專利名稱：：具有改變的油、蛋白或纖維含量的植物的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本公開涉及具有改變的油、蛋白和/或纖維含量的'經(jīng)修飾的植物，以及制造具有改變的油、蛋白和/或纖維含量的經(jīng)修飾的植物的方法和從這樣的植物生產(chǎn)油的方法。
背景技術(shù)：
：操縱作物種子的成分、特別是種子油和蛋白的含量和組成、以及家畜的種子粗粉中的可用的可代謝能量("AME")的能力，在農(nóng)業(yè)工業(yè)中具有重要的應(yīng)用，涉及加工的食物油和動物飼料。農(nóng)業(yè)作物的種子含有多種有價值的成分，包括油、蛋白和淀粉。工業(yè)加工可以分離某些或所有這些成分，單獨(dú)銷售用于特定的應(yīng)用。例如，美國大豆作物的接近60%被大豆加工工業(yè)碾碎。大豆加工產(chǎn)生以高價值銷售的純化的油，同時剩余的種子粗粉作為家畜飼料銷售(U.S.SoybeanBoard2001SoyStats(美國大豆委員會，2001年大豆?fàn)顩r))。低芥子酸油菜(canola)籽也被碾碎以生產(chǎn)油和副產(chǎn)品低芥子酸油菜籽粗粉(CanolaCouncilofCanada(加拿大低芥子酸油菜籽理事會))。低芥子酸油菜籽粗粉含有高百分率的蛋白并具有良好的氨基酸配比，但是因?yàn)樗懈呃w維和肌醇六磷酸鹽含量，不容易被家畜消化(Slominski,B.A.等，1999Proceedingsofthe10thInternationalRapeseedCongress,Canberra,Australia)，比大豆粗粉的價值要低。在美國生產(chǎn)的玉米，55%以上被用作動物飼料(愛荷華州玉米種植者協(xié)會(IowaCornGrowersAssociation))。玉米的價值與其被家畜消化的能力直接相關(guān)。因此，希望能夠最大化種子的油含量和粗粉的AME。對于被加工的含油種子例如大豆和低芥子酸油菜籽來說，增加種子的絕對油含量將增加這些谷物的價值，而增加粗粉的AME將增加其價值。對于被加工的玉米來說，油含量的增加或減少都可能是所需的，這取決于其它主要成分將被如何使用。減少油可以通過減少不需要的與油的氧化有關(guān)的味道而改進(jìn)分離到的淀粉的質(zhì)量?；蛘?，當(dāng)?shù)矸郾挥糜谝掖忌a(chǎn)時，味道是不重要的，增加油含量可以增加整體價值。在許多飼料谷物例如玉米和小麥中，希望增加種子油含量，因?yàn)橛捅绕渌姆N子成分例如碳水化合物具有更高的能量含量。種子油加工，和大多數(shù)谷類加工商業(yè)一樣，是資本密集型商業(yè)，因此，產(chǎn)品的分布從低價值的成分向高價值的油類成分的小的遷移，對于谷類加工者來說可能具有明顯的經(jīng)濟(jì)學(xué)影響。此外，通過調(diào)整種子蛋白和纖維的含量和組成而不降低種子的油含量來增加粗粉的AME，可以增加動物飼料的價值。對于油類的生物技術(shù)操作，已經(jīng)顯示出提供了組成的改變和油產(chǎn)量的提高。組成的改變包括高油酸大豆和玉米油(美國專利Nos.6,229,033和6,248,939)，以及含有月桂酸酯的種子(美國專利No.5，639，790)等。在組成的改變中進(jìn)行的工作主要集中于加工的油類種子，但是可以容易地擴(kuò)展到非油類種子作物，包括玉米。盡管對于增加油含量存在著相當(dāng)大的興趣，但目前在該領(lǐng)域唯一實(shí)施的生物技術(shù)是高油玉米(High-OilCom)(HOC)技術(shù)(DuPont，美國專利No.5,704,160)。HOC在被稱為頂交(T叩Cross)的生產(chǎn)系統(tǒng)中使用了通過經(jīng)典篩選育種開發(fā)的高油授粉者以及原種(elite)(雄性不育)雜種雌性。頂交高油系統(tǒng)將在玉米中收獲的谷物油含量從大約3.5%提高到大約7%，增加了谷物的能量含量。盡管富有成果，但HOC生產(chǎn)系統(tǒng)具有固有的局限性。首先，這種低百分率的授粉者負(fù)責(zé)整塊田的結(jié)實(shí)率的系統(tǒng)包含了內(nèi)在的風(fēng)險，特別是在干旱年份。其次，現(xiàn)有的HOC田中的油含量還沒能達(dá)到種子油含量超過9%。最后，高油玉米主要不是生物化學(xué)的改變，而是具有增加油含量的間接結(jié)果的解剖學(xué)突變體(胚尺寸的增加)。因?yàn)檫@些原因，可選的替代性高油策略、特別是源自于生物化學(xué)結(jié)果改變的高油策略，將是特別有價值的。對種子成分的操作已經(jīng)鑒定到了幾種改進(jìn)種子粗粉的營養(yǎng)質(zhì)量、可消化性和AME的成分。在低芥子酸油菜籽和大豆中增加賴氨酸的含量(Falco等，1995S/o/Tec/mo/ogy13:577-582)增加了這種必需氨基酸的可利用性，并降低了對營養(yǎng)添加劑的需要。具有增加的種子蛋白的大豆變異體與常規(guī)變異體相比顯示出含有明顯更多的可代謝能量(Edwards等，1999,尸o"/^ySc/.79:525-527)。降低玉米種子的肌醇六磷酸鹽含量已經(jīng)顯示出增加了動物飼料中氨基酸的生物可利用性(Douglas等，2000,Pow/frySc/.79:1586-1591)，降低大豆粗粉中的寡糖含量增加了粗粉中的可代謝能量(Parsons等，2000,Pw/^y&〖.79:1127-1131)。大豆和低芥子酸油菜是加工油和種子粗粉市場最明顯的耙作物，因?yàn)閮煞N作物都被碾碎榨油，剩余的粗粉作為動物詞料銷售。大規(guī)模的商業(yè)工作(例如美國專利No.5,952,544;PCT申請No.W09411516)證實(shí)，擬南芥(』r"6Wo;w^)是這些作物中油類代謝的良好模型。種子油成分的生物化學(xué)篩選已經(jīng)鑒定了擬南芥中許多關(guān)鍵的生物合成酶類的基因，并導(dǎo)致鑒定了農(nóng)業(yè)上重要的基因的直系同源物。例如，使用化學(xué)誘變的群體進(jìn)行的篩選已經(jīng)鑒定了其種子顯示出改變的脂肪酸組成的脂類突變體(Lemieux等，1990，77zeor.80:234-240;James禾口Dooner,1990,77zeor.80:241-245)。檢領(lǐng)U改變的脂肪酸組成的T-DNA誘變篩選(Feldmann等，1989，Sc&"ce243:1351-1354)鑒定到了去飽和酶(FJZ)3)禾PA-12去飽和酶(FAD2);Yadav等，1993，尸/虛尸/z戸'o/.103:467-476;Okuley等，1994,P/a"/Ce〃6(1):147國158)。一項(xiàng)集中于油含量而不是油質(zhì)量的篩選，分析了化學(xué)誘導(dǎo)的突變體的皺縮的種子或改變的種子密度，從中推斷出種子油含量的改變(Focks和Benning,1998,尸/a^尸/yw'o/.118:91-101)。另一項(xiàng)被設(shè)計(jì)用于鑒定參與非常長鏈脂肪酸的生產(chǎn)的酶的篩選，鑒定到了負(fù)責(zé)降低種子中的三?；视屠鄯e的二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的編碼基因中的突變(KatavicV等，1995，尸/z^Zo/.108(1):399-409)。進(jìn)一步顯示出，DGATcDNA的種子特異性的過表達(dá)與增加的種子油含量有關(guān)(Jako等，2001,尸/fl^P/^/o/.126(2):861-74)。擬南芥也是用于理解影響粗粉質(zhì)量的種子成分的積累的模型。例如，擬南芥含有在許多雙子葉植物包括低芥子酸油菜和大豆中發(fā)現(xiàn)的白蛋白和球蛋白種子貯藏蛋白"hewry1995,尸/awCe〃7:945-956)。用于合成纖維的成分例如纖維素和木質(zhì)素的生物化學(xué)途徑，在維管植物中是保守的，影響了這些成分的擬南芥突變體已經(jīng)被分離出來(綜述在Chapel禾口Carpita1998,C群eWOpz.m.owz>z尸』腸/ogy1:179-185中)。植物中的激活標(biāo)簽是指通過在植物基因組中插入含有調(diào)控序列(例如增強(qiáng)子)的異源核酸構(gòu)建物而產(chǎn)生隨機(jī)突變的方法。調(diào)控序列可以起到增強(qiáng)一個或多個天然植物基因的轉(zhuǎn)錄的作用；因此，激活標(biāo)簽是用于產(chǎn)生獲得功能的、一般來說顯性的突變體的富有成果的方法(參見例如Hayashi等，1992,S".e"ce258:1350-1353;WeigelD等，2000,P/"W尸/7"/o/ogy,122:1003-1013)。插入的構(gòu)建物提供了用于其錯誤表達(dá)引起了突變表現(xiàn)型的天然植物的快速鑒定的分子標(biāo)簽。激活標(biāo)簽也可以導(dǎo)致缺失功能的表現(xiàn)型。插入可以導(dǎo)致天然植物基因的破壞，在這種情況下表現(xiàn)型一般是隱性的。激活標(biāo)簽已經(jīng)被用于多種物種中，包括煙草和擬南芥，以鑒定許9多不同種類的突變體表現(xiàn)型以及與這些表現(xiàn)型有關(guān)的基因(Wilson等，1996,尸/aWCe〃8:659-671;Schaffer等，1998，Ce〃93:1219-1229;Fridborg等，1999,尸/a^Ce〃11:1019-1032;Kardailsky等，1999,Sc/置e286:1962-1965;禾口ChristensenS等，1998，<她謹(jǐn)"o朋/Co"/e腦ceoArabidopsis7"ean:A，Univ.ofWisconsin-Madison,6月，24-28,Abstract165)。
發(fā)明內(nèi)容本申請?zhí)峁┝司哂懈淖兊谋憩F(xiàn)型的修飾的植物。具有改變的表現(xiàn)型的修飾的植物，可以包括改進(jìn)的油數(shù)量和/或改進(jìn)的粗粉質(zhì)量的表現(xiàn)型。修飾的植物中的改變的表現(xiàn)型也可以包括在修飾的植物的任何部分中、例如種子中、改變的油、蛋白和/或纖維含量。在修飾的植物的某些實(shí)施方案中，改變的表現(xiàn)型是種子的油含量的增加(高油表現(xiàn)型)。在其它實(shí)施方案中，改變的表現(xiàn)型可以是種子中蛋白含量的增加，和/或種子的纖維含量的減少。還提供了從修飾的植物的種子產(chǎn)生的種子粗粉，其中種子具有改變的蛋白含量和/或改變的纖維含量。還提供了從修飾的植物的種子產(chǎn)生的油，其中種子具有改變的油含量。任何這些變化可以導(dǎo)致與對照或野生型植物相比，來自修飾的植物的種子或種子粗粉的AME增加。本文還提供了從具有改變的表現(xiàn)型的修飾的植物的任何部分產(chǎn)生的粗粉、飼料或食物。在某些實(shí)施方案中，公開的修飾的植物包括具有含有HIO核苷酸序列(或別名HIO基因)的轉(zhuǎn)化載體的轉(zhuǎn)基因植物，該核苷酸序列編碼"HIO"多肽或與編碼該多肽的序列互補(bǔ)。在特定實(shí)施方案中，HIO多肽在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因植物中引起了改變的油含量、改變的蛋白含量和/或改變的纖維含量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物選自蕓苔屬(Brassica)的植物包括低芥子酸油菜和油菜籽、大豆、玉米、向日葵、棉花、可可、紅花、油棕、椰子、亞麻、蓖麻、花生、小麥、燕麥和水稻。還提供了生產(chǎn)油或種子粗粉的方法，包括培育轉(zhuǎn)基因植物，并從該植物回收油和/或種子粗粉。本公開還提供了含有編碼HIO多肽的核酸序列的飼料、粗粉、谷物或種子。本公開內(nèi)容還提供了含有HIO多肽或其直系或旁系同源物的飼料、粗粉、谷物或種子。公開的轉(zhuǎn)基因植物的例子通過下面的方法生產(chǎn)，方法包括將含有編碼HIO多肽的HIO核苷酸序列或與編碼HIO多肽的序列互補(bǔ)的序列的植物轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入到植物的祖細(xì)胞中，以及培育轉(zhuǎn)化的祖細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，HIO多核苷酸序列表達(dá)在該轉(zhuǎn)基因植物中，在轉(zhuǎn)基因植物中引起了改變的表現(xiàn)型。在某些特定的、非限制性的實(shí)施例中，該方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物中，HIO多肽的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因植物中，與對照的、非轉(zhuǎn)基因的或野生型植物相比，導(dǎo)致了高(增加的)油、高(增加的)蛋白和/或低(降低的)纖維的表現(xiàn)型。本文還公開了用于產(chǎn)生具有改變的表現(xiàn)型的植物的其它方法，其中鑒定到了在其HIO核酸序列中具有突變或等位基因的植物，這些突變或等位基因?qū)е屡c缺少突變或等位基因的植物相比改變了的表現(xiàn)型。突變的植物可以使用一種或多種誘變劑產(chǎn)生，例如化學(xué)誘變劑、輻射或紫外線。在方法的某些實(shí)施方案中，繁育植物，以產(chǎn)生遺傳有等位基因并表現(xiàn)出改變的表現(xiàn)型的后代。在方法的特定實(shí)施方案中，方法使用了候選基因/QTL方法或TILLING方法。本文還提供了具有改變的表現(xiàn)型的修飾的植物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，修飾的植物細(xì)胞包含轉(zhuǎn)化載體，該載體含有編碼HIO多肽的HIO核苷酸序列或與編碼該多肽的序列互補(bǔ)的序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞選自蕓苔屬(Brassica)的植物包括低芥子酸油菜和油菜籽、大豆、玉米、向日葵、棉花、可可、紅花、油棕、椰子、亞麻、蓖麻、花生、小麥、燕麥和水稻。在其它實(shí)施方案中，植物細(xì)胞是種子、花粉、繁殖體或胚細(xì)胞。本公開還提供了來自從該祖細(xì)胞培育出來的植物的直接后代或間接后代的植物細(xì)胞。發(fā)明詳述術(shù)語除非特別指明，在本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本公開所屬
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的專業(yè)人員所理解的相同的含義。對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的定義和術(shù)語，從業(yè)人員可以具體參考Sambrook等(Mo/ecw/arC/om'wg:^Z^6oratoo;Ma肌al(SecondEdition),《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)，ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.，1989)禾口AusubelFM等(Cwre"/VotocoAyMo/ecw/orB/o/ogy,《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》，JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.,1993)。應(yīng)該理解，本公開不限于所描述的具體的方法、方案和試劑，因?yàn)檫@些是可以改變的。本文使用的術(shù)語"改變的表現(xiàn)型"是指植物或植物的任何部分(例如種子，或從種子生產(chǎn)的粗粉)具有改變的油、蛋白和/或纖維含量(表現(xiàn)型)。正如本文提供的，改變的油、蛋白(例如可消化的蛋白)禾口/或纖維含量，包括植物、種子或種子粗粉中油、蛋白(例如可消化的蛋白)和/或纖維含量的增加的或降低的水平。這些變化的任何組合可以導(dǎo)致改變的表現(xiàn)型。例如，在一個特定的非限制性的例子中，改變的表現(xiàn)型可以指增加的油和降低的纖維含量。在另一個特定的非限制性的例子中，改變的表現(xiàn)型可以指未改變的蛋白和降低的纖維含量。在另一個特定的非限制性的例子中，改變的表現(xiàn)型可以指增加的油和蛋白以及降低的纖維。在其它非限制性的例子中，改變的表現(xiàn)型可以指增加的油和蛋白和未改變的纖維含量，未改變的油、增加的蛋白和降低的纖維含量，或增加的油、增加的蛋白和降低的纖維含量。還提供了可以導(dǎo)致種子或從種子產(chǎn)生的粗粉的AME(可利用的可代謝能量)的增加的任何這些變化的組合。改變的表現(xiàn)型還包括改進(jìn)的種子質(zhì)量(ISQ)表現(xiàn)型或改進(jìn)的種子粗粉質(zhì)量表現(xiàn)型。本文使用的術(shù)語"可利用的可代謝能量"(AME)是指飼料中可以通過在動物中消化而提取出來的、并與動物粗粉中可利用的可消化的蛋白和油的量有關(guān)的能量的量。AME通過估算喂食前在飼料中的能量的量，以及測量在消費(fèi)了飼料后動物的排泄物中能量的量來確定。在一個特定的非限制性的例子中，具有增加的AME的修飾的植物，包括具有改變的種子油、可消化蛋白、總蛋白和/或纖維含量，導(dǎo)致從該種子衍生的動物飼料的價值增加的修飾的植物。本文使用的術(shù)語"含量"是指例如種子或種子粗粉成分的種類和相對量。本文使用的術(shù)語"種子油"是指種子中油的總量。本文使用的術(shù)語"種子纖維"是指植物種子的不能消化的成分，包括細(xì)胞成分例如纖維素、半纖維素、果膠、木質(zhì)素和酚醛物質(zhì)。本文使用的術(shù)語"粗粉"是指在從種子提取油之后剩余的種子成分。粗粉的成分的例子包括蛋白和纖維。本文使用的術(shù)語"種子總蛋白"是指種子內(nèi)蛋白的總量。本文使用的術(shù)語"種子可消化蛋白"是指能夠被動物消化道中的酶消化的種子蛋白。它是總蛋白含量的一部分。本文使用的術(shù)語"載體"是指被設(shè)計(jì)用于在不同宿主細(xì)胞之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建物。"表達(dá)載體"是指具有將異源DNA片段導(dǎo)入外源細(xì)胞并在其中進(jìn)行表達(dá)的能力的載體。許多原核和真核表達(dá)載體是可商購的。適合的表達(dá)載體的選擇在本
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的專業(yè)人員的知識范圍內(nèi)。"異源的"核酸構(gòu)建物或序列具有對于它在其中表達(dá)的植物細(xì)胞來說不是本身具有的一部分序列。對于控制序列來說，異源的是指控制序列(即啟動子或增強(qiáng)子)本身的功能不是調(diào)節(jié)它目前正在調(diào)節(jié)的同樣基因的表達(dá)。一般來說，異源的核酸序列對于它們出現(xiàn)在其中的13細(xì)胞或基因組的一部分來說不是內(nèi)源的，而是通過感染、轉(zhuǎn)染、微注射、電穿孔等方法加入到細(xì)胞中的。"異源的"核酸構(gòu)建物可以含有與在天然植物中發(fā)現(xiàn)的控制序列/DNA編碼序列組合相同或不同的控制序列/DNA編碼序列組合。異源的核酸序列的特定的、非限制性的例子包括HIO核酸序列、或其片段、衍生物(變異體)或直系或旁系同源物。本文使用的術(shù)語"基因"是指參與生產(chǎn)多肽鏈的DNA區(qū)段，它可以包含也可以不包含編碼區(qū)域之前或之后的區(qū)域，例如5'非翻譯(5'UTR)或"前導(dǎo)"序列和3'UTR或"尾部"序列，以及在單個編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)和不轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列。術(shù)語"同源物"是指通過從共同的祖先DNA序列遺傳下來而與參比基因相關(guān)的任何基因。術(shù)語"直系同源物"是指不同物種中通過物種形成而從共同的袓先基因進(jìn)化而來的同源物。典型情況下，直系同源物保留了同樣的或相似的功能，盡管它們的主要結(jié)構(gòu)有區(qū)別(突變)。術(shù)語"旁系同源物"是指相同物種中通過共同祖先基因的遺傳復(fù)制進(jìn)化而來的同源物。在許多情況下，旁系同源物表現(xiàn)出相關(guān)的(但不總是相同的)功能。在本文中使用的術(shù)語同源物包含了直系同源物和旁系同源物。在某種程度上，當(dāng)特定的物種從與另外的物種共有的祖先DNA序列進(jìn)化出多個相關(guān)的基因時，術(shù)語直系同源物包含了術(shù)語旁系同源物。本文使用的"重組體"包括了指稱已經(jīng)通過導(dǎo)入異源核酸序列進(jìn)行了修飾的細(xì)胞或載體，或從這樣修飾的細(xì)胞衍生的細(xì)胞。因此，例如，重組體細(xì)胞表達(dá)的是與細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的天然(非重組的)形式具有不同形式的基因，或者表達(dá)的是天然基因，而細(xì)胞本身的天然基因由于精心設(shè)計(jì)的人類干預(yù)而表達(dá)異常、表達(dá)過低或完全不表達(dá)。本文使用的術(shù)語"基因表達(dá)"是指基于基因的核酸序列生產(chǎn)多肽的過程。該過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯；因此，"表達(dá)"可以是指多核苷酸或多肽序列，也可以是指兩者。有時，多核苷酸序列的表達(dá)不導(dǎo)致蛋白的翻譯。"過表達(dá)"是指多核苷酸和/或多肽序列的表達(dá)相對于它在野生型(或其它參比[例如非轉(zhuǎn)基因的])植物中的表達(dá)來說增加了，可以涉及天然存在的或非天然存在的序列。"異位表達(dá)"是指以在未被修飾的或野生型植物中不天然發(fā)生的時間、地點(diǎn)和/或增加的水平進(jìn)行的表達(dá)。"低表達(dá)"是指多核苷酸和/或多肽序列、一般為內(nèi)源基因、相對于它在野生型植物中的表達(dá)來說，降低的表達(dá)。術(shù)語"錯誤表達(dá)"和"改變的表達(dá)"包括過表達(dá)、低表達(dá)和異位表達(dá)。在將核酸序列插入到細(xì)胞中的上下文中，術(shù)語"導(dǎo)入"包含了"轉(zhuǎn)染"、"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，并包括指稱將核酸序列引入到真核或原核細(xì)胞中，在那里核酸序列可以整合到細(xì)胞的基因組中(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子，或短暫表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。本文中使用的"植物細(xì)胞"是指任何源自于植物的細(xì)胞，包括來自于未分化的組織(例如愈傷組織)以及來自于植物種子、花粉、繁殖體和胚的細(xì)胞。本文使用的術(shù)語"天然的"和"野生型"相對于給定的植物性狀或表現(xiàn)型來說，是指在自然界中同樣種類的植物中發(fā)現(xiàn)的性狀或表現(xiàn)型的形式。在一個實(shí)施方案中，野生型或天然植物也是對照植物。在另一個實(shí)施方案中，野生型或天然植物是非轉(zhuǎn)基因的或未突變的植物。在另一個實(shí)施方案中，野生型或天然植物是未修飾的植物。本文使用的術(shù)語"修飾的"對于植物來說，是指具有改變的表現(xiàn)型的植物(例如通過遺傳工程、誘變或育種方法產(chǎn)生的植物)。遺傳工程植物也可以是轉(zhuǎn)基因植物。在特定實(shí)施方案中，通過育種方法產(chǎn)生的修飾的植物首先使用多種誘變劑，例如化學(xué)誘變劑，輻射或紫外線中的任何一種進(jìn)行誘變。修飾的植物可以在轉(zhuǎn)基因植物的任何部分例如種子中，具有與類似的未修飾的植物相比，改變的油含量、改變的蛋白含量和/或改變的纖維含量的任何組合。本文使用的術(shù)語"改變的"是指在修飾的植物中，與類似的未修飾的植物相比，植物的性狀或表現(xiàn)型(例如油含量、蛋白含量和/或纖維含量)的改變(增加或降低)。在一個特定的、非限制性的例子中，具有改變的性狀的修飾的植物包括相對于類似的未修飾的植物來說，具有增加的油含量、增加的蛋白含量和/或降低的纖維含量的植物。在另一個特定的、非限制性的例子中，具有改變的性狀的修飾的植物包括相對于類似的未修飾的植物來說，未改變的油含量、增加的蛋白含量和/或降低的纖維含量。在另一個特定的、非限制性的例子中，具有改變的性狀的修飾的植物包括相對于類似的未修飾的植物來說，增加的油含量、增加的蛋白含量和/或未改變的纖維含量。對于修飾的植物來說，"感興趣的表現(xiàn)型(性狀)"是指通過T1和/或后續(xù)世代的植物證實(shí)的可觀察到的或可測量到、沒有被相應(yīng)的未修飾的植物(即在類似條件下培育或分析的基因型相似的植物)所顯示出的表現(xiàn)型。感興趣的表現(xiàn)型可以代表植物中的改進(jìn)(例如，植物種子中增加的油含量，增加的蛋白含量，和/或降低的纖維含量)，或可以提供在其它植物中產(chǎn)生改進(jìn)的手段。"改進(jìn)"是通過給植物提供獨(dú)特的和/或新的表現(xiàn)型或品質(zhì)，從而可以改進(jìn)植物物種或品種的用途的特點(diǎn)。這樣的修飾的植物可以具有改進(jìn)的表現(xiàn)型，例如改變的油、蛋白和/或纖維表現(xiàn)型。從具有改進(jìn)的表現(xiàn)型的修飾的植物的種子產(chǎn)生的粗粉，可以具有改進(jìn)的(增加的)粗粉質(zhì)量。在特定的、非限制性的具有改進(jìn)的(增加的)質(zhì)量表現(xiàn)型的粗粉的例子中，粗粉從修飾的植物的種子產(chǎn)生，其中種子相對于類似的未修飾的植物來說，具有增加的蛋白含量和/或降低的纖維含量。詞組"改變的油含量的表現(xiàn)型"是指修飾的植物的可測量到的表現(xiàn)型，其中植物表現(xiàn)出與類似的但是未修飾的(例如非轉(zhuǎn)基因的或未突變的)植物相比，總的油含量(即種子質(zhì)量中油所占的百分率)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加或降低。高油表現(xiàn)型是指總的油含量的增加。在各種不同的實(shí)施方案中，油含量的增加包括油含量增加大約1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、7.5%、10%或以上。同樣，油含量的降低在各種不同實(shí)施方案中包括油含量降低大約1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、7.5%、10%或以上。詞組"改變的蛋白含量的表現(xiàn)型"是指修飾的植物的可測量到的表現(xiàn)型，其中植物表現(xiàn)出與類似的但是未修飾的(例如非轉(zhuǎn)基因的或未突變的)植物相比，總的蛋白含量(即種子質(zhì)量中蛋白所占的百分率)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加或降低。高蛋白表現(xiàn)型是指總的蛋白含量的增加。在各種不同的實(shí)施方案中，蛋白含量的增加包括總蛋白含量增加大約1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、7.5%、10%或以上。同樣，在各種不同的實(shí)施方案中，可消化的蛋白含量的增加包括可消化的蛋白含量增加大約1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、7.5%、10%或以上。蛋白含量的降低在各種不同實(shí)施方案中包括總蛋白含量降低大約1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、7.5%、10%或以上。同樣地，可消化的蛋白含量的降低在各種不同實(shí)施方案中包括可消化的蛋白含量降低大約1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、7.5%、10%或以上。詞組"改變的纖維含量的表現(xiàn)型"是指修飾的植物的可測量到的表現(xiàn)型，其中植物表現(xiàn)出與類似的但是未修飾的(例如非轉(zhuǎn)基因的或未突變的)植物相比，總的纖維含量(即種子質(zhì)量中纖維所占的百分率)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加或降低。低纖維表現(xiàn)型是指總的纖維含量的降低。纖維含量的增加包括纖維含量增加大約1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、7.5%、10%或以上。同樣，纖維含量的降低包括纖維含量降低大約1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3,5%、4.0%、4.5%、5.0%、7.5%、10%或以上。本文使用的"突變體"或"突變的"多核苷酸序列或基因與相應(yīng)的野生型多核苷酸序列或基因在序列或表達(dá)上不同，其中的差異造成了改變的植物表現(xiàn)型或性狀。相對于植物或植物株系來說，術(shù)語"突變體"或"突變的"是指植物或植物株系具有改變的植物表現(xiàn)型或性狀，其中改變的表現(xiàn)型或性狀與野生型多核苷酸序列或基因的改變的表達(dá)有關(guān)。突變的多核苷酸序列或基因可以通過遺傳工程方法(例如激活標(biāo)簽或轉(zhuǎn)化)產(chǎn)生，或通過使用一種或多種誘變劑(例如化學(xué)誘變劑、輻射或紫外線)產(chǎn)生，或通過使用改變DNA序列的方法(例如易錯PCR、DNA改組分子育種、定點(diǎn)突變，或?qū)⒒驅(qū)胍鹫T變的生物體，例如DNA修復(fù)活性缺陷的大腸桿菌或酵母菌株)來產(chǎn)生。本文使用的術(shù)語"T1"是指從TO植物的種子產(chǎn)生的植物的世代。Tl世代是第一組修飾的植物，可以通過使用篩選藥劑例如抗生素或除草劑進(jìn)行篩選，而修飾的植物含有相應(yīng)的抗性基因。術(shù)語"T2"是指以前被選擇作為是修飾的Tl植物的花自體受精而產(chǎn)生的植物的世代。T3植物是從T2植物產(chǎn)生的，依此類推。本文使用的給定植物的"直接后代"源自于該植物的種子(或有時是其它組織)，并且是立即的后續(xù)世代；例如，對于給定譜系來說，T2植物是T1植物的直接后代。給定植物的"間接后代"源自于該植物直接后代的種子(或其它組織)，或源自于該譜系中后續(xù)世代的種子(或其它組織)；例如，T3植物是Tl植物的間接后代。本文使用的"植物部分"包括任何植物器官或組織，包括但不限于種子、胚、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、根、枝條、配子體、孢子體、花粉和小孢子。植物細(xì)胞可以從任何植物器官或組織以及從其制備的培養(yǎng)物獲得。本文提供了具有改變的表現(xiàn)型的修飾的植物細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，修飾的植物細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞包含轉(zhuǎn)化載體，轉(zhuǎn)化載體含有編碼HIO多肽的HIO核苷酸序列或與編碼該多肽的序列互補(bǔ)的序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞選自蕓苔屬(Brassica)的植物包括低芥子酸油菜和油菜籽、大豆、玉米、向日葵、棉花、可可、紅花、油棕、椰子、亞麻、蓖麻、花生、小麥、燕麥和水稻。在其它實(shí)施方案中，植物細(xì)胞是種子、花粉、繁殖體或胚細(xì)胞。本公開還提供了來自作為從該祖細(xì)胞培育的植物的直接后代或間接后代的植物的植物細(xì)胞?？捎糜诒景l(fā)明的方法的植物的類別總的來說與可進(jìn)行轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物的類別一樣廣泛，包括單子葉和雙子葉植物。本文使用的"轉(zhuǎn)基因植物"包括在其基因組中含有異源多核苷酸的植物。異源多核苷酸可以被穩(wěn)定地整合到基因組中，也可以在染色體之外。優(yōu)選情況下，本發(fā)明的多核苷酸被穩(wěn)定地整合到基因組中，使得多核苷酸被傳遞到后續(xù)的世代中。其中已經(jīng)導(dǎo)入了異源多核苷酸的植物細(xì)胞、組織、器官或植株，被認(rèn)為是"轉(zhuǎn)化的"、"轉(zhuǎn)染的"或"轉(zhuǎn)基因的"。轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞的也含有異源多核苷酸的直接和間接后代，也被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因的。本文公開了具有改變的表現(xiàn)型的修飾的植物。具有改變的表現(xiàn)型的修飾的植物，與相似的但未修飾的(例如非轉(zhuǎn)基因的或未突變的)植物相比，可以含有改進(jìn)的(增加的)油量和/或改進(jìn)的(增加的)粗粉質(zhì)量。具有改變的表現(xiàn)型的修飾的植物，與相似的但未修飾的(例如非轉(zhuǎn)基因的或未突變的)植物相比，可以在修飾的植物的任何部分中、例如種子中、含有改變的油、蛋白和/或纖維含量。在修飾的植物的某些實(shí)施方案中，例如在具有改進(jìn)的或增加的油含量表現(xiàn)型的植物中，改變的表現(xiàn)型包括與相似的但未修飾的(非轉(zhuǎn)基因的或未突變的)植物相比，植物的種子的油含量的增加(高油表現(xiàn)型)。在各種不同的實(shí)施方案中，油含量的增加包括油含量增加大約1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、7.5%、10%或以上。改變的表現(xiàn)型可以是一種或多種脂肪酸例如油酸的增加，同時其它脂肪酸例如亞油酸或亞麻酸降低。脂肪酸含量的變化包括特定脂肪酸增加大約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60。/。、70%、80Q/o、90o/o、100%19或以上。在修飾的植物的其它實(shí)施方案中，例如在具有改進(jìn)的或增加的粗粉質(zhì)量表現(xiàn)型的植物中，改變的表現(xiàn)型可以是種子中蛋白含量的增加和/或種子的纖維含量的降低。蛋白含量的增加包括蛋白含量、例如總蛋白含量或可消化蛋白的含量增加大約1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、7.5%、10%或以上。種子蛋白含量的這種改變可以是種子貯藏蛋白例如白蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白和谷蛋白的量改變的結(jié)果。纖維含量的降低包括纖維含量降低大約1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、7.5%、10%或以上。這種纖維含量的改變可以是纖維質(zhì)成分例如纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠的量改變的結(jié)果。還提供了從修飾的植物的種子衍生的種子粗粉，其中種子具有改變的(例如增加的)蛋白(例如可消化的)含量和/或改變的(例如降低的)纖維含量。還提供了從修飾的植物的種子衍生的油，其中種子具有改變的油含量。任何這些變化，可以導(dǎo)致相對于對照的、非轉(zhuǎn)基因的或野生型植物來說，來自修飾的植物的種子或種子粗粉的AME的增加。AME的增加，在各種不同的實(shí)施方案中，包括種子或種子粗粉中AME增加大約1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、7.5%、10%或以上。本文還提供了從具有改變的表現(xiàn)型的修飾的植物的任何部分生產(chǎn)的粗粉、詞料或食物。在某些實(shí)施方案中，公開的轉(zhuǎn)基因植物含有轉(zhuǎn)化載體，該載體含有編碼"HIO"多肽的HIO核苷酸序列或與編碼該肽的序列互補(bǔ)的序列。在特定的實(shí)施方案中，HIO多肽在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因植物中改變的油含量、改變的蛋白含量和/或改變的纖維含量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物選自蕓苔屬(Brassica)的植物包括低芥子酸油菜和油菜籽、大豆、玉米、向日葵、棉花、可可、紅花、油棕、椰子、亞麻、蓖麻、花生、小麥、燕麥和水稻。還提供了生產(chǎn)油或種子粗粉的方法，包括培育轉(zhuǎn)基因植物以及從該植物回收油和/或種子粗粉。本公開進(jìn)一步提供了含有編碼HIO多肽的核酸序列的飼料、粗粉、谷?；蚍N子。本公開還提供了含有HIO多肽或其直系同源物或旁系同源物的飼料、粗粉、谷?；蚍N子。將編碼所需蛋白的所需多核苷酸序列導(dǎo)入到植物細(xì)胞中的各種方法都可加以利用，并且對于本
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的專業(yè)人員來說是已知的，包括但不限于(1)物理方法例如微注射、電穿孔和微粒介導(dǎo)的投送(生物彈或基因槍技術(shù))；(2)病毒介導(dǎo)的投送方法；以及(3)農(nóng)桿菌(^gro6a"en'ww)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。最常用的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化方法和生物彈或微粒轟擊介導(dǎo)的方法(即基因槍)。典型情況下，希望進(jìn)行核轉(zhuǎn)化，但是，當(dāng)希望特異性轉(zhuǎn)化質(zhì)體例如葉綠體或淀粉質(zhì)體時，可以利用所需多核苷酸的微粒介導(dǎo)的投送轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)體。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化通過使用屬于農(nóng)桿菌屬"^oZ)fl"en'ww)的遺傳工程改造的土壤細(xì)菌來完成。許多帶有Ti或Ri質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌(JgroZa"en'w附/^me/ac/em1)禾卩發(fā)根農(nóng)桿菌(v4gro6ac&Wwmr//zoge"es)的野生型和可轉(zhuǎn)化態(tài)(disarmed卩菌株可用于將基因轉(zhuǎn)入到植物中?；蜣D(zhuǎn)移經(jīng)過被稱為"T-DNA"的特定DNA的轉(zhuǎn)移來進(jìn)行，該DNA可以被遺傳工程改造，以將任何DNA的目標(biāo)片段攜帶到植物物種中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物的遺傳轉(zhuǎn)化包括幾個步驟。第一個步驟，一般被稱為"接種"，在其中首先使有毒的農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞彼此相互接觸。在接種后，使農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞/組織在適合生長和T-DNA轉(zhuǎn)移的條件下，一起生長幾個小時到幾天或以上的一段時間。該步驟被稱為"共培養(yǎng)"。在共培養(yǎng)和T-DNA投送后，將植物細(xì)胞用殺菌或抑菌劑進(jìn)行處理，以殺死或限制仍然與外植體接觸和/或在含有外植體的容器中的農(nóng)桿菌的生長。如果該步驟在不存在任何選擇性藥劑的情況下進(jìn)行以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因?qū)Ψ寝D(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的擇優(yōu)生長，那么它一般被稱為"延遲"步驟。如果在存在有利于轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的選擇性壓力的情"步驟。當(dāng)使用"延遲"步驟時，一般在隨后進(jìn)行一個或多個"選擇"步驟。對于微粒轟擊(美國專利No.5,550,318，美國專利No.5，538,880，美國專利No.5,610,042和PCT公開WO95/06128;每個專利特別在此以其全文引為參考)來說，將顆粒用核酸包被，然后通過推進(jìn)力投送到細(xì)胞中。示例性的顆粒包括含有鎢、鉑以及優(yōu)選金的顆粒。用于通過加速將DNA投送到植物細(xì)胞中的方法的說明性的實(shí)施方案是生物彈顆粒投送系統(tǒng)(BioRad,Hercules,CA)，它可用于推動包被有DNA的顆粒或細(xì)胞通過篩網(wǎng)，例如不銹鋼或Nytex篩網(wǎng)，到達(dá)覆蓋有在懸浮液中培養(yǎng)的單子葉植物細(xì)胞的濾膜表面上。微粒轟擊技術(shù)具有廣泛的適用性，可用于實(shí)際上轉(zhuǎn)化任何植物物種。已經(jīng)通過微粒轟擊進(jìn)行轉(zhuǎn)化的物種的例子包括單子葉植物物種例如玉米(PCT公開No.WO95/06128)、大麥、小麥(美國專利No.5,563,055，在此以其全文引為參考)、水稻、燕麥、黑麥、甘蔗和高梁，以及許多雙子葉植物包括煙草、大豆(美國專利No.5,322,783，在此以其全文引為參考)、向日葵、花生、棉花、西紅柿和普遍來說的豆科植物(美國專利No.5,563,055，在此以其全文引為參考)。不論使用何種轉(zhuǎn)化方法，為了對轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞進(jìn)行選擇或評分，被轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中的DNA含有在可再生的植物組織中起作用的基因，以產(chǎn)生賦予植物組織對有毒性的化合物的抗性的化合物。用作可選擇的、可篩選的或可記分的標(biāo)記物的目標(biāo)基因包括但不限于GUS、綠色熒光蛋白(GFP)、熒光素酶(LUX)、抗生素或除草劑耐受基因?？股乜剐曰虻睦影ㄇ嗝顾亍⒖敲顾?、新霉素、G418、博來霉素、氨甲蝶呤(以及三甲氧芐胺嘧啶)、氯霉素和四環(huán)素。編碼涉及除草劑耐受的蛋白的多核苷酸分子在本
技術(shù)領(lǐng)域：
是已知的，包括但不限于在美國專利No.5,627,061、美國專利No5，633，435和美國專利No6,040,497中描述的編碼5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的多核苷酸分子，以及在美國專利No.5，094，945中描述的用于耐受草甘膦(glyphosate)的aroA的編碼多核苷酸分子；在美國專利No.4，810，648中描述的編碼用于耐受溴苯腈的溴苯腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子；在Misawa等，(尸/a^丄4:833-840,1993)和Misawa等，(尸/a^J.6:481-489,1994)中描述的編碼用于耐受噠草伏(norflurazon)的八氫番茄紅素去飽和酶(crtl)的多核苷酸分子；在Sathasiivan等，(/化c/.18:2188-2193,1990)中描述的編碼用于耐受磺酰脲類除草劑的乙酰羥酸合酶(AHAS，也稱為ALS)的多核苷酸分子；以及在DeBlock等，0EAffi(9汄6:2513-2519,1987)中描述的用于耐受草胺磷和雙丙氨膦的bar基因。從各種不同的轉(zhuǎn)化的外植體再生、發(fā)育和培育植物，在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已經(jīng)有完善的記錄。這種再生和生長過程典型地包括選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，以及對那些個性化的細(xì)胞通過胚發(fā)育的通常階段通過生根的小苗階段進(jìn)行栽培的步驟。轉(zhuǎn)基因胚和種子類似地被再生。隨后，將獲得的轉(zhuǎn)基因的生根的苗種植在適合的植物生長培養(yǎng)基例如土壤中。在暴露于選擇性藥劑的情況下存活的細(xì)胞、或在篩選分析中被評分為陽性的細(xì)胞，可以培養(yǎng)在支持植物再生的培養(yǎng)基中。發(fā)育的小苗被轉(zhuǎn)移到含有較低植物生長混合物的土壤中，使其受冷而變得耐寒，然后轉(zhuǎn)移到溫室或生長室中發(fā)育成熟。本發(fā)明可使用任何可轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。本文中使用的可轉(zhuǎn)化，是指細(xì)胞或組織能夠進(jìn)一步繁殖而產(chǎn)生植株。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員將會認(rèn)識到，有許多植物細(xì)胞或組織是可轉(zhuǎn)化的，在插入外源DNA并經(jīng)過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件后，植物細(xì)胞或組織可以形成分化的植物。適合于這些目的的組織可以包括但不限于未成熟的胚、小盾片組織、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物、未成熟的花序、莖分生組織、節(jié)外植體、愈傷組織、下胚軸組織、子葉、根和葉?？梢允褂萌魏芜m合的植物培養(yǎng)基。適合的培養(yǎng)基的例子包括但不限于基于MS的培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，Physiol.Plant,15:473-497，1962)或基于N6的培養(yǎng)基(Chu等，ScientiaSinica18:659,1975)，其中添加有其它植物生長調(diào)節(jié)劑，包括但不限于植物生長素、細(xì)胞分裂素、ABA和赤霉素。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員熟悉各種不同的組織培養(yǎng)基，它們在經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶砑雍?，可以支持植物組織的生長和發(fā)育，并適合于植物轉(zhuǎn)化和再生。這些組織培養(yǎng)基或者作為商業(yè)制備物購買，或者定制配制和修飾。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員將會意識到，在轉(zhuǎn)化和再生中使用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加物例如營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑，以及其它的培養(yǎng)條件例如孵育過程中的光強(qiáng)度、pH和孵育溫度，對于具特定的目標(biāo)品種來說，可以被最適化。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認(rèn)識到，在將表達(dá)盒穩(wěn)定地導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物并證實(shí)其可操作之后，可以通過有性雜交將其導(dǎo)入其它的植物中。取決于被雜交的物種，可以使用許多標(biāo)準(zhǔn)的育種技術(shù)中的任何一種。具有改變的表現(xiàn)型的植物的鑒定使用擬南芥"m6/c/o"^)激活標(biāo)簽篩選(ACTTAG)來鑒定1)具有改變的油、蛋白和/或纖維含量的ACTTAG植物株系(分別參見下面表1中的第4、5和6列)與2)在表2和3的第3列中鑒定的核酸序列之間的關(guān)聯(lián)性，其中每個核酸序列被提供有基因別名或HIO命名(HIO#，參見表1、2和3中的第1歹!])。HIO命名是任意的，并不必定涉及具有高油(HIO)表現(xiàn)型的植物。簡單來說，正如在實(shí)施例中進(jìn)一步描述的，將大量擬南芥植物用pSKI015載體突變，該載體含有來自根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的T-DNA，病毒的增強(qiáng)子元件，以及選擇性標(biāo)記物基因(Weigel等，2000，尸/aWP/^/o/og乂122:1003-1013)。當(dāng)T-DNA插入到被轉(zhuǎn)化的植物的基因組中時，增強(qiáng)子元件可以導(dǎo)致在附近、一般在增強(qiáng)子的大約9千堿基(kb)之內(nèi)的基因被上調(diào)。將T1植物暴露于選擇性試劑，以便特異性回收表達(dá)了選擇性標(biāo)記物、因此帶有T-DNA插入片段的轉(zhuǎn)化的植物。允許T1植物生長至成熟，自體受精并產(chǎn)生種子。收獲T2種子、標(biāo)記并儲存。為了增加種子儲備，將大約18個T2播種在土壤中，待發(fā)芽后暴露于選擇性藥劑，以回收轉(zhuǎn)化的T2植物。從這些植物收獲T3種子，并合并。按照實(shí)施例中的描述使用近紅外光譜(NIR)估算種子的油、蛋白和纖維素含量。通過對表1第3列中鑒定的ACTTAG株系中T-DNA插入片段兩側(cè)的基因組DNA序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了HIO核酸序列與改變的表現(xiàn)型之間的關(guān)聯(lián)性。ACTTAG株系是用含有4個串聯(lián)的CaMV35S增強(qiáng)子拷貝的T-DNA元件轉(zhuǎn)化的單植株衍生而來的植株家族。因此，公開的HIO核酸序列和/或多肽可用于開發(fā)具有改變的、例如高油表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)基因植物。HIO核酸序列可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物例如含油種子作物，以提供從含油種子加工獲得的改進(jìn)的油產(chǎn)量，并導(dǎo)致從轉(zhuǎn)基因植物的種子回收的油量的增加。HIO核酸序列也可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物例如飼料谷類作物，以提供改變的表現(xiàn)型，導(dǎo)致用于動物飼養(yǎng)的能量的增加，例如具有改變的蛋白和/或纖維含量、導(dǎo)致AME增加的種子或種子粗粉。HIO核酸序列還可用于增加特種油料作物的油含量，以便增加所需的不常見脂肪酸的產(chǎn)率和/或回收率。不常見的脂肪酸的具體的非限制性的例子是蓖麻油酸、斑鳩菊酸和非常長鏈的多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)。已經(jīng)被遺傳修飾以表達(dá)HIO多肽的轉(zhuǎn)基因植物可用于生產(chǎn)種子，其中使用標(biāo)準(zhǔn)的方法來培育轉(zhuǎn)基因植物，并從植物的部分(例如種子)獲得油和種子粗粉。HIO核酸和多肽在本文描述的激活標(biāo)簽篩選中發(fā)現(xiàn)的每個HIO核酸序列的HIO命名列于下面的表1-3的第1列中。公開的HIO多肽列于下面的表2和3的第4列中。HIO命名是任意的，不一定涉及具有高油(HIO)表現(xiàn)型的植物。本文使用的基因別名或HIO命名，是指任何當(dāng)在植物中表達(dá)時導(dǎo)致植物的任何部分例如種子中改變的表現(xiàn)型的多肽序列(或編碼它的核酸序列)。在一個實(shí)施方案中，HIO多肽是指全長的HIO蛋白，或其具有"功能活性"的片段、衍生物(變異體)或直系同源物或旁系同源物，使得蛋白的片段、衍生物或直系同源物或旁系同源物表現(xiàn)出與一個或多個公開的全長HIO多肽相關(guān)的一種或多種功能活性，這些公開的全長HIO多肽例如在表2和3的第4列中引用的GenBank登記號中提供的、對應(yīng)于SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO:16中顯示的氨基酸序列的氨基酸序列，或其直系同源物或旁系同源物。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，功能活性的HIO多肽在轉(zhuǎn)基因植物中導(dǎo)致改變的表現(xiàn)型。在另一個實(shí)施方案中，功能活性的HIO多肽，當(dāng)在植物中錯誤表達(dá)時，導(dǎo)致改變的油、蛋白和/或纖維含量表現(xiàn)型(例如改變的種子粗粉含量表現(xiàn)型)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，HIO多肽的錯誤表達(dá)導(dǎo)致植物中高油(例如增加的油)、高蛋白(例如增加的總蛋白或可消化蛋白)和/或低纖維(例如降低的纖維)表現(xiàn)型。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，HIO多肽的錯誤表達(dá)導(dǎo)致植物中未改變的油、高蛋白(例如增加的總蛋白或可消化蛋白)禾口/或低纖維(例如降低的纖維)表現(xiàn)型。在另一個實(shí)施方案中，HIO多肽的錯誤表達(dá)導(dǎo)致了粗粉的改進(jìn)的AME。在另一個實(shí)施方案中，功能活性的HIO多肽當(dāng)在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)時，能夠拯救缺陷的(包括缺失的)內(nèi)源HIO多肽活性；拯救多肽可以來自于與具有缺陷的多肽活性的物種相同或不同的物種。本公開還提供了含有HIO多肽、或其片段、衍生物(突變體)或直系同源物或旁系同源物的詞料、粗粉、谷物、食物或種子。在另一個實(shí)施方案中，全長HIO多肽的功能活性片段(例如具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO:16中顯示的氨基酸序列的天然多肽的功能活性片段，或其天然存在的直系同源物或旁系同源物)保留了與全長HIO多肽相關(guān)的一種或多種生物學(xué)特性，例如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、結(jié)合活性、催化活性或細(xì)胞或細(xì)胞外定位活性。HIO片段優(yōu)選含有HIO結(jié)構(gòu)域例如C-或N-末端或催化結(jié)構(gòu)域等，并優(yōu)選含有HIO蛋白的至少10個、優(yōu)選至少20個、更優(yōu)選至少25個、最優(yōu)選至少50個連續(xù)的氨基酸。HIO基因的功能性結(jié)構(gòu)域列于表2的第6列中，可以使用PFAM程序(BatemanA等，1999,A^c/e/c^c/cfo27:260-262)或INTERPRO(Mulder等，2003，A^c/e/c爿c/^s31，315-318)程序來鑒定。全長HIO多肽或其片段的功能活性變異體，包括具有氨基酸插入、缺失或取代的、保留了與全長HIO多肽有關(guān)的一種或多種生物學(xué)特性的多肽。在某些情況下，產(chǎn)生了改變HIO多肽的翻譯后加工的變異體。例如，與天然多肽相比，變異體可以具有改變的蛋白運(yùn)輸或蛋白定位特征、或改變的蛋白半衰期。本文使用的術(shù)語"HIO核酸"是指任何當(dāng)在植物中表達(dá)時導(dǎo)致在植物的任何部分例如種子中改變的表現(xiàn)型的多核苷酸。在一個實(shí)施方案中，HIO多核苷酸包括具有表2和3的第3列中引用的GenBank登記號中提供的、對應(yīng)于SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13或SEQIDNO:15中顯示的核酸序列的序列或與其互補(bǔ)的序列的核酸，及其功能活性片段、衍生物或直系同源物或旁系同源物。本公開的HIO核酸可以是源自于基因組DNA的DNA，或cDNA或RNA。在一個實(shí)施方案中，功能活性的HIO核酸編碼功能活性的HIO多肽或與編碼該多肽的核酸互補(bǔ)。功能活性的HIO核酸還包括用作在編碼功能活性的HIO多肽之前需要加工、例如剪接的原始RNA轉(zhuǎn)錄本(即mRNA前體)的模板的基因組DNA。HIO核酸可以包括其它的非編碼序列，它們可以被轉(zhuǎn)錄也可以不被轉(zhuǎn)錄；這樣的序列包括5'和3'UTRs、多聚腺苷化信號和控制基因表達(dá)的調(diào)控序列等，正如本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的。某些多肽需要加工事件，例如蛋白裂解、共價修飾等，以便變成具有完全的活性。因此，功能活性核酸可以編碼成熟的或加工前的HIO多肽或中間的形式。HIO多核苷酸也可以包含異源編碼序列，例如編碼被包含以促進(jìn)融合多肽的純化的標(biāo)記物或轉(zhuǎn)化標(biāo)記物的序列。在另一個實(shí)施方案中，功能活性的HIO核酸能夠被用于產(chǎn)生失去功能27的HIO表現(xiàn)型，例如通過反義抑制、共抑制等。本公開還提供了含有編碼HIO多肽的核酸序列的詞料、粗粉、谷物、食物或種子。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在本公開的方法中使用的HIO核酸含有編碼HIO多肽的核酸序列，或與編碼該多肽的序列互補(bǔ)的核酸序列，該HIO多肽與公開的HIO多肽序列、例如在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO:16中顯示的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的序列同一性。在另一個實(shí)施方案中，HIO多肽含有與公開的HIO多肽序列(例如SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO:16中顯示的氨基酸序列)具有至少50%或60%同一性的多肽序列，并且可以與公開的HIO多肽序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的序列同一性。在另一個實(shí)施方案中，HIO多肽與公開的HIO多肽序列具有50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的序列同一性，可以含有HIO多肽的保守蛋白結(jié)構(gòu)域(例如在表2的第6列中列出的蛋白結(jié)構(gòu)域)。在另一個實(shí)施方案中，HIO多肽含有與表2的第4列中引用的多肽的功能活性片段具有至少50%、60%、70%、80%、85%、卯％、95%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽序列。在另一個實(shí)施方案中，HIO多肽包含了在其整個長度上與表2的第4列中引用的GenBank登記號的多肽序列具有至少50%、60%、70%、80%、卯％、95%、97%、98%或99%的同一性、并含有表2的第6列中列出的保守蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽序列。在另一方面，HIO多核苷酸序列在其整個長度上與公開的HIO核酸序列、例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13或SEQIDNO:15中顯示的核酸序列、或與這樣的HIO序列互補(bǔ)的核酸序列具有至少50%到60%的同一性，并且可以與公開的HIO序列或其功能活性片段或互補(bǔ)序列具有至少70%、80%、85%、卯％、95%、97%、98%或99%的序列同一性。在另一個實(shí)施方案中，公開的HIO核酸含有SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13或SEQIDNO:15中顯示的核酸序列，或與這樣的HIO序列互補(bǔ)的核酸序列，以及與這樣的HIO序列具有顯著的序列同源性的核酸序列。本文使用的詞組"顯著的序列同源性"是指與這樣的HIO序列具有輕微的或不重要的序列變異的核酸序列，即序列以基本上相同的方式起作用并編碼HIO多肽。本文使用的"百分(％)序列同一性"對于具體的對象序列或其特定部分來說，被定義為在將序列進(jìn)行比對，以及如果需要獲得最大的百分序列同一性而引入缺口后，在被鑒定的序列中與對象序列(或其特定部分)中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分率，正如通過程序WU-BLAST-2.0al9(Altschul等，J.M/.腸/"1990,215:403-410)使用被設(shè)定為缺省值的搜索參數(shù)所產(chǎn)生的那樣。HSPS和HSPS2參數(shù)是動態(tài)值，由程序自身根據(jù)具體序列的組成和目標(biāo)序列搜索所使用的具體數(shù)據(jù)庫的組成來建立。"百分(％)同一性值"通過用匹配一致的核苷酸或氨基酸的數(shù)量，除以被報告的百分同一性的序列的長度來確定。"百分(％)氨基酸序列相似性"通過執(zhí)行與確定％氨基酸序列同一性時使用的計(jì)算相同的計(jì)算來確定，但是在計(jì)算中除了一致的氨基酸之外還包含了保守的氨基酸取代。保守的氨基酸取代是一個氨基酸被取代成另一個具有相似特性的氨基酸，使得蛋白的折疊或活性不受顯著影響的取代。可以互相取代的芳香族氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；可互換的疏水性氨基酸是亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸；可互換的極性氨基酸是谷氨酰胺和天冬酰胺；可互換的堿性氨基酸是精氨酸、賴氨酸和組氨酸；可互換的酸性氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸；可互換的小氨基酸是丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。對象核酸分子的衍生的核酸分子包括與公開的HIO核酸序列(例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15中顯示的核酸序列)選擇性雜交的序列。雜交的嚴(yán)緊性可以通過雜交和清洗過程中的溫度、離子強(qiáng)度、pH和變性劑例如甲酰胺的存在來控制。通常使用的條件是眾所周知的(參見例如C^reW/Votoco//"A/o/ecw/ar5油gy,《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》，Vol.1，Chap.2.10，JohnWiley&Sons,Publishers(1994);Sambrook等，1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual(SecondEdition),《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)，ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.,)。在某些實(shí)施方案中，本公開的核酸分子能夠與含有公開的核苷酸序列的核酸分子在嚴(yán)緊的雜交條件下雜交，嚴(yán)緊的雜交條件是將含有核酸的濾膜在含有6X單濃度的檸檬酸鹽(SSC)(1XSSC是0.15MNaCl、0.015M檸檬酸鈉；pH7.0)、5XDenhardt's溶液、0.05%焦磷酸鈉和100嗎/ml鯡魚精子DNA的溶液中在65°C下預(yù)雜交8小時到過夜；在含有6XSSC、IXDenhardt's溶液、100ng/ml酵母tRNA和0.05%焦磷酸鈉的溶液中在65°C下雜交18-20小時；以及在含有0.1XSSC和0.1%SDS(十二烷基硫酸鈉)的溶液中將濾膜在65。C下清洗1小時。在其它實(shí)施方案中，使用了中等嚴(yán)緊的雜交條件，條件為將含有核酸的濾膜在含有35%甲酰胺、5XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.1%PVP、0.1%Ficoll、1%BSA和500pg/ml變性的鮭魚精子DNA的溶液中在40°C下預(yù)處理6小時；在含有35%甲酰胺、5XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.2%BSA、100|ig/ml鮭魚精子DNA和10%(wt/vol)硫酸葡聚糖的溶液中在40°C下雜交18-20小時；然后在含有2XSSC和0.1%SDS的溶液中在55。C下進(jìn)行兩次1小時的清洗?；蛘?，可以使用低嚴(yán)緊條件，包括在含有20%甲酰胺、5xSSC、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5XDenhardt's溶液、10%硫酸葡聚糖和20ng/ml變性的剪切過的鮭魚精子DNA的溶液中在37。C下溫育8小時到過夜；在同樣的緩沖液中雜交18到20小時；以及在1xSSC中在大約37°C下清洗濾膜1小時。作為遺傳密碼簡并性的結(jié)果，可以產(chǎn)生編碼HIO多肽的大量多核苷酸序列。例如，可以選擇符合特定宿主生物體要求的最適密碼子用法(參見例如Nakamura等，1999,iVwc/e/c^c/A27:292)的密碼子，以增加在特定的宿主物種中發(fā)生的多肽的表達(dá)的速度。這樣的序列變異體可以用在本文公開的方法中。公開的方法可以使用公開的擬南芥HIO核酸序列的直系同源物(和/或旁系同源物)。每個公開的擬南芥HIO基因的代表性的推測的直系同源物(和/或旁系同源物)被鑒定在下面的表3的第5列中。在其它植物物種中鑒定直系同源物的方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是已知的。一般來說，不同物種中的直系同源物，由于存在一個或多個蛋白基序和/或三維結(jié)構(gòu)而保留了同樣的功能。在進(jìn)化中，當(dāng)在物種形成后發(fā)生基因復(fù)制事件時，一個物種例如擬南芥中的單個基因，可能對應(yīng)于另一個物種中的多個基因(旁系同源物)。當(dāng)特定的植物物種的序列數(shù)據(jù)可獲得時，一般通過序列同源性分析例如BLAST分析，通常使用蛋白誘餌序列來鑒定直系同源物。如果從正向BLAST結(jié)果得到的最佳命中序列在進(jìn)行反向BLAST中檢索到了最初的詢問序列時，序列被指定為可能的直系同源物(HuynenMA和BorkP，1998,Proc.A^/.爿cad.95:5849-5856;HuynenMA等，2000,i^ean^,10:1204-1210)。用于多個序列比對的程序，例如CLUSTAL(ThompsonJD等，1994，A^c/e/c^c/^/^.22:4673-4680)，可用于突出同源的(直系同源的和/或旁系同源的)蛋白的保守區(qū)域和/或殘基，并產(chǎn)生系統(tǒng)發(fā)生樹。在代表了多個來自不同物種的同源序列(例如通過BLAST分析檢索到的)的系統(tǒng)發(fā)生樹中，來自兩個物種的直系同源序列，相對于來自這兩個物種的所有其它序列來說，一般表現(xiàn)為在樹上最為接近。結(jié)構(gòu)串線(structuralthreading)或其它蛋白折疊的分析(例如使用ProCeryon,Biosciences,Salzburg,Austria的軟件)也可以鑒定可能的直系同源物。核酸雜交方法也可用于發(fā)現(xiàn)直系同源的基因，當(dāng)不能獲得序列數(shù)據(jù)時優(yōu)選使用這種方法。簡并PCR和cDNA或基因組DNA文庫的篩選是常用的用于發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因序列的方法，在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的(參見例如Sambrook,1989,Afo/ecw/flrC7om'"g:」丄fl60n^07Afa"Ma/(SecondEdition),《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)，ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.;Dieffenbach禾卩Dveksler,1995,PCi尸n'mer^4Za6orato^Afo"Ma/,《PCR引物實(shí)驗(yàn)指南》ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY)。例如，用于從目標(biāo)植物物種產(chǎn)生cDNA文庫、以及使用部分同源的基因探針探測文庫的方法，被描述在Sambrook等中。擬南芥HIO編碼序列的高度保守的部分可以用作探針。HIO直系同源的核酸可以與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13或SEQIDNO:15的核酸，在高度、中度或低嚴(yán)緊條件下進(jìn)行雜交。在擴(kuò)增或分離了假設(shè)的直系同源物的區(qū)段后，可以將該區(qū)段克隆并通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測序，并用作探針來分離完整的cDNA或基因組DNA克隆。此外，有可能開始EST計(jì)劃以產(chǎn)生目標(biāo)植物物種的序列信息的數(shù)據(jù)庫。在另一種方法中，與已知HIO多肽特異性結(jié)合的抗體被用于直系同源物(和/或旁系同源物)分離(參見例如Harlow和Lane，1988,1999:v4"W6o(i/w」Z^6w她7她認(rèn)a/，《抗體實(shí)驗(yàn)指南》，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)。Western印跡分析可以確定特定植物物種的粗提液中HIO直系同源物(即與公開的HIO多肽直系同源的蛋白)的存在。當(dāng)觀察到反應(yīng)性時，可以通過篩選代表特定植物物種的表達(dá)文庫來分離編碼候選直系同源物的序列。表達(dá)文庫可以在各種不同的可商購載體中構(gòu)建，包括Xgtll，正如在Sambrook等，1989中描述的。一旦通過任何這些方法鑒定到候選直系同源物后，可以使用候選直系同源序列作為誘餌("詢問")，針對擬南芥或其它其中HIO核酸和/或多肽序列已經(jīng)被鑒定的物種的序列進(jìn)行反向BLAST。HIO核酸和多肽可以使用任何可用的方法獲得。例如，正如以前描述的，通過篩選DNA文庫或通過使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來分離目標(biāo)cDNA或基因組DNA序列的技術(shù)，在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的。或者，可以合成核酸序列。任何己知的方法，例如定點(diǎn)突變(KunkelTA等，1991,MeAo&￡"^ymo/.204:125-39),可用于將所需的變化導(dǎo)入到克隆的核酸中?？偟膩碚f，本文公開的方法包括將所需形式的HIO核酸導(dǎo)入到用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物表達(dá)載體中，以及在宿主植物中表達(dá)HIO多肽。表達(dá)HIO多肽的轉(zhuǎn)化的植物和植物細(xì)胞表現(xiàn)出改變的表現(xiàn)型，并且在一個特定的非限制性的例子中，可以具有高的(增加的)油、高的(增加的)蛋白和/或低的(降低的)纖維含量。"分離的"HIO核酸分子與它在自然情況下被發(fā)現(xiàn)的形式或狀態(tài)(setting)不同，并且已經(jīng)被鑒定并與在自然來源的HIO核酸中通常伴隨它的至少一種污染的核酸分子分離開。但是，分離的HIO核酸分子包括含在通常表達(dá)HIO多肽的細(xì)胞中的HIO核酸分子，其中核酸分子位于例如與天然細(xì)胞中不同的染色體位置上。具有改變的表現(xiàn)型的遺傳修飾的植物的產(chǎn)生公開的HIO核酸和多肽可用于產(chǎn)生具有修飾的或改變的表現(xiàn)型、例如改變的油、蛋白和/或纖維含量表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)基因植物。本文使用的"改變的油含量(表現(xiàn)型)"可以是指植物的任何部分中的改變的油含量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物中HIO基因的改變的表達(dá)被用于產(chǎn)生具有高的油含量(表現(xiàn)型)的植物。本文使用的"改變的總蛋白含量(表現(xiàn)型)"或"改變的可消化蛋白含量(表現(xiàn)型)"可以是指植物的任何部分中改變的蛋白(總的或可消化的)含量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，HIO基因在植物中的改變的表達(dá)被用于產(chǎn)生具有高的(或增加的)總的或可消化的蛋白含量(表現(xiàn)型)的植物。本文使用的"改變的纖維含量(表現(xiàn)型)"可以是指植物的任何部分中的改變的纖維含量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，植物中HIO基因的改變的表達(dá)被用于產(chǎn)生具有低的(或降低的)纖維含量(表現(xiàn)型)的植物。改變的油、蛋白和/或纖維含量通常在種子中被發(fā)現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因植物的例子包括含有植物轉(zhuǎn)化載體的植物，轉(zhuǎn)化載體中具有編碼HIO多肽的核苷酸序列或與編碼該多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，該HIO多肽具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO:16中顯示的氨基酸序列，或其直系同源物或旁系同源物。含有公開的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物、例如玉米、大豆和低芥子酸油菜，可用于生產(chǎn)植物油和粗粉。植物油被用于各種不同食品中，而來自種子的粗粉被用作動物飼料。在從轉(zhuǎn)基因植物收獲種子后，清理種子以除去植物的柄莖和其它物質(zhì)，然后在滾筒輾粉機(jī)中去皮以破碎外殼。將壓碎的種子加熱到75-100°C，使水解酶變性，裂解未破碎的含油細(xì)胞，并使小的油滴合并。然后通過在螺旋壓榨機(jī)壓搾種子原料取出(并且可以回收)大部分油。剩余的油通過用有機(jī)溶劑例如己垸進(jìn)行抽提而從壓濾餅中取出。通過將粗粉加熱到大約100°C來除去溶劑。在干燥后，將粗粉粒化成均一的形式。含有種子的蛋白、可消化的碳水化合物和纖維的粗粉，在用作動物飼料之前，可以與其它材料相混合。本文描述的用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法一般來說適用于所有植物。盡管激活標(biāo)簽和基因鑒定是在擬南芥中進(jìn)行的，但HIO核酸序列(或其直系同源物、旁系同源物、變異體或片段)可以表達(dá)在任何類型的植物中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，產(chǎn)油植物在特定器官、主要是種子中產(chǎn)生和儲存三?；视汀＿@樣的物種包括大豆(G(yc/"e、油菜籽和低芥子酸油菜(包括甘藍(lán)型油菜f^am'c"w印wJ,凡cfl，es/r/s)、向曰奏(Z/e/ZaW/zM1、棉花(Gos^/7/wm/2hM/^w)、玉米(Zeema")、可可旦(T7eo6rowfl！cacao)、紅花(CaW/zawws"""on'ws)、油棕(￡7ae&gw,"ee腦S)、椰子(Cocos聽"/era)、亞麻(Z^'"wmM7'Za"M〖附"m)、蓖麻(i/c/wws禾口花生(Jrac/z/s/y^og^a)，以及小麥、水稻和燕麥。產(chǎn)水果和蔬菜的植物、產(chǎn)谷粒的植物、產(chǎn)堅(jiān)果的植物、快速循環(huán)的蕓苔屬(Brassica)、苜蓿(^fe"/cagosaHva)、煙草(7Wco"a"fl)、草坪草(禾本科^Poaceae^)、其它的飼料作物以及野生物種，也可用作獨(dú)特的脂肪酸的來源。在其它實(shí)施方案中，任何表達(dá)HIO核酸序列的植物在特定的植物部分或器官、例如種子中，也可以表達(dá)增加的蛋白和/或降低的纖維含量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認(rèn)識到，在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中存在廣泛的不同的轉(zhuǎn)化技術(shù)，同時新的技術(shù)正不斷變得可用。任何適合于靶宿主植物的技術(shù)都可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用。例如，構(gòu)建物可以各種不同的形式導(dǎo)入，包括但不限于作為DNA鏈、在質(zhì)粒中或在人工染色體中。將構(gòu)建物導(dǎo)入靶植物細(xì)胞，可以通過各種不同的技術(shù)來完成，包括但不限于異源核酸的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔、微注射、微粒轟擊、磷酸鈣-DNA共沉淀或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。植物的轉(zhuǎn)化優(yōu)選是永久性的，即通過將導(dǎo)入的表達(dá)構(gòu)建物整合到宿主植物基因組中，以便導(dǎo)入的構(gòu)建物傳遞到后續(xù)的植物世代中。取決于應(yīng)用目標(biāo)，含有HIO多核苷酸的異源核酸構(gòu)建物可以編碼完整的蛋白或其生物活性部分。在一個實(shí)施方案中，基于Ti的二元載體系統(tǒng)可用于轉(zhuǎn)移多核苷酸。標(biāo)準(zhǔn)的農(nóng)桿菌二元載體對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且許多是可商購的(例如pBI121ClontechLaboratories,PaloAlto,CA)。構(gòu)建物或載體可以含有植物啟動子以表達(dá)所選的核酸分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動子是植物啟動子。用農(nóng)桿菌載體轉(zhuǎn)化植物的最適步驟依賴于被轉(zhuǎn)化的植物的類型而變化。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的示例性方法包括轉(zhuǎn)化下胚軸的外植體、苗尖、源自于不孕秧苗或小植株的莖或葉的組織。這樣的轉(zhuǎn)化的植物可以有性繁殖，或者通過細(xì)胞或組織培養(yǎng)來繁殖。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化以前已經(jīng)被描述用于大量不同類型的植物，用于這樣的轉(zhuǎn)化的方法可以在科學(xué)文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)。特別有關(guān)聯(lián)的是轉(zhuǎn)化商業(yè)上重要的作物的方法，例如蕓苔屬物種的植物包括低芥子酸油菜和油菜籽(DeBlock等，1989，P/a^P/zj^/o/.,91:694-701)、玉米(Ishida等，1996A^&"5/o&c'/mo/.14:745-750，Zhang等，2002尸/a"fCe〃ie;.21:263-270)、向日葵(Everett等，1987,B/o/rec/z朋/og乂5:1201)、大豆(Christou等，1989,/Voc.Ato/,園，86:7500-7504;Kline等，1987,7V"詢，327:70)、小麥、水稻和燕麥。HIO核酸序列的表達(dá)(包括轉(zhuǎn)錄和翻譯)可以根據(jù)表達(dá)的水平、表達(dá)所發(fā)生的組織類型和/或表達(dá)的發(fā)育階段進(jìn)行調(diào)控。有許多異源調(diào)控序列(例如啟動子和增強(qiáng)子)可用于控制HIO核酸序列的表達(dá)。這些包括了組成性的、可誘導(dǎo)的和可調(diào)控的啟動子，以及以組織或時間特異性的方式控制表達(dá)的啟動子和增強(qiáng)子。示例性的組成性啟動子包括覆盆子E4啟動子(美國專利Nos.5,783,393和5,783,394)、胭脂堿合酶(NOS)啟動子(Ebert等，Proc.A^/.爿cadSc/.(t/.S.AJW:5745-5749,1987)、章魚堿合酶(OCS)啟動子(攜帶在根癌農(nóng)桿菌的誘導(dǎo)腫瘤的質(zhì)粒上)、花椰菜花葉病毒啟動子例如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動子(Lawton等，尸toMo/.飾/.9:315-324,1987)和CaMV35S啟動子(Odell等，A^we3":810-812，1985禾卩JonesJD等，1992,7Va似gem'ci仏，1:285-297)、玄參花葉病毒35S啟動子(美國專利No.5,378,619)、來自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)的光誘導(dǎo)的啟動子、Adh啟動子(Walker等，iVoc.Ato/.Sc/.「f/.S.y^S4:6624-6628,1987)、蔗糖合酶啟動子(Yang等，iVoc.A^/.爿cac/.Sc/.(T/.S.爿J57:4144-4148，19卯)、R基因復(fù)合物啟動子(Chandler等，77zeP/aWCe〃7:1175-1183，1989)、葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動子、CsVMV啟動子(VerdaguerB等，1998,尸/a^Mo/37:1055-1067),以及甜瓜肌動蛋白啟動子(已公開的PCT申請WO0056863)。示例性的組織特異性啟動子包括西紅柿E4和E8啟動子(美國專利No.5,859,330)和西紅柿2AII基因啟動子(VanHaarenMJJ等，1993,尸/a^A/o/歷o.,21:625-640)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，HIO核酸序列的表達(dá)在其表達(dá)與早期種子和/或胚的發(fā)育相關(guān)的基因的調(diào)控序列的控制之下。事實(shí)上，在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的啟動子是種子增強(qiáng)的啟動子。這樣的啟動子的例子包括來自例如下列基因的5'調(diào)控區(qū)napin(Kridl等，Seedi仏1:209:219,1991)、球蛋白(Belanger和Kriz,G匿t,129:863-872，1991，GenBank登記號No.L22295)、y玉米蛋白Z27(L叩es等，Mo/Ge"".，247:603-613,1995)、L3油質(zhì)蛋白啟動子(美國專利No.6,433,252)、菜豆蛋白(Bustos等，尸/flWCe〃，1(9):839陽853,1989)、表殼蛋白5(arcelin5)(美國專利申請No.2003/0046727)、大豆7S啟動子、7Sa啟動子(美國專利申請No.2003/0093828)、大豆7Sa，p-伴球蛋白啟動子、7Sa,啟動子(Beachy等，￡MSO,,4:3047，1985;Schuler等，7VMc/e/c^"W7吖，10(24):8225-8244,1982)、大豆胰蛋白酶抑制劑(Riggs等，尸/aWCe〃1(6):609-621,1989)、ACP(Baerson等，編.,22(2):255-267,1993)、硬脂?；?ACP去飽和酶(Slocombe等，尸/滅尸/y^W.104(4):167-176,1994)大豆(3-伴球蛋白a'亞基(Chen等，ZVoc.淑/.爿cad5W.83:8560-8564，1986)、蠶豆(r/c/a/a^)USP(P-Vf.Usp，美國專利申請No.2003/229918中的SEQIDNO:1、2禾卩3)以及玉米(Zea)L3油質(zhì)蛋白啟動子(Hong等，尸/a^Mo/.Ao/.,34(3):549-555,1997)。還包括玉米蛋白，這是在玉米胚乳中發(fā)現(xiàn)的一類貯藏蛋白。玉米蛋白基因的基因組克隆已經(jīng)被分離(Pedersen等，Ce〃，29:1015-1026，1982;以及Russell等，7>wwge"/c6(2):157-168)，來自這些克隆、包括15kD、16kD、19kD、22kD、27kD和基因的啟動子，也可以使用。其它已知在例如玉米中起作用的啟動子包括下列基因的啟動子waxy、BW"/e、S/znwyb"2、分支酶I和II、淀粉合酶、脫支酶、油質(zhì)蛋白、谷蛋白和蔗糖合酶。豆科植物的其啟動子與早期種子和胚的發(fā)育有關(guān)的基因，包括蠶豆豆球蛋白(Baumlein等，1991,Mo/.225:121-8;Baumlein等，1992,尸/滅2:233-9)、泰豆鄉(xiāng)(Fiedler等，1993,尸/滅Mo/,腸/.22:669-79)、豌豆固W"7/w(Bown等，1988,丄251:717-26)、37豌豆外源凝集素(dePater等，1993，尸/a^Ce//5:877-86)、菜豆(尸.vzJgaWs)p-菜豆蛋白(Bustos等，1991,￡M5(910:1469-79)、菜豆Z)丄五C2和尸/ZS[卩](Bobb等，1997,A/^c/e/c」c/A25:641-7)和大豆(3-伴球蛋白、7S貯藏蛋白(Chamberland等，1992,尸/a"fMo/.5/o/.19:937-49)。其啟動子與早期種子和胚的發(fā)育相關(guān)的谷類基因包括水稻谷蛋白("GluA-3"，Yoshihara和Takaiwa，1996，尸WCe//P—.。/.37:107-11;"GluB-l，'，Takaiwa等，1996,踏"ZMo/.腸/.30:1207-21;Washida等，1999,尸/a^AZo/.歷o/.40:1-12;"Gt3"，Leisy等，1990,尸toMo/.S/o/.14:41-50)、水稻醇溶谷蛋白(Zhou&Fan,1993,7V謹(jǐn)ge"/c2:141-6)、小麥醇溶谷蛋白(Hammond-Kosack等，1993，￡MS(9丄12:545-54)、玉米的玉米蛋白(Z4，Matzke等，1990,P』Mo/.腸/.14:323-32)、以及大麥大麥醇溶蛋白(Entwistle箏，1991,P/耐脅/.17:1217-31)。其它其啟動子與早期種子和胚的發(fā)育有關(guān)的基因包括油棕GL07A(7S球蛋白，Morcillo等，2001，尸/7"〖0/.尸/a"n12:233-243)、甘藍(lán)型油菜(Snxw/ca"apws)"op^、2SIC藏蛋白禾口napA基因(Josefsson等，1987,JC/zem.262:12196-201;Stalberg等，1993,尸/a"fMo/.腸/.199323:671-83;Ellerstrom等，1996，尸/a"/Mo/.腸/.32:1019-27)、甘藍(lán)型油菜油質(zhì)蛋白(Keddie等，1994，尸/a"fMo/.24:327-40)、擬南芥油質(zhì)蛋白(Plant等，1994,P/aWMo/.所o/.25:193-205)、擬南芥FAE1(Rossak等，2001,尸/a"ZAfo/.5/。/.46:717-25)、刀豆conA(Yamamoto等，1995,尸/"WMo/.腸/.27:729-41)和長春花胡豆苷合酉每(Str,Ouwerkerk禾口Memelink,1999,Mo/.261:635-43)。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，使用了在油生物合成過程中表達(dá)的基因的調(diào)控序列(參見例如美國專利No.5,952,544)。可選的啟動子來自植物貝t藏蛋白基因(Bevan等，1993,尸Mos,7>薦.Soc,5.廳.342:209-15)。其它可以使用的啟動子描述在例如美國專利Nos.5,378，619、5,391,725、5,428,147、5,447,858、5,608,144、5,608,144、5,614,399、5,633,441、5,633,435禾卩4,633,436中。在另一個實(shí)施方案中，可以將內(nèi)源的HIO基因置于轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄因子的控制之下，或用于設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)其表達(dá)的結(jié)合位點(diǎn)。一類這樣的轉(zhuǎn)錄因子是Cys2-His2-鋅指蛋白(ZFPs)。ZFPs是常見的DNA結(jié)合蛋白，可以被設(shè)計(jì)成與特定的DNA序列特異性結(jié)合(Beerli&Barbas,NatBiotechnol.，2002,20:135-141;Gommans等，JMolBiol"2005,354:507-519)。單獨(dú)的鋅指結(jié)構(gòu)域由大約30個氨基酸組成，是結(jié)構(gòu)上保守的，可以與DNA的3-4bp相互作用。可以合成含有多個被設(shè)計(jì)與HIO基因啟動子中的特定DNA序列結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)的多肽。設(shè)計(jì)與特定DNA序列相互作用的鋅指結(jié)構(gòu)域的原則，已經(jīng)描述在Segal等(Segal等，ProcNatlAcadSciUSA.,1999,96:2758-2763)、Dreier等(Dreier等，JMolBiol.,2000,303:489-502)、以及Beerli禾口Barbas(Beerli&Barbas,NatBiotechnol.,2002,20:135-141)中。這些DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以與效應(yīng)結(jié)構(gòu)域融合以形成合成的ZFP，它們可以調(diào)控與它們結(jié)合的基因的轉(zhuǎn)錄?？梢曰罨D(zhuǎn)錄的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域包括但不限于單純性皰疹病毒蛋白VP16(Sadowski等，Nature.,1988，335:563-564)和VP64(Beerli等，ProcNatlAcadSciUSA.,1998,95:14628-14633)的酸性部分，以及NF-kB轉(zhuǎn)錄因子p65結(jié)構(gòu)域(Bae等，NatBiotechnol.,2003,21:275-280.;Liu等，JBiolChem.,2001,276:11323-11334)?？梢砸种妻D(zhuǎn)錄的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域包括但不限于mSIN3和KRAB(Ayer等，MolCellBiol"1996,16:5772-5781;Beerli&Barbas，NatBiotechnol.，2002,20:135-141;Beerli等，ProcNatlAcadSciUSA,1998,95:14628-14633;Margolin等，ProcNatlAcadSciUSA.,1994，91:4509-4513)。這些方法已經(jīng)顯示出能在植物中起作用(Guan等，ProcNatlAcadSciUSA.,2002,99:13296-13301;Stege等，PlantJ.,2002,32:1077-1086;VanEene廳am等，MetabEng.,2004,6:101-108)。在另一個方面，在某些情況下可能希望抑制內(nèi)源HIO核酸序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的這個方面的示例性的方法包括但不限于反義抑制(Smith等，1988,淑騰，334:724-726;vanderKrol等，1988，S/orec/zm々"M,6:958-976)、共抑制(Napoli等，1990,P/滅Ce〃,2:279-289)、核酶(PCT公開W097/10328)和正義和反義的組合(Waterhouse等，1998,iVoc.淑/.^cac/.,,95:13959-13964)。在宿主細(xì)胞中抑制內(nèi)源序列的方法，典型情況下利用了至少一部分被抑制的序列的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和翻譯。這樣的序列可以與內(nèi)源序列的編碼以及非編碼區(qū)同源。反義抑制可以使用整個cDNA序列(Sheehy等，1988,尸麼.淑/.JcaJ.園,85:8805-8809)、部分cDNA序列包括5'編碼序列的片段(Cannon等，1990,尸/慮Mo/.5/o/.，15:39-47)或3'非編碼序列的片段(Ch'ng等，1989，尸rac.^crn/.Sc/.t/W，86:10006-10010)。共抑制技術(shù)可以使用完整的cDNA序列(Napoli等，1990,尸/cmCe〃，2:279-289;vanderKrol等，1990,尸/a^Ce〃，2:291-299)或部分cDNA序列(Smith等，1990,Mo/.G匿"",224:477-481)。可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的分子和遺傳學(xué)測試以進(jìn)一步分析核酸序列與觀察到的表現(xiàn)型之間的關(guān)聯(lián)性。示例性的技術(shù)描述如下。1.DNA/RNA分析可以通過例如原位雜交測定突變株和野生型株系中的階段和組織特異性基因的表達(dá)圖譜?？梢赃M(jìn)行基因、特別是調(diào)節(jié)區(qū)域兩翼的基因的甲基化狀態(tài)分析。其它適合的技術(shù)包括過表達(dá)、異位表達(dá)、在其它植物物種中表達(dá)和基因敲除(反基因組學(xué)、定向敲除、病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS;參見BaulcombeD,1999,^rc/z.Wro/.Sw;;/.15:189-201))。在優(yōu)選的應(yīng)用中，一般通過微陣列分析獲得的表達(dá)分布情況，被用于同時測量許多不同基因表達(dá)的差異或誘導(dǎo)的變化。用于微陣列分析的技術(shù)在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的(SchenaM等，1995270:467-470;BaldwinD等，1999,CO一尸W腸/.2(2):96-103;DangondF,PA"zWGe"om/"(2000)2:53-58;vanHalNL等，/S/他c/mo/.(2000)78:271-280;RichmondT禾口SomervilleS，C鮮，(9—.尸/"^5;W.20003:108-16)。可以對每個帶標(biāo)簽的株系進(jìn)行表達(dá)情況分析。這樣的分析可以鑒定出作為目標(biāo)基因過表達(dá)的結(jié)果被協(xié)同調(diào)控的其它基因，這可以幫助將未知基因放置到特定的途徑中。2.基因產(chǎn)物分析基因產(chǎn)物分析可以包括重組蛋白的表達(dá)、抗血清的生產(chǎn)、免疫定位、催化或其它活性的生物化學(xué)分析、磷酸化狀態(tài)的分析、以及通過酵母雙雜交分析來分析與其它蛋白的相互作用。3.途徑分析途徑分析可以包括根據(jù)基因或基因產(chǎn)物錯誤表達(dá)的表現(xiàn)型、或通過與相關(guān)基因的序列同源性，將基因或基因產(chǎn)物放置在特定的生物化學(xué)、代謝或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中。或者，分析可以包括與野生型株系或其它突變株系的遺傳雜交(產(chǎn)生雙突變體)，以確定基因在途徑中的次序，或確定突變對途徑中下游的"報告"基因的表達(dá)的影響。具有改變的表現(xiàn)型的突變植物的產(chǎn)生本文描述了產(chǎn)生具有改變的表現(xiàn)型的植物的其它方法，其中植物被鑒定為在其HIO核酸序列中具有突變或等位基因，導(dǎo)致了與缺少突變或等位基因的植物相比改變的表現(xiàn)型。突變的植物可以使用一種或多種誘變劑產(chǎn)生，例如化學(xué)誘變劑(例如甲基磺酸乙酯、甲基磺酸甲酯、硫酸二乙酯、和硝基胍或5-溴-脫氧尿苷)、輻射或紫外線。在方法的某些實(shí)施方案中，突變的植物可以被繁殖以產(chǎn)生后代，它們遺傳了突變或等位基因，并具有改變的表現(xiàn)型。例如，本文提供了在內(nèi)源HIO核酸序列中具有一個或多個賦予了改變的表現(xiàn)型的突變的植物的鑒定方法，以及產(chǎn)生這些具有這樣的表現(xiàn)型的非轉(zhuǎn)基因的突變植物的后代的方法。具有改變的表現(xiàn)型的突變的植物，可以具有改變的油、蛋白和/或纖維含量，或改變的種子粗粉含量。在被稱為"TILLING"(在基因組中靶向誘導(dǎo)的局部病變)方法的一個特定實(shí)施方案中，使用例如EMS(甲基磺酸乙酯)處理，在目標(biāo)植物的種子中誘導(dǎo)突變。將得到的植物進(jìn)行培育和自體受精，并將后代用于制備DNA樣品。使用了HIO核酸序列的PCR擴(kuò)增和測序來鑒定突變的植物在HIO核酸序列中是否具有突變。然后可以測試具有HIO突變的植物的改變的油、蛋白和/或纖維含量。為了證實(shí)HIO突變引起修飾的表現(xiàn)型，可以通過遺傳雜交來進(jìn)行將修飾的基因的存在與修飾的表現(xiàn)型相關(guān)聯(lián)的實(shí)驗(yàn)。TILLING可以鑒定到改變了特定基因的表達(dá)或改變了由這些基因編碼的蛋白的活性的突變(參見Colbert等，2001，尸/耐尸—W.126:480-484;McCallum等，2000,淑歸飾&c/mo/ogy18:455-457)。在方法的另一個特定實(shí)施方案中，可以在標(biāo)記物輔助的育種程序中使用候選基因/數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTLs)方法，來鑒定HIO核酸序列或HIO核酸序列的直系同源物(和/或旁系同源物)中可以賦予改變的油、蛋白和/或纖維含量的等位基因或突變(參見Bert等，T7zeor^^/2003Jun;107(l):181-9;禾口Lionneton等，Ge"ome,2002Dec;45(6):1203-15)。因此，在本公開的另一方面，HIO核酸被用于鑒定具有改變的油、蛋白和/或纖維含量的植物在內(nèi)源HIO核酸序列中是否具有突變，或是否具有在植物中導(dǎo)致改變的油、蛋白和/或纖維含量的等位基因。盡管已經(jīng)參考具體的方法和實(shí)施方案對本公開進(jìn)行了描述，但應(yīng)該認(rèn)識到，在不背離本公開的情況下可以對其進(jìn)行各種不同的修改和變化。所有本文中引用的出版物，出于描述和公開可以與本公開的內(nèi)容結(jié)合使用的組合物和方法的目的，在此明確引為參考。所有引用的專利、專利申請和參考的公共數(shù)據(jù)庫中的序列信息，也引為參考。實(shí)施例實(shí)施例1通過用激活標(biāo)簽構(gòu)建物進(jìn)行轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生具有HIO表現(xiàn)型的植物本實(shí)施例描述了具有改變的油、蛋白和/或纖維含量的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。使用激活標(biāo)簽"ACTTAG"載體pSKI015(GI#6537289;WeigelD等，2000,P/flW/^"/o/ogy，122:1003-1013)來產(chǎn)生突變?；旧习凑找压_的申請PCTW00183697中的描述，使用了標(biāo)準(zhǔn)方法來產(chǎn)生擬南芥轉(zhuǎn)基因植物。簡單來說，將T0擬南芥(Col-0)植物用攜帶有pSKI015載體的農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該載體含有來自農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA、除草劑抗性選擇標(biāo)記基因和4XCaMV35S增強(qiáng)子元件。在Tl世代根據(jù)除草劑抗性來選擇轉(zhuǎn)基因植物。收獲T2種子(從T1植物)，并播種在土壤中。將T2植物暴露于除草劑中，以殺死缺少ACTTAG載體的植物。將T2植物培育至成熟，允許其自體受精并結(jié)子。對于每個株系大量收獲T3種子(從T2植物)。在收獲時通過近紅外光譜(NIR)分析T3種子。使用Bruker22近紅外光譜儀捕獲NIR光譜。使用Bruker軟件，利用來自NIR分析的數(shù)據(jù)并按照制造商的說明書上的參考方法，估算了總的種子油、總的種子蛋白和總的種子纖維的含量。按照《美國油類化學(xué)家學(xué)會官方方法和推薦用法》(第五版)(OfficialMethodsandRecommendedPracticesoftheAmericanOilChemistsSociety,5thEd.，AOCS,Champaign,111.)中的AOCS步驟Aml-92的通用方法，開發(fā)了油含量預(yù)測校正方法。按照Dumas步驟AOAC968.06的通用方法(《AOAC分析的官方方法》(AOAC國際版第17版)，(OfficialMethodsofAnalysisofAOACInternational17thEditionAOAC),Gaithersburg,MD)，使用種子樣品的總氮含量數(shù)據(jù)開發(fā)了NIR總蛋白含量預(yù)測校正方法。按照AOAC官方方法962.09的通用方法(《AOAC分析的官方方法》(AOAC國際版第17版)，(OfficialMethodsofAnalysisofAOACInternational17thEditionAOAC),Gaithersburg,MD)，使用種子樣品的粗纖維含量數(shù)據(jù)開發(fā)了NIR纖維含量預(yù)測校正方法。按照B薩se等(1986Anal.Biochem.152:141-145)的方法，使用種子樣品的油酸含量數(shù)據(jù)開發(fā)了NIR油酸含量預(yù)測校正方法。通過在一組種子樣品中測量可消化蛋白的含量，開發(fā)了用于預(yù)測可消化蛋白含量的NIR校正曲線。在已知質(zhì)量的種子中總蛋白的含量通過使用Dumas方法(AOAC官方方法968.06)測量種子的總氮含量來確定。種子纖維從獨(dú)立的種子樣品中使用Honig和Rackis的方法(1979，JFoodC&m.,27:1262-1266)來提取。殘留的與纖維相關(guān)的未消化的蛋白通過Dumas方法(AOAC官方方法968.06)來測量?？上鞍缀客ㄟ^從種子中蛋白的總量中減去與纖維有關(guān)的未消化的蛋白的量來確定。對82,274個獨(dú)立的ACTTAG株系的來自NIR光譜的油、蛋白和纖維預(yù)測值進(jìn)行了比較。在種子組成分析之后，通過反向PCR和測序確定了每個株系中ACTTAG元件在基因組中的位置。在該分析中考慮了37,995個具有回收到的兩翼序列的株系。通過NIR光譜法確定了82,274個株系中的種子油和蛋白值并進(jìn)行了歸一化，以允許對在不同時間培育的植物中的種子成分值進(jìn)行比較。通過對在同一天種植的所有植物(包括大量其它ACTTAG植物，包括對照、野生型或非轉(zhuǎn)基因植物)的種子中的平均油、蛋白和纖維值進(jìn)行計(jì)算，對油、蛋白和纖維值進(jìn)行了歸一化。每個株系的種子成分被表示成"百分相對值"，它通過用每個株系的成分值除以同一天種植的所有株系的平均成分值(將大約等于對照、野生型或非轉(zhuǎn)基因植物中的值)來計(jì)算。"百分相對蛋白"和"百分相對纖維"的計(jì)算類似。使用反向PCR來回收T-DNA插入片段兩側(cè)的基因組DNA。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，并使用堿基BLASTN搜索和/或搜索擬南芥信息資源(TAIR)數(shù)據(jù)庫(可以在公開可用的網(wǎng)點(diǎn)獲得)來定位在基因組上的位置。一般來說，位于ACTTAG元件中的增強(qiáng)子的9kb范圍內(nèi)的啟44動子被認(rèn)為是在"活化空間"內(nèi)。在編碼序列中帶有T-DNA插入片段的基因不被認(rèn)為是在"活化空間"內(nèi)。鑒定到的ACTTAG株系列于表l的第3列中。在某些情況下，一個以上的ACTTAG株系與基因相關(guān)。通過將第3列中鑒定到的植物與在同樣時間生長的、但沒有顯示出性狀的其它植物中種子的成分進(jìn)行比較，確定了分別在第4、5、6和7列中顯示的相對的油、蛋白、纖維和油酸的值。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>實(shí)施例2擬南芥HIO序列的分析序歹U分析使用BLAST(Altschul等，1990,Mo/.S/o/.215:403-410)、PFAM(Bateman等，1999,A^c/e/ci仏27:260-262)、INTERPRO(Mulder等，2003A^c/e/c^c/Ai仏31,315-318)、PSORT(NakaiK和HortonP,1999,7>e"<*^oc/ze肌Sc/.24:34-6)、禾口/或CLUSTAL(ThompsonJD等，1994,7Vwc/e""AL22:4673-4680)進(jìn)行。實(shí)施例3重演實(shí)驗(yàn)為了測試表1和2中過表達(dá)的基因是否改變的種子成分的表現(xiàn)型，將表達(dá)這些基因的轉(zhuǎn)基因植物的種子中的蛋白、可消化蛋白、油和纖維的含量，與來自非轉(zhuǎn)基因的對照植物的種子中的蛋白、可消化蛋白、油和纖維的含量進(jìn)行了比較。為此，將基因克隆到植物轉(zhuǎn)化載體中，置于強(qiáng)的組成性CsVMV啟動子和種子特異性PRU啟動子之后。使用floraldip方法將這些構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到擬南芥植物中。植物轉(zhuǎn)化載體含有提供了對有毒化合物的抗性并用作選擇標(biāo)記的基因。將轉(zhuǎn)化的植物的種子鋪在含有有毒化合物的瓊脂培養(yǎng)基上。7天后，鑒定為健康的綠色植物的轉(zhuǎn)基因植物，并移植到土壤中。將非轉(zhuǎn)基因的對照植物在瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)，允許其生長7天，然后移植到土壤中。轉(zhuǎn)基因的小苗和非轉(zhuǎn)基因的對照植物被移植到2英寸的花盆中，放置在10英寸乘20英寸的培養(yǎng)盤中隨機(jī)的位置上。將植物培育至成熟，允許其自體受精并結(jié)子。從每株植物收獲種子，使用前面描述的方法通過近紅外(NIR)光譜法估算油的含量。每種構(gòu)建物對種子成分的影響在至少兩個實(shí)驗(yàn)中評估。表4列出了通過雙因子方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)，以p-值S0.05鑒定到的被測試能夠?qū)е掠汀⒌鞍?、可消化蛋白的顯著增加或纖維的顯著降低的構(gòu)建物。這些構(gòu)建物列于表4中。對于蛋白、油、可消化蛋白和纖維的ANOVAp-值分別列于第4-7列中。具有顯著p-值的構(gòu)建物用粗體列出。蛋白、油、可消化蛋白和纖維的平均值分別列于第8-11列中，它們通過將每個實(shí)驗(yàn)中測定的轉(zhuǎn)基因植物的平均值進(jìn)行平均來計(jì)算。表449<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>權(quán)利要求1.含有植物轉(zhuǎn)化載體的轉(zhuǎn)基因植物，該載體含有編碼HIO多肽的核苷酸序列或與編碼該多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，該HIO多肽含有SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14或SEQIDNO16中顯示的氨基酸序列，或其直系同源物或旁系同源物，由此該轉(zhuǎn)基因植物相對于對照植物具有增加的油含量表現(xiàn)型或改進(jìn)的粗粉質(zhì)量表現(xiàn)型。2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，是選自蕓苔屬(5rww'M)的植物，包括低芥子酸油菜和油菜籽、大豆、玉米、向日葵、棉花、可可、紅花、油棕、椰子、亞麻、蓖麻、花生、小麥、燕麥和水稻。3.從權(quán)利要求1的植物獲得的植物部分。4.權(quán)利要求3的植物部分，是種子。5.從權(quán)利要求4的種子生產(chǎn)的粗粉、飼料或食物。6.生產(chǎn)油的方法，包括培育權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，以及從該植物回收油。7.權(quán)利要求6的方法，其中從植物的種子回收油。8.在植物中產(chǎn)生增加的油含量的方法，該方法包括a)將含有編碼HIO多肽的核苷酸序列或與編碼HIO多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的植物轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入到植物的祖細(xì)胞中，該HIO多肽含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO:16中顯示的氨基酸序列，或其直系同源物或旁系同源物，以及b)培育轉(zhuǎn)化的祖細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，在所述轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)該多核苷酸序列，并且該轉(zhuǎn)基因植物相對于對照植物來說表現(xiàn)出增加的油含量表現(xiàn)型。9.通過權(quán)利要求8的方法獲得的植物。10.權(quán)利要求9的植物，是選自蕓苔屬(Brassica)的植物，包括低芥子酸油菜和油菜籽、大豆、玉米、向日葵、棉花、可可、紅花、油棕、椰子、亞麻、蓖麻、花生、小麥、燕麥和水稻。11.權(quán)利要求9的植物，其中植物選自從該祖細(xì)胞培育而來的植物、作為從該祖細(xì)胞培育而來的植物的直接后代的植物、以及作為從該祖細(xì)胞培育而來的植物的間接后代的植物。12.產(chǎn)生具有增加的油含量的植物的方法，包括鑒定在其HIO基因中具有等位基因的植物，該等位基因?qū)е屡c缺少該等位基因的植物相比增加的油含量，以及產(chǎn)生該被鑒定的植物的后代，其中產(chǎn)生的后代遺傳了該等位基因并具有高油表現(xiàn)型。13.權(quán)利要求12的方法，使用了候選基因/QTL方法。14.權(quán)利要求12的方法，使用了TILLING方法。15.含有由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13或SEQIDNO:15中顯示的核酸序列編碼的多肽的飼料、粗粉、谷物、食物或種子。16.含有多肽的伺料、粗粉、谷物、食物或種子，該多肽含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO:16中顯示的氨基酸序列，或其直系同源物或旁系同源物。17.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，其中改進(jìn)的粗粉質(zhì)量表現(xiàn)型包括在從轉(zhuǎn)基因植物的種子生產(chǎn)的粗粉中，與對照植物相比，可用的可代謝能量的增加。18.權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因植物，其中可用的可代謝能量的增加包括轉(zhuǎn)基因植物的種子中改變的蛋白和/或纖維含量。19.權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物，其中蛋白含量增加和/或纖維含量降低。20.權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因植物，其中可用的可代謝能量的增加包括轉(zhuǎn)基因植物的種子中降低的纖維含量。21.生產(chǎn)粗粉的方法，包括培育權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物以及從該植物回收粗粉，從而產(chǎn)生粗粉。22.權(quán)利要求21的方法，其中粗粉從植物的種子生產(chǎn)。23.在植物中產(chǎn)生改進(jìn)的粗粉質(zhì)量表現(xiàn)型的方法，該方法包括a)將含有編碼HIO多肽的核苷酸序列或與編碼HIO多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的植物轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入到植物的祖細(xì)胞中，該HIO多肽含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO:16中顯示的氨基酸序列，或其直系同源物或旁系同源物，以及b)培育轉(zhuǎn)化的祖細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，在所述轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)該多核苷酸序列，并且該轉(zhuǎn)基因植物相對于對照植物表現(xiàn)出改進(jìn)的24.通過權(quán)利要求23的方法獲得的植物。25.權(quán)利要求24的植物，是選自蕓苔屬(Brassica)的植物，包括低芥子酸油菜和油菜籽、大豆、玉米、向日葵、棉花、可可、紅花、油棕、椰子、亞麻、蓖麻、花生、小麥、燕麥和水稻。26.權(quán)利要求24的植物，其中植物選自從該祖細(xì)胞培育而來的植物、作為從該祖細(xì)胞培育而來的植物的直接后代的植物、以及作為從該祖細(xì)胞培育而來的植物的間接后代的植物。27.產(chǎn)生具有改進(jìn)的粗粉質(zhì)量表現(xiàn)型的植物的方法，包括鑒定在其HIO基因中具有等位基因的植物，該等位基因?qū)е屡c缺少該等位基因的植物相比增加的粗粉質(zhì)量，以及產(chǎn)生該被鑒定的植物的后代，其中產(chǎn)生的后代遺傳了該等位基因并具有改進(jìn)的粗粉質(zhì)量，由此產(chǎn)生具有改進(jìn)的粗粉質(zhì)量表現(xiàn)型的植物。28.權(quán)利要求27的方法，使用了候選基因/QTL方法。29.權(quán)利要求27的方法，使用了TILLING方法。全文摘要本發(fā)明涉及由于HIO核酸的改變的表達(dá)而表現(xiàn)出改進(jìn)的油量表現(xiàn)型或改進(jìn)的粗粉質(zhì)量表現(xiàn)型的植物。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有改進(jìn)的油量表現(xiàn)型或改進(jìn)的粗粉質(zhì)量表現(xiàn)型的植物的方法。文檔編號C12N15/82GK101627124SQ200780051122公開日2010年1月13日申請日期2007年12月13日優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日發(fā)明者海因·措恩格(梅達(dá)爾)·額,約翰·P·戴維斯申請人:農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)有限責(zé)任公司