420acagtatggc ttctctgtgg ttgagaagta cggtaccttc tactttatca gccatctcat480aaaatgtctt aggcatattc tttctatttt atttccctct taatgatttc ttcttttttt540tattgcattc ccgttttatt ttcaaaagtt gttactgtct ctaaatcaag aagaaacctt600cttagtagat ccagctgata ttcagccttt tttaaattgg actgcaggtt tttaaagggg660agcttcaagc attgataagc atttccagtc cacaccgttt gagaagaata tacccgtgag720ttgcattagt tgtgtgatta tacagttttc ttgtcttttt gctatgtcca tcaacactag780agattcgtga agttattagt gtagtcaacg catagggaga ggtgattggt gacttttgga840cgatttcagg tgctttaggg ttattg 866<210>4<211>957<212>DNA<213>甘藍型油菜<220>
<223>BolJon標志物<400>4gatccgattc ttctcctgtt gagatcagct ccaaacatca aacaacttgt acacaaatat 60ctttacttgc taaatggaac atgacaagag atagaaaatc ttgctcatag tattgtacaa120gggataacag tgtagaaaac aaaccgtctg taagattttc tccctgatcc tctcacttaa180ccagtaggcg tttttcacat tgaagcgcat atctactttg gtattcactg aataaaaaaa240gaaagctggt aacatgtgaa ggatatacaa gcattgatac accaagtagt cacaaactac300attataaagg tcagaccttt gttcacattc tggcctccag gaccaccgct tctagcaaag360ttaagcgtaa catggtctgc acgtatacaa atgaaaatgt ttctatcaaa atcctataaa420atagagctct ataacattgt cgatacatag tttcactaac tctgcaagta ctaaacacat480atacaaacaa aactatgcga acagatcaaa actactacag aacacagttc tatgacactg540tcgatagtaa catcctctgc aagtaccaaa gagatagcaa atgaaactat gtaaacaaat600caaaattcta aatttctcca tcacaaggac ctacagaata gagttatcat aacattttct660gtaaatattt ccatcaaaat gactagagaa cagagttctt ataacattat ctgtaaatgt720tccaacaaaa ccactacata gcagagttct tataacattg tctgtaaatg tccaatcaaa780accactacag aacaaagctc ctataacatt gtttatacaa agtttcacta aatctacaaa840ctttccccgt aaatgagctt aatatcaccc aaagatgttt caatcagata aagagtacga900catcgttttg agattagaac aaactgaaac ttacgtagag tgatttgagg agtaggc 957<210>5<211>672<212>DNA<213>甘藍型油菜<220>
<223>CP418L標志物<400>5aatttctcca tcacaaggac ctacagaata gagttatcat aacattttct gtaaatattt 60ccatcaaaat gactagagaa cagagttctt ataacattat ctgtaaatgt tccaacaaaa120ccactacata gcagagttct tataacattg tctgtaaatg tccaatcaaa accactacag180
aacaaagctc ctataacatt gtttatacaa agtttcacta aatctacaaa ctttccccgt240aaatgagctt aatatcaccc aaagatgttt caatcagata aagagtaacg acatcgtttt300gagattagaa caaactgaaa cttacgtaga gtgatttgag gagtaggctc gttgccagca360gagctagctc tctcctccgc ctcatgaagc atctgttgca cctgagacaa ccgtgacgaa420actttccgat caccgccacc agaattcgac gccgcgcatc ggaaggatcc gaatcgggaa480ctgagtgaac ccgagcgatc ccgggagtgc gacggagcga tgggaaaaga gagtggcacg540atttcgacga agagtggaag aggagagggt ggtggataaa ctcgcgtatg atcaagttcg600tcatcgtcct gattgccgcc attttttttg tcagggcgct ctgtggctta gaagtttccg660atgtcaatga ac67權(quán)利要求
1.產(chǎn)生Ogura胞質(zhì)雄性不育(cms)的甘藍型油菜雙低恢復(fù)系的方法，所述甘藍型油菜呈現(xiàn)出攜帶Rfo恢復(fù)基因的蘿卜漸滲物，其中缺失蘿卜Pgi-2等位基因并重組入甘藍的Pgi-2基因，所述甘藍型油菜還具有良好農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo傳遞率和高營養(yǎng)勢，所述方法包括以下步驟a)將含缺失蘿卜插入物的春性甘藍型油菜的雙低cms系與春性Drakkar的雙低系雜交，以形成甘藍型油菜的雜合恢復(fù)植株，b)減數(shù)分裂前用γ射線輻照由步驟a)獲得的雜合恢復(fù)植株，c)將步驟b)所得花的花粉與cms雙低春性Wesroona系雜交，d)測試后代的營養(yǎng)勢、雌性可育性和cms基因傳遞率，e)選擇后代品系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟b)中的輻照劑量是6mn期間65Gray。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟a)的春性甘藍型油菜雙低cms系是R211。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用選自PGIol、PGIUNT、PGIint、BolJon和CP418的五個標志物的組合進行步驟d)中的測試。
5.Ogura胞質(zhì)雄性不育(cms)的甘藍型油菜雙低恢復(fù)系，所述甘藍型油菜呈現(xiàn)出Rfo插入，其中缺失蘿卜Pgi-2等位基因并重組入甘藍的Pgi-2基因，所述甘藍型油菜還具有良好農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo傳遞率和高營養(yǎng)勢。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的甘藍型油菜雙低恢復(fù)系，其中它們呈現(xiàn)選自PGIol、PGIUNT、PGIint、BolJon和CP418的五個標志物的獨特組合。
7.甘藍型油菜雜交種植物及其后代，通過以下步驟獲得a)提供根據(jù)權(quán)利要求1產(chǎn)生并繁育成純合的恢復(fù)系，b)將所述恢復(fù)系作為傳粉者用于雜交生產(chǎn)領(lǐng)域，c)將cms不育植物作為生產(chǎn)雜交種種子的植物用于雜交生產(chǎn)領(lǐng)域，和d)從所述雄性不育植物收獲雜交種種子。
8.由權(quán)利要求1中所得蕓苔屬品系發(fā)育的蕓苔屬植物的種子。
9.權(quán)利要求7中所得甘藍型油菜的種子。
10.權(quán)利要求1和2中所得甘藍型油菜的種子，其于2003年7月4日以參考編號NCIMB41183保藏于NCIMB Limited，23 St Machar Drive，Aberdeen，Scotland，AB243RY.UK。
11.至少四個標志物PGIol、PGIint、BolJon和CP418的組合、或其中包含至少一個多態(tài)性位點的任意部分用于表征Ogura cms的甘藍型油菜重組恢復(fù)系的用途，所述甘藍型油菜呈現(xiàn)Rfo插入，其中缺失蘿卜Pgi-2等位基因并重組入甘藍的Pgi-2基因，所述甘藍型油菜還具有良好農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo傳遞率和高營養(yǎng)勢。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中所述組合是五個標志物PGIol、PGIUNT、PGIint、BolJon和CP418的組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其中-用引物PGIol U和PGIol L擴增標志物PGIol(PGIol U5′TCATTTGATTGTTGCGCCTG3′；PGIol L5′TGTACATCAGACCCGGTAGAAAA3′)-用引物PGIint U和PGIint L擴增標志物PGIint(PGIint U5′CAGCACTAATCTTGCGGTATG3′；PGIint L5′TAATAACCCTAAAAGCACCTG3′)-用引物PGIol U和PGIint L擴增標志物PGIUNT(PGIol U5′TCATTTGATTGTTGCGCCTG3′；PGIint L5′TAATAACCCTAAAAGCACCTG3′)-用引物BolJon U和BolJon L擴增標志物BolJon(BolJon U5′GATCCGATTCTTCTCCTGTTG3；BolJon L5′GCCTACTCCTCAAATCACTCT3′)-用引物SG129U和pCP418L擴增標志物CP418(SG129U參見Giancola et al(5)pCP418L5′AATTTCTCCATCACAAGGACC3′)
14.PGIol標志物，其序列如下TCATTTGATT GTTGCGCCTG TCGCCTTGTT GTGTTATGAT GAATGAACAG CAGTCATTTA60ACATGTGGTT AACTTAACAG GGCTCCGGCT GTTGCAAAAC ACATGGTTGC TGTCAGCACT 120AATCTTGCGG TATGAATTTG TGATTAAATT TGTTTGTTTG TGACTCTTTC TTCATTGTTC 180GTTTTCGTAC AATAAACCGA ATGTATAATC TTTTTACAAA CTGAATTTTC TACCGGGTCT 240GATGTACA248
15.PGIUNT標志物，其序列如下TCATTTGATT GTTGCGCCTG TCGCCTTGTT GTGTTATGAT GAATGAACAG CAGTCATTTA60ACATGTGGTT AACTTAACAG GGCTCCGGCT GTTGCAAAAC ACATGGTTGC TGTCAGCACT 120AATCTTGCGG TATGAATTTG TGATTAAATT TGTTTGTTTG TGACTCTTTC TTCATTGTTC 180GTTTTCGTAC AATAAACCGA ATGTATAATC TTTTACAAAC TGAATTTTCT ACCGGGTCTG 240ATGTACAATG CTAGTCTCCA TGTTCTTGGG GATCATGATT TATTTTCTAC ATGTATTCAG 300ACAGTACAGA AGAAAGTGTT CAAAACTCTG GATGTTTTAA TTTACAGTTA GTGGAGAAGT 360TCGGCATTGA TCCGAACAAT GCATTTGCAT TTTGGGACTG GGTTGGTGGA AGGTACAGTG 420GTAAGTGCTT GTTTATTTGG TTGTATAAAT TTCTCGTCCA TTTCCGCTTG CTTAGTGTAT 480AACTGAAATT CTTTTGCAGT TTGCAGTGCT GTTGGAGTCT TACCATTGTC TCTACAGTAT 540GGCTTCTCTG TGGTTGAGAA GTACGGTACC TTCTACTTTA TCAGCCATCT CATAAAATGT 600CTTAGGCATA TTCTTTCTAT TTTATTTCCC TCTTAATGAT TTCTTCTTTT TTTTATTGCA 660TTCCCGTTTT ATTTTCAAAA GTTGTTACTG TCTCTAAATC AAGAAGAAAC CTTCTTAGTA 720GATCCAGCTG ATATTCAGCC TTTTTTAAAT TGGACTGCAG GTTTTTAAAG GGGAGCTTCA 780AGCATTGATA AGCATTTCCA GTCCACACCG TTTGAGAAGA ATATACCCGT GAGTTGCATT 840AGTTGTGTGA TTATACAGTT TTCTTGTCTT TTTGCTATGT CCATCAACAC TAGAGATTCG 900TGAAGTTATT AGTGTAGTCA ACGCATAGGG AGAGGTGATT GGTGACTTTT GGACGATTTC 960AGGTGCTTTA GGGTTATTG979
16.PGIint標志物，其序列如下CAGCACTAAT CTTGCGGTAT GAATTTGTGA TTAAATTTGT TTGTTTGTGA CTCTTTCTTC60ATTGTTCGTT TTCGTACAAT AAACCGAATG TATAATCTTT TACAAACTGA ATTTTCTACC 120GGGTCTGATG TACAATGCTA GTCTCCATGT TCTTGGGGAT CATGATTTAT TTTCTACATG 180TATTCAGACA GTACAGAAGA AAGTGTTCAA AACTCTGGAT GTTTTAATTT ACAGTTAGTG 240GAGAAGTTCG GCATTGATCC GAACAATGCA TTTGCATTTT GGGACTGGGT TGGTGGAAGG 300TACAGTGGTA AGTGCTTGTT TATTTGGTTG TATAAATTTC TCGTCCATTT CCGCTTGCTT 360AGTGTATAAC TGAAATTCTT TTGCAGTTTG CAGTGCTGTT GGAGTCTTAC CATTGTCTCT 420ACAGTATGGC TTCTCTGTGG TTGAGAAGTA CGGTACCTTC TACTTTATCA GCCATCTCAT 480AAAATGTCTT AGGCATATTC TTTCTATTTT ATTTCCCTCT TAATGATTTC TTCTTTTTTT 540TATTGCATTC CCGTTTTATT TTCAAAAGTT GTTACTGTCT CTAAATCAAG AAGAAACCTT 600CTTAGTAGAT CCAGCTGATA TTCAGCCTTT TTTAAATTGG ACTGCAGGTT TTTAAAGGGG 660AGCTTCAAGC ATTGATAAGC ATTTCCAGTC CACACCGTTT GAGAAGAATA TACCCGTGAG 720TTGCATTAGT TGTGTGATTA TACAGTTTTC TTGTCTTTTT GCTATGTCCA TCAACACTAG 780AGATTCGTGA AGTTATTAGT GTAGTCAACG CATAGGGAGA GGTGATTGGT GACTTTTGGA 840CGATTTCAGG TGCTTTAGGG TTATTG866
17.BolJon標志物，其序列如下GATCCGATTC TTCTCCTGTT GAGATCAGCT CCAAACATCA AACAACTTGT ACACAAATAT60CTTTACTTGC TAAATGGAAC ATGACAAGAG ATAGAAAATC TTGCTCATAG TATTGTACAA 120GGGATAACAG TGTAGAAAAC AAACCGTCTG TAAGATTTTC TCCCTGATCC TCTCACTTAA 180CCAGTAGGCG TTTTTCACAT TGAAGCGCAT ATCTACTTTG GTATTCACTG AATAAAAAAA 240GAAAGCTGGT AACATGTGAA GGATATACAA GCATTGATAC ACCAAGTAGT CACAAACTAC 300ATTATAAAGG TCAGACCTTT GTTCACATTC TGGCCTCCAG GACCACCGCT TCTAGCAAAG 360TTAAGCGTAA CATGGTCTGC ACGTATACAA ATGAAAATGT TTCTATCAAA ATCCTATAAA 420ATAGAGCTCT ATAACATTGT CGATACATAG TTTCACTAAC TCTGCAAGTA CTAAACACAT 480ATACAAACAA AACTATGCGA ACAGATCAAA ACTACTACAG AACACAGTTC TATGACACTG 540TCGATAGTAA CATCCTCTGC AAGTACCAAA GAGATAGCAA ATGAAACTAT GTAAACAAAT 600CAAAATTCTA AATTTCTCCA TCACAAGGAC CTACAGAATA GAGTTATCAT AACATTTTCT 660GTAAATATTT CCATCAAAAT GACTAGAGAA CAGAGTTCTT ATAACATTAT CTGTAAATGT 720TCCAACAAAA CCACTACATA GCAGAGTTCT TATAACATTG TCTGTAAATG TCCAATCAAA 780ACCACTACAG AACAAAGCTC CTATAACATT GTTTATACAA AGTTTCACTA AATCTACAAA 840CTTTCCCCGT AAATGAGCTT AATATCACCC AAAGATGTTT CAATCAGATA AAGAGTACGA 900CATCGTTTTG AGATTAGAAC AAACTGAAAC TTACGTAGAG TGATTTGAGG AGTAGGC 957
18.CP418標志物，其序列如下AATTTCTCCA TCACAAGGAC CTACAGAATA GAGTTATCAT AACATTTTCT GTAAATATTT60CCATCAAAAT GACTAGAGAA CAGAGTTCTT ATAACATTAT CTGTAAATGT TCCAACAAAA 120CCACTACATA GCAGAGTTCT TATAACATTG TCTGTAAATG TCCAATCAAA ACCACTACAG 180AACAAAGCTC CTATAACATT GTTTATACAA AGTTTCACTA AATCTACAAA CTTTCCCCGT 240AAATGAGCTT AATATCACCC AAAGATGTTT CAATCAGATA AAGAGTAACG ACATCGTTTT 300GAGATTAGAA CAAACTGAAA CTTACGTAGA GTGATTTGAG GAGTAGGCTC GTTGCCAGCA 360GAGCTAGCTC TCTCCTCCGC CTCATGAAGC ATCTGTTGCA CCTGAGACAA CCGTGACGAA 420ACTTTCCGAT CACCGCCACC AGAATTCGAC GCCGCGCATC GGAAGGATCC GAATCGGGAA 480CTGAGTGAAC CCGAGCGATC CCGGGAGTGC GACGGAGCGA TGGGAAAAGA GAGTGGCACG 540ATTTCGACGA AGAGTGGAAG AGGAGAGGGT GGTGGATAAA CTCGCGTATG ATCAAGTTCG 600TCATCGTCCT GATTGCCGCC ATTTTTTTTG TCAGGGCGCT CTGTGGCTTA GAAGTTTCCG 660ATGTCAATGA AC 67全文摘要
生產(chǎn)Ogura胞質(zhì)雄性不育(cms)的甘藍型油菜(Brassica napus)雙低恢復(fù)系的方法，所述甘藍型油菜呈現(xiàn)出攜帶Rfo恢復(fù)基因的蘿卜漸滲物，其中缺失蘿卜Pgi－2等位基因并重組入甘藍(Brassica oleracea)的Pgi－2基因，所述甘藍型油菜還具有良好農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值，其特征是雌性可育性、良好的Rfo傳遞率和高營養(yǎng)勢。形成甘藍型油菜雜交種子及其后代的方法。甘藍型油菜的種子以及組合標志物PGIol、PGIunt、PGIint、BolJon和CP418用于表征的用途。
文檔編號C12Q1/68GK1816276SQ200480019056
公開日2006年8月9日 申請日期2004年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月4日
發(fā)明者卡特琳·普里馬爾-布里塞, 雷吉娜·德盧爾姆, 讓-皮埃爾·普帕爾, 雷蒙德·霍爾韋, 弗朗索瓦絲·布達爾, 喬治·佩爾蒂埃, 米歇爾·勒納爾 申請人:國家農(nóng)藝研究院