專利名稱：食物或食物原材料中特定屬的植物的定量pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定量檢測(cè)食物或食物成分中所含的特定植物屬的方法。
背景技術(shù)：
自2002年4月日本已經(jīng)開始實(shí)施了在產(chǎn)品上的變應(yīng)原性特定成分標(biāo)記系統(tǒng)。由此，對(duì)于食物，根據(jù)下述條件，小麥、蕎麥、花生、乳和蛋這五項(xiàng)作為特定成分必須強(qiáng)制性標(biāo)記[衛(wèi)生、勞動(dòng)和福利部(theMinistry of Health，Labour and Welfare)網(wǎng)址“Labeling of FoodsContaining Allergens”(http://www.mhlw.go.jp/topics/0103/tp0329-2b.html)；和“Journal of the Food Hygienics Society of Japan(日語為SHOKUHIN EISEIGAKU ZASSHI)(日本)，The Food HygienicsSociety of Japan，2002，第43卷，第4期，第j-269-j-271頁”]。此后，衛(wèi)生、勞動(dòng)和福利部提供了通過定量ELISA法進(jìn)行初篩的特定成分測(cè)試公告，該方法利用多克隆抗體和定性PCR法(小麥、蕎麥和花生)以及蛋白印跡(乳和蛋)進(jìn)行驗(yàn)證測(cè)試。在這一初篩ELISA法中，把經(jīng)兩個(gè)ELISA試劑盒中的任意一個(gè)檢測(cè)確定其定量數(shù)值為10ppm或更高(根據(jù)來自特定成分的總蛋白量/產(chǎn)品最終重量)的樣品評(píng)估為陽性，并且除調(diào)查其生產(chǎn)記錄外，還進(jìn)一步經(jīng)PCR法(小麥、蕎麥和花生)或蛋白印跡(乳和蛋)進(jìn)行證實(shí)[衛(wèi)生、勞動(dòng)和福利部網(wǎng)址“Inspection Method of Foods Containing Allergens”(SHOKU-HATSU No.1106001(衛(wèi)生、勞動(dòng)和福利部，藥物和食物安全局，食物安全部門(Department of Food Safety，Pharmaceuticaland Food Safety Bureau of the Ministry of Health，Labour andWelfare)公告No.001(2002年11月6日)))(http://wwwhourei.mhlw.go.jp/～hourei/cgi-bin/t_docframe.cgi？MODE＝tsuchi&DMODE＝CONTENTS&SMODE＝NORMAL&KEYWORD＝&EFSNO＝4642)]。
總的來說，ELISA法是一種高靈敏度的蛋白檢測(cè)方法，也是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。然而，利用多克隆抗體的ELISA法具有相對(duì)高的交叉反應(yīng)性，有可能檢測(cè)到非特異性蛋白(Enzyme Immunoassay，EijiIshikawa指導(dǎo)翻譯(1989))，并可能由此產(chǎn)生假陽性。對(duì)假陽性的檢查需要通過其它方法來再次驗(yàn)證。
雖然ELISA法的靈敏度高，但該方法僅有有限的測(cè)量動(dòng)力學(xué)范圍。有限的測(cè)量動(dòng)力學(xué)范圍意味著，對(duì)濃度未知的樣品的準(zhǔn)確測(cè)量可能涉及通過數(shù)次連續(xù)稀釋來制備測(cè)試溶液和選擇落入標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的測(cè)試溶液的測(cè)量結(jié)果。用ELISA進(jìn)行測(cè)量時(shí)，通常都不考慮對(duì)比如各待檢樣品的提取效率和對(duì)ELISA反應(yīng)的抑制這樣的影響進(jìn)行修正。因此，當(dāng)通過對(duì)預(yù)計(jì)將會(huì)進(jìn)行受到各種加工和污染的樣品，尤其是食物等，進(jìn)行測(cè)量來測(cè)定定量值時(shí)，應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎。
例如，用于檢測(cè)商業(yè)購(gòu)買的蕎麥蛋白的ELISA法對(duì)于試劑盒所附的用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的蕎麥蛋白標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試液的檢測(cè)靈敏度高達(dá)1ng/ml(0.02至0.1ppm，根據(jù)來自特定成分的總蛋白量/稀釋20至400倍并用于進(jìn)行ELISA的產(chǎn)品最終重量)[“Journal of the FoodHygienics Society of Japan(日語為SHOKUHIN EISEIGAKUZASSHI)(日本)，The Food Hygienics Society of Japan，2002，第43卷，第4期，第j-275-j-277頁”；Journal of the Food HygienicsSociety of Japan(日語為SHOKUHIN EISEIGAKU ZASSHI)(日本)，The Food Hygienics Society of Japan，2002，第43卷，第4期，第j-277-j.279頁”；FAST KIT(Food Allergen Screening Test)series -ELISA 蕎麥-《Instruction Manual》，Nippon MeatPackers，Inc.；and instruction manual of Morinaga buckwheatmeasurement kit，Morinaga Institute of Biological Science]。然而，例如，當(dāng)從含有達(dá)到根據(jù)來自蕎麥的總蛋白量/樣品重量的該濃度水平的蕎麥粉樣品取樣2-g等分試樣時(shí)，除非待檢特定成分具有非常細(xì)的顆粒大小，否則可能無法從樣品中取樣蕎麥粉顆粒。
另一方面，目前已知的一種檢測(cè)污染蕎麥的PCR方法的靈敏度約為5pg蕎麥DNA的量，且能夠檢測(cè)添加了蕎麥了的小麥樣品中約10ppm的蕎麥。然而，本領(lǐng)域已知的這一方法不能作定量分析[“Journal of the Food Hygienics Society of Japan(日語為SHOKUHIN EISEIGAKU ZASSHI)(日本)，The Food HygienicsSociety of Japan，2002，第43卷，第4期，第j-280-j-282頁”；和“Outline for 84th Academic Lecture Meeting of the Food HygienicsSociety of Japan”(日本)，The Food Hygienics Society of Japan，2002，第104頁]。
本發(fā)明人開發(fā)了一種靶向ITS序列的定性PCR法作為探測(cè)是否存在特定植物屬的方法，該法的檢測(cè)靈敏度為1ppm或更高(DNA/DNA)，并于2002年9月27日遞交了日本專利申請(qǐng)(日本專利申請(qǐng)第2002-284222號(hào))。然而，該方法不能進(jìn)行定量分析。
一種利用PCR對(duì)基因改造作物進(jìn)行定量的方法，通過測(cè)量基因改造玉米特異性基因序列的拷貝數(shù)以及用分開測(cè)量的玉米固有內(nèi)源基因序列的拷貝數(shù)進(jìn)行修正，來測(cè)量玉米成分中基因改造玉米成分的量。[“Journal of AOAC INTERNATIONAL”(US)，AOACINTERNATIONAL，2002，第85卷，第5期，第1077-1089頁]。
更確切地說，用純基因改造玉米的一個(gè)一般栽培種來測(cè)定從其種子提取的DNA中的“重組DNA序列的拷貝數(shù)/內(nèi)源基因序列的拷貝數(shù)”值(與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的比率)。接著，測(cè)定未知樣品的“重組DNA序列的拷貝數(shù)/內(nèi)源基因序列的拷貝數(shù)”值，并乘以與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)之比率的倒數(shù)和100，從而測(cè)量基因改造玉米的含量。該法適于對(duì)由相同植物物種組成的樣品(比如僅由玉米物種組成的樣品)中的重組體含量進(jìn)行定量，因?yàn)樵S多玉米栽培種的拷貝數(shù)是相同的，而且使用了具有這些栽培種通用核苷酸序列的內(nèi)源基因作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
然而，考慮到測(cè)量存在于由各種有生命物種成分及無生命成分組成的混合物中的變應(yīng)原特定成分的量，難以從各種不同的活物種DNA中找到一種能夠獲得的內(nèi)源序列作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。此外，也不可能從比如無生命物質(zhì)那樣的無DNA物質(zhì)中找到內(nèi)源序列。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明人已經(jīng)嘗試開發(fā)了一種缺點(diǎn)更少的定量檢測(cè)污染食物或食物成分的特定成分的方法。也即，本發(fā)明人為開發(fā)一種具有足夠定量檢測(cè)污染食物或食物成分的特定成分的特異性和靈敏度的定量方法的目的，已經(jīng)做了本發(fā)明的研究，該方法使得能夠修正由比如各待檢樣品的提取效率和對(duì)檢測(cè)反應(yīng)的抑制帶來的影響，且該方法比ELISA法具有更寬的動(dòng)力學(xué)范圍。
更確切地說，本發(fā)明人經(jīng)過堅(jiān)持不懈地研究一種定量PCR檢測(cè)法的建立已經(jīng)完成了本發(fā)明，其特征在于計(jì)劃利用來自標(biāo)準(zhǔn)植物的樣品(標(biāo)準(zhǔn)植物樣品)來修正比如備待檢樣品的提取效率和對(duì)檢測(cè)反應(yīng)的抑制這樣的影響；具有比本領(lǐng)域已知的ELISA法更寬的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)范圍；以及具有足夠的特異性和靈敏度。
也即，本發(fā)明涉及1.一種用PCR法對(duì)食物或食物成分中屬于某一特定植物屬的植物進(jìn)行定量的方法，其包括將來自待檢特定植物屬的樣品和標(biāo)準(zhǔn)植物樣品以預(yù)定比率混合制成修正樣品，并從該修正樣品中提取基因組DNA；將已知量的標(biāo)準(zhǔn)植物樣品添加到待檢食物或食物成分中制成測(cè)試樣品，并從該測(cè)試樣品中提取基因組DNA；用檢測(cè)來自待檢特定植物屬的樣品的引物組和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的引物組對(duì)提取自修正樣品和測(cè)試樣品的作為模板的基因組DNA進(jìn)行定量PCR；用定量PCR法對(duì)修正樣品確定來自標(biāo)準(zhǔn)植物的DNA拷貝數(shù)/來自特定植物屬的DNA拷貝數(shù)的值，作為標(biāo)準(zhǔn)修正值；和用定量PCR法對(duì)測(cè)試樣品確定來自特定植物屬的DNA拷貝數(shù)/來自標(biāo)準(zhǔn)植物的DNA拷貝數(shù)的值，和用標(biāo)準(zhǔn)修正值來修正該值從而計(jì)算出食物或食物成分中所含的屬于特定植物屬的植物的量；2.根據(jù)上述1的方法，其中所述定量PCR法是實(shí)時(shí)PCR法；3.根據(jù)上述2的方法，其特征在于該實(shí)時(shí)PCR法根據(jù)通過使用在5’末端帶有熒光染料和在3’末端帶有猝滅劑的、能與基因組DNA部位的內(nèi)部區(qū)域雜交的探針?biāo)派涑龅墓饬繉?duì)DNA進(jìn)行定量，該內(nèi)部區(qū)域與PCR引物組的各寡核苷酸雜交，其中從探針5’末端的熒光染料發(fā)射出的光受到3’末端的猝滅劑抑制，在PCR反應(yīng)中從引物開始的Taq聚合酶-催化的DNA延伸過程中，該探針被Taq聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性降解從而使熒光染料與猝滅劑解離，隨之導(dǎo)致發(fā)光；4.根據(jù)上述1至3之中任一項(xiàng)的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)植物屬于除高地雜草和食物作物之外的植物物種；
5.根據(jù)上述4的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)植物是補(bǔ)血草；6.根據(jù)上述1至5之中任一項(xiàng)的方法，其中所述待檢特定植物屬是蕎麥屬(Fagopyrum)、落花生屬(Arachis)、小麥屬(Triticum)或大豆屬(Glycine)；7.根據(jù)上述2或3的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)植物是補(bǔ)血草，用于檢測(cè)補(bǔ)血草的引物組是由具有SEQ ID NO57所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO58所示序列的寡核苷酸組成的組，且用于檢測(cè)補(bǔ)血草的探針是具有SEQ ID NO59所示序列的寡核苷酸；8.根據(jù)上述2或3的方法，其中所述待檢特定植物屬是蕎麥屬，用于檢測(cè)蕎麥屬的引物組是由具有SEQ ID NO14所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO15所示序列的寡核苷酸組成的組，且用于檢測(cè)蕎麥屬的探針是具有SEQ ID NO64所示序列的寡核苷酸；9.根據(jù)上述2或3的方法，其中所述待檢特定植物屬是落花生屬，用于檢測(cè)落花生屬的引物組是由具有SEQ ID NO21所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO26、65或66所示序列的寡核苷酸組成的組，且用于檢測(cè)落花生屬的探針是具有SEQ ID NO34所示序列的寡核苷酸；10.用于檢測(cè)補(bǔ)血草的引物組，其由具有SEQ ID NO57所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO58所示序列的寡核苷酸組成；11.用于檢測(cè)蕎麥屬的引物組，其由具有SEQ ID NO14所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO15所示序列的寡核苷酸組成；12.用于檢測(cè)落花生屬的引物組，其由具有SEQ ID NO21所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO26、65或66所示序列的寡核苷酸組成；13.用于檢測(cè)食物或食物成分中屬于特定植物屬的植物的方法的試劑盒，其包含用于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的引物組；14.根據(jù)上述13的試劑盒，還含有用于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的探針；15.根據(jù)上述13或14的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)植物是補(bǔ)血草，且用于檢測(cè)補(bǔ)血草的引物組是由具有SEQ ID NO57所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO58所示序列的寡核苷酸組成的組；16.根據(jù)上述15的試劑盒，還含有具有SEQ ID NO59所示序列的用于檢測(cè)補(bǔ)血草的探針；17.根據(jù)以上13至16之中任一項(xiàng)的試劑盒，還含有用于檢測(cè)待檢特定植物屬的引物組；18.根據(jù)上述13至16之中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述待檢特定植物屬是蕎麥屬，且用于檢測(cè)蕎麥屬的引物組是由具有SEQ ID NO14所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO15所示序列的寡核苷酸組成的組；19.根據(jù)上述18的試劑盒，還含有具有SEQ ID NO64所示序列的用于檢測(cè)蕎麥屬的探針；20.根據(jù)上述13至16之中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述待檢特定植物屬是落花生屬，且用于檢測(cè)落花生屬的引物組是由具有SEQ IDNO21所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO26、65或66所示序列的寡核苷酸組成的組；21.根據(jù)上述20的試劑盒，還含有具有SEQ ID NO34所示序列的用于檢測(cè)落花生屬的探針；22.根據(jù)上述15的試劑盒，還含有作為標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的補(bǔ)血草樣品；23.根據(jù)上述13的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)植物是補(bǔ)血草且待檢特定植物屬是蕎麥屬，該試劑盒還含有用于繪制補(bǔ)血草和蕎麥屬標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有相連的具有補(bǔ)血草擴(kuò)增靶序列的DNA和具有蕎麥屬擴(kuò)增靶序列的DNA；24.根據(jù)上述13的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)植物是補(bǔ)血草且待檢特定植物屬是落花生屬，該試劑盒還含有用于繪制補(bǔ)血草和落花生屬標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有相連的具有補(bǔ)血草擴(kuò)增靶序列的DNA和具有落花生屬擴(kuò)增靶序列的DNA；25.用于檢測(cè)食物或食物成分中屬于蕎麥屬的植物的方法的試劑盒，其包含由具有SEQ ID NO14所示序列的寡核苷酸和具有SEQID NO15所示序列的寡核苷酸組成的用于檢測(cè)蕎麥屬的引物組；26.根據(jù)上述25的試劑盒，還含有具有SEQ ID NO64所示序列的用于檢測(cè)蕎麥屬的探針；27.用于檢測(cè)食物或食物成分中屬于落花生屬的植物的方法的試劑盒，其包含由具有SEQ ID NO21所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO26、65或66所示序列的寡核苷酸組成的用于檢測(cè)落花生屬的引物組；和28.根據(jù)上述27的試劑盒，還含有具有SEQ ID NO34所示序列的用于檢測(cè)落花生屬的探針。
由此首次公開了本發(fā)明的方法，也即，不是通過外在添加DNA作為標(biāo)準(zhǔn)來修正比如反應(yīng)液中對(duì)PCR反應(yīng)的抑制這樣的影響，而是通過從外在補(bǔ)加了標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的樣品中同時(shí)提取待檢特定植物屬的DNA(本文中所使用的“待檢特定植物屬”甚至還包括待定量的特定植物屬)和標(biāo)準(zhǔn)植物的DNA而非純化的DNA進(jìn)行定量PCR法，來修正比如各待檢樣品的DNA提取效率和對(duì)PCR反應(yīng)的抑制這樣的影響的方法。該法可以進(jìn)行高度可靠的定量，因?yàn)樗軌蛟跇?biāo)準(zhǔn)植物樣品和來自待檢特定植物屬的樣品間的比如DNA提取效率和對(duì)PCR反應(yīng)的抑制這樣的影響是一致的條件下進(jìn)行測(cè)量。本發(fā)明的方法具有該方法能夠修正比如DNA提取效率和對(duì)PCR反應(yīng)的抑制以及甚至待檢樣品間的DNA含量差異這樣的影響的優(yōu)點(diǎn)。此外，即便存在假陽性的話，通過將其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列分析，該利用PCR法的定量分析也能可靠地將所述假陽性排除，并且由此，該方法可以說具有優(yōu)越的工業(yè)實(shí)用性。因此，本發(fā)明可用于定量檢測(cè)食物或食物成分中所含的屬于變應(yīng)原性特定植物屬的植物。
因此，在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明也包括用于檢測(cè)作為標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的補(bǔ)血草的引物組和用于檢測(cè)作為特定植物屬的蕎麥屬或落花生屬的引物組。除此之外，在實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)中與這些引物組結(jié)合使用的探針也包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的方法中所使用的含有用于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的引物組或(和)用于檢測(cè)屬于待檢特定植物屬的植物的引物組中的任一或其二者的試劑盒也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。該試劑盒可以包含上述探針。該試劑盒還可以包含標(biāo)準(zhǔn)植物樣品。優(yōu)選的標(biāo)準(zhǔn)植物是補(bǔ)血草，其優(yōu)選樣品是補(bǔ)血草植物的干粉，尤其優(yōu)選其種子干粉。此外，該試劑盒可以含有用于繪制標(biāo)準(zhǔn)植物樣品和特定植物屬的標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有相連的具有標(biāo)準(zhǔn)植物樣品序列的DNA和具有待檢特定植物屬序列的DNA，該質(zhì)粒能夠被該試劑盒中所包含的引物組擴(kuò)增。
本說明書中，“用于檢測(cè)”給定植物或植物屬(包括屬于，也即，包括在該屬中的植物)或來自它們之中任一的樣品的“的引物”是指，由在PCR法中特異性擴(kuò)增給定植物或?qū)儆诮o定植物屬的植物的基因組DNA的寡核苷酸組成的引物。由兩個(gè)寡核苷酸組成的用于PCR法的引物對(duì)，即正向和反向引物，在本文中可以稱作“引物組”。
盡管本發(fā)明的引物可以在定量PCR法中用于定量各植物屬，但顯然，這些引物還可以用于對(duì)各植物屬的非定量(也即定性)檢測(cè)。本發(fā)明引物的使用使得能夠檢測(cè)屬于待檢植物屬的各植物物種。本發(fā)明的引物和引物組有利于在定量和非-定量PCR法中使用。
本文中所使用的術(shù)語“檢測(cè)”同時(shí)包括定性和定量檢測(cè)。
本發(fā)明中，設(shè)計(jì)了用于特異性擴(kuò)增來自待檢特定植物屬的DNA的引物。也即，設(shè)計(jì)了一種在嚴(yán)格條件下能夠與具有45S rRNA前體基因序列中的特定植物屬的通用核苷酸序列的核酸分子雜交的引物，其中該引物是具有當(dāng)該引物與核酸分子雜交時(shí)能夠與特定植物屬的ITS-1序列中的核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的3’末端的引物(A)或具有當(dāng)該引物與核酸分子雜交時(shí)能夠與特定植物屬的ITS-2序列中的核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的3’末端的引物(B)。在完成了使用一或多個(gè)引物(A)和(B)的PCR后，根據(jù)作為指示劑的含有特定植物屬的至少一部分ITS-1或ITS-2序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，可以檢測(cè)到特定植物屬的存在。
本文中所使用的短語“在嚴(yán)格條件下雜交”意指，在Sambrook J.等人所述的標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下兩個(gè)DNA片段彼此雜交(Expression ofcloned genes in E.coli(Molecular CloningA laboratory manual(1989))Cold Spring harbor Laboratory Press，New York，USA，9.47-9.62和11.45-11.61)。更確切地說，該短語意指，根據(jù)，例如，按照以下方程確定的Tm值實(shí)施的雜交(例如約3.0×SSC或2.0×SSC，30℃或37℃)，之后在比雜交條件更嚴(yán)格的條件下洗滌(例如，約2.0×SSC，30℃、37℃、40℃、44℃或48℃或更高；或1.0×SSC或0.5×SSC，37℃或更高)?；?，例如，彼此雜交的核苷酸序列對(duì)適于雜交和洗滌的“嚴(yán)格條件”的選擇是本領(lǐng)域熟知的。本文中僅述及術(shù)語“雜交”時(shí)，該術(shù)語意指除另行說明的條件外在嚴(yán)格條件下的雜交。
Tm＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(G+C分?jǐn)?shù))-(600/N)本文中所使用的術(shù)語“屬”意指一個(gè)包括了屬于該屬的全部植物或包括了選自屬于該屬植物的若干個(gè)物種的組。
本發(fā)明中所使用的引物組是能夠在嚴(yán)格條件下與具有45S rRNA前體基因序列中的特定植物屬的通用核苷酸序列的核酸分子雜交的引物組。重要的是，引物對(duì)中至少一個(gè)引物是具有當(dāng)該引物與核酸分子雜交時(shí)能夠與特定植物屬的ITS-1序列中的核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的3’末端的引物(A)或具有當(dāng)該引物與核酸分子雜交時(shí)能夠與特定植物屬的ITS-2序列中的核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的3’末端的引物(B)。本文中，引物(A)還包括與ITS-1序列和5.8S rRNA基因序列間的橋連區(qū)域雜交的引物和與ITS-1序列和SSU rRNA基因序列間的橋連區(qū)域雜交的引物。同樣地，引物B還還包括與ITS-2序列和5.8S rRNA基因序列間的橋連區(qū)域雜交的引物和與ITS-2序列和LSU rRNA基因序列間的橋連區(qū)域雜交的引物。引物(A)和(B)各自優(yōu)選由至少15個(gè)堿基組成，更優(yōu)選由15至30個(gè)堿基組成。由于ITS-1和ITS-2序列包含對(duì)物種特異的可變序列，所以通用或特異于特定植物屬的引物(A)或(B)優(yōu)選可通過選擇具有ITS-1或ITS-2序列中通用和特異于特定植物屬的核苷酸序列的核酸分子來獲得，這是因?yàn)樵摵怂岱肿泳哂?5S rRNA前體基因序列中的特定植物屬的通用核苷酸序列。此外，可以使用引物(A)和(B)中的一或兩個(gè)或更多個(gè)。使用兩個(gè)或更多個(gè)引物(A)和(B)可進(jìn)一步提高對(duì)特定植物屬的特異性。
另一方面，引物(A)與能夠在嚴(yán)格條件下與核酸分子雜交的引物(C)結(jié)合使用，所述核酸分子具有一段連續(xù)連接了特定植物屬的ITS-1、5.8S rRNA基因、ITS-2和LSU rRNA基因的序列中的部分核苷酸序列。或者，引物(A)與能夠在嚴(yán)格條件下與核酸分子雜交的引物(E)結(jié)合使用，所述核酸分子具有一段連續(xù)連接了特定植物屬的SSU rRNA基因和ITS-1的序列中的部分核苷酸序列。再一方面，引物(B)與能夠在嚴(yán)格條件下與核酸分子雜交的引物(D)結(jié)合使用，所述核酸分子具有一段連續(xù)連接了特定植物屬的SSU rRNA基因、ITS-1、5.8S rRNA基因和ITS-2的序列中的部分核苷酸序列?；蛘撸?B)與能夠在嚴(yán)格條件下與核酸分子雜交的引物(F)結(jié)合使用，所述核酸分子具有一段連續(xù)連接了特定植物屬的ITS-2和LSU rRNA基因的序列中的部分核苷酸序列。本文中，5.8S rRNA基因高度保守，且包含許多對(duì)大量植物通用的序列。因此，引物(C)優(yōu)選選自在嚴(yán)格條件下能夠與具有5.8S rRNA基因的部分核苷酸序列的核酸分子雜交和具有當(dāng)該引物與核酸分子雜交時(shí)能夠與5.8SrRNA基因序列中的核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合的3’末端的引物，或者，引物(D)優(yōu)選選自在嚴(yán)格條件下能夠與具有5.8S rRNA基因的部分核苷酸序列的核酸分子雜交和具有當(dāng)該引物與核酸分子雜交時(shí)能夠與5.8S rRNA基因序列中的核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合的3’末端的引物，由此使得有可能將該引物普遍應(yīng)用于各種植物。這些引物是固定的，且待檢特定植物屬的通用和特異引物選自ITS-1或ITS-2區(qū)。以這種方式，可以容易地設(shè)計(jì)具有高靈敏度的用于檢測(cè)由屬于特定植物屬的植物所造成的污染的引物。引物(C)至(F)優(yōu)選各由優(yōu)選至少15個(gè)堿基、更優(yōu)選15至30個(gè)堿基組成。
為設(shè)計(jì)這些引物，可以根據(jù)，例如，“Recent Advances in PCRMethodologyBasic Methodology and it′s Application”(Protein，Nucleic Acid and Enzyme，1996 Supplement，Kyoritsu Shuppan)、“Visual Experimental Note Series，Biotechnology ExperimentsIllustrated 3，PCR for Real Amplification(Hontouni Hueru PCR inJapanese)，Cell Technology Supplement”(Nakayama，H.，1996，Syujunsha)、“PCR Technology--Principles and Applications of DNAAmplification-”(Erlich，H.A.(ed.)，supervised by Kato，K.，Takara Shuzo)來設(shè)計(jì)引物。然而，當(dāng)特定植物屬?gòu)钠渲蠨NA較不可能被片段化的未經(jīng)處理的產(chǎn)物中進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，引物可以是那些能夠產(chǎn)生在700個(gè)堿基以內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物的引物。或者，當(dāng)特定植物屬?gòu)慕?jīng)處理的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其DNA由于可能的片段化有可能較短。從這一點(diǎn)來看，由于能夠達(dá)到高靈敏度，所以優(yōu)選使用能夠產(chǎn)生200個(gè)堿基以內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物的引物。
因此，引物(C)或(D)優(yōu)選為能夠在嚴(yán)格條件下與具有SEQ IDNO1中所示核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列的核酸分子雜交的引物。由于5.8S rRNA基因序列幾乎跨整個(gè)基因序列在植物間都高度同源，因此任何能夠與該基因序列中任何區(qū)域雜交的引物都可以使用。然而，由于SEQ ID NO1中所示區(qū)域具有特別高的同源性，所以優(yōu)選上述引物。更優(yōu)選的是在嚴(yán)格條件下能夠與具有SEQ ID NO1中第11至63位的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列的核酸分子雜交的引物。優(yōu)選作為引物(C)的這樣的引物是SEQ ID NO2至4中所示的任一寡核苷酸(其與具有SEQ ID NO1所示序列的核酸分子雜交)?；蛘?，優(yōu)選作為引物(D)的這樣的引物是SEQ ID NO5至7中所示的任一寡核苷酸(其與具有SEQ ID NO1所示序列的互補(bǔ)鏈的核酸分子雜交)。上述引物在嚴(yán)格條件下應(yīng)當(dāng)特異性與靶核酸分子雜交。此外，引物3’末端的核苷酸應(yīng)當(dāng)與靶DNA序列部分的相應(yīng)核苷酸互補(bǔ)，以使得雜交后的引物能夠作為引發(fā)延伸反應(yīng)的引物起作用。因此，只要該引物滿足這些要求，該引物可以是由SEQ ID NO2至7中所示的任一核苷酸序列所指示的帶有一個(gè)或若干個(gè)堿基缺失、取代或添加的寡核苷酸。
通過獲得來自GenBank的待檢特定植物屬和其它植物屬的多種植物的ITS-1-5.8S rRNA基因-ITS-2序列、以及進(jìn)行比對(duì)以搜索對(duì)該特定植物屬通用和高度特異的區(qū)域，可以鑒定出ITS-1或ITS-2序列中對(duì)特定植物屬通用或特異的核苷酸序列。此外，為保持尤其特異于特定植物屬及其相關(guān)植物物種的特異性，可以通過改變引物序列3’末端的核苷酸從這一鑒定出的區(qū)域中選擇出一段引物序列。
例如，當(dāng)特定植物屬是蕎麥屬時(shí)，蕎麥屬ITS-1序列中通用和特異于蕎麥屬的核苷酸序列可以選自蕎麥(Fagopyrum esculentum)(普通蕎麥)的序列，因?yàn)榇罅靠梢陨虡I(yè)獲得的蕎麥都是蕎麥(普通蕎麥)，而且可商業(yè)獲得的蕎麥的實(shí)際序列與GenBank中登記的蕎麥序列一致。核苷酸序列的特定例子可以包括SEQ ID NO8、9或10中所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。其優(yōu)選例子可以包括SEQID NO8中第11至61位的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列以及SEQID NO9中第11至67位的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。SEQ IDNO10中所示的核苷酸序列尤其可用作從中選擇用于特異檢測(cè)蕎麥屬成員的引物的區(qū)域，所述蕎麥屬成員為蕎麥(普通蕎麥)、苦蕎麥(F.tataricum，Dattan蕎麥)、F.homotropicum和金蕎麥(F.cymosum)。
對(duì)蕎麥屬優(yōu)選的引物(A)是SEQ ID NO11至16中所示的任一寡核苷酸(其在嚴(yán)格條件下分別與SEQ ID NO8的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈(若寡核苷酸為SEQ ID NO11至14所示)和與SEQ ID NO9的核苷酸序列(若寡核苷酸為SEQ ID NO15和16所示))雜交。或者，該引物可以是由SEQ ID NO11至16中所示的任一核苷酸序列所指示的帶有一個(gè)或若干個(gè)堿基缺失、取代或添加的寡核苷酸。ITS-2序列中通用和特異于蕎麥屬的核苷酸序列的例子可包括SEQID NO36或37中所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。這些核苷酸序列尤其可用作從中選擇用于特異檢測(cè)蕎麥屬成員的引物的區(qū)域，所述蕎麥屬成員為蕎麥(普通蕎麥)、苦蕎麥(Dattan蕎麥)、F.homotropicum和金蕎麥。優(yōu)選使用SEQ ID NO11至14中的任一引物與SEQ ID NO15和16或SEQ ID NO2至4中的任一引物的組合。
當(dāng)特定植物屬是落花生屬時(shí)，落花生屬ITS-1序列中通用和特異于落花生屬的核苷酸序列可以選自A.villosa的序列，因?yàn)榭缮虡I(yè)獲得的花生的實(shí)際序列與GenBank中登記的A.correntina和A.villosa的序列一致(盡管大量可商業(yè)獲得的花生是落花生(Arachishypogaea))。核苷酸序列的特定例子可以包括SEQ ID NO17至20中所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。優(yōu)選地，該核苷酸序列是SEQ ID NO17第11至62位的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列，SEQ ID NO18第11至47位的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列，SEQ ID NO19第11至50位的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列，或SEQ ID NO20第11至58位的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
對(duì)落花生屬優(yōu)選的引物(A)是SEQ ID NO21至31、65和66中所示的任一寡核苷酸(其在嚴(yán)格條件下分別與SEQ ID NO17的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈(若寡核苷酸為SEQ ID NO21至23所示)、與SEQ ID NO18的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈(若寡核苷酸為SEQ IDNO24和25所示)、與SEQ ID NO20的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈(若寡核苷酸為SEQ ID NO30和31所示)、以及與SEQ ID NO19的核苷酸序列(若寡核苷酸為SEQ ID NO26至29、65和66所示)雜交)?；蛘?，該引物可以是具有SEQ ID NO21至31、65和66所示的任一核苷酸序列且?guī)в幸粋€(gè)或若干個(gè)堿基缺失、取代或添加的寡核苷酸，只要該寡核苷酸在嚴(yán)格條件下與上述各相應(yīng)序列雜交。落花生屬ITS-2序列中通用和特異于落花生屬的核苷酸序列的例子可包括SEQ ID NO38中所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。優(yōu)選地，該核苷酸序列是SEQ ID NO38中第11至47位的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。對(duì)落花生屬優(yōu)選的引物(B)是SEQ ID NO39中所示的寡核苷酸(其在嚴(yán)格條件下能與SEQ ID NO38的核苷酸序列雜交)?；蛘?，該引物可以是由SEQ ID NO39中所示的核苷酸序列所指示的帶有一個(gè)或若干個(gè)堿基缺失、取代或添加的寡核苷酸。優(yōu)選使用SEQ ID NO21、24和25的任一引物和SEQ ID NO2至4的任一引物的組合，SEQ ID NO21、24和25的任一引物和SEQ ID NO39的引物的組合，SEQ ID NO39的引物和SEQ IDNO5至7的任一引物的組合，或SEQ ID NO21至23、30和31的任一引物和SEQ ID NO26至29、65和66的任一引物的組合。然而，更優(yōu)選的是SEQ ID NO21、24和25的任一引物與SEQ IDNO2至4的任一引物的組合，或SEQ ID NO21的引物與SEQ IDNO26、65和66的任一引物的組合。
當(dāng)特定植物屬是小麥屬時(shí)，小麥屬ITS-2序列中通用和特異于小麥屬的核苷酸序列的例子可以包括SEQ ID NO40至42所示核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。優(yōu)選地，該核苷酸序列是SEQ ID NO40中第11至50位的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列，SEQ ID NO41中第11至47位的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列，或SEQ IDNO42中第11至47位的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
對(duì)小麥屬優(yōu)選的引物(B)是SEQ ID NO43至45中所示的任一寡核苷酸(其在嚴(yán)格條件下分別能與SEQ ID NO40的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈(若寡核苷酸為SEQ ID NO43所示)、與SEQ ID NO41的核苷酸序列(若寡核苷酸為SEQ ID NO44所示)和與SEQ IDNO42的核苷酸序列(若寡核苷酸為SEQ ID NO45所示)雜交)。該引物可以是由SEQ ID NO43至45中所示的任一核苷酸序列所指示的帶有一個(gè)或若干個(gè)堿基缺失、取代或添加的寡核苷酸。優(yōu)選使用SEQ ID NO43的引物和SEQ ID NO44和45的一或多個(gè)引物的組合。
當(dāng)特定植物屬是大豆屬時(shí)，大豆屬ITS-2序列中通用和特異于大豆屬的核苷酸序列的例子可以包括SEQ ID NO46、47和48所示核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。優(yōu)選地，該核苷酸序列是SEQ IDNO46中第11至48位的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列，SEQ IDNO47中第11至55位的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列，或SEQID NO48中第11至52位的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
對(duì)大豆屬優(yōu)選的引物(B)是SEQ ID NO49至56中所示的任一寡核苷酸(其在嚴(yán)格條件下分別能與SEQ ID NO46的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈(若寡核苷酸為SEQ ID NO49所示)、與SEQ ID NO47的核苷酸序列(若寡核苷酸為SEQ ID NO50至65所示)、和與SEQ ID NO48的核苷酸序列(若寡核苷酸為SEQ ID NO56所示)雜交)。該引物可以是由SEQ ID NO49至56中所示的任一核苷酸序列所指示的帶有一個(gè)或若干個(gè)堿基缺失、取代或添加的寡核苷酸。優(yōu)選使用SEQ ID NO49的引物和SEQ ID NO50至56的一或多個(gè)引物的組合。
為設(shè)計(jì)這些引物并對(duì)所設(shè)計(jì)出的引物進(jìn)行評(píng)估，可以采用PCR模擬。
例如，在對(duì)用于檢測(cè)蕎麥屬的引物的設(shè)計(jì)中，在ITS-1-5.8S rRNA基因-ITS-2序列部分中發(fā)現(xiàn)了一段通用且高度特異于包括可食用蕎麥(普通蕎麥和Dattan蕎麥)在內(nèi)的蕎麥屬植物的21個(gè)序列的區(qū)域，而且為保持對(duì)其它植物的特異性，通過改變引物序列3’末端的核苷酸可以從該區(qū)域選擇出引物序列。然而，在ITS-1-5.8S rRNA基因-ITS-2序列部分中缺失的核苷酸位點(diǎn)和數(shù)量將因蕎麥屬中各物種不同而變化。因此，為了從蕎麥屬植物的全部21個(gè)序列獲得同樣大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，還需進(jìn)行選擇。如果能夠獲得相同大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，則可容易地檢測(cè)出蕎麥屬的存在。模擬證實(shí)，可以從蕎麥屬植物的全部21條序列獲得相同大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，尤其是通過選擇蕎麥屬的引物(A)和引物(C)或兩個(gè)引物(A)。由此使得可以容易地設(shè)計(jì)能夠根據(jù)大小區(qū)分非特異性產(chǎn)物的引物。
在本發(fā)明中，上述引物用于通過PCR法檢測(cè)屬于待檢特定植物屬的植物。或者說，通過定量PCR法對(duì)植物進(jìn)行定量。
對(duì)于PCR，比如各變性、退火和延伸步驟的溫度和時(shí)間，酶(DNA聚合酶)的類型和濃度，dNTP、引物和氯化鎂的濃度，以及模板DNA的量這樣的條件可以根據(jù)，例如，Saiki RK等人，Science，2301350-1354(1985)和“Plant Cell Technology Suppl.，Plant CellTechnology Series，PCR Experimental Protocols of Plants”(Shimamoto，K.和Sasaki，T eds.(1995))中所述的一般方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)匦薷暮妥顑?yōu)化。
或者，PCR擴(kuò)增可以在PCR擴(kuò)增所使用的引物和DNA模板的退火溫度下進(jìn)行，所述溫度設(shè)定為高于根據(jù)比如HYB SimulatorTM版本4.0(Advanced Gene Computing Technologies，Inc.)和PrimerExpressTM版本1.5(Applied Biosystems)這樣的商業(yè)可獲得的軟件計(jì)算得出的引物Tm值的溫度，優(yōu)選在Tm值+10至+3℃的溫度下，之后再于退火溫度下進(jìn)行附加的PCR擴(kuò)增，所述退火溫度設(shè)定在約為引物Tm值的溫度下，優(yōu)選在Tm值+7至±0℃的溫度下。
利用實(shí)時(shí)PCR法的定量方法優(yōu)選為定量PCR法。實(shí)時(shí)PCR法的例子包括但不限于，SYBR Green、Fluorogenic探針(例如，TaqManTM探針)、分子信標(biāo)(Molecular Beacon)和LightCyclerTM探針法。近來，積極開發(fā)了多種實(shí)時(shí)PCR法，且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以實(shí)施其中的任何一種方法。為設(shè)計(jì)該方法中所使用的探針，從能夠在嚴(yán)格條件下與某一部位的內(nèi)部區(qū)域雜交的序列中選擇探針，所述內(nèi)部區(qū)域與擴(kuò)增靶序列的各PCR引物雜交。
一種尤其優(yōu)選的實(shí)時(shí)PCR法是，其特征在于通過使用如上述所設(shè)計(jì)的特定植物屬-特異性引物組以及在5’末端帶有熒光染料且在3’末端帶有猝滅劑的探針從而根據(jù)所放射的光量對(duì)DNA進(jìn)行定量的方法，所述探針在嚴(yán)格條件下能夠與雜交于擴(kuò)增靶序列的PCR引物組的各寡核苷酸的部位的內(nèi)部區(qū)域雜交，其中從探針5’末端的熒光染料所放射出的光受到3’末端的猝滅劑的抑制，在PCR反應(yīng)中從引物進(jìn)行Taq聚合酶-催化的DNA延伸的過程中，所述探針被Taq聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性降解從而使熒光染料與猝滅劑解離，由此探針放射出光。不需要整個(gè)探針序列包括在雜交于PCR引物的部位的內(nèi)部區(qū)域中。在所設(shè)計(jì)的探針的3’-末端堿基和在與探針雜交的鏈的反義鏈上所設(shè)計(jì)的引物的3’-末端堿基之間可能重疊了1至10個(gè)堿基或1至5個(gè)堿基。更優(yōu)選從具有通用于待檢特定植物屬的序列的區(qū)域選擇探針序列。TaqManTM探針優(yōu)選為上述探針。一種設(shè)計(jì)TaqMan探針的方法是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Applied Biosystems，Japan，“Simple Operational Guideline for Primer Express Software，SimpleOperational Guideline for TaqMan Probe Search in Primer ExpressSoftwareRev。C”(http//www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/product/ctlgpage.jsp？MODELCD＝19775&PLCD＝17689&BUCD＝131))?？梢栽卺槍?duì)給定植物或?qū)儆诮o定植物屬的植物的定量PCR中所使用的探針在本文中稱作“用于檢測(cè)”給定植物或?qū)儆诮o定植物屬的植物“的探針”。也即，在本說明書中，“用于檢測(cè)的探針”指，通過該探針與用于檢測(cè)植物屬的引物組的組合使用能夠檢測(cè)屬于各植物屬的植物的探針。如上所述，在本文中，檢測(cè)同時(shí)包括定性和定量檢測(cè)。應(yīng)當(dāng)理解，這樣的一種探針在定量檢測(cè)中也是有利的。
探針中所使用的熒光染料的已知例子包括但不限于，F(xiàn)AM、HEX、TET和FITC。此外，猝滅劑的已知例子包括但不限于，TAMRA和Dabcyl，以及非熒光猝滅劑。
探針優(yōu)選長(zhǎng)為13至30個(gè)堿基，尤其優(yōu)選長(zhǎng)為13至25個(gè)堿基。即使探針的堿基長(zhǎng)度很短，但為維持高Tm值更優(yōu)選地使用在3’末端帶有另外用MGB(Minor Groove Binden)標(biāo)記的猝滅劑的探針。具體地，蕎麥屬的探針的例子為如SEQ ID NO64所示的寡核苷酸。落花生屬的探針的例子優(yōu)選為如下寡核苷酸，若是SEQ ID NO24和25的任一引物和SEQ ID NO2至4的任一引物的組合，則為在嚴(yán)格條件下能夠與SEQ ID NO32或33所示的核苷酸序列的的互補(bǔ)核苷酸序列雜交的寡核苷酸，或者，若是SEQ ID NO21至23的任一引物和SEQ ID NO26至29、65和66的任一引物的組合，則是SEQ ID NO34所示的寡核苷酸。對(duì)于SEQ ID NO30和31的任一引物與SEQ ID NO26至29的任一引物的組合，探針優(yōu)選為在嚴(yán)格條件下能夠與SEQ ID NO35所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列雜交的寡核苷酸、以及SEQ ID NO34所示的寡核苷酸。尤其優(yōu)選以SEQ ID NO34所示的寡核苷酸作為探針結(jié)合SEQ ID NO21的引物與SEQ ID NO26、65和66的任一引物的組合一起使用。
合成具有所設(shè)計(jì)序列的寡核苷酸后可以用商業(yè)可獲得的試劑盒構(gòu)建這樣的探針?；蛘?，探針的構(gòu)建可以外購(gòu)或定制，且探針的許多合同生產(chǎn)商是本領(lǐng)域已知的(例如，Applied Biosystems，日本(http//www.appliedbiosystems.co.jp))。
本發(fā)明的定量方法使用了修正樣品和測(cè)試樣品，在修正樣品中來自待檢特定植物屬的樣品(尤其是待定量的)和標(biāo)準(zhǔn)植物樣品按照預(yù)定比率混合，在測(cè)試樣品中向待檢食物或食物成分中添加了已知量的標(biāo)準(zhǔn)植物樣品。該方法包括，用同樣的方法從修正樣品和測(cè)試樣品中提取基因組DNA；在相同條件下進(jìn)行定量PCR法；用定量PCR法對(duì)修正樣品確定來自標(biāo)準(zhǔn)植物的DNA拷貝數(shù)(Lo)/來自特定植物屬的DNA拷貝數(shù)(Fo)的值，作為標(biāo)準(zhǔn)修正值；和對(duì)測(cè)試樣品確定來自特定植物屬的DNA拷貝數(shù)(Fs)/來自標(biāo)準(zhǔn)植物的DNA拷貝數(shù)(Ls)的值，以及通過以下方程用標(biāo)準(zhǔn)修正值來修正該值，從而計(jì)算出食物或食物成分(1g)中所含的屬于特定植物屬的植物的量(μg)。
屬于特定植物屬的植物的量(ppm(μg/g))＝Fs/Ls×Lo/Fo×1,000,000因此，該方法使得可以修正比如各待檢食物或食物成分的DNA提取效率和對(duì)PCR反應(yīng)的抑制以及甚至各待檢樣品間DNA含量差異這樣的影響。該方法還可以在比如鹽這樣的不含DNA的食物成分以及包含該成分的食物中正確地定量檢測(cè)屬于特定植物屬的植物。
當(dāng)需要評(píng)估PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否是假陽性時(shí)，可以通過對(duì)PCR完成后反應(yīng)液中所含的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列分析來嚴(yán)格地進(jìn)行評(píng)估。
由于想要多種成分對(duì)DNA提取效率的影響盡可能一致，所以本發(fā)明中所使用的標(biāo)準(zhǔn)植物樣品優(yōu)選為任何一種處于與待檢特定植物屬相似的狀態(tài)的樣品。優(yōu)選地，該標(biāo)準(zhǔn)植物樣品源自不可能污染待檢食物或食物成分的植物物種。根據(jù)目前的情況，在栽培過程中很難除去高地野草污染食物作物的可能性且痕量的衍生自野草的物質(zhì)污染食物作物，優(yōu)選使用除被認(rèn)為是高地野草的植物物種之外的植物物種作為標(biāo)準(zhǔn)植物樣品。也即，標(biāo)準(zhǔn)植物樣品應(yīng)當(dāng)從不太可能被食物或食物成分中所使用的植物污染和不太可能污染食物或食物成分的植物物種中選擇。
各種高地野草已知為上述高地野草。其主要例子包括禾本科(Poaceae)、竹亞科(Bambusoideae)、香蒲科(Typhaceae)、莎草科(Cyperaceae)、地星科(Asteraceae)、蓼科(Polygonaceae)、鴨跖草科(Commelinaceae)、木賊科(Equisetaceae)、?？?Moraceae)、馬齒莧科(Portulacaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、豆科(Leguminoae)、酢漿草科(Oxalidaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、傘形科(Apiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、唇形科(Lamiacea)、車前草科(Plantaginaceae)、茄科(Solanaceae)和葫蘆科(Cucurbitaceae)。詳細(xì)信息參見，例如，The Weed Science Society of Japan網(wǎng)站的說明。
例如，可以一次大量獲得和保存的均一材料，比如可商業(yè)獲得的種子，更優(yōu)選為標(biāo)準(zhǔn)植物樣品。
標(biāo)準(zhǔn)植物樣品可以來自任何植物組織(比如種子、葉和根莖)。若待檢樣品來自，例如，蕎麥、小麥和花生種子，則標(biāo)準(zhǔn)植物樣品和待檢樣品優(yōu)選為種子。根據(jù)這些觀點(diǎn)，在對(duì)不含例如西瓜、番木瓜和瓜的食物的檢測(cè)中優(yōu)選比如西瓜、番木瓜和瓜這樣的果肉中含有大量被果肉和外殼使之與外界隔離的種子的植物物種。不作為食物作物栽培的植物物種也是優(yōu)選的，即使它們的種子不與外界隔離。考慮到這些條件，本發(fā)明中使用的標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的例子包括但尤其不限于(只要滿足條件)，那些源自喜林草屬(Nemophila)(爵床科(Hydrophyllaceae))、苣苔花屬(Gloxinia)(苦苣苔科(Gesneriaceae))和補(bǔ)血草(補(bǔ)血草屬(Limonium))(藍(lán)雪科(Plumbaginaceae))的植物樣品。尤其優(yōu)選的是補(bǔ)血草種子。
考慮到，例如，DNA提取效率和靈敏度和/或定量PCR法的精確性，優(yōu)選避免使用那些含有大量對(duì)DNA提取或PCR反應(yīng)表現(xiàn)抑制活性的成分的植物作為標(biāo)準(zhǔn)植物樣品。
作為舉例，本文實(shí)施例中以使用補(bǔ)血草種子作為標(biāo)準(zhǔn)植物樣品進(jìn)行舉例說明。如上所述，高地野草極可能污染食物作物并因此不適宜作為標(biāo)準(zhǔn)植物樣品。因此，本發(fā)明人調(diào)查了在The Weed ScienceSociety of Japan網(wǎng)站(http//wssj.ac.affrc.go.jp)中被描述為高地野草的全部860個(gè)類型的植物的科名，并選擇了補(bǔ)血草作為屬于不包括在這些科內(nèi)的科的植物。用特異性檢測(cè)補(bǔ)血草ITS-1序列的引物檢查總的食物成分中是否存在補(bǔ)血草污染，所述食物成分也即，五個(gè)類型的可商業(yè)獲得的小麥，五個(gè)類型的可商業(yè)獲得的玉米粉，和三個(gè)類型的可商業(yè)獲得的芥末。然而，在所有這些食物成分中根本檢測(cè)不到污染。因此，預(yù)期補(bǔ)血草優(yōu)選為本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)植物樣品。
本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)了在含有大量高地野草的禾本科中使用水稻而非補(bǔ)血草作為標(biāo)準(zhǔn)植物樣品不是優(yōu)選的。這可能是因?yàn)椋瑢儆诤瘫究频母叩匾安葜参镌谠耘噙^程中會(huì)污染所栽培的成分植物。
被選擇作為標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的植物材料的粉碎粉末(例如，補(bǔ)血草種子)和被選擇作為來自待檢特定植物屬的樣品的植物(例如，蕎麥)粉末以預(yù)定比率混合制成修正樣品。除了該修正樣品，將上述相同標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的粉碎粉末添加到待檢食物或食物成分中制成測(cè)試樣品。在粉碎過程中，重要的是必須充分考慮，以不產(chǎn)生其它食物成分的污染，且尤其是來自待檢特定植物屬的樣品與標(biāo)準(zhǔn)植物樣品彼此間的污染。例如，必須徹底的進(jìn)行粉碎過程中所使用的器械等的洗滌工作。為制備修正和測(cè)試樣品，優(yōu)選修正樣品中的來自特定植物屬的樣品和測(cè)試樣品中的食物或食物成分的樣品應(yīng)當(dāng)使用幾乎相同的量，且修正樣品中的標(biāo)準(zhǔn)植物樣品和測(cè)試樣品中來自標(biāo)準(zhǔn)樣品的樣品應(yīng)當(dāng)使用幾乎相同的量。
接下來，從修正樣品和測(cè)試樣品提取DNA?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的各種方法、且也可以用可商業(yè)獲得的試劑盒或預(yù)包裝柱進(jìn)行該DNA提取。例如，參照QIAGEN Genomic DNA Handbook andUser-Developed ProtocolIsolation of genomic DNA from plants usingthe QIAGEN Genomic-tip可以使用由QIAGEN生產(chǎn)的Genomic-tip。
之后，將所提取的DNA用于定量PCR法。盡管用于定量分析的各種PCR技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，但利用TaqManTM探針的定量實(shí)時(shí)PCR法將是方便和有利的。
用于檢測(cè)(包括定量檢測(cè))標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的引物優(yōu)選為從標(biāo)準(zhǔn)植物樣品引發(fā)特異性DNA擴(kuò)增的引物。此外，優(yōu)選的是滿足以下要求的引物在對(duì)從修正樣品中提取的基因組DNA進(jìn)行的定量PCR法中，來自標(biāo)準(zhǔn)植物的DNA拷貝數(shù)與來自特定植物屬的DNA拷貝數(shù)幾乎無差異，所述修正樣品中以預(yù)定比率混合了待檢特定植物屬的樣品和標(biāo)準(zhǔn)植物樣品；和兩個(gè)拷貝數(shù)間的差異在100倍以內(nèi)，優(yōu)選在10倍以內(nèi)。這是因?yàn)樯鲜鯨o/Fo比率是穩(wěn)定的。
例如，在用補(bǔ)血草作為標(biāo)準(zhǔn)植物樣品時(shí)，對(duì)于補(bǔ)血草可使用的引物由源自補(bǔ)血草ITS-1序列部分的以下序列組成5’-TTG GAC GTG TAT CCC TTG TGG TTC-3’(SEQ ID NO57)；和5’-CAC GAA GGT GAA AGT TGC GTT CAT-3’(SEQ ID NO58)。
如上述，任何一個(gè)能夠與已經(jīng)雜交于各擴(kuò)增靶序列的PCR引物的部位的內(nèi)部區(qū)域雜交的探針均可用作檢測(cè)補(bǔ)血草的TaqMan探針。例如，具有衍生自ITS-1序列的一部分的以下序列的探針5’-TGT GCG ACG CGG AAT G-3’(SEQ ID NO59)可以用熒光染料標(biāo)記并用作TaqMan探針。
借助定量實(shí)時(shí)PCR法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算修正樣品和測(cè)試樣品的來自標(biāo)準(zhǔn)植物的DNA拷貝數(shù)與來自待檢特定植物屬的DNA拷貝數(shù)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員易于用各種方法生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線可以通過利用長(zhǎng)度已知的DNA作模板實(shí)施定量PCR法來產(chǎn)生，包括通過定量PCR法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)植物樣品和來自待檢特定植物屬的樣品擴(kuò)增靶序列。
此外，通過構(gòu)建一個(gè)含有通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)植物樣品和來自待檢特定植物屬的樣品進(jìn)行定量PCR法獲得的擴(kuò)增靶序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒、并用該質(zhì)粒作為模板可以產(chǎn)生具有更高可重復(fù)性和更少錯(cuò)誤的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將含有來自待檢特定植物屬的樣品的擴(kuò)增靶序列的DNA和含有來自標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的擴(kuò)增靶序列的DNA插入到一個(gè)質(zhì)粒載體中從而構(gòu)建一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒。該質(zhì)?？梢栽诖竽c桿菌(E.coli)等中擴(kuò)增，由此獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。
例如，經(jīng)定量PCR法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)植物樣品和來自待檢特定植物屬的樣品產(chǎn)生的擴(kuò)增靶序列可以利用Jayaraman K.等人(1992.BioTechniques 12392-398)的采用外部和橋連引物的方法連接。
可以將標(biāo)準(zhǔn)植物樣品和來自待檢特定植物屬的樣品的擴(kuò)增靶序列整合進(jìn)一個(gè)質(zhì)粒，由此減少由于稀釋而產(chǎn)生的兩條序列的濃度錯(cuò)誤。或者，通過利用短質(zhì)粒DNA分子，也可以減少由于稀釋產(chǎn)生的錯(cuò)誤。
由于所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板具有已知的堿基長(zhǎng)度，因此可以根據(jù)重量濃度和堿基長(zhǎng)度來確定標(biāo)準(zhǔn)曲線模板溶液中所含的拷貝數(shù)。根據(jù)該拷貝數(shù)，計(jì)算測(cè)試樣品中所含的拷貝數(shù)。
本發(fā)明的這樣一種定量PCR檢測(cè)法的概念可應(yīng)用于待檢特定成分源自動(dòng)物的情況(比如家畜產(chǎn)品)以及待檢特定成分源自微生物的情況。當(dāng)待檢特定成分源自動(dòng)物時(shí)(比如家畜產(chǎn)品)，優(yōu)選應(yīng)當(dāng)使用源自動(dòng)物的成分作為標(biāo)準(zhǔn)樣品?；蛘撸?dāng)待檢特定成分源自微生物時(shí)，優(yōu)選應(yīng)當(dāng)使用源自微生物的成分作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。
本說明書包括日本專利申請(qǐng)第2003-139513號(hào)的說明書和/或附圖中所述的內(nèi)容，本申請(qǐng)要求了該專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。
附圖簡(jiǎn)述附

圖1A是檢測(cè)Shirahana蕎麥的PCR靈敏度的結(jié)果。PCR后，將所得PCR反應(yīng)液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙啶染色和用熒光圖像分析儀進(jìn)行分析；附圖1B是檢測(cè)Dattan蕎麥的PCR靈敏度的結(jié)果。PCR后，將所得PCR反應(yīng)液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙啶染色和用熒光圖像分析儀進(jìn)行分析；附圖2是檢測(cè)蕎麥PCR特異性的結(jié)果。PCR后，將所得PCR反應(yīng)液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙啶染色和用熒光圖像分析儀進(jìn)行分析；附圖3是檢查其它植物種子的補(bǔ)血草PCR特異性的結(jié)果。PCR后，將所得PCR反應(yīng)液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙啶染色和用熒光圖像分析儀進(jìn)行分析；附圖4為檢查各種食物成分的補(bǔ)血草PCR特異性的結(jié)果。PCR后，將所得PCR反應(yīng)液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙啶染色和用熒光圖像分析儀進(jìn)行分析；附圖5A是對(duì)蕎麥DNA實(shí)施定量PCR法的結(jié)果。對(duì)500pg蕎麥DNA和小麥、花生、大豆、玉米、芥末、胡椒和水稻DNA各50ng實(shí)施了定量PCR法。然而，在定量檢測(cè)區(qū)域中未檢測(cè)到除蕎麥外的成分。因此，證實(shí)了只有蕎麥可以被特異性地定量；附圖5B是對(duì)蕎麥DNA實(shí)施定量PCR法的結(jié)果。盡管對(duì)500pg蕎麥DNA和50ng補(bǔ)血草DNA實(shí)施了定量PCR法，但證實(shí)了在定量檢測(cè)區(qū)域中未能檢測(cè)到補(bǔ)血草；附圖6是對(duì)蕎麥DNA實(shí)施定量PCR法的結(jié)果。對(duì)黑旋花屬野草DNA實(shí)施了定量PCR法。甚至使用了50ng黑旋花屬野草DNA作為模板，但其擴(kuò)增率顯著慢于用10拷貝的標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)粒作為模板的擴(kuò)增率，且擴(kuò)增信號(hào)也沒有達(dá)到閾值。在定量檢測(cè)區(qū)域中未檢測(cè)到黑旋花屬野草。如此證實(shí)了只有蕎麥能夠被特異性地定量；附圖7是用標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)粒對(duì)蕎麥DNA實(shí)施定量PCR法的結(jié)果；附圖8是獲自附圖7所示結(jié)果的圖；附圖9是對(duì)補(bǔ)血草DNA實(shí)施定量PCR法的結(jié)果。對(duì)500pg作為模板的補(bǔ)血草DNA實(shí)施PCR。盡管對(duì)小麥、花生、大豆、玉米、芥末、胡椒、水稻、黑旋花屬野草DNA各50ng實(shí)施了定量PCR法，但在檢測(cè)區(qū)域中均未檢測(cè)到。由此證實(shí)了只有補(bǔ)血草可以被特異性地定量；附圖10是用標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)粒對(duì)補(bǔ)血草DNA實(shí)施定量PCR法的結(jié)果；附圖11是獲自附圖10所示結(jié)果的圖；附圖12為檢查各種食物成分的花生PCR的特異性的結(jié)果。PCR后，將所得PCR反應(yīng)液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙啶染色和用熒光圖像分析儀進(jìn)行分析；附圖13對(duì)花生DNA實(shí)施定量PCR法的結(jié)果。對(duì)500fg花生DNA和小麥、蕎麥、大豆、玉米、蘋果、小豆(adzuki bean)和補(bǔ)血草DNA各50ng實(shí)施了定量PCR。然而，在定量檢測(cè)區(qū)域中未檢測(cè)到除花生外的成分。如此證實(shí)了，只有花生可以被特異性地定量；附圖14是用花生DNA對(duì)花生DNA進(jìn)行定量PCR法的結(jié)果；和附圖15是獲自附圖14所示結(jié)果的圖。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式下文中，參照實(shí)施例，本發(fā)明將得到更具體的描述。
實(shí)施例1
A.DNA提取申所使用的植物樣品(1)蕎麥種子使用了來自Takano的Shirahana蕎麥(普通蕎麥；蕎麥，二倍體)和Dattan蕎麥(tatary蕎麥；苦蕎麥，二倍體)種子。
(2)小麥、花生、大豆、玉米、芥末和補(bǔ)血草種子，以及白胡椒和水稻(糙米)使用了可商業(yè)獲得的產(chǎn)品。
(3)小麥、大豆、玉米、芥末和黑旋花屬野草葉子使用了從可商業(yè)獲得的種子萌發(fā)的葉子。
B.DNA提取(1)從蕎麥種子和白胡椒提取DNA參照QIAGEN Genomic DNA Handbook and User-DevelopedProtocolIsolation of genomic DNA from plants using the QIAGENGenomic-tip，根據(jù)以下程序用QIAGEN生產(chǎn)的Genomic-tip進(jìn)行DNA提取。
在15-ml的管中，加入1g粉碎的樣品，添加4ml Carlson裂解緩沖液(0.1M Tris-HCl(pH9.5)、2％CTAB、1.4M聚乙二醇#6000和20mM EDTA)、8μl RNA酶A(100mg/ml)、10μl 2-巰基乙醇和80μl蛋白酶K(20mg/ml)并混合，之后于74℃溫育20分鐘。恢復(fù)至室溫后，向所得混合物中加入5ml苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)并充分混合。之后通過離心從其收集含水層。向該含水層中補(bǔ)充相同量的氯仿∶異戊醇(24∶1)并充分混合。之后通過離心從其收集含水層。再次向含水層中加入等量氯仿∶異戊醇(24∶1)并混合后，通過離心從其收集含水層。
從所得含水層取出1/2等分試樣，并將其進(jìn)行異丙醇沉淀從而收集所得沉淀物。將該沉淀物溶解于500μl緩沖液QBT中并加入到經(jīng)1ml緩沖液QBT平衡的Genomic-tip 20/G柱中，隨后DNA被柱吸附。隨后，用5ml緩沖液QBT以及隨后用2ml緩沖液QC洗滌該柱。最后，將經(jīng)過1.7ml緩沖液QF洗脫和異丙醇沉淀收集得到的沉淀物溶解于40μl無菌超純水。測(cè)量所得溶液中的DNA濃度，并將經(jīng)過無菌超純水適當(dāng)稀釋的DNA溶液用作PCR的模板DNA樣品。
(2)從小麥、大豆、玉米、芥末和補(bǔ)血草種子以及水稻(糙米)提取DNA參照DNeasy Plant Maxi試劑盒手冊(cè)，根據(jù)以下程序用QIAGEN生產(chǎn)的DNeasy Plant Maxi試劑盒進(jìn)行DNA提取。
在15-ml的管中，加入2g粉碎的樣品，添加10ml緩沖液AP1和20μl RNA酶A(100mg/ml)并混合。將所得混合物于65℃溫育15分鐘，之后在約3000×g下離心10分鐘。將所得上清液的4-ml等分試樣收集到15-ml的管中，依次向其中加入1.8ml緩沖液AP2。將所得混合物置于冰上10分鐘，并在約3000×g下離心10分鐘。將所得上清液加到QIAshredder Spin柱上，并在約3000×g下離心5分鐘。將5-ml等分試樣的所得流通液收集到50-ml管中，向其中依次加入7.5ml緩沖液AP3/E并混合。將所得混合物加入到DNeasySpin柱上，并在約3,000×g下離心5分鐘以使DNA吸附到柱上。然后，向柱中添加12ml緩沖液AW，并在約3,000×g下離心5分鐘，之后洗滌該柱。再向其中添加12ml緩沖液AW并在約3000×g下離心10分鐘，之后洗滌該柱。最后，向柱中添加1ml于65℃預(yù)溫育的緩沖液AE并放置10分鐘。之后將柱在約3000×g下離心5分鐘并將DNA從柱中洗脫。測(cè)量所得溶液中的DNA濃度，并將經(jīng)過無菌超純水適當(dāng)稀釋的DNA溶液用作PCR的模板DNA樣品。
(3)從花生種子提取DNA參照QIAGEN Genomic DNA Handbook和NucleoSpin Extract 2in 1 For Direct Purification of PCR Products，根據(jù)以下程序組合使用由QIAGEN生產(chǎn)的DNeasy Plant Maxi試劑盒和由MACHEREY-NAGEL生產(chǎn)的NucleoSpin Extract 2 in 1進(jìn)行DNA提取。
在15-ml管中，加入1g粉碎的樣品，添加10ml緩沖液G2、100μl蛋白酶K(20mg/ml)和10μl RNA酶A(100mg/ml)并混合，之后于50℃溫育1小時(shí)。將所得混合物在約3,000×g下離心10分鐘以得到其上清液。將所得上清液加入到經(jīng)1ml緩沖液QBT平衡過的Genomic-tip 20/G柱上，隨后DNA被該柱吸附。然后，用4ml緩沖液QC洗滌柱。然后用1ml預(yù)熱至50℃的緩沖液QF將DNA洗脫。向所得洗脫液中加入4體積的緩沖液NT2并混合。然后，將650-μl/運(yùn)行的所得混合液加入到兩個(gè)NucleoSpin提取柱中，并在約6,000×g下離心1分鐘以使DNA吸附到柱上。重復(fù)該步驟直到全部量的混合液都被處理過。然后，向柱中加入600μl緩沖液NT3，并在約6,000×g下離心1分鐘，之后洗滌柱。再向其中添加600μl緩沖液NT3，并以最大速度離心1分鐘以完全除去保留在柱中的緩沖液NT3。最后，向柱中加入100μl緩沖液NE，并在最大速度下離心1分鐘以使DNA從柱上洗脫。把從異丙醇沉淀收集得到的沉淀物溶解于50μl無菌超純水中。測(cè)量所得溶液中的DNA濃度，并將經(jīng)過無菌超純水適當(dāng)稀釋的DNA溶液用作PCR的模板DNA樣品。
(4)從小麥、大豆、玉米、芥末和黑旋花屬野草葉子中提取DNA利用由QIAGEN生產(chǎn)的DNeasy Plant Mini試劑盒，參照DNeasyPlant Mini試劑盒手冊(cè)，根據(jù)以下程序進(jìn)行DNA提取。
在15-ml管中，加入0.5g粉碎的樣品，添加3ml緩沖液AP1和30μl RNA酶A(100mg/ml)并混合，之后于65℃溫育15分鐘。向該混合物中添加975μl緩沖液AP2并置于冰上10分鐘。將混合物離心以獲得其上清液。將所得上清液加入到QIAshredder Spin柱中，依次離心以從柱中獲得流通液。向該流通液中加入0.5體積的緩沖液AP3和1體積的乙醇并混合。然后，將650-μl/運(yùn)行的所得混合液加到兩個(gè)DNeasy Spin柱中，并在約6,000×g下離心約1分鐘以使DNA吸附到柱上。重復(fù)該步驟直到全部量的混合液都被處理過。然后，向柱中加入500μl緩沖液AW，并在約6,000×g下離心1分鐘，之后洗滌柱。再向其中添加500μl緩沖液AW，并以最大速度離心1分鐘以完全除去保留在柱中的緩沖液AW。最后，向柱中加入120μl預(yù)熱至65℃的緩沖液AE，并在約6,000×g下離心1分鐘以使DNA從柱上洗脫。測(cè)量所得溶液中的DNA濃度，并將經(jīng)過無菌超純水適當(dāng)稀釋的DNA溶液用作PCR的模板DNA樣品。
C.檢測(cè)蕎麥ITS-1-5.8S rRNA基因序列的部分的PCR(1)用于檢測(cè)蕎麥屬的引物用通用于以下在GenBank中登記屬于蕎麥屬植物的21條序列的ITS-1-5.8S rRNA基因序列的序列作為引物序列1硬枝蕎麥(Fagopyrum urophyllum)(AB000342)2硬枝蕎麥(AB000341)3苦蕎麥(亞種potanini)(AB000340)4苦蕎麥(AB000339)
5長(zhǎng)柄野蕎麥(Fagopyrum statice)(AB000338)6長(zhǎng)柄野蕎麥(AB000337)7Fagopyrum pleioramosum(AB000336)8線葉野蕎麥(Fagopyrum lineare)(AB000335)9小野蕎麥(Fagopyrum leptopodum)(AB000334)10Fagopyrum homotropicum(AB000333)11細(xì)柄野蕎麥(Fagopyrum gracilipes)(AB000332)12Fagopyrum esculentum ancestralis(AB000331)13蕎麥(AB000330)14金蕎麥(AB000329)15金蕎麥(AB000328)16金蕎麥(AB000327)17金蕎麥(AB000326)18金蕎麥(AB000325)19金蕎麥(AB000324)20Fagopyrum capillatum(AB000323)21Fagopyrum callianthum(AB000322)然后，合成具有以下序列的寡核苷酸(oligo)DNA引物(由QIAGEN生產(chǎn)，OPC-純化的寡核苷酸)，并用作檢測(cè)蕎麥ITS-1-5.8SrRNA基因序列的部分的PCR引物(下文中稱作蕎麥PCR)5’-CGC CAA GGA CCA CGA ACA GAA G-3’(SEQ ID NO14)；和5’-CGT TGC CGA GAG TCG TTC TGT TT-3’(SEQ ID NO15)。
(2)用于檢測(cè)蕎麥屬的引物的特異性(PCR模擬)用PCR模擬軟件Amplify 1.0(Bill Engels)來證實(shí)模擬結(jié)果是否顯示用檢測(cè)蕎麥的引物獲得了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述模擬根據(jù)屬于蕎麥屬的植物的21條序列、8條除蕎麥外的有可能成為變應(yīng)原的植物的序列(花生、小麥、大豆、胡桃、日本松蕈(matsutake mushroom)、桃、蘋果和桔子)、4條常用作食物成分的植物的序列(玉米、水稻、胡椒和芥末)和27條與蕎麥相關(guān)的植物物種的序列。本文中所使用的蕎麥相關(guān)植物物種是指，當(dāng)用Genbank中登記的普通蕎麥，即蕎麥的核苷酸序列(AB000330)中的ITS-1序列部分進(jìn)行BLAST同源性檢索時(shí)，達(dá)到60分?jǐn)?shù)命中(Score 60bits)或更高的除蕎麥屬之外的植物。此處，選擇各植物所屬的某一屬中達(dá)到最高分?jǐn)?shù)的物種的序列作為該屬的代表性序列。對(duì)該序列的ITS-1-5.8S rRNA基因-ITS-2序列區(qū)域進(jìn)行PCR模擬。模擬中所使用序列的GenBank登記號(hào)和模擬結(jié)果示于表1A至1C.表1A至1C中的縮寫字母和符號(hào)如下所示實(shí)心星形預(yù)計(jì)產(chǎn)生具有靶大小左右大小(±10bp)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的那些W值產(chǎn)生PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的可能性高可能性...W6＞W(wǎng)5＞W(wǎng)4＞W(wǎng)3＞W(wǎng)2...低可能性數(shù)值(bp)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小(bp)從擴(kuò)增中獲得的值減去2的值-預(yù)計(jì)不產(chǎn)生PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的那些



如表1A至1C中所示的，從模擬結(jié)果預(yù)期，從屬于蕎麥屬的植物的21條序列可獲得具有101bp靶大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。此外還預(yù)期，從8條除蕎麥外的有可能成為變應(yīng)原的植物的序列(花生、小麥、大豆、胡桃、日本松蕈、桃、蘋果和桔子)、4條常用作食物成分的植物的序列(玉米、水稻、胡椒和芥末)和27條與蕎麥相關(guān)的植物物種的序列未能得到具有靶大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
(3)蕎麥PCR根據(jù)以下程序，用QIAGEN生產(chǎn)的HotStarTaq Master Mix試劑盒進(jìn)行蕎麥PCR。
將SEQ ID NO14和15(各終濃度為0.5μM)的引物和模板DNA加入到12.5μl 2×HotStartTaq Master Mix(HotStar Taq DNA聚合酶，含有3mM MgCl2的PCR緩沖液，和dNTP各400μM)中，用無菌超純水調(diào)節(jié)其終體積至25μl形成反應(yīng)液，依次將其置于0.2-ml微管中、并根據(jù)以下PCR步驟用由Applied Biosystems生產(chǎn)的熱循環(huán)儀GeneAmp PCR System 9600進(jìn)行反應(yīng)95℃下酶活化15分鐘；95℃變性1分鐘，66℃退火2分鐘，72℃延伸1分鐘，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；和最后于72℃延伸4分鐘。將所得PCR反應(yīng)液在含有溴化乙啶的2％瓊脂糖凝膠上跑電泳，并用由Amersham Biosciences生產(chǎn)的熒光圖像分析儀FluorImager 595進(jìn)行分析。結(jié)果示于附圖1A、1B和2。附圖1A、1B、和2中的縮寫字母和符號(hào)如下所示M100-bp DNA序列梯標(biāo)記(-)未添加模板DNA數(shù)字所添加的模板DNA量箭標(biāo)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物靶帶(約101bp)通過使用用于擴(kuò)增植物葉綠體DNA的部分的引物獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物證實(shí)了，所提取的植物DNA的純度水平可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增(數(shù)據(jù)未顯示)。
(4)蕎麥PCR的靈敏度和特異性蕎麥的PCR結(jié)果是，從500至50fg的Shirahana蕎麥(普通蕎麥)和Dattan蕎麥DNA獲得了從蕎麥靶ITS-1-5.8S rRNA基因序列預(yù)期的約101bp大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如附圖1A和1B所示?？梢詸z測(cè)到500至50fg蕎麥DNA的靈敏度相當(dāng)于如下靈敏度水平當(dāng)以50ng提取自特定樣品的DNA作為模板進(jìn)行PCR時(shí)，可以檢測(cè)到樣品DNA中所含的10至1ppm蕎麥DNA。
蕎麥的PCR結(jié)果是，從小麥葉、花生種子、大豆葉、玉米葉、芥末葉和白胡椒以及水稻DNA各50ng未獲得具有靶大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如附圖2所示。類似地，還證實(shí)了從鮭精DNA也未獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未顯示)。如附圖2所示，盡管從50至5ng黑旋花屬野草(一個(gè)蕎麥相關(guān)物種)的葉片DNA獲得了一條具有靶大小但條帶模糊的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，但從500pg或更少的該DNA卻未得到具有靶大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。不會(huì)將500pg或更低的黑旋花屬野草DNA檢測(cè)為假陽性的特異性相當(dāng)于如下特異性水平當(dāng)以50ng提取自特定樣品的DNA作為模板進(jìn)行PCR時(shí)，不會(huì)將1％或更低的黑旋花屬野草DNA(如果存在的話)檢測(cè)為假陽性。此外，還存在這樣的可能性，即PCR條件的改變會(huì)導(dǎo)致甚至從50至5ng黑旋花屬野草DNA也不產(chǎn)生具有靶大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。
(5)蕎麥PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列分析用SEQ ID NO14和15的引物通過雙鏈直接測(cè)序分析由此獲得的Shirahana蕎麥DNA-衍生的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列。將所得核苷酸序列與GenBank中登記的普通蕎麥，即蕎麥的核苷酸序列(AB000330)進(jìn)行比較，以證實(shí)Shirahana蕎麥DNA-衍生的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列與GenBank中登記的普通蕎麥(蕎麥)核苷酸序列(AB000330)的靶位點(diǎn)100％匹配。這證明了，利用引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增出并檢測(cè)到了蕎麥ITS-1-5.8S rRNA基因序列的一部分。
這些結(jié)果顯示，利用引物進(jìn)行的蕎麥PCR能夠，以高靈敏度和特異性，檢測(cè)蕎麥屬普通植物的ITS-1-5.8S rRNA基因序列。我們決定在對(duì)蕎麥ITS-1-5.8S rRNA基因序列拷貝數(shù)進(jìn)行定量的PCR(下文中稱作，對(duì)蕎麥序列的定量PCR法)中使用該引物。
D.檢測(cè)補(bǔ)血草ITS-1序列部分的PCR(用于修正)以下，調(diào)查了經(jīng)PCR對(duì)修正中所使用的標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的檢測(cè)。
在本實(shí)施例中，用補(bǔ)血草作標(biāo)準(zhǔn)植物樣品，補(bǔ)血草是一種未在日本The Weed Science Society所述的高地野草中列出的種子植物，其種子易于獲得。
(1)用于檢測(cè)補(bǔ)血草的引物根據(jù)Genebank中登記的補(bǔ)血草DNA序列(AJ222860)，設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)補(bǔ)血草ITS-1序列中一部分的PCR(下文中稱作補(bǔ)血草PCR)的具有以下序列的引物，以合成寡核苷酸DNA引物(由QIAGEN生產(chǎn)，OPC-純化的寡核苷酸)5’-TTG GAC GTG TAT CCC TTG TGG TTC-3’(SEQ ID NO57)；和5’-CAC GAA GGT GAA AGT TGC GTT CAT-3’(SEQ ID NO58)。
(2)補(bǔ)血草PCR除上述引物各使用0.2μM的終濃度外，基本上以與上述實(shí)施例1.C.(3)相同的方式進(jìn)行補(bǔ)血草PCR。結(jié)果示于附圖3和4。
通過使用用于擴(kuò)增一部分植物葉綠體DNA的引物獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物證實(shí)了，所提取的植物DNA的純度水平可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增(數(shù)據(jù)未顯示)。
(3)補(bǔ)血草PCR的特異性補(bǔ)血草的PCR結(jié)果是，從50ng補(bǔ)血草種子DNA獲得了從補(bǔ)血草靶ITS-1序列預(yù)期的約101bp大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如附圖3所示。此外，從Shirahana蕎麥種子、Dattan蕎麥種子、小麥種子、花生種子、大豆種子、玉米種子、芥末種子、白胡椒、水稻和黑旋花屬野草葉片DNA各50ng未獲得具有靶大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如附圖3所示。類似地，還證實(shí)了從鮭精DNA也未獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未顯示)。
由此推測(cè)用于檢測(cè)補(bǔ)血草DNA的引物具有對(duì)補(bǔ)血草DNA的特異性。
(4)評(píng)估食物成分中是否存在補(bǔ)血草污染以下驗(yàn)證了補(bǔ)血草是否適于用作標(biāo)準(zhǔn)植物樣品。也即，為證實(shí)補(bǔ)血草不污染食物或食物成分，進(jìn)行了補(bǔ)血草PCR。
補(bǔ)血草PCR的結(jié)果是，從5種類型的小麥、5種類型的玉米粉和3種類型的芥末種子DNA各50ng未得到具有靶大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如附圖4所示。
(5)評(píng)估補(bǔ)血草中是否存在蕎麥污染進(jìn)行了如下述建立的蕎麥序列定量PCR法以驗(yàn)證蕎麥?zhǔn)欠裎廴玖搜a(bǔ)血草種子樣品。對(duì)蕎麥序列定量PCR法的結(jié)果是，經(jīng)證實(shí)，從補(bǔ)血草種子DNA未發(fā)現(xiàn)指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)，以及未觀察到污染(數(shù)據(jù)未顯示)。
(6)對(duì)補(bǔ)血草PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列分析用SEQ ID NO57和58的引物經(jīng)雙鏈直接測(cè)序分析所獲得的源自補(bǔ)血草DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列。將所得核苷酸序列與GenBank中登記的補(bǔ)血草(Limonium sinuatum)的核苷酸序列(AJ222860)進(jìn)行比較，以證實(shí)源自補(bǔ)血草DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列與GenBank中登記的補(bǔ)血草(Limonium sinuatum)核苷酸序列(AJ222860)的靶位點(diǎn)100％匹配?？梢宰C實(shí)，補(bǔ)血草PCR擴(kuò)增出并檢測(cè)到了補(bǔ)血草靶ITS-1序列的一部分。
這些結(jié)果暗示，補(bǔ)血草和食物成分間并沒有相互污染，且補(bǔ)血草適于用作用于修正的標(biāo)準(zhǔn)植物樣品。由此我們決定在對(duì)補(bǔ)血草ITS-1序列拷貝數(shù)進(jìn)行定量的PCR(下文中稱作，對(duì)補(bǔ)血草序列的定量PCR法)中使用SEQ ID NO57和58的引物。
E.構(gòu)建定量分析中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒(1)對(duì)蕎麥PCR和補(bǔ)血草PCR靶DNA序列的連接PCR和對(duì)連接PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列分析將蕎麥靶擴(kuò)增產(chǎn)物和補(bǔ)血草靶擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR法連接并導(dǎo)入TA克隆載體。將TA克隆載體導(dǎo)入大腸桿菌并擴(kuò)增，由此構(gòu)建了用于定量分析蕎麥和補(bǔ)血草拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒。
首先，合成了具有以下序列的寡核苷酸DNA引物(QIAGEN生產(chǎn)，OPC-純化的寡核苷酸)并將其用作引物。這些引物包含上述蕎麥PCR和補(bǔ)血草PCR中所使用的蕎麥和補(bǔ)血草引物位點(diǎn)。
5’-TCT AGA CGC CAA GGA CCA CGA ACA GAA G-3’(SEQ IDNO60)5’-CAA AAG CTT CGT TGC CGA GAG TCG TTC TGT TT-3’(SEQID NO61)5’-ACG AAG CTT TTG GAC GTG TAT CCC TTG TGG TTC-3’(SEQ ID NO62)
5’-GGA TCC CAC GAA GGT GAA AGT TGC GTT CAT-3’(SEQ IDNO63)。
參照J(rèn)ayaraman K.等人的方法根據(jù)下述程序用QIAGEN生產(chǎn)的HotStarTaq Master Mix試劑盒構(gòu)建了一個(gè)連接質(zhì)粒(1992.A PCR-Mediated Gene Synthesis Strategy Involving the Assembly ofOligonucleotides Representing Only One of the Strands，BioTechniques 12392-398)。
向25μl 2×HotStartTaq Master Mix(HotStar Taq DNA聚合酶，含有3mM MgCl2的PCR緩沖液，和dNTP各400μM)中添加dNTP(終濃度500μM)，加入SEQ ID NO60和63(各1.0μM終濃度)的引物作為外部引物、SEQ ID NO61和62(各25nM終濃度)的引物作為橋連引物。加入實(shí)施例1.C.(4)中獲得的帶有蕎麥PCR靶DNA序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和實(shí)施例1.D.(3)中獲得的帶有補(bǔ)血草PCR靶DNA序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板DNA。用無菌超純水將終體積調(diào)至50μl形成反應(yīng)液，將其依次置于0.2-ml微管中、并根據(jù)以下PCR步驟用MJ Research生產(chǎn)的熱循環(huán)儀PTC-200DNAEngine進(jìn)行反應(yīng)95℃下酶活化15分鐘；95℃變性1分鐘，40℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，進(jìn)行15個(gè)循環(huán)；95℃變性1分鐘，66℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將所得PCR反應(yīng)液在含有溴化乙啶的2％瓊脂糖凝膠上跑電泳，并用由AmershamBiosciences生產(chǎn)的熒光圖像分析儀FluorImager 595進(jìn)行分析。用SEQ ID NO60和63的引物經(jīng)雙鏈直接測(cè)序分析所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列。
連接PCR的結(jié)果是，獲得了具有預(yù)期約200bp大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未顯示)。核苷酸序列分析的結(jié)果證實(shí)，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物含有蕎麥PCR和補(bǔ)血草PCR的靶DNA序列(數(shù)據(jù)未顯示)。
(2)將連接PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入質(zhì)粒中并對(duì)所插入的DNA片段進(jìn)行核苷酸序列分析用pGEM-T Easy Vector System(Promega生產(chǎn))，將由此獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物TA-克隆進(jìn)pGEM-T Easy Vector中，然后用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli JM109(DH5α))。在LB培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)帶有約220-bp插入片段轉(zhuǎn)化體，所述插入片段經(jīng)菌落PCR和核苷酸序列分析可以證實(shí)包含蕎麥PCR和補(bǔ)血草PCR的靶DNA序列。用QIAGEN生產(chǎn)的QIAGEN Hi Speed Plasmid Midi試劑盒提取和純化來自所得培養(yǎng)物的質(zhì)粒。用質(zhì)粒上序列的引物經(jīng)雙鏈測(cè)序分析純化的質(zhì)粒中所插入的DNA片段的核苷酸序列。結(jié)果證實(shí)，正如所期望的，轉(zhuǎn)化體質(zhì)粒中所插入的DNA片段核苷酸序列含有蕎麥PCR和補(bǔ)血草PCR的靶DNA序列(數(shù)據(jù)未顯示)。
(3)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒的稀釋系列根據(jù)上述提取和純化的質(zhì)粒的質(zhì)粒長(zhǎng)度和吸收(Abs.260nm)計(jì)算質(zhì)粒分子數(shù)目(拷貝數(shù))。用5ng/μl鮭精DNA(Wako PureChemical Industries生產(chǎn)，來自鮭魚睪丸的溶解于無菌超純水的纖維狀脫氧核糖核酸鈉)稀釋該質(zhì)粒，以制備109至101拷貝/2.5μl的標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒稀釋系列。我們決定在對(duì)蕎麥和補(bǔ)血草序列的定量PCR法中使用該稀釋系列生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
F.定量蕎麥序列拷貝數(shù)的PCR(1)用于檢測(cè)蕎麥序列的TaqMan MGB探針合成具有以下序列的TaqMan MGB探針(Applied Biosystems日本生產(chǎn)的，報(bào)道分子染料FAM)，并將其用作檢測(cè)蕎麥序列的探針。用GenBank中登記為蕎麥屬植物ITS-1-5.8S rRNA基因序列的21條序列的通用序列作為探針序列。
5’-CGG GAC GCG CTT C-3’(SEQ ID NO64)(2)蕎麥序列的定量PCR法根據(jù)以下程序用QIAGEN生產(chǎn)的QuantiTect Probe PCR試劑盒進(jìn)行對(duì)蕎麥序列的定量PCR法。
將SEQ ID NO14和15的引物(終濃度各為0.2μM)、SEQ IDNO64的TaqMan MGB探針(終濃度0.2μM)和模板DNA加入到12.5μl 2×QuantiTect Probe PCR Master Mix中。用無菌超純水將終體積調(diào)至25μl得到溶液，依次將該溶液分配到96孔PCR板中。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線，分配的是補(bǔ)充有標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒DNA稀釋系列的溶液而非模板DNA。將其中分配了各溶液的96孔PCR板置于AppliedBiosystems生產(chǎn)的實(shí)時(shí)PCR儀Sequence Detection System 7700中，溶液在里面根據(jù)以下PCR步驟發(fā)生反應(yīng)50℃2分鐘；95℃15分鐘；和95℃變性1分鐘，66℃退火2分鐘，和72℃延伸1分鐘，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。用一式兩份樣品進(jìn)行各反應(yīng)(在2孔中)。反應(yīng)結(jié)束后，分析延伸步驟中取得的熒光數(shù)據(jù)。首先將基線設(shè)定為0至1循環(huán)，然后在證實(shí)熒光升高的循環(huán)開始出現(xiàn)之前將其適當(dāng)?shù)卦O(shè)定在一個(gè)范圍內(nèi)。根據(jù)Kuribara H等人，2002，Novel Reference Molecules forQuantitation of Genetically Modified Maize and Soybean，JournalAOAC International 851077-1089中所述的方法設(shè)定閾值。結(jié)果示于附圖5A、5B、6、7和8。
通過使用用于擴(kuò)增一部分植物葉綠體DNA的引物成功獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物證實(shí)了，所提取的植物DNA的純度水平可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增(數(shù)據(jù)未顯示)。
(3)對(duì)蕎麥序列定量PCR法的特異性對(duì)蕎麥序列定量PCR法的結(jié)果是，從Shirahana蕎麥種子DNA得到了指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)，如附圖5A和5B所示。另一方面，從小麥葉片、花生種子、大豆葉片、玉米葉片、芥末葉片、白芥末、水稻和補(bǔ)血草種子DNA各50ng未觀察到指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)。類似地，在鮭精DNA中未觀察到指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)(數(shù)據(jù)未顯示)。盡管如附圖6所示在50ng黑旋花屬野草葉片DNA中觀察到了微弱的擴(kuò)增信號(hào)，但其出現(xiàn)在晚于10拷貝標(biāo)準(zhǔn)曲線閾值循環(huán)的閾值循環(huán)(Ct值)處、并且未達(dá)到閾值線。
該特異性相當(dāng)于如下特異性水平當(dāng)以50ng提取自補(bǔ)加有補(bǔ)血草的特定樣品的DNA作為模板進(jìn)行PCR時(shí)，該樣品不會(huì)被定量為假陽性，即使該樣品是一種百分之百不可食用的野草物種——黑旋花屬野草(蕎麥的相關(guān)物種)。
(4)對(duì)蕎麥序列定量PCR法的定量性質(zhì)和靈敏度對(duì)蕎麥序列定量PCR法的結(jié)果是，可以證實(shí)定量性質(zhì)和靈敏度，在所述定量性質(zhì)和靈敏度用108至101拷貝的標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)粒能夠畫出相關(guān)系數(shù)為0.999且斜率為的-3.504的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如附圖7和8所示。獲得指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)的靈敏度也可以從50fg Shirahana蕎麥DNA發(fā)現(xiàn)。此外，在作出5ng至50fg Shirahana蕎麥DNA的Ct值圖時(shí)，在該范圍內(nèi)還可證實(shí)能畫出相關(guān)線性曲線的定量性質(zhì)(數(shù)據(jù)未顯示)。
這些結(jié)果證明，同時(shí)使用SEQ ID NO14和15引物和SEQ IDNO64探針的對(duì)蕎麥序列的定量PCR法能夠以高靈敏度和特異性檢測(cè)蕎麥屬普通植物的ITS-1-5.8S rRNA基因序列并定量其拷貝數(shù)。我們決定在對(duì)污染蕎麥量的測(cè)量中組合使用對(duì)蕎麥序列的定量PCR法和以下所示的用于修正的對(duì)補(bǔ)血草序列的定量PCR法。
G.定量補(bǔ)血草序列拷貝數(shù)的PCR(1)用于檢測(cè)補(bǔ)血草序列的TaqMan MGB探針合成具有以下序列的TaqMan MGB探針(Applied Biosystems日本生產(chǎn)的，報(bào)道分子染料FAM)，并將其用作檢測(cè)補(bǔ)血草序列的探針。
5’-TGT GCG ACG CGG AAT G-3’(SEQ ID NO59)(2)對(duì)補(bǔ)血草序列的定量PCR法和分析除了SEQ ID NO57和58的引物各以終濃度0.2μM使用，且SEQ ID NO59的TaqMan MGB探針以終濃度0.2μM使用之外，以與實(shí)施例1.F.(2)基本相同的方式進(jìn)行對(duì)補(bǔ)血草序列定量PCR法。結(jié)果示于附圖9、10和11。
(3)對(duì)補(bǔ)血草序列定量PCR法的特異性對(duì)補(bǔ)血草序列定量PCR法的結(jié)果是，從補(bǔ)血草種子DNA發(fā)現(xiàn)了指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)，如附圖9所示。另一方面，從Shirahana蕎麥種子、Dattan蕎麥種子、小麥種子、花生種子、大豆種子、玉米種子、芥末種子、白芥末、水稻和黑旋花屬野草葉片DNA各50ng未觀察到指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)。類似地，在鮭精DNA中未觀察到指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)(數(shù)據(jù)未顯示)。
(4)對(duì)補(bǔ)血草序列定量PCR法的定量性質(zhì)對(duì)補(bǔ)血草序列定量PCR法的結(jié)果是，證實(shí)了定量性質(zhì)，在所述定量性質(zhì)用108至101拷貝的標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)粒能夠畫出相關(guān)系數(shù)為0.999且斜率為的-3.386的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如附圖10和11所示。
這些結(jié)果證明，同時(shí)使用SEQ ID NO57和58引物和SEQ IDNO59探針的對(duì)補(bǔ)血草序列的定量PCR法能夠特異性地檢測(cè)補(bǔ)血草的ITS-1序列并定量其拷貝數(shù)。我們決定在對(duì)污染蕎麥量的測(cè)量中組合使用用于修正的對(duì)補(bǔ)血草序列的定量PCR法和實(shí)施例1.F中所示的對(duì)蕎麥序列的定量PCR法。
實(shí)施例2
A.用作標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)血草，多種蕎麥粉樣品，和制備人工污染樣品中所使用的蕎麥、水稻和小麥(1)補(bǔ)血草使用了Sakata Seed Corporation出售的切割花(cut flower)的Excellent Light Blue(單個(gè)批次)。
(2)蕎麥?zhǔn)褂昧薚akano Co.，Ltd出售的Shirahana蕎麥(普通蕎麥；蕎麥，二倍體)蕎麥粉、Dattan蕎麥(苦蕎麥，二倍體)蕎麥粉、TakaneRuby(蕎麥，二倍體)蕎麥粉和Great Ruby(蕎麥，四倍體)蕎麥粉。在制備人工污染樣品時(shí)使用了Shirahana蕎麥粉。
(3)小麥?zhǔn)褂昧松虡I(yè)購(gòu)買的Norin 61。
(4)水稻使用了商業(yè)購(gòu)買的無化學(xué)藥劑Akita Komachi糙米。
B.用作標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)血草和制備人工污染樣品時(shí)所使用的水稻和小麥的粉碎和DNA提取(1)粉碎用裝有轉(zhuǎn)子(用不銹鋼制造，24-邊)和篩子(用不銹鋼制造，0.20mm)的Ultra Centrifugal Mill ZM1(由Retsch生產(chǎn)的)進(jìn)行粉碎。
(2)洗滌粉碎機(jī)在粉碎樣品之前和之后，用水洗滌粉碎機(jī)的各部分，比如盛樣品的容器、樣品蓋、轉(zhuǎn)子、篩子、扣件和夾具，浸入10％漂白液中，用水洗滌，并使之干燥。粉碎機(jī)的主體部分用氣槍清洗和擦拭，然后使用。
(3)用蕎麥和補(bǔ)血草驗(yàn)證粉碎機(jī)未受污染大量粉碎樣品前，先取其部分或者用未受蕎麥和補(bǔ)血草污染的商購(gòu)的帶有玉米外殼的凍干玉米進(jìn)行粉碎。之后從其提取DNA，以通過如實(shí)施例1.F和實(shí)施例1.G所示的對(duì)蕎麥序列和補(bǔ)血草序列的定量PCR法驗(yàn)證從50ng模板DNA是否存在指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)。若未觀察到熒光信號(hào)，則將該粉碎機(jī)評(píng)定為未受污染，并繼續(xù)進(jìn)行下述的樣品大量粉碎工作。若觀察到了熒光信號(hào)，則將該粉碎機(jī)評(píng)定為受到污染。此時(shí)，再次洗滌粉碎機(jī)，并在該粉碎機(jī)中粉碎已被證實(shí)未受蕎麥和補(bǔ)血草污染的糙米(1kg)。洗滌粉碎機(jī)和更換新篩子后，再次粉碎未受蕎麥和補(bǔ)血草污染的商購(gòu)的帶有玉米外殼的凍干玉米，并以與上述相同的方式驗(yàn)證是否存在熒光信號(hào)。在可以評(píng)定該粉碎機(jī)未受蕎麥和補(bǔ)血草污染后，繼續(xù)進(jìn)行下述的樣品大量粉碎工作。
(4)大量粉碎補(bǔ)血草并驗(yàn)證不存在蕎麥對(duì)粉碎的粉的污染在已經(jīng)驗(yàn)證未受蕎麥污染的粉碎機(jī)中，粉碎約1kg補(bǔ)血草。從粉碎的粉末取樣十份2-g等分試樣，并根據(jù)實(shí)施例1.B.(2)所述的方法用DNeasy Plant Maxi試劑盒從其提取DNA，以通過對(duì)蕎麥序列的定量PCR法驗(yàn)證從50ng模板DNA不產(chǎn)生指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)(數(shù)據(jù)未顯示)。用這些方法保證未受蕎麥污染的補(bǔ)血草粉末。
(5)大量粉碎水稻和小麥并驗(yàn)證不存在蕎麥和補(bǔ)血草對(duì)粉碎的粉的污染在已經(jīng)驗(yàn)證未受蕎麥和補(bǔ)血草污染的粉碎中，粉碎約500g水稻。從粉碎的粉末取樣五份2-g等分試樣，并根據(jù)實(shí)施例1.B.(2)所述的方法用DNeasy Plant Maxi試劑盒從其提取DNA，以通過對(duì)蕎麥序列和補(bǔ)血草序列的定量PCR法驗(yàn)證從50ng模板DNA不產(chǎn)生指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)小麥進(jìn)行同樣操作程序。用這些方法獲得未受蕎麥和補(bǔ)血草污染的水稻和小麥粉碎粉末。
C.制備人工污染的樣品(1)含蕎麥粉的人工污染的水稻粉碎粉末制備了六個(gè)抗-靜電OP袋(Fukusuke Kogyo生產(chǎn)，PZ型第6號(hào)(特別的抗-補(bǔ)血草處理)，可以用拉鏈再封閉，且三側(cè)密封)，其中稱量并放置了45.00g水稻粉碎粉末，并編號(hào)為1～6。在1號(hào)袋中，稱量并放置了5.00g蕎麥粉。將袋口封閉，用手使袋中的內(nèi)容物混合15分鐘，從而獲得含有10％蕎麥粉的水稻粉碎粉末。接下來，稱量5.00g含有10％(100,000ppm)蕎麥粉的該水稻粉末，并置于2號(hào)袋中。將袋口封閉，用手使袋中的內(nèi)容物混合15分鐘，從而獲得含有1％(10,000ppm)蕎麥粉的水稻粉碎粉末。重復(fù)這些稀釋和混合步驟從而制備含有100,000至1ppm蕎麥粉的水稻粉碎粉末。
(2)含有蕎麥粉的人工污染小麥粉碎粉末樣品以上述相同方式制備含有100,000至1ppm蕎麥粉的小麥粉碎粉末。
(3)含有蕎麥粉的人工污染水稻和小麥粉碎粉末樣品在一個(gè)抗靜電OP袋(Fukusuke Kogyo生產(chǎn)，PZ型第5號(hào)(特別的抗-補(bǔ)血草處理)，可以用拉鏈再封閉，且三側(cè)密封)中稱量并放置了12.5g含有10ppm蕎麥粉的水稻粉碎粉末和12.5g含有10ppm蕎麥粉的小麥粉碎粉末。將袋口封閉，用手使袋中的內(nèi)容物混合15分鐘，從而獲得含有10ppm蕎麥粉的水稻和小麥粉碎粉末。
D.根據(jù)DNA提取確定人工污染樣品-取樣規(guī)模(1)Shirahana蕎麥粉的顆粒大小分布測(cè)量假定蕎麥粉為球形的，對(duì)于測(cè)定蕎麥粉顆粒的大小，測(cè)量了Shirahana蕎麥粉的顆粒大小分布(激光衍射/散射法，干燥處理，在0.5kg/cm2壓力條件下)。該測(cè)定外包給了Seishin Enterprise Co.，Ltd.，Powder Technology Centre。結(jié)果是，Shirahana蕎麥粉的顆粒大小(中值大小)(×50)為80.941μm。
(2)蕎麥粉的體積密度測(cè)量為測(cè)定蕎麥粉密度(包括顆粒間和顆粒內(nèi)空隙和孔洞的密度)，對(duì)Shirahana蕎麥粉進(jìn)行了體積密度測(cè)量(汞(Hg)法在該方法中，將蕎麥粉置于具有固定容積的室中，然后向室中灌滿水銀)。該測(cè)量外包給了Seishin Enterprise Co.，Ltd.，Powder Technology Centre。結(jié)果，Shirahana蕎麥粉的體積密度(Hg法)是1.181g/cm3。
蕎麥粉所占體積＝(室的體積)-(所添加的水銀的體積)蕎麥粉體積密度(Hg法)＝(所加入的蕎麥粉重量)/(蕎麥粉所占體積)(3)人工污染樣品中蕎麥粉顆粒數(shù)的試計(jì)算和確定取樣規(guī)模從所測(cè)量的Shirahana蕎麥粉值(顆粒大小為80.941μm，且密度為1.181g/cm3)計(jì)算出了每顆粒蕎麥粉的重量，以試計(jì)算各種蕎麥粉濃度的人工污染樣品中的蕎麥粉顆粒數(shù)。結(jié)果示于表2。該結(jié)果揭示，當(dāng)定量中用于DNA提取的樣品是從含有10ppm目的污染蕎麥的人工污染樣品取樣時(shí)，在已經(jīng)取樣的樣品中放置至少約100粒蕎麥粉需要4g或更多的用于DNA提取的樣品。我們決定取樣5-g等分試樣進(jìn)行DNA提取。
人工污染樣品中的Shirahana蕎麥粉顆粒數(shù)

E.從100％蕎麥粉+補(bǔ)血草標(biāo)準(zhǔn)、和人工污染樣品+補(bǔ)血草標(biāo)準(zhǔn)提取DNA(1)各種蕎麥粉樣品從Shirahana蕎麥粉取樣了六個(gè)樣品，從Takane Ruby蕎麥粉、Great Ruby蕎麥粉和Dattan蕎麥粉各取樣了三個(gè)樣品。這些樣品在DNA提取中使用。
(2)人工污染的樣品從含有100ppm Shirahana蕎麥粉的小麥粉碎粉末、含有10ppmShirahana蕎麥粉的小麥粉碎粉末、含有10ppm Shirahana蕎麥粉的水稻粉碎粉末和含有10ppm Shirahana蕎麥粉的小麥和水稻粉碎粉末各取樣了三個(gè)樣品，并用于DNA提取。
(3)DNA提取參照QIAGEN Genomic DNA Handbook and User-DevelopedProtocolIsolation of genomic DNA from plants using the QIAGENGenomic-tip，根據(jù)以下程序用QIAGEN生產(chǎn)的Genomic-tip提取DNA。
將5g樣品和1g補(bǔ)血草粉碎粉末置于50-ml管中，并向管中添加30ml Carlson裂解緩沖液(0.1M Tris-HCl(pH9.5)、2％CTAB、1.4M聚乙二醇#6000和20mM EDTA)、60μl RNA酶A(100mg/ml)、75μl 2-巰基乙醇和600μl蛋白酶K(20mg/ml)。為進(jìn)一步提高樣品的分散度，向混合物中加入三個(gè)氧化鋯球(Nikkato生產(chǎn)，YTZ球，φ7mm)，用搖動(dòng)器(Iwaki Sangyo生產(chǎn)，KM Shaker V-DX)在Speed 100處混合10分鐘或更久直到團(tuán)塊消除，之后于74℃溫育20分鐘。在溫育過程中，每五分鐘手搖管并混合。
在3,000xg離心10分鐘后，將4ml所得上清液收集到一支15-ml的管中，并加入5ml苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)且充分混合。該混合物在3,000xg離心10分鐘后，將所得上清液(含水層)收集到一支15-ml的管中，并加入3.5ml氯仿∶異戊醇(24∶1)且充分混合。該混合物在3,000xg離心10分鐘后，將所得上清液(含水層)收集到一支15-ml的管中，并再次用氯仿∶異戊醇(24∶1)提取和離心以收集上清液(含水層)。把經(jīng)異丙醇沉淀從上清液(含水層)的150-μl等分試樣收集到的沉淀物溶解在100μl無菌超純水中，并加入900μl緩沖液QBT。將所得溶液應(yīng)用于經(jīng)1ml緩沖液QBT平衡的Genomic-tip 20/G柱，隨后DNA吸附到該柱上。然后，用4ml緩沖液QC洗滌該柱。最后把用1ml緩沖液QF洗脫DNA和異丙醇沉淀收集到的沉淀物溶解于40μl無菌超純水中。測(cè)量所得溶液中的DNA濃度，用無菌超純水適當(dāng)稀釋DNA溶液，并將其用作PCR的模板DNA樣品。
F.計(jì)算從補(bǔ)加有補(bǔ)血草標(biāo)準(zhǔn)的100％蕎麥粉提取的DNA中的“補(bǔ)血草序列拷貝數(shù)/蕎麥序列考貝數(shù)的比率”用實(shí)施例1.F.和實(shí)施例1.G中所述的方法進(jìn)行對(duì)蕎麥序列和補(bǔ)血草序列的定量PCR法。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量了從補(bǔ)加有補(bǔ)血草標(biāo)準(zhǔn)的100％蕎麥粉提取的50ng DNA的蕎麥序列拷貝數(shù)和補(bǔ)血草序列拷貝數(shù)。根據(jù)定量值，計(jì)算了“補(bǔ)血草序列拷貝數(shù)/蕎麥序列拷貝數(shù)＝Lo/Fo比率”。通過同時(shí)測(cè)量2個(gè)孔中的相同樣品以及從兩個(gè)測(cè)量值獲得比率平均值計(jì)算了各蕎麥粉樣品的Lo/Fo比率。
Lo/Fo比率測(cè)量的結(jié)果是，Shirahana蕎麥粉(各在兩個(gè)孔中一式兩份測(cè)量的6個(gè)提取的樣品)的Lo/Fo比率是2.36，Takane Ruby蕎麥粉的是3.25，Great Ruby蕎麥粉的是2.70，以及Dattan蕎麥粉(各在兩個(gè)孔中一式兩份測(cè)量的3個(gè)提取的樣品)的是4.75，如表3所示。我們決定用此處獲得的Shirahana蕎麥粉的Lo/Fo比率和實(shí)施例2.G中計(jì)算的人工污染樣品的“蕎麥序列拷貝數(shù)/補(bǔ)血草序列拷貝數(shù)＝Fs/Ls比率”來確定污染蕎麥的量。多種蕎麥粉樣品在Lo/Fo比率測(cè)量中的原始數(shù)據(jù)示于表4A和4B。
多種蕎麥粉樣品的Lo/Fo比率
Lo/Fo比率測(cè)量中多種蕎麥粉樣品的原始數(shù)據(jù)(第一次測(cè)量)第一次測(cè)量中多種蕎麥粉樣品的原始數(shù)據(jù)




標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-3.461 Y-截距40.165斜率-3.390Y-截距40.055相關(guān)系數(shù)0.999閾值線0.26 相關(guān)系數(shù)0.999 閾值線0.26基線(3，10)基線(3，10) Lo/Fo比率測(cè)量中多種蕎麥粉樣品的原始數(shù)據(jù)(第一次測(cè)量)
Lo/Fo比率測(cè)量中多種蕎麥粉樣品的原始數(shù)據(jù)(第二次測(cè)量)第二次測(cè)量中多種蕎麥粉樣品的原始數(shù)據(jù)




標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-3.43 Y-截距39.853斜率-3.398 Y-截距42.303相關(guān)系數(shù)0.999 閾值線0.26 相關(guān)系數(shù)0.999 閾值線1.02基線(1，5) 基線(1，5) Lo/Fo比率測(cè)量中多種蕎麥粉樣品的原始數(shù)據(jù)(第二次測(cè)量)

Dattan蕎麥粉的測(cè)量值偏離Shirahana蕎麥粉的測(cè)量值最多，然而，它只是Shirahana蕎麥粉測(cè)量值的兩倍。由此認(rèn)為本發(fā)明的方法作為定量PCR方法具有足夠的準(zhǔn)確性。
G.計(jì)算從補(bǔ)加有補(bǔ)血草標(biāo)準(zhǔn)的人工污染樣品提取的DNA的“蕎麥序列考貝數(shù)/補(bǔ)血草序列拷貝數(shù)比率”和計(jì)算污染人工污染樣品的蕎麥量用實(shí)施例1.F.和實(shí)施例1.G所述的方法進(jìn)行對(duì)蕎麥序列和補(bǔ)血單序列的定量PCR法。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量了50ng從補(bǔ)加有補(bǔ)血草標(biāo)準(zhǔn)的人工污染樣品提取的DNA的蕎麥序列拷貝數(shù)和補(bǔ)血草序列拷貝數(shù)。根據(jù)定量值計(jì)算了“蕎麥序列拷貝數(shù)/補(bǔ)血蘋序列拷貝數(shù)＝Fs/Ls比率”。通過提取來自相同樣品的三個(gè)樣品，各樣品在兩個(gè)孔中進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算了人工污染樣品的Fs/Ls比率。用此處計(jì)算出的Fs/Ls比率和實(shí)施例2.F中計(jì)算出的Lo/Fo比率根據(jù)以下方程測(cè)定了污染人工污染樣品(1g)的蕎麥量(μg)。
污染蕎麥的量(ppm(μg/g))＝Fs/Ls×Lo/Fo×1,000,000Fs/Ls比率測(cè)量的結(jié)果和污染蕎麥量的計(jì)算結(jié)果是，在對(duì)含有100ppm Shirahana蕎麥粉的小麥粉碎粉末、含有10ppm Shirahana蕎麥粉的小麥粉碎粉末、含10ppm Shirahana蕎麥粉的水稻粉碎粉末和含10ppm Shirahana蕎麥粉的小麥和水稻粉碎粉末的兩次測(cè)量的每一次中都能夠得到合理的值，如表5所示。Fs/Ls比率測(cè)量中多種人工污染樣品的原始數(shù)據(jù)示于6A和6B。
人工污染樣品中污染的蕎麥量的測(cè)量結(jié)果總結(jié)(PCR)人工污染樣品中污染的蕎麥量的測(cè)量結(jié)果

*從每一個(gè)人工污染樣品提取3個(gè)樣品，且以n＝2進(jìn)行每一次測(cè)量。
*將從補(bǔ)充了1g補(bǔ)血草屬(補(bǔ)血草)標(biāo)準(zhǔn)的5g人工污染樣品提取的50ng DNA進(jìn)行PCR。
*將Shirahana蕎麥Lo/Fo值＝2.36用于計(jì)算人工污染樣品中的蕎麥粉濃度(ppm)。
*含有10ppm蕎麥的水稻的No.1和No.3樣品以參考值顯示，因?yàn)樗鼈兟湓诙垦a(bǔ)血草序列拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之外。
污染的蕎麥量的測(cè)量中多種人工污染樣品的原始數(shù)據(jù)(第一次測(cè)量)第一次測(cè)量中人工污染樣品的原始數(shù)據(jù)




標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-3.504 Y-截距40.974斜率-3.382 Y-截距40.043相關(guān)系數(shù)0.999閾值線0.26 相關(guān)系數(shù)0.999閾值線0.26基線(3，10)基線(3，10) 污染的蕎麥量的測(cè)量中多種人工污染樣品的原始數(shù)據(jù)(第一次測(cè)量)

*含有10ppm蕎麥的水稻的人工污染樣品以參考值顯示，因?yàn)檠a(bǔ)血草序列的拷貝數(shù)超過了標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。
污染的蕎麥量的測(cè)量中多種人工污染樣品的原始數(shù)據(jù)(第二次測(cè)量)第二次測(cè)量中人工污染樣品的原始數(shù)據(jù)




標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-3.475Y-截距41.45斜率-3.385 Y-截距41.855相關(guān)系數(shù)0.999 閾值線0.51 相關(guān)系數(shù)0.999閾值線0.77基線(3，8) 基線(3，8) 污染的蕎麥量的測(cè)量中多種人工污染樣品的原始數(shù)據(jù)(第二次測(cè)量)

實(shí)施例3A.DNA提取中所使用的植物樣品(1)花生、蕎麥(Shirahana蕎麥)和補(bǔ)血草種子使用了與實(shí)施例1.A.(1)和實(shí)施例1.A.(2)中相同的種子。
(2)小麥、大豆和玉米葉片使用了與實(shí)施例1.A.(3)中相同的葉片。
(3)小豆、杏仁、胡桃、澳大利亞堅(jiān)果、和榛實(shí)種子、松子、向日葵種子、罌粟種子、芝麻和蘋果使用了商購(gòu)的產(chǎn)品。
(4)蕎麥(Shirahana蕎麥)和小豆葉片使用了從商購(gòu)種子萌發(fā)的葉片。
B.DNA提取
(1)從補(bǔ)血草種子提取DNA以與實(shí)施例1.B.(2)相同的方式提取DNA。
(2)從花生、杏仁、和榛實(shí)種子、罌粟種子和芝麻提取DNA以與實(shí)施例1.B.(3)相同的方式提取DNA。
(3)從蕎麥(Shirahana蕎麥)、小麥、大豆、玉米和小豆葉片和蘋果種子提取DNA以與實(shí)施例1.B.(4)相同的方式提取DNA。
(4)從澳大利亞堅(jiān)果種子提取DNA參照QIAGEN Genomic DNA Handbook根據(jù)以下程序用QIAGEN生產(chǎn)的Genomic-tip提取DNA。
在50-ml的管中，加入1g粉碎的樣品，添加10ml緩沖液G2、200μl蛋白酶K(20mg/ml)和20μl RNA酶A(100mg/ml)并混合，之后于50℃溫育1小時(shí)。然后在約3000×g離心所得混合物10分鐘以得到其上清液。對(duì)已經(jīng)除去了油內(nèi)容物和粉末的上清液以約3,000xg進(jìn)一步離心10分鐘以得到其上清液。將所得上清液加入到經(jīng)1ml緩沖液QBT平衡的Genomic-tip 20/G柱中，之后DNA被該柱吸附。然后，用4ml緩沖液QC洗滌該柱。將經(jīng)過1ml預(yù)熱至50℃的緩沖液QF洗脫和異丙醇沉淀收集得到的沉淀物溶解于100μl無菌超純水中。測(cè)量所得溶液中的DNA濃度，并將經(jīng)過無菌超純水適當(dāng)稀釋的DNA溶液用作PCR的模板DNA樣品。
(5)從胡桃種子、松子和向日葵種子提取DNA參照DNeasy Plant Maxi試劑盒手冊(cè)，根據(jù)以下程序用QIAGEN生產(chǎn)的DNeasy Plant Maxi試劑盒進(jìn)行DNA提取。
在15-ml的管中，加入1g粉碎的樣品，添加10ml緩沖液AP1和10μl RNA酶A(100mg/ml)并混合，之后于65℃溫育60分鐘。之后將所得溶液在約3000×g下離心10分鐘以得到其上清液。向該上清液中加入1.5ml緩沖液AP2。將所得混合物置于冰上10分鐘并離心以得到其上清液。將所得上清液加到QIAshredder Spin柱上，以通過離心從該柱得到流通液。向該流通液中加入1.5體積的緩沖液AP3和1體積乙醇，并混合。將所得混合物加入到DNeasy Spin柱上并在約1,500×g下離心1分鐘以使DNA吸收到柱上。然后，向柱中加入10ml緩沖液AW，并在約1,500xg下離心1分鐘，之后洗滌該柱。再向柱中添加10ml緩沖液AW，并在約1,500xg下離心1分鐘。隨后，在約3,000xg下離心10分鐘以完全除去柱中殘余的緩沖液AW。最后向柱中加入1ml預(yù)熱至65℃的無菌超純水并保持5分鐘。之后以約3,000xg將柱離心5分鐘以從柱中將DNA洗脫。將經(jīng)異丙醇沉淀收集到的沉淀物溶解到100μl無菌超純水中。測(cè)量所得溶液中的DNA濃度，并將經(jīng)過無菌超純水適當(dāng)稀釋的DNA溶液用作PCR的模板DNA樣品。
C.檢測(cè)花生ITS-1序列的部分的PCR(1)檢測(cè)花生的引物用通用于以下11條在GenBank中登記的落花生屬植物序列的ITS-1序列的序列作為引物序列。關(guān)于這些植物中的落花生，還使用了一條從分析商購(gòu)花生獲得的序列以替代GenBank中登記的落花生(AF156675)。
1Arachis batizocoi(AF203553)2Arachis correntina(AF203554)3Arachis hermannii(AF203556)4Arachis hoehnei(AJ320395)5落花生(AF156675和從分析商購(gòu)花生獲得的序列)6Arachis magna(AF203555)7Arachis major(AF203552)8Arachis palustris(AF203557)9Arachis pintoi(AF203551)10Arachis triseminata(AF204233)11絨毛落花生(AF203558)然后，合成了具有如下序列的寡核苷酸DNA引物(由QIAGEN生產(chǎn)，OPC-純化的寡核苷酸)，并將其用作檢測(cè)花生ITS-1序列的部分的PCR(下文中稱作花生PCR)的引物。
5’-GCG GAA AGC GCC AAG GAA GC-3’(SEQ ID NO21)5’-GTC GCC CCG ACC GGA TG-3’(SEQ ID NO66)5’-CGT CGC CCC GAC CGG AT-3’(SEQ ID NO26)5’-TCG TCG CCC CGA CCG GAT G-3’(SEQ ID NO65)(2)用于檢測(cè)花生的引物的特異性(PCR模擬)
用PCR模擬軟件Amplify 1.0(Bill Engels)來證實(shí)模擬結(jié)果是否顯示用檢測(cè)花生的引物獲得了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述模擬根據(jù)屬于落花生屬的植物的11條序列、8條除花生外的有可能成為變應(yīng)原的植物的序列(蕎麥、小麥、大豆、胡桃、日本松蕈、桃、蘋果和桔子)、8條常用作食物成分的植物的序列(玉米、水稻、胡椒、芥末、胡蘿卜、香菇(shiitake mushroom)、大白菜和蕪菁)、6條豆科植物的序列(菜豆、利馬豆、小扁豆、鷹嘴豆、綠豆和小豆)、69條與花生相關(guān)的植物物種的序列，和補(bǔ)血草。本文中所使用的花生相關(guān)植物物種是指，當(dāng)用Genbank中登記的花生，即落花生的核苷酸序列(AF156675)中的ITS-1序列部分進(jìn)行BLAST同源性檢索時(shí)達(dá)到60分?jǐn)?shù)命中或更高的、除落花生屬之外的植物。此處，選擇各植物所屬的某一屬中達(dá)到最高分?jǐn)?shù)的物種的序列作為該屬的代表性序列。對(duì)該序列的ITS-1-5.8S rRNA基因-ITS-2序列進(jìn)行PCR模擬。在組合使用SEQ ID NO21和65的引物的模擬中所使用序列的GenBank登記號(hào)和模擬結(jié)果示于表7A至7E。表7A至7E中的縮寫字母和符號(hào)如下所示實(shí)心星形預(yù)計(jì)產(chǎn)生具有靶大小左右大小(±10bp)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的那些W值產(chǎn)生PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的可能性高可能性...W6＞W(wǎng)5＞W(wǎng)4＞W(wǎng)3＞W(wǎng)2...低可能性數(shù)值(bp)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小(bp)從擴(kuò)增中獲得的值減去2的值-預(yù)計(jì)不產(chǎn)生PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的那些





如表7A至7C中所示，從模擬結(jié)果預(yù)期，組合使用SEQ ID NO21和65的引物時(shí)，從屬于落花生屬的植物的11條序列可獲得具有76bp靶大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。此外還預(yù)期，從7條除花生外的有可能成為變應(yīng)原的植物的序列(蕎麥、小麥、大豆、胡桃、日本松蕈、桃和桔子)、8條常用作食物成分的植物的序列(玉米、水稻、胡椒、芥末、胡蘿卜、香菇、大白菜和蕪菁)、6條豆科植物的序列(菜豆、利馬豆、小扁豆、鷹嘴豆、綠豆和小豆)、69條與花生相關(guān)的植物物種的序列，以及補(bǔ)血草，未能得到具有靶大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。由于預(yù)計(jì)可能從蘋果得到具有大小不同于靶大小、但具有微弱信號(hào)的非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所以我們決定通過實(shí)際PCR對(duì)蘋果進(jìn)行再次驗(yàn)證。PCR模擬的結(jié)果顯示，預(yù)計(jì)在組合使用具有SEQ ID NO21和66所示序列的引物和組合使用SEQ ID NO21和26的引物這兩種情況中，都可以從落花生屬植物序列得到具有靶大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
(3)花生PCR根據(jù)以下程序，用QIAGEN生產(chǎn)的HotStarTaq Master Mix試劑盒進(jìn)行花生PCR。
將引物(各終濃度為0.2μM)和模板DNA加入到12.5μl 2×HotStartTaq Master Mix(H0tStar Taq DNA聚合酶，含有3mMMgCl2的PCR緩沖液，和dNTP各400μM)中，用無菌超純水調(diào)節(jié)其終體積至25μl以形成反應(yīng)液。依次將其置于0.2-ml微管中、并根據(jù)以下PCR步驟用由Applied Biosystems生產(chǎn)的熱循環(huán)儀GeneAmpPCR System 9600進(jìn)行反應(yīng)95℃下酶活化15分鐘；95℃變性30秒，68℃退火和延伸30秒，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；和最后于72℃延伸4分鐘。將所得PCR反應(yīng)液在含有溴化乙啶的2％瓊脂糖凝膠上跑電泳，并用由Amersham Biosciences生產(chǎn)的熒光圖像分析儀FluorImager 595進(jìn)行分析。組合使用SEQ ID NO21和65的引物的結(jié)果作為代表示于附圖12。附圖12中的縮寫字母和符號(hào)如下所示M100-bp DNA序列梯標(biāo)記(-)未添加模板DNA數(shù)字所添加的模板DNA量箭標(biāo)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物靶帶(約76bp)通過使用用于擴(kuò)增植物葉綠體DNA或核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因序列的部分的引物獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物證實(shí)了，所提取的植物DNA的純度水平可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增(數(shù)據(jù)未顯示)。
(4)花生PCR的靈敏度和特異性花生的PCR結(jié)果是，從500fg的花生DNA獲得了從花生靶ITS-1序列預(yù)期的約76bp大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如附圖12所示。使得可以檢測(cè)到500fg花生DNA的靈敏度相當(dāng)于如下靈敏度水平當(dāng)以50ng提取自特定樣品的DNA作為模板進(jìn)行PCR時(shí)，可以檢測(cè)到樣品DNA中所含的10ppm蕎麥DNA。
花生的PCR結(jié)果是，從蘋果種子、小麥葉片、蕎麥葉片、小豆葉片、大豆葉片、玉米葉片和補(bǔ)血草種子DNA各50ng未獲得具有靶大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如附圖12所示。盡管PCR模擬已經(jīng)預(yù)計(jì)到可能從蘋果得到具有大小不同于靶大小、但具有微弱信號(hào)的非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，但經(jīng)證實(shí)這一問題不會(huì)發(fā)生。類似地，還證實(shí)了從杏仁種子、榛實(shí)種子、澳大利亞堅(jiān)果種子、胡桃種子、罌粟種子、松子、向日葵種子、芝麻和鮭精DNA也未獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，從所得結(jié)果，發(fā)現(xiàn)花生PCR在組合使用SEQ ID NO21和66的引物和組合使用SEQ ID NO21和26的引物這兩種情況中都具有類似的靈敏度和特異性(數(shù)據(jù)未顯示)。
(5)花生PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列分析用SEQ ID NO21和65的引物通過雙鏈直接測(cè)序分析組合使用SEQ ID NO21和65的引物獲得的花生DNA-衍生的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列。將所得核苷酸序列與商購(gòu)花生，即落花生的核苷酸序列相比較，以證實(shí)花生DNA-衍生的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列與商購(gòu)花生(落花生)的核苷酸序列的靶位點(diǎn)百分之百匹配(數(shù)據(jù)未顯示)。這證明了，利用引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增和檢測(cè)到了花生ITS-1序列的一部分。此外，從所得結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在組合使用SEQ ID NO21和66的引物和組合使用SEQ ID NO21和26的引物這兩種情況中，PCR都擴(kuò)增和檢測(cè)到了花生ITS-1序列的一部分(數(shù)據(jù)未顯示)。
這些結(jié)果顯示，利用引物進(jìn)行的花生PCR能夠，以高靈敏度和特異性，檢測(cè)落花生屬普通植物的ITS-1序列。我們決定在對(duì)花生ITS-1序列拷貝數(shù)進(jìn)行定量的PCR(下文中稱作對(duì)花生序列的定量PCR法)中使用這些引物。
D.定量花生序列拷貝數(shù)的PCR(1)用于檢測(cè)花生序列的TaqMan MGB探針合成具有以下序列的TaqMan MGB探針(Applied Biosystems日本生產(chǎn)，報(bào)道分子染料FAM)，并將其用作檢測(cè)花生序列的探針。用GenBank中登記為落花生屬植物ITS-1序列的11條序列的通用序列和從分析商購(gòu)花生獲得的序列作為探針序列。
5’-TGC TCT CCC CGC CGG C-3’(SEQ ID NO34)(2)對(duì)花生序列的定量PCR法根據(jù)以下程序用QIAGEN生產(chǎn)的QuantiTect Probe PCR試劑盒進(jìn)行對(duì)花生序列的定量PCR法。
將引物(終濃度各為0.2μM)、SEQ ID NO34的TaqMan MGB探針(終濃度0.1μM)和模板DNA加入到12.5μl 2×QuantiTectProbePCR Master Mix中。用無菌超純水將終體積調(diào)至25μl以得到溶液，依次將該溶液分配到96孔PCR板中。將其中分配了溶液的96孔PCR板置于Applied Biosystems生產(chǎn)的實(shí)時(shí)PCR儀SequenceDetection System 7700中，溶液在里面根據(jù)以下PCR步驟發(fā)生反應(yīng)95℃15分鐘；和95℃變性30秒，68℃退火和延伸30秒，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；和最終于72℃延伸4分鐘。用相同的樣品一式兩份進(jìn)行各反應(yīng)(在2孔中)。反應(yīng)結(jié)束后，分析延伸步驟中取得的熒光數(shù)據(jù)。首先將基線設(shè)定為0至1循環(huán)，然后在證實(shí)熒光升高的循環(huán)開始出現(xiàn)之前將其適當(dāng)?shù)卦O(shè)定在一個(gè)范圍內(nèi)。根據(jù)Kuribara H等人，2002，Novel Reference Molecules for Quantitation of Genetically ModifiedMaize and Soybean，Journal AOAC International 851077-1089中所述的方法設(shè)定閾值線。組合使用SEQ ID NO21和65的引物的情況作為代表示于附圖13、14和15。
通過使用用于擴(kuò)增一部分植物葉綠體DNA或核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因序列的引物獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物證實(shí)了，所提取的植物DNA的純度水平可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增(數(shù)據(jù)未顯示)。
(3)對(duì)花生序列的定量PCR法的特異性對(duì)花生序列的定量PCR法的結(jié)果是，從花生種子DNA獲得了指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)，如附圖13所示。另一方面，從蘋果種子、小麥葉片、蕎麥葉片、小豆葉片、大豆葉片、玉米葉片和補(bǔ)血草種子DNA各50ng未觀察到指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)。類似地，在杏仁種子、榛實(shí)種子、澳大利亞堅(jiān)果種子、胡桃種子、罌粟種子、松子、向日葵種子、芝麻、蘋果和鮭精DNA中未觀察到指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，從所得結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在組合使用SEQ ID NO21和66的引物和組合使用SEQ ID NO21和26的引物這兩種情況中，該定量PCR法具有相似的特異性(數(shù)據(jù)未顯示)。
(4)對(duì)花生序列的定量PCR法的定量性質(zhì)和靈敏度對(duì)花生序列的定量PCR法的結(jié)果是，可以驗(yàn)證定量性質(zhì)和靈敏度，在所述定量性質(zhì)和靈敏度用50ng至500fg量的花生DNA能夠畫出相關(guān)系數(shù)為0.996且斜率為的-3.911的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如附圖14和15所示。達(dá)到指示擴(kuò)增的熒光信號(hào)的靈敏度也可以在50fg花生DNA發(fā)現(xiàn)。此外，從所得結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在組合使用SEQ ID NO21和66的引物和組合使用SEQ ID NO21和26的引物這兩種情況中，該定量PCR法具有相似的定量性質(zhì)和靈敏度(數(shù)據(jù)未顯示)。
這些結(jié)果證明，結(jié)合使用SEQ ID NO21和65的引物與SEQ IDNO34的探針的對(duì)花生序列的定量PCR法、結(jié)合使用SEQ ID NO21和66的引物與SEQ ID NO34的探針的對(duì)花生序列的定量PCR法以及結(jié)合使用SEQ ID NO21和26的引物與SEQ ID NO34的探針的對(duì)花生序列的定量PCR法能夠以高靈敏度和特異性檢測(cè)落花生屬普通植物的ITS-1序列以及定量花生序列的拷貝數(shù)，只要生成了含有花生靶序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明的對(duì)花生序列的定量PCR法可以與在測(cè)量污染花生量中用于修正的對(duì)補(bǔ)血草序列的定量PCR法組合使用。
實(shí)施例4在加工樣品中證實(shí)定量PCR法的定量性質(zhì)通過向80g含有100ppm(在下文中，W/W)蕎麥的小麥中加入35g水和0.8g鹽制成生面團(tuán)(直徑6cm，厚1mm)，對(duì)該生面團(tuán)進(jìn)行如下四種中的任何一種熱處理(1)烘焙(160℃，10分鐘)、(2)油炸(185℃，5秒)、(3)蒸(100℃，10分鐘)和煮(100℃，10分鐘)，并將其用作烹調(diào)加工產(chǎn)品模型。然后將其與補(bǔ)血草標(biāo)準(zhǔn)樣品混合，之后以上述相同的方式提取DNA。用由具有SEQ IDNO14所示序列的核苷酸和具有SEQ ID NO15所示序列的核苷酸組成的引物組，組合具有SEQ ID NO64所示序列的探針，對(duì)所加熱樣品中所含的蕎麥進(jìn)行定量。當(dāng)考慮水含量時(shí)，根據(jù)在加工產(chǎn)品中的蕎麥所測(cè)得的定量值，確定所使用的小麥中的蕎麥濃度。結(jié)果，(1)烘焙產(chǎn)品的蕎麥濃度為145ppm，(2)油炸產(chǎn)品的蕎麥濃度為56ppm，(3)蒸制產(chǎn)品的蕎麥濃度為198ppm，和(4)煮制產(chǎn)品的蕎麥濃度為143ppm，并顯示了足夠的定量性質(zhì)。由此暗示，采用本發(fā)明的方法進(jìn)行的定量可以在食物加工中所有最為普遍的熱處理方法(烘焙、油炸、蒸和煮)中進(jìn)行。因此，認(rèn)為本發(fā)明的方法對(duì)于用除上述加工方法外的方法加工的加工食物能夠維持其定量性質(zhì)。由此，本發(fā)明的方法可廣泛應(yīng)用于加工的食物。
本文所引用的所有公開文件、專利和專利申請(qǐng)均全文引入本文作為參考。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的對(duì)污染食物或食物成分的特定植物屬的植物進(jìn)行定量的PCR法能夠檢測(cè)和定量食物或食物成分中存在的極低量的屬于特定植物屬的植物，且同樣地，對(duì)檢測(cè)是否存在屬于比如蕎麥屬、落花生屬、小麥屬和大豆屬這樣的變應(yīng)原性植物屬的植物、以及對(duì)該植物進(jìn)行的定量尤其有效。本發(fā)明的PCR法是這樣一種方法，其中對(duì)比如各待檢樣品的DNA提取效率和對(duì)PCR反應(yīng)的抑制這樣的影響的修正不是通過外在添加純化的DNA作為標(biāo)準(zhǔn)來修正比如反應(yīng)液中對(duì)PCR反應(yīng)的抑制這樣的影響來進(jìn)行的，而是通過從外在補(bǔ)加了標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的樣品中同時(shí)提取來自待檢特定植物屬的DNA和來自標(biāo)準(zhǔn)植物的DNA而非純化DNA以實(shí)施定量PCR法來進(jìn)行的。由于能夠在標(biāo)準(zhǔn)植物樣品和來自待檢特定植物屬的樣品間的比如DNA提取效率以及對(duì)PCR反應(yīng)的抑制的影響是一致的這樣的條件下進(jìn)行測(cè)量，所以該方法使得可以進(jìn)行高度可靠的定量。本發(fā)明的方法有這樣一個(gè)優(yōu)點(diǎn)該方法能夠修正比如DNA提取效率和對(duì)PCR反應(yīng)的抑制、甚至待檢樣品間的DNA含量差異這樣的影響。該方法還可以在比如鹽這樣的不含DNA的食物成分或包含該成分的食物中正確地定量檢測(cè)屬于特定植物屬的植物。
因此，本發(fā)明可用于定量檢測(cè)污染食物或食物成分的、屬于變應(yīng)原性特定植物屬的植物。此外，即便存在假陽性的話，通過將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列分析，該利用PCR法的定量分析也能可靠地將其排除，且由此可以說該方法具有優(yōu)越的工業(yè)實(shí)用性。
本發(fā)明的定量PCR法比ELISA法具有更寬的動(dòng)力學(xué)范圍，且能夠達(dá)到足夠高的定量檢測(cè)污染食物或食物成分的特定成分的特異性和靈敏度。此外，與合成材料(引物和探針)組合使用的方法可以實(shí)現(xiàn)測(cè)量結(jié)果的高重復(fù)性和可靠性。
序列表<110>House Foods Corporation<120>食物或食物原材料中特定屬的植物的定量PCR檢測(cè)方法<130>PH-2153-PCT<150>JP 2003-139513<151>2003-05-16<160>66<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>73<212>DNA<213>蕎麥(Fagopyrum esculentum)<400>1caacggatat ctcggctctc gcatcgatga agaacgtagc gaaatgcgat acttggtgtg60aattgcagaa tcc 73<210>2<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>2gcatttcgct acgttcttca tcgatgc27<210>3<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>3
atcgcatttc gctacgttct tcatcg 26<210>4<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>4agtatcgcat ttcgctacgt tcttcatc 28<210>5<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>5gcatcgatga agaacgtagc gaaatgc27<210>6<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>6cgatgaagaa cgtagcgaaa tgcgat 26<210>7<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>7
gatgaagaac gtagcgaaat gcgatact 28<210>8<211>71<212>DNA<213>蕎麥(Fagopyrum esculentum)<400>8acgaaccccg gcgcggactg cgccaaggac cacgaacaga agcgcgtccc gagcctcccg60gtccccgggc g 71<210>9<211>77<212>DNA<213>蕎麥(Fagopyrum esculentum)<400>9ccgggcggca cggcggcgtc gcgtcgtttc tacgaaacag aacgactctc ggcaacggat60atctcggctc tcgcatc 77<210>10<211>58<212>DNA<213>蕎麥(Fagopyrum esculentum)<400>10gccggaaggg cgagctcccc cgaaacacca agtacggcgg gcggaccccg aaggccat 58<210>11<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>11ggaccacgaa cagaagcgcg tcccg 25<210>12<211>21<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>PCR引物<400>12cacgaacaga agcgcgtccc g 21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>13ggaccacgaa cagaagcgcg t 21<210>14<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>14cgccaaggac cacgaacaga ag 22<210>15<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>15cgttgccgag agtcgttctg ttt23<210>16<211>26<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>PCR引物<400>16gtcgttctgt ttmktagaaa cgacgc 26<210>17<211>72<212>DNA<213>Arachis villosa<400>17cgccccgtct caaacaagaa caaaaccccg gcgcggaaag cgccaaggaa gccaaacgtt60tctgctctcc cc72<210>18<211>57<212>DNA<213>Arachis villosa<400>18aacgtttctg ctctccccgc cggctccgga gacggcatcc ggtcggggcg acgagtg 57<210>19<211>60<212>DNA<213>Arachis villosa<400>19ccgccggctc cggagacggc atccggtcgg ggcgacgagt gaccacaaga gttaagaacg60<210>20<211>68<212>DNA<213>Arachis villosa<400>20ggccggccgtg cgcggccgg cgccccgtct caaacaagaa caaaaccccg gcgcggaaag60cgccaagg 68<210>21<211>20<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>21gcggaaagcg ccaaggaagc20<210>22<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>22ggcgcggaaa gcgccaa 17<210>23<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>23caaaaccccg gcgcggaaa 19<210>24<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>24cggcttccgg agacggca 18<210>25<211>17<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>25cggctccgga gacggca 17<210>26<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>26cgtcgccccg accggat 17<210>27<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>27tcgtcgcccc gaccggat 18<210>28<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>28ctcgtcgccc cgaccggat 19<210>29
<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>29actcgtcgcc ccgaccggat20<210>30<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>30cgccccgtct caaacaagaa caaaaccc 28<210>31<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>31ccccgtctca aacaagaaca aaaccc 26<210>32<211>20<212>DNA<213>Arachis villosa<400>32cgacgagtga ccacaagagt20<210>33<211>24
<212>DNA<213>Arachis villosa<400>33aacgactctc ggcaacggat atct 24<210>34<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR探針<400>34tgctctcccc gccggc16<210>35<211>36<212>DNA<213>Arachis villosa<400>35agaacaaaac cccggcgcgg aaagcgccaa ggaagc 36<210>36<211>53<212>DNA<213>蕎麥(Fagopyrum esculentum)<400>36agggcacgcc tgtctgggcg tcacgcaccg cgtcgccccc tccccctcct tcc 53<210>37<211>56<212>DNA<213>蕎麥(Fagopyrum esculentum)<400>37aagactacgc atcgcgtcgc gtcgccgcga gccccgggag gaaagacccg agagag56<210>38<211>57<212>DNA
<213>Arachis villosa<400>38acgggctctt ggtggggagc ggcaccgcgg cagatggtgg tcgagaacaa ccctcgt 57<210>39<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>39ccatctgccg cggtgcc 17<210>40<211>60<212>DNA<213>普通小麥(Triticum aestivum)<400>40tctcaacggg aatcgggatg cggcatctgg tccctcgtct ctcaagggac ggtggaccga60<210>41<211>57<212>DNA<213>普通小麥(Triticum aestivum)<400>41taccgcgccg gacacagcgc atggtgggcg tcctcgcttt atcaatgcag tgcatcc 57<210>42<211>57<212>DNA<213>普通小麥(Triticum aestivum)<400>42taccgtgtcg aacacagcgc atggtgggcg tctttgcttt atcaactgca gtgcata 57<210>43<211>20<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>PCR引物<400>43cggcatctgg tccctcgtct20<210>44<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>44gcgaggacgc ccaccat 17<210>45<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>45gcaaagacgc ccaccat 17<210>46<211>58<212>DNA<213>大豆(Glycine max)<400>46gttgctgcgc ggggtgtatg ctgacctccc gcgagcaccc gcctcgtggt tggttgaa 58<210>47<211>65<212>DNA<213>大豆(Glycine max)<400>47gttcatggcc gacttcgccg tgataaaatg gtggatgagc cacgctcgag accaatcacg60
tgcga65<210>48<211>62<212>DNA<213>大豆(Glycine max)<400>48gttcatggcc gacttcgccg tgataaaatg gatgagccac gctcgaccaa acgtgcgacc60gg 62<210>49<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>49ctgacctccc gcgagcac 18<210>50<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>50gcgtggctca tccaccattt tatca 25<210>51<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>51gcgttgctca tccaccattt tatca 25
<210>52<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>52gcgttgctca tccaccattt tgtca 25<210>53<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>53gcattgctca tccaccattt tgtca 25<210>54<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>54gcgctgctca tccgccattt tgtca 25<210>55<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>55gcgctgctca tccaccattt tgtca 25
<210>56<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>56gcgtggctca tccattttat ca 22<210>57<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>57ttggacgtgt atcccttgtg gttc 24<210>58<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>58cacgaaggtg aaagttgcgt tcat 24<210>59<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR探針<400>59tgtgcgacgc ggaatg16
<210>60<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>60tctagacgcc aaggaccacg aacagaag 28<210>61<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>61caaaagcttc gttgccgaga gtcgttctgt tt 32<210>62<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>62acgaagcttt tggacgtgta tcccttgtgg ttc 33<210>63<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>63ggatcccacg aaggtgaaag ttgcgttcat 30<210>64
<211>13<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR探針<400>64cgggacgcgc ttc 13<210>65<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>65tcgtcgcccc gaccggatg 19<210>66<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>66gtcgccccga ccggatg 1權(quán)利要求
1.一種用PCR法對(duì)食物或食物成分中屬于某一特定植物屬的植物進(jìn)行定量的方法，其包括將來自待檢特定植物屬的樣品和標(biāo)準(zhǔn)植物樣品以預(yù)定比率混合制成修正樣品，并從該修正樣品中提取基因組DNA；將已知量的標(biāo)準(zhǔn)植物樣品添加到待檢食物或食物成分中制成測(cè)試樣品，并從該測(cè)試樣品中提取基因組DNA；用檢測(cè)來自待檢特定植物屬的樣品的引物組和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的引物組對(duì)提取自修正樣品和測(cè)試樣品的作為模板的基因組DNA進(jìn)行定量PCR；用定量PCR法對(duì)修正樣品確定來自標(biāo)準(zhǔn)植物的DNA拷貝數(shù)/來自特定植物屬的DNA拷貝數(shù)的值，作為標(biāo)準(zhǔn)修正值；和用定量PCR法對(duì)測(cè)試樣品確定來自特定植物屬的DNA拷貝數(shù)/來自標(biāo)準(zhǔn)植物的DNA拷貝數(shù)的值，和用標(biāo)準(zhǔn)修正值來修正該值從而計(jì)算出食物或食物成分中所含的屬于特定植物屬的植物的量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述定量PCR法是實(shí)時(shí)PCR法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于該實(shí)時(shí)PCR法根據(jù)通過使用在5’末端帶有熒光染料和在3’末端帶有猝滅劑的、能與基因組DNA部位的內(nèi)部區(qū)域雜交的探針?biāo)派涑龅墓饬繉?duì)DNA進(jìn)行定量，該內(nèi)部區(qū)域與PCR引物組的各寡核苷酸雜交，其中從探針5’末端的熒光染料發(fā)射出的光受到3’末端的猝滅劑抑制，在PCR反應(yīng)中從引物開始的Taq聚合酶-催化的DNA延伸過程中，該探針被Taq聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性降解從而使熒光染料與猝滅劑解離，隨之導(dǎo)致發(fā)光。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之中任一項(xiàng)的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)植物屬于除高地雜草和食物作物之外的植物物種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)植物是補(bǔ)血草。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之中任一項(xiàng)的方法，其中所述待檢特定植物屬是蕎麥屬、落花生屬、小麥屬或大豆屬。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)植物是補(bǔ)血草，用于檢測(cè)補(bǔ)血草的引物組是由具有SEQ ID NO57所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO58所示序列的寡核苷酸組成的組，且用于檢測(cè)補(bǔ)血草的探針是具有SEQ ID NO59所示序列的寡核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其中所述待檢特定植物屬是蕎麥屬，用于檢測(cè)蕎麥屬的引物組是由具有SEQ ID NO14所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO15所示序列的寡核苷酸組成的組，且用于檢測(cè)蕎麥屬的探針是具有SEQ ID NO64所示序列的寡核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其中所述待檢特定植物屬是落花生屬，用于檢測(cè)落花生屬的引物組是由具有SEQ ID NO21所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO26、65或66所示序列的寡核苷酸組成的組，且用于檢測(cè)落花生屬的探針是具有SEQ ID NO34所示序列的寡核苷酸。
10.用于檢測(cè)補(bǔ)血草的引物組，其由具有SEQ ID NO57所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO58所示序列的寡核苷酸組成。
11.用于檢測(cè)蕎麥屬的引物組，其由具有SEQ ID NO14所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO15所示序列的寡核苷酸組成。
12.用于檢測(cè)落花生屬的引物組，其由具有SEQ ID NO21所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO26、65或66所示序列的寡核苷酸組成。
13.用于檢測(cè)食物或食物成分中屬于特定植物屬的植物的方法的試劑盒，其包含用于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的引物組。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，還含有用于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的探針。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)植物是補(bǔ)血草，且用于檢測(cè)補(bǔ)血草的引物組是由具有SEQ ID NO57所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO58所示序列的寡核苷酸組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的試劑盒，還含有具有SEQ ID NO59所示序列的用于檢測(cè)補(bǔ)血草的探針。
17.根據(jù)權(quán)利要求13至16之中任一項(xiàng)的試劑盒，還含有用于檢測(cè)待檢特定植物屬的引物組。
18.根據(jù)權(quán)利要求13至16之中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述待檢特定植物屬是蕎麥屬，且用于檢測(cè)蕎麥屬的引物組是由具有SEQ IDNO14所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO15所示序列的寡核苷酸組成的組。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的試劑盒，還含有具有SEQ ID NO64所示序列的用于檢測(cè)蕎麥屬的探針。
20.根據(jù)權(quán)利要求13至16之中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述待檢特定植物屬是落花生屬，且用于檢測(cè)落花生屬的引物組是由具有SEQID NO21所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO26、65或66所示序列的寡核苷酸組成的組。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的試劑盒，還含有具有SEQ ID NO34所示序列的用于檢測(cè)落花生屬的探針。
22.根據(jù)權(quán)利要求15的試劑盒，還含有作為標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的補(bǔ)血草樣品。
23.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)植物是補(bǔ)血草且待檢特定植物屬是蕎麥屬，該試劑盒還含有用于繪制補(bǔ)血草和蕎麥屬標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有相連的具有補(bǔ)血草擴(kuò)增靶序列的DNA和具有蕎麥屬擴(kuò)增靶序列的DNA。
24.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)植物是補(bǔ)血草且待檢特定植物屬是落花生屬，該試劑盒還含有用于繪制補(bǔ)血草和落花生屬標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有相連的具有補(bǔ)血草擴(kuò)增靶序列的DNA和具有落花生屬擴(kuò)增靶序列的DNA。
25.用于檢測(cè)食物或食物成分中屬于蕎麥屬的植物的方法的試劑盒，其包含由具有SEQ ID NO14所示序列的寡核苷酸和具有SEQID NO15所示序列的寡核苷酸組成的用于檢測(cè)蕎麥屬的引物組。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，還含有具有SEQ ID NO64所示序列的用于檢測(cè)蕎麥屬的探針。
27.用于檢測(cè)食物或食物成分中屬于落花生屬的植物的方法的試劑盒，其包含由具有SEQ ID NO21所示序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO26、65或66所示序列的寡核苷酸組成的用于檢測(cè)落花生屬的引物組。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，還含有具有SEQ ID NO34所示序列的用于檢測(cè)落花生屬的探針。
全文摘要
一種根據(jù)PCR技術(shù)測(cè)定食物或食物原材料中的特定屬的植物量的方法，包括(i)提供修正樣品，其中來自作為檢測(cè)靶的特定屬的植物樣品和標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的混合比率預(yù)先確定，并從該樣品中提取基因組DNA；(ii)通過向作為試驗(yàn)受試者的食物或食物原材料中添加已知量的標(biāo)準(zhǔn)植物樣品來制成測(cè)試樣品，并從該樣品提取基因組DNA；(iii)用引物和這些基因組DNA實(shí)施定量PCR；和(iv)在用從修正樣品測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)修正值進(jìn)行修正時(shí)，計(jì)算測(cè)試樣品中所含的特定植物原材料的量。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1823165SQ20048002050
公開日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2004年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月16日
發(fā)明者平尾宜司, 平元雅之, 渡邊聰, 正野仁慈 申請(qǐng)人:家庭食品株式會(huì)社