專利名稱：表達(dá)縮膽囊素基因的重組t4噬菌體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表達(dá)縮膽囊素基因的重組T4噬菌體的特征和應(yīng)用。本發(fā)明進一步涉及重組T4噬菌體對豬、兔、牛、雞、鴨、鵝等動物的主動免疫技術(shù)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
縮膽囊素(Cholecystokinin，CCK)是一種調(diào)節(jié)動物采食量的有效因子。縮膽囊素又稱膽囊收縮素或促胰酶素，是由小腸粘膜的I細(xì)胞分泌的多肽類激素。CCK前體為130個氨基酸，逐步分解成為小分子的CCK，目前發(fā)現(xiàn)的CCK有CCK-83，CCK-58，CCK-39，CCK-33，CCK-12，CCK-8和CCK-4。其不同部位主要在羧基端，但長度延伸在氨基端。餐后血漿中主要為大分子CCK，包括CCK-58，CCK-39，CCK-33和CCK-12。這些大分子CCK經(jīng)胰蛋白酶水解后均成為8肽的氨基酸殘基，即CCK-8。CCK-8具有CCK分子的全部活性，與8肽的胃泌素結(jié)構(gòu)相似，都具有相同的氨基末端序列Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2，該序列是CCK和胃泌素發(fā)揮其生物活性所必需的。CCK存在于腦和胃腸道中，是腦內(nèi)含量較多的一種腦腸肽(brain-gut peptide)類物質(zhì)。CCK在各部位的含量則差別很大。在胃腸道，CCK有促進膽囊、胃和幽門括約肌收縮；促進遠(yuǎn)端十二指腸和空腸蠕動；促進膽汁、胃酸、胰液的分泌；增強胰酶的活性；促進胰島素0胰高血糖素、降鈣素的釋放；調(diào)節(jié)胰多肽在腸道和胰液中的釋放；抑制胃排空等功能。CCK受體有兩種CCK-A受體和CCK-B受體，其中CCK-A受體在外周器官含量很高，而CCK-B受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量很高。CCK-A受體有兩個結(jié)合位點高親和力位點和低親和力位點。近年來的研究表明CCK是和CCK-A的低親和力位點結(jié)合使動物產(chǎn)生飽感從而使動物采食停止。
CCK可以降低多種動物的采食量。CCK-A受體基因敲除大鼠表現(xiàn)為肥胖、易饑餓、采食增加(Schwartz等，1999)。研究發(fā)現(xiàn)，在多種動物中，無論是外源性CCK，還是機體自身生成的內(nèi)源性CCK都能使機體產(chǎn)生飽感(Della Fera等，1979，1981；Gibbs等，1973；Mc Laughlin等，1980)。外源性注入CCK也會降低動物的采食量。中樞和外周引入CCK具有相同的降低采食量的作用，CCK作為神經(jīng)遞質(zhì)直接在腦內(nèi)產(chǎn)生飽感。小劑量CCK就可以有效地抑制采食，在狗、鼠、兔、猴等多種哺乳動物及人體實驗研究中發(fā)現(xiàn)，無論生理劑量或藥理劑量的CCK都能抑制進食后的胃排空活動(Doong等，1998)，進而抑制動物采食。血漿CCK濃度與胃排空率呈反比關(guān)系。
對CCK免疫的研究已經(jīng)開展了較長時間，早期研究表明，利用免疫調(diào)控技術(shù)可有效調(diào)控體內(nèi)激素的分泌，從而調(diào)節(jié)動物的生產(chǎn)性能(Della等，1981；Lawrence等，1986；Pekas，1991，1993；Schanbacher等，1994)。目前，在豬和一些反芻動物上已有以CCK為抗原進行主動免疫和被動免疫的研究報道，結(jié)果表明對動物生產(chǎn)性能有一定的調(diào)控作用。Jens等(1978)用CCK-33單獨免疫兔子，在加強免疫3次后，獲得了效價很高的抗CCK-33的抗血清，說明CCK有一定的抗原性，可以用來接種動物使之產(chǎn)生抗體。而國內(nèi)，陳均輝(1992)用CCK-8大分子與牛血清蛋白(BSA)聯(lián)結(jié)形成全抗原免疫兔子，加強免疫后也獲得了高滴度的抗CCK-8抗血清。雖然CCK免疫調(diào)控在豬、羊上有一定效果，但為了在生產(chǎn)中能夠應(yīng)用該技術(shù)，必須尋找到一種CCK免疫原，其免疫用量少，免疫過程方便可行，抗體相對穩(wěn)定、易于保存使用，而且能大量生產(chǎn)抗體，又符合動物保護法規(guī)的方法。
用CCK作抗原主動免疫動物可以提高動物的采食量和增重。Pekas和Trout(1990)用CCK免疫生長豬后，其采食量和增重分別提高了8.2％和10.6％，胴體重提高8.7％，體長增加2.4％，對瘦肉/脂肪的比值和蛋白質(zhì)/脂肪的比值沒有影響，但CCK免疫豬的胴體瘦肉和脂肪重增加。由此可見，CCK免疫后，豬的生長速度增加是因為胴體增重增加，但對胴體組成沒有影響。Mclaughlin等(1985)用CCK主動免疫鼠后發(fā)現(xiàn)，處理組比對照組的采食量增加了9％(P＜0.04)，增重提高了17％(P＜0.02)。這些研究結(jié)果表明應(yīng)用CCK主動免疫動物對于動物的采食具有一定的促進作用，但結(jié)論也僅限于一些哺乳動物，對于其它動物方面的效果還有待進一步實驗證實。
以上研究都是將化學(xué)合成的，或者是從動物組織中分離純化的CCK或其活性部分與大分子物質(zhì)(如BSA等)偶聯(lián)，然后免疫動物。但還沒有用噬菌體表達(dá)CCK或其活性部分(如CCK-33肽、CCK-8肽)的報道。
噬菌體表面展示技術(shù)(phage display)是1980年代發(fā)展起來的一項新的生物技術(shù)(Smith，1985)，它能將表達(dá)的外源多肽和蛋白質(zhì)以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，并保持相對獨立的空間構(gòu)象和生物活性。T4噬菌體屬于有尾噬菌體中A群A2亞群的典型成員，其基本形態(tài)結(jié)構(gòu)是頭長徑約95nm，橫徑約為65nm。T4噬菌體衣殼由3種必需衣殼蛋白組成，主要的衣殼蛋白gp23和2個次要衣殼蛋白gp24、gp20。其中分子量為45kDa的gp23在每個病毒顆粒中有960個拷貝，而其余2個次要衣殼蛋白拷貝數(shù)較少，gp24有55個拷貝，而gp20只有12個拷貝。此外，在衣殼的外表面包被著2種非必需外殼蛋白分子量為9kDa的SOC和分子量為40kDa的HOC，二者相距7nm，以對稱的形式分布于噬菌體二十面體表面。SOC和HOC僅提供噬菌體額外的穩(wěn)定能力，是在噬菌體衣殼裝配完成后才組裝到衣殼表面的，它們的缺失不影響T4噬菌體的繁殖和感染。將外源蛋白與T4噬菌體表面的SOC或者HOC蛋白形成融合蛋白，從而可以獲得具有外源蛋白的重組T4噬菌體。采用這樣的方法，獲得了表達(dá)愛滋病毒(HIV)gp120 V3肽、脊髓灰質(zhì)炎病毒VP1(Ren et al，1996)、腦膜炎奈氏菌PorA(Jiang et al，1997)抗原蛋白、傳染性囊病病毒VP2(曹永長等，2003)、禽流感H5亞型和H9亞型HA蛋白(呂英姿等，2002)的重組T4噬菌體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于獲得表達(dá)縮膽囊素基因的重組T4噬菌體，為主動免疫縮膽囊素和縮膽囊素抗體的檢測提供一種新的抗原。
本發(fā)明提供的重組T4噬菌體是采用基因重組的方法獲得的。其構(gòu)建方法是首先是構(gòu)建一系列含有縮膽囊素33肽基因多串聯(lián)體的重組質(zhì)粒。這些質(zhì)粒是采用基因工程方法獲得的，具體構(gòu)建方法如下(1)根據(jù)雞cck基因的堿基序列及大腸桿菌高頻密碼子，設(shè)計合成cck-33基因，基因序列為GGTTCTACTGGCCGCTTCTCTGTCCTTG GCAACCGTGTACAGAGCATTGATCCGACGCACCGTATTAATGACCGTGACTACATGGGCTGGATGGATTTT。
(2)將cck-33基因插入pRSETA質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pRSETA-1CCK，具體操作如下根據(jù)人工合成的cck-33基因設(shè)計特異性引物，采用PCR方法，以人工合成的cck-33基因為模板，擴增cck-33基因片段。用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測PCR產(chǎn)物，觀察到大小約120bp的特異性條帶。
用SacI和BamHI在37℃分別消化CCK-33基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pRSETA，接著在T4連接酶的作用之下，連接消化的cck-33基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pRSETA。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得插入了cck-33基因的轉(zhuǎn)化子。然后用特異性引物P1/P2對含有cck-33基因的轉(zhuǎn)化子進行PCR篩選。用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測PCR產(chǎn)物，觀察到大小約120bp的特異性條帶。
對PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測定，獲得重組質(zhì)粒命名為pRSETA-1CCK。
(3)根據(jù)BamHI和BglII互為同尾酶的特性，構(gòu)建cck-33基因2串聯(lián)體(簡稱2cck)，具體操作如下將重組質(zhì)粒pRSETA-1CCK用兩組酶在37℃進行消化第一組用BamHI和HindIII進行消化，回收較小的片段；第二組用BglII、HindIII和CIAP進行消化，回收較大的片段。接著在T4連接酶的作用之下，連接回收的大片段和小片段。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得含有2cck的重組子。然后用特異性引物P1/P2對含有2cck的重組子進行PCR篩選。用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測PCR產(chǎn)物，觀察到約230bp的特異性條帶。
對PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測定，獲得的重組質(zhì)粒命名為pRSETA-2CCK。
(4)在pRSETA-2CCK的基礎(chǔ)上構(gòu)建cck-33基因的4串聯(lián)體(簡稱4cck)，具體操作如下將重組質(zhì)粒pRSETA-2CCK用兩組酶在37℃進行消化第一組用BamHI和HindIII進行消化，回收較小的片段；第二組用BglII、HindIII和CIAP進行消化，回收較大的片段。接著在T4連接酶的作用之下，連接回收的大片段和小片段。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得含有4cck基因的重組子。然后用特異性引物P3(5’-GATAAGGATCGATGGGGATCC-3’)/P4(5’-ATGGTACCAGCTG CAGATCT-3’)對含有4cck的重組子進行PCR篩選。對PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測定，獲得的重組質(zhì)粒命名為pRSETA-4CCK。
采用相同的方法，分別獲得含有cck-33基因6串聯(lián)體(簡稱6cck)、8串聯(lián)體(簡稱8cck)，相應(yīng)地命名為pRSETA-6CCK、pRSETA-8CCK。
在獲得含有cck-33基因多串聯(lián)體重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，構(gòu)建含有cck-33基因多串聯(lián)體的整合質(zhì)粒。下面以含有4cck整合質(zhì)粒的構(gòu)建為例說明其構(gòu)建方法。
(1)采用特異性引物Pup2(5′-ATTGAATTCTGATGACGATAAGGAT-3′)/Pdn2(5′-ATCGAATTCCTACATGGTACCAGCTGC-3′)，用PCR方法從質(zhì)粒pRSETA-4CCK中擴增4cck基因。PCR反應(yīng)體系(100μL)組成如下10×PCR buffer 10μl，dNTPs 8μL，Taq酶1μL，Pup2 1μL，Pdn2 1μL，pRSETA-4CCK 1μl，ddH2O 78μL。PCR擴增程序如下循環(huán)194℃ 3min；循環(huán)2～3194℃ 40sec，64℃ 40sec，72℃ 60sec；循環(huán)3272℃ 10min。擴增產(chǎn)物在4℃保存。用1％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測PCR產(chǎn)物。
(2)將4cck基因插入pR質(zhì)粒(Ren et al，1996)中，構(gòu)建重組整合質(zhì)粒pR-4CCK，其操作步驟如下用EcoR I在37℃分別消化4cck基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pR，接著在T4連接酶的作用之下，連接消化的4cck的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pR。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得插入了4cck基因的重組子。然后用1對特異性引物SOC-S(5′-GAATCATATGGCTA GTCTCGCGG-3′)/Pdn2進行PCR篩選。對PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測定，獲得重組整合質(zhì)粒pR-4CCK。
然后，用重組整合質(zhì)粒pR-4CCK和缺陷性T4噬菌體T4-Z1(Ren etal，1996)進行同源重組，獲得表達(dá)CCK-33肽4串聯(lián)體蛋白(4CCK)的重組T4噬菌體，其操作步驟如下用整合質(zhì)粒pR-4CCK轉(zhuǎn)化大腸桿菌E2，獲得的大腸桿菌為E-4CCK；在裝入500μL SC培養(yǎng)液的器皿中加入1μL氨卞青霉素(Amp)，然后加入10μL E-4CCK，在37℃培養(yǎng)至光密度值OD600大約為0.5時，加入50μL T4-Z1，在35℃200r/m振搖培養(yǎng)至有細(xì)菌碎片出現(xiàn)，獲得的產(chǎn)物為未鑒定的重組T4噬菌體；在1個經(jīng)過滅菌的器皿中加入培養(yǎng)超過12h的大腸桿菌E2600μL，不加溶菌酶，將在2～10℃儲存的SC頂層培養(yǎng)基放在微波爐中溶解，待瓊脂溫度降到45℃左右的時候取2mL倒入裝有大腸桿菌E2的器皿中，將混合液混勻，立即倒在預(yù)先配置的SC底層培養(yǎng)基平皿上，當(dāng)瓊脂完全冷凝時，在SC頂層培養(yǎng)基上分別點10μL未鑒定的重組T4噬菌體，待吸收完畢后，放在37℃培養(yǎng)16h以上。如果E-4CCK中的質(zhì)粒與T4-Z1發(fā)生了重組，成功地將4cck基因轉(zhuǎn)入T4噬菌體中，則在沒有加溶菌酶的平皿上可以生長出噬菌斑；在平皿上鋪含有E2細(xì)菌的SC頂層培養(yǎng)基，用滅菌牙簽把生長出的噬菌斑在SC頂層培養(yǎng)基上點梅花斑，放在37℃培養(yǎng)12h以上，生長良好的梅花斑用消毒好的刀片將其剝下，浸泡在磷酸緩沖液中6h；用特異性引物Pup2/Pdn2從梅花斑浸泡液中擴增到特異性條帶，則說明已獲得表達(dá)4CCK蛋白的重組T4噬菌體，命名為T4-4CCK。
SC培養(yǎng)液按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone和5g NaCl，加雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min后4℃保存。
SC底層培養(yǎng)基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和12g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L Tris-Cl和10mL 25％檸檬酸鈉·2H2O溶液，搖勻后倒平板，4℃保存。
SC頂層培養(yǎng)基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和7g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，4℃保存。用時加熱溶解，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/LTris-Cl和10mL 25％檸檬酸鈉。2H2O溶液，搖勻后備用。
采用類似的方法，構(gòu)建表達(dá)CCK-33肽(1CCK)和CCK-33肽8串聯(lián)體(8CCK)的重組噬菌體，相應(yīng)地將這些重組噬菌體命名為T4-1CCK和T4-8CCK。
表達(dá)CCK-33肽多串聯(lián)體的重組T4噬菌體的特征為(1)本發(fā)明提供的重組噬菌體T4-1CCK、T4-4CCK和T4-8CCK都具有序列表中序列1的核苷酸序列，或序列1的串聯(lián)體序列。序列1又稱為cck-33基因，由99個堿基對組成，是根據(jù)雞cck基因的堿基序列及大腸桿菌高頻密碼子而設(shè)計的。序列1的串聯(lián)體序列，是用若干個堿基將兩個cck-33基因以首尾相連的方式，將若干個cck-33基因連接起來形成的序列。對于序列1和序列1的多串聯(lián)體，采用PCR方法可以擴增出特異性條帶，也可以采用DNA序列測定的方法進行確定。
(2)本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物具有序列表中序列2的氨基酸序列，或序列2的串聯(lián)體序列。序列2又稱為CCK-33肽，是由序列1編碼的。序列2的串聯(lián)體序列，是用若干個氨基酸將兩個CCK-33肽以首尾相連的方式，將若干個CCK-33肽連接起來形成的序列。采用抗CCK-33肽的特異性抗體，或者抗CCK-8肽的特異性抗體，或者抗其它形式的CCK的特異性抗體，都可以檢測到該多肽產(chǎn)物。
(3)本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒還包括具有CCK等同序列的質(zhì)粒。CCK等同序列，是與cck-33基因的核苷酸序列，或CCK-33肽的氨基酸殘基序列相比有一個或若干個核苷酸或氨基酸殘基的差別，包括堿基或氨基酸殘基的改變、缺失、添加、或插入，或與cck-33基因序列中的連續(xù)24個堿基以上的區(qū)段有75％以上的同源性。
本發(fā)明提供的重組噬菌體具有重要的應(yīng)用價值。應(yīng)用之一是將所述的重組噬菌體作為抗原，采用重組噬菌體直接免疫或?qū)⑵渑c佐劑配合免疫豬、牛、兔、雞等動物，可以促進動物采食，提高生產(chǎn)性能。
本發(fā)明提供的重組噬菌體的第二個應(yīng)用，是采用重組噬菌體直接免疫或?qū)⑵渑c佐劑配合制成疫苗免疫蛋雞，通過收集免疫雞的雞蛋，可以大量獲得抗CCK的特異性抗體。
本發(fā)明提供的重組噬菌體的另一個應(yīng)用，是將所述的重組噬菌體作為抗原，應(yīng)用于包括但不限于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)，檢測動物血清中的CCK特異性抗體。
本發(fā)明具有明顯的優(yōu)點和效果。(1)本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計基因序列，采用基因工程的方法獲得的重組噬菌體，表達(dá)量高，易于純化，成本低。(2)本發(fā)明獲得的CCK-33肽多串聯(lián)體具有很好的免疫原性。CCK在動物體內(nèi)主要以羥基端酰胺化的CCK-8和CCK-33的形式存在。由于CCK-33和CCK-8的分子量太小，不能直接作為抗原免疫動物，一般需要將它們與大分子物質(zhì)(如BSA)偶聯(lián)。本發(fā)明提供的重組T4噬菌體巧妙地將CCK-33肽或其多串聯(lián)體與T4噬菌體頭部的SOC蛋白融合后，展示在T4噬菌體表面。由于SOC位點在T4噬菌體頭部表面具有960個拷貝，所以與SOC融合表達(dá)的CCK-33肽或其多串聯(lián)體的拷貝數(shù)高。由于CCK-33肽或其多串聯(lián)體分布于T4噬菌體頭部表面，因而T4噬菌體本身充當(dāng)了CCK-33肽或其多串聯(lián)體的載體，當(dāng)本發(fā)明提供的重組T4噬菌體作為抗原時，CCK-33肽或其多串聯(lián)體的免疫原性比單獨的CCK蛋白的免疫原性強。作為疫苗的抗原、或者作為免疫檢測的抗原使用時，比人工合成的CCK多肽，甚至和其它的蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的CCK多肽或其多串聯(lián)體相比，本發(fā)明所述的重組T4噬菌體具有明顯的優(yōu)點。
以下結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明提供的表達(dá)CCK-33肽多串聯(lián)體的重組噬菌體的構(gòu)建、重組噬菌體的特征分析、應(yīng)用途徑作具體說明。


圖1為cck-33基因及其多串聯(lián)體構(gòu)建示意圖。pRSET A為克隆質(zhì)粒載體，pRSETA-1CCK為插入了cck-33基因的重組質(zhì)粒，pRSETA-2CCK為插入了cck-33基因2串聯(lián)體(2cck)的重組質(zhì)粒，pRSETA-4CCK為插入了cck-33基因4串聯(lián)體(4cck)的重組質(zhì)粒，pRSETA-6CCK為插入了cck-33基因6串聯(lián)體(6cck)的重組質(zhì)粒，pRSETA-8CCK為插入了cck-33基因8串聯(lián)體(8cck)的重組質(zhì)粒。BamHI、HindIII、BglII、SacI是質(zhì)粒上的限制性內(nèi)切酶位點。
圖2為cck-33基因及其多串聯(lián)體的PCR鑒定結(jié)果圖。泳道1、2是cck-33基因及其多串聯(lián)體的PCR產(chǎn)物，泳道M為DNA分子量標(biāo)記。A為cck-33基因PCR產(chǎn)物，B為cck-33基因4串聯(lián)體(4cck)PCR產(chǎn)物，C為cck-33基因8串聯(lián)體(8cck)PCR產(chǎn)物。
圖3為用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII分別對重組質(zhì)粒pRSETA-1CCK、pRSETA-2CCK、pRSETA-4CCK、pRSETA-6CCK和pRSETA-8CCK進行雙酶切的電泳鑒定圖。M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1泳道為pRSETA-1CCK質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，外源片斷大小約為120bp；2泳道為pRSETA-2CCK質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，外源片斷大小約為230bp；3泳道為pRSETA-4CCK質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，外源片斷大小約為450bp；4泳道為pRSETA-6CCK質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，外源片斷大小約為700bp；5泳道為pRSETA-8CCK質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，外源片斷大小約為1100bp。
圖4為重組整合質(zhì)粒pR-CCK的構(gòu)建示意圖。1CCK表示cck-33基因，4CCK表示cck-33基因4串聯(lián)體，8CCK表示cck-33基因8串聯(lián)體。pR表示整合質(zhì)粒，pR-1CCK表示插入了cck-33基因的重組整合質(zhì)粒，pR-4CCK表示插入了cck-33基因4串聯(lián)體(4cck)的重組整合質(zhì)粒，pR-8CCK表示插入了cck-33基因8串聯(lián)體(8cck)的重組整合質(zhì)粒。Ampr表示氨卞青霉素抗性，Kpr表示卡那霉素抗性。e、soc、den V都是T4噬菌體上的基因。EcoRI、BamHI、NdeI、HindIII、PstI、PvuI是質(zhì)粒上的限制性內(nèi)切酶位點。
圖5為cck-33基因4串聯(lián)體(4cck)在重組T4噬菌體SOC位點展示模式圖。A為重組整合質(zhì)粒pR-4CCK；B為缺陷型T4噬菌體ΦT4-Z1；C為重組后攜帶有目的基因4CCK的重組T4噬菌體T4-4CCK。
圖6為重組噬菌體T4-1CCK的PCR鑒定結(jié)果圖。泳道1～3是含有cck基因的重組噬菌體的PCR產(chǎn)物，泳道4為陰性對照，泳道M為分子量標(biāo)記。
圖7為重組噬菌體T4-4CCK的PCR鑒定結(jié)果圖。泳道1～9是含有4cck基因的重組噬菌體的PCR產(chǎn)物，泳道M為分子量標(biāo)記。
圖8為重組噬菌體T4-8CCK的PCR鑒定結(jié)果圖。泳道1是含有8cck基因的重組噬菌體的PCR產(chǎn)物，泳道M為分子量標(biāo)記。
圖9為野生型T4噬菌體及重組噬菌體免疫電鏡圖譜。A為野生型T4噬菌體。B為重組噬菌體T4-4CCK。C為與CCK陽性血清反應(yīng)的重組噬菌體T4-4CCK。
圖10重組噬菌體和野生型噬菌體的SDS-PAGE(12％)檢測圖。M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1泳道為重組噬菌體T4-4CCK；2泳道為野生型T4噬菌體。箭頭所指為SOC-4CCK融合蛋白。
實施例實施例1.含有cck-33基因(1cck)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)雞cck基因的堿基序列及大腸桿菌高頻密碼子，設(shè)計合成cck-33基因，基因序列為GGTTCTACTGGCCGCTTCTCTGTCCT TGGCAACCGTGTACAGAGCATTGATCCGACGCACCGTATTAATGACCGTGACTACATGGGCTGGATGGATTTT。
根據(jù)人工合成的cck-33基因設(shè)計特異性引物P1(5’-CATGGATCCGGTTCTACTGGCCGCT-3’)/P2(5’-CATGAGCTCCCAAAATCCATCCAGCC-3’)，采用PCR方法，以人工合成的cck-33基因為模板，擴增cck-33基因片段。擴增cck-33基因片段的PCR反應(yīng)體系(200μL)組成如下20μL 10×PCR buffer，16μL dNTPs，2μL Taq酶，1.5μL引物P1，1.5μL引物P2，0.5μL人工合成的cck-33基因模板，最后加水至總體積達(dá)到200μL。PCR溫度循環(huán)程序如下循環(huán)194℃ 3min；循環(huán)2～3194℃ 40sec，56℃ 40sec，72℃ 60sec；循環(huán)3272℃ 10min。擴增產(chǎn)物在4℃保存。用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測PCR產(chǎn)物，觀察到特異性條帶。
用SacI和BamHI在37℃分別消化cck-33基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pRSETA，接著在T4連接酶的作用之下，連接消化的cck-33基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pRSETA。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得插入了cck-33基因的轉(zhuǎn)化子。然后用特異性引物P1/P2對含有cck-33基因的轉(zhuǎn)化子進行PCR篩選。檢測cck-33基因片段的PCR反應(yīng)體系(20μL)組成如下2μL 10×buffer，1.6μL dNTPs，0.2μL Taq酶，0.5μL引物P1，0.5μL引物P2，1μL待檢菌液，最后加水至總體積20μL。PCR擴增在Mastercycler gra dient PCR儀(Eppendorf公司)上進行，溫度循環(huán)程序如下循環(huán)194℃ 3min；循環(huán)2～3194℃ 40sec，56℃ 40sec，72℃ 60sec；循環(huán)3272℃ 10min。擴增產(chǎn)物在4℃保存。用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測PCR產(chǎn)物，觀察到特異性條帶(圖2)。對PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測定，獲得重組質(zhì)粒命名為pRSETA-1CCK。
實施例2.含有cck-33基因2串聯(lián)體(2cck)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pRSETA-1CCK用兩組酶在37℃進行消化第一組用BamHI和HindIII進行消化，回收較小的片段；第二組用BglII、HindIII和CIAP進行消化，回收較大的片段。接著在T4連接酶的作用之下，連接回收的大片段和小片段。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得含有2cck的重組子。然后用特異性引物P1/P2對含有2cck基因的重組子進行PCR篩選。PCR方法參照“實施例1”。對PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測定，獲得的重組質(zhì)粒命名為pRSETA-2CCK。
實施例3.含有cck-33基因4串聯(lián)體(4cck)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pRSETA-2CCK用兩組酶在37℃進行消化第一組用BamHI和HindIII進行消化，回收較小的片段；第二組用BglII、HinIII和CIAP進行消化，回收較大的片段。接著在T4連接酶的作用之下，連接回收的大片段和小片段。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得含有4cck的重組子。然后用特異性引物P3(5’-GATAAGGATCGATGGGGATCC-3’)/P4(5’-ATGGTACCAGCTGCAGATCT-3’)對含有4cck的重組子進行PCR篩選。PCR方法參照“實施例1”。電泳檢測PCR產(chǎn)物，觀察到特異性條帶(圖2)。對PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測定，獲得的重組質(zhì)粒命名為pRSETA-4CCK。
實施例4.含有cck-33基因6串聯(lián)體(6cck)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pRSETA-2CCK用BamHI和HindIII在37℃進行消化回收較小的片段；將重組質(zhì)粒pRSETA-4CCK用BglII、HindIII和CIAP進行酶切消化，回收較大的片段。接著在T4連接酶的作用之下，連接回收的大片段和小片段。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得含有6cck的重組子。然后用特異性引物P3/P4對含有6cck的重組子進行PCR篩選。PCR方法參照“實施例1”。對PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測定，獲得的重組質(zhì)粒命名為pRSETA-6CCK。
實施例5.含有cck-33基因8串聯(lián)體(8cck)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pRSETA-2CCK用BamHI和HindIII在37℃進行消化，回收較小的片段；將重組質(zhì)粒pRSETA-6CCK用BglII、HindIII和CIAP進行酶切消化，回收較大的片段。接著在T4連接酶的作用之下，連接回收的大片段和小片段。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得含有8cck的重組子。然后用特異性引物P3/P4對含有8cck的重組子進行PCR篩選。PCR方法參照“實施例1”。電泳檢測PCR產(chǎn)物，觀察到特異性條帶(圖2)。對PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mLLA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16-20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測定，獲得的重組質(zhì)粒命名為pRSETA-8CCK。
實施例6.含有cck-33基因4串聯(lián)體(4cck)的整合質(zhì)粒的構(gòu)建采用特異性引物Pup2(5’-ATTGAATTCTGATGACGATAAGGAT-3’)/Pdn2(5’-ATCGAATTCCTACATGGTACCAGCTGC-3’)，用PCR方法從質(zhì)粒pRSETA-4CCK中擴增4cck基因。PCR反應(yīng)體系(100μL)組成如下10×PCR buffer 10μl，dNTPs 8μL，Taq酶1μL，Pup2 1μL，Pdn2 1μL，pRSETA-4CCK 1μl，ddH2O 78μL。PCR擴增在Mastercycler gradient PCR儀(Eppendorf公司)上進行，程序如下循環(huán)194℃ 3min；循環(huán)2～3194℃ 40sec，64℃ 40sec，72℃ 60sec；循環(huán)3272℃ 10min。擴增產(chǎn)物在4℃保存。
用EcoRI在37℃分別消化4CCK基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pR，接著在T4連接酶的作用之下，連接消化的4cck的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pR。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得插入了4cck基因的重組子。然后用1對特異性引物SOC-S(5’-GAATCATATGGCTAGTCTCGCGG-3’)/Pdn2進行PCR篩選。對PCR篩選陽性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16～20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測定，獲得重組整合質(zhì)粒pR-4CCK。
實施例7.表達(dá)CCK-33肽4串聯(lián)體(4CCK)的重組T4噬菌體的獲得用重組整合質(zhì)粒pR-4CCK和缺陷性T4噬菌體T4-Z1(Ren et al，1996)進行同源重組，獲得表達(dá)4CCK的重組T4噬菌體。
先用整合質(zhì)粒pR-4CCK轉(zhuǎn)化大腸桿菌E2，獲得的大腸桿菌為E-4CCK。然后進行以下操作在裝入500μL SC培養(yǎng)液的試管中加入1μL Amp，然后加入10μL E-4CCK，在37℃培養(yǎng)至OD600大約0.5時，加入50μL T4-Z1，繼續(xù)在35℃ 200r/m振搖培養(yǎng)至有細(xì)菌碎片出現(xiàn)，獲得的產(chǎn)物為未鑒定的重組T4噬菌體；
在1個經(jīng)過滅菌的器皿中加入培養(yǎng)超過12小時的大腸桿菌E2600μL，不加溶菌酶，將在4℃儲存的SC頂層培養(yǎng)基放在微波爐中溶解，待瓊脂溫度降到45℃左右的時候取2mL倒入裝有大腸桿菌E2的器皿中，將混合液在旋渦震蕩器上混勻，立即倒在預(yù)先配置的SC底層培養(yǎng)基平皿上。等到瓊脂完全冷凝時，在SC頂層培養(yǎng)基上分別點10μL未鑒定的重組T4噬菌體，待吸收完畢后，放在37℃培養(yǎng)16h以上，如果E-4CCK中的質(zhì)粒與T4-Z1發(fā)生了重組，成功地將4cck基因轉(zhuǎn)入T4噬菌體中，則在不加溶菌酶的平皿上可以生長出噬菌斑；在滅菌的平皿上鋪SC頂層培養(yǎng)基，然后用滅菌牙簽把生長出的噬菌斑在SC頂層培養(yǎng)基上點梅花斑，放在37℃培養(yǎng)12h以上，生長良好的梅花斑用消毒好的刀片將其剝下，浸泡在磷酸緩沖液中6h；采用PCR篩選T4噬菌體轉(zhuǎn)化子。檢測4cck基因的PCR反應(yīng)體系組成如下每25μL反應(yīng)體系中含2.5μL 10×PCR緩沖液，2μL dNTPs，0.3μL Taq酶，0.5μL Pup2，0.5μL Pdn2，1μL梅花斑浸泡液和18.2μL雙蒸水。將反應(yīng)混合物混勻、離心后，在PCR儀上進行溫度循環(huán)。溫度循環(huán)程序如下首先94℃ 3min；然后94℃ 40sec、51℃40sec、72℃ 90sec，共循環(huán)30次；最后72℃ 10min。采用1％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠)電泳對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行檢測。如果觀察到特異性條帶，則說明已獲得了表達(dá)4CCK蛋白的重組T4噬菌體，命名為T4-4CCK。
SC培養(yǎng)液按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone和5g NaCl，加雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L Tris-Cl和10mL 25％檸檬酸鈉·2H2O溶液，搖勻后鋪平板，4℃保存。
SC底層培養(yǎng)基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和12g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L Tris-Cl和10mL25％檸檬酸鈉·2H2O溶液，搖勻后鋪平板，4℃保存。
SC頂層培養(yǎng)基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和7g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，4℃保存。用時加熱溶解，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L Tris-Cl和10mL 25％檸檬酸鈉.2H2O溶液，搖勻后備用。
實施例8.重組T4噬菌體的免疫電鏡觀察分別取野生型T4噬菌體、重組T4噬菌體和1/3體積CCK陽性血清混合，37℃放置1小時后，直接涂片。同時用不加陽性血清的上述噬菌體作對照。磷鎢酸負(fù)染，JEM-1010型透射電鏡觀察。比較與CCK抗血清反應(yīng)前后的噬菌體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)野生型T4噬菌體的形態(tài)不受CCK陽性血清的影響；而重組T4噬菌體的形態(tài)受CCK陽性血清影響明顯。未與CCK陽性血清反應(yīng)的重組T4噬菌體的形態(tài)與野生型T4噬菌體形態(tài)相同，頭部為白色；而與陽性血清作用之后的重組T4噬菌體頭部變黑。
實施例9.重組T4噬菌體的SDS-PAGE檢測大量培養(yǎng)重組噬菌體T4-4CCK，離心濃縮，當(dāng)噬菌體濃度達(dá)到1011個/mL時，進行SDS-PAGE檢測。SDS-PAGE方法如下取重組噬菌體T4-4CCK和T4噬菌體SOC缺失株T4-Z1各100μL，然后加入2×上樣緩沖液100μL，混勻后，樣品在-80℃冰箱和37℃烘箱內(nèi)分別凍融三次。參照汪家政等(2000)編《蛋白質(zhì)手冊》方法制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)。成層膠濃度為5％，分離膠濃度為12％。將待檢樣品煮沸5min，取30μL加入凝膠點樣孔中，在電場作用下進行電泳。電泳緩沖液為Tris-甘氨酸。電壓為80v/cm，待溴酚藍(lán)到達(dá)成層膠底部時電壓升高到160v/cm。待溴酚藍(lán)接近凝膠底部時，停止電泳，取下凝膠，置于1％考馬斯亮藍(lán)溶液中染色過夜，用脫色液脫色。在約30kD處可見特異性條帶(圖10)。
實施例10.重組噬菌體對肉雞的免疫效果將重組噬菌體T4-4CCK制成油乳劑疫苗進行肉雞免疫實驗，疫苗中T4-CCK的含量為1010個/mL。將360只胡須肉雞飼養(yǎng)至20日齡后隨機分成2組，每組三個重復(fù)，每個重復(fù)60只雞，1組為對照組，2組為重組噬菌體免疫組。20日齡免疫第一次，以后每隔20天免疫一次，共免疫3次。肉雞飼養(yǎng)至90日齡結(jié)束。實驗結(jié)束時，稱重并統(tǒng)計耗料量，計算全期的平均增重、平均采食量和料肉比。結(jié)果表明重組噬菌體免疫組的體增重和采食量明顯高于對照組，料肉比也有所下降。
表1重組噬菌體T4-4CCK免疫對肉雞生長性能的影響

分別在35、55和90天齡時采血，測定血清中CCK抗體。
在96孔酶標(biāo)板上，每孔加上純化的0.2mg/mL大腸桿菌表達(dá)的4CCK融合蛋白100μL，4℃包被過夜。棄去包被液，每孔用200μL清洗緩沖液洗酶標(biāo)板3次，在紗布上拍干清洗緩沖液后，每孔加入5％脫脂奶粉100μL封閉液，37℃封閉2h。棄去封閉液，每孔用200μL清洗緩沖液洗酶標(biāo)板3次，在紗布上拍干清洗緩沖液，每孔加入最適稀釋濃度的一抗100μL，37℃反應(yīng)1h。棄去一抗，每孔用200μL清洗緩沖液洗酶標(biāo)板3次，在紗布上拍干清洗緩沖液后，每孔加入用1∶1000稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體)100μL，37℃反應(yīng)1h。棄去二抗，每孔用200μL清洗緩沖液洗酶標(biāo)板3次，在紗布上拍干清洗緩沖液后，每孔加入顯色緩沖液100μL，當(dāng)達(dá)顯色高峰時(約10～30min)加入1mol/L H2SO4100μL終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取OD450值。用P/N表示抗體水平?？瞻讓φ战M3次檢測的結(jié)果均為P/N＜2，且三次的結(jié)果變化幅度非常小。而免疫組3次檢測P/N均超過2，且后兩次結(jié)果高于第一次(表2)。
表2 重組噬菌體T4-4CCK免疫后雞血清中CCK抗體的ELISA檢測(P/N)

序列表<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>表達(dá)縮膽囊素基因的重組T4噬菌體<140>
<141>
<160>2<210>1<211>99<212>DNA<213>縮膽囊素-33(Choleystokinin-33，CCK-33)<220>
<221>cDNA<222>(1)…(99)<220>
<221>CDS<222>
<400>1ggt tct act ggc cgc ttc tct gtc ctt ggc aac cgt gta cag agc att 48Gly Ser Thr Gly Arg Phe Ser Val Leu Gly Asn Arg Val Gln Ser Ile15 10 15gat ccg acg cac cgt att aat gac cgt gac tac atg ggc tgg atg gat 96Asp Pro Thr His Arg Ile Asn Asp Arg Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp20 25 30ttt 99Phe33<210>2<211>33<212>PRT<213>縮膽囊素-33(Choleystokinin-33，CCK-33)<400>2Gly Ser Thr Gly Arg Phe Ser Val Leu Gly Asn Arg Val Gln Ser Ile1 5 10 15Asp Pro Thr His Arg Ile Asn Asp Arg Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp20 25 30Phe3權(quán)利要求
1.一種重組T4噬菌體，其含有SEQ ID No.1的核苷酸序列或SEQ IDNo.1的串聯(lián)體序列或與SEQ ID No.1有75％以上同源性且具有一個或幾個核苷酸殘基的改變、缺失、添加或插入的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組T4噬菌體，其特征在于含有SEQ IDNo.1的多串聯(lián)體序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組T4噬菌體，其特征在于核苷酸SEQID No.1編碼具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽。
4.一種構(gòu)建重組T4噬菌體的方法，包括步驟1).克隆核苷酸序列SEQID No.1，或根據(jù)BamH I和Bgl II互為同尾酶的特性，獲得SEQ ID No.1的多串聯(lián)體序列；2).將核苷酸序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的多串聯(lián)體序列插入pR質(zhì)粒中構(gòu)建相應(yīng)的重組整合質(zhì)粒；3).將2)中獲得的重組整合質(zhì)粒與缺陷性T4噬菌體T4-Z1進行同源重組，獲得表達(dá)CCK-33肽的重組T4噬菌體。
5.一種提高動物采食量并增重的方法，其包括將包含任一權(quán)利要求1-3中的重組T4噬菌體的疫苗用于所述動物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述動物為豬、牛、兔或雞、鴨、鵝。
7.一種制備抗CCK的特異性抗體的方法，包括將任一權(quán)利要求1-3中的重組T4噬菌體直接免疫或?qū)⑵渑c佐劑配合制成疫苗免疫蛋雞，并收集免疫雞的雞蛋來獲得抗CCK的特異性抗體。
8.任一權(quán)利要求1-3中的重組T4噬菌體作為抗原在檢測動物血清中CCK特異性抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個表達(dá)縮膽囊素基因的重組T4噬菌體，所述重組T4噬菌體具有雞縮膽囊素33肽基因或其多串聯(lián)體的核苷酸序列。本發(fā)明也提供了雞縮膽囊素33肽或其多串聯(lián)體的氨基酸殘基序列，以及利用重組T4噬菌體對動物進行主動免疫的技術(shù)及其應(yīng)用。
文檔編號C12N7/01GK1687407SQ20051001158
公開日2005年10月26日 申請日期2005年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月15日
發(fā)明者曹永長, 覃健萍, 畢英佐, 舒鼎銘, 馬靜云, 謝青梅 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)