專利名稱：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的相思樹高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及相思樹高效再生系統(tǒng)以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的相思樹高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立。
背景技術(shù)：
相思屬(Acacia)是豆科(含羞草亞科)中一個(gè)重要的屬，包括大約1200個(gè)種，盛產(chǎn)于澳大利亞，非洲，印度和美洲[3](Simmons1987；Jones et al.1990)，產(chǎn)于我國(guó)的僅臺(tái)灣相思(A.confusa)一種。大多數(shù)相思可以出產(chǎn)上好的木柴，有一些則是生產(chǎn)紙漿，橡膠，蛋白質(zhì)，鞣質(zhì)，涂料，墨水以及食用香料的優(yōu)良資源。相思樹是一類優(yōu)良的短輪伐山地造林樹種，適應(yīng)性強(qiáng)，速生，適合于熱帶、亞熱帶生長(zhǎng)繁殖，尤為突出的是相思樹的根系與根瘤菌共生，可迅速固氮，改良土壤，在人工造林和荒地開墾上有著巨大的價(jià)值(Palmberg 1981)。相思還可以有效地檢測(cè)土壤腐蝕，并且有助于固定沙丘。
眾所周知的是豆科樹木在其自然環(huán)境中的再生率較低。厚莢相思樹的擴(kuò)大栽培需要優(yōu)良無(wú)性系的克隆繁殖及其高效的體外繁殖技術(shù)，包括微繁和再生技術(shù)。此外，生物技術(shù)諸如遺傳轉(zhuǎn)化、體細(xì)胞克隆選擇、單倍體生產(chǎn)也需要可靠、高效的再生系統(tǒng)。雖然相思樹種再生困難，并且在其體外培養(yǎng)條件下會(huì)出現(xiàn)各種問(wèn)題(Nangia and Singh，1996)，但近年來(lái)，文獻(xiàn)報(bào)道了幾種相思樹的再生，包括兒茶A.catechu(Rout等.1995)，大葉相思A.auriculiformis(Rao和Prasad 1991)，馬占相思A.Mangium(Ahmad 1991；Bhaskar and Subhash 1996；Galiana等.1991[只有一篇]a，b；Xie和Hong 2001a，b)，藤金合歡A.sinuata(Vengadesan等.2000，Vengadesan等.2002)，阿拉伯膠金合歡A.nilotica(Garg等.1996)以及刺球花A.farnesiana(Ortiz等.2000)，但再生率都較低。然而，有關(guān)厚莢相思再生系統(tǒng)的建立卻未見(jiàn)報(bào)道，只是有文獻(xiàn)報(bào)道其芽器官、萌芽條、以及帶有頂芽的嫩莖微繁殖的報(bào)道。
樹木的體外繁殖技術(shù)包括微繁殖，器官發(fā)生，體細(xì)胞無(wú)性系變異，誘變和體細(xì)胞胚胎發(fā)生。微繁殖是在林業(yè)生物技術(shù)中體外繁殖的重要途徑，該技術(shù)可以在節(jié)省時(shí)間和空間的條件下產(chǎn)生幾百萬(wàn)個(gè)相同的個(gè)體。相思樹常規(guī)繁殖方法以種子繁殖為主，由于相思種子具有一定的分化性，其樹形、生長(zhǎng)量、抗性、纖維含量等性狀表現(xiàn)差異大，在一定程度上約束了它們的開發(fā)利用。相思樹種微繁殖的成功使得這些問(wèn)題迎刃而解。目前，有多達(dá)20多種相思樹種已經(jīng)使用野生外植體來(lái)進(jìn)行更普遍的微繁殖，如刺葉金合歡(A.senegal)，阿拉伯膠金合歡(A.nilotica)，大葉相思(A.auriculiformis)，藤金合歡(A.sinuata)和馬占相思(A.mangium)，厚莢相思(A.crassicarpa)，卷莢相思(A.cincinuata)，雜交相思莞屏一號(hào)(A.mangium×A.auriculiformis)等。
植物的離體器官發(fā)生是指離體的組織或細(xì)胞在組織培養(yǎng)的條件下形成不定芽、根和花芽等器官的過(guò)程。離體器官發(fā)生是植物再生完整植株的最主要的方式之一。它不僅在大量無(wú)性繁殖植物上具有重要的應(yīng)用價(jià)值，而且是利用生物技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行遺傳改良的前提和基礎(chǔ)。在一些生物技術(shù)中如細(xì)胞融合培養(yǎng)體細(xì)胞雜種、利用花粉和胚乳獲得單倍體或多倍體植株和培育轉(zhuǎn)基因植物等等都需要進(jìn)行離體器官發(fā)生和植株再生。器官發(fā)生一般受外源植物激素水平的誘導(dǎo)，并且直接從外植體組織或者通過(guò)愈傷組織發(fā)生。在大葉相思和柯阿金合歡中，從大田和無(wú)菌生長(zhǎng)的幼苗上取下的莖尖外植體經(jīng)過(guò)愈傷組織階段可以產(chǎn)生不定芽。在臺(tái)灣相思的組織培養(yǎng)中，子葉被認(rèn)為是最佳的外植體。也有人嘗試過(guò)在刺葉金合歡中，從高度分化的組織，比如形成層和韌皮部，誘導(dǎo)出愈傷組織?？鲜舷嗨?A.cuninghamia)的莖尖、嫩莖段和葉片也可成功誘導(dǎo)出再生芽[62]。其它的外植體還包括阿拉伯膠金合歡，藤金合歡和旋扭相思的下胚軸，兒茶和藤金合歡的成熟子葉，馬占相思的子葉，子葉節(jié)，胚軸，小葉，葉柄，莖以及幼莖的薄細(xì)胞層。在誘導(dǎo)器官發(fā)生的過(guò)程中，大多使用植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的組合。植物生長(zhǎng)素選擇的順序是2，4-D＞NAA＞IAA＞IBA。在柯阿金合歡，大葉相思，藤金合歡和馬占相思，臺(tái)灣相思，肯氏相思的不定芽誘導(dǎo)中，6-BA是最常用的細(xì)胞分裂素。在相思樹的器官發(fā)生過(guò)程中，一般認(rèn)為BA可增加愈傷組織的緊密程度。也有研究報(bào)道指出，單獨(dú)使用TDZ可在馬占相思的愈傷組織中成功誘導(dǎo)不定芽。還有文獻(xiàn)報(bào)道，KT也可用于大葉相思，兒茶和藤金合歡的器官發(fā)生。
在多數(shù)相思樹種中，多種培養(yǎng)基類型都可以引起再生。其中MS培養(yǎng)基最為常用，1/2MS成功也可用于金合歡Acacia sinuate的再生。用MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基對(duì)柯阿金合歡進(jìn)行再生試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基可誘導(dǎo)更多的不定芽。在兒茶相思中，WPM和1/2WPM也被成功的用來(lái)誘導(dǎo)再生芽。最近，Douglas(2000)和McNamara發(fā)現(xiàn)馬占相思可以在DKW培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的再生。對(duì)于柯阿金合歡，Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基既可用于愈傷組織誘導(dǎo)，又可用于不定芽的再生。
體細(xì)胞胚胎發(fā)生來(lái)源于一個(gè)單細(xì)胞，與那些諸如器官發(fā)生和微繁殖等多細(xì)胞的繁殖是不同的。它是細(xì)胞全能性的最有力的證明，在很多木本樹木中已經(jīng)報(bào)道了體細(xì)胞胚胎發(fā)生，而木本豆科植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生較為困難。在許多相思樹種中，不成熟的和幼齡的外植體常被用來(lái)誘導(dǎo)胚性愈傷。不成熟子葉，不成熟胚乳和不成熟合子胚被分別用來(lái)在兒茶，阿拉伯膠金合歡，刺球花，馬占相思，大葉相思中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生和獲得幼苗。而藤金合歡用葉來(lái)進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)，結(jié)果所有的愈傷組織都生成胚胎并且發(fā)育成植株。用子葉作為外植體在刺葉金合歡中誘導(dǎo)胚胎發(fā)生也獲得了成功。在相思樹的體細(xì)胞胚胎發(fā)生中，最先報(bào)道的是使用NAA在兒茶中由不成熟子葉通過(guò)懸浮培養(yǎng)獲得的。使用NAA和KT生成愈傷組織和體細(xì)胞胚(球形胚，心形的，魚雷形的)。只有在不添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基中，胚才能萌發(fā)。Das(1996)等使用濃度較低的NAA和KT誘導(dǎo)了兒茶的體細(xì)胞胚，只有在NAA存在的條件下胚胎才能發(fā)生。
在大葉相思獲得胚性愈傷組織的過(guò)程中，激素的作用特別是2，4-D的作用最為關(guān)鍵。阿拉伯膠金合歡的不成熟胚乳在2mg/L的2，4-D和5mg/L的BA誘導(dǎo)下產(chǎn)生了胚性愈傷。暗培養(yǎng)增加了胚胎生成的頻率。在由刺球花和藤金合歡的不成熟合子胚誘導(dǎo)胚性愈傷中，2，4-D也起重要作用，在MS基本培養(yǎng)基中可以得到不同的胚胎階段。最近Xie和Hong(2001.b)使用TDZ和IAA誘導(dǎo)出了胚性愈傷。使用GA3可以獲得魚雷形胚和子葉階段的胚。Shahana和Gupta(2000)使用ZT(2mg/L)由刺葉金合歡的子葉直接獲得胚胎發(fā)生。添加其它的植物生長(zhǎng)素，如2，4-D和NAA，只能生成少量的胚，特別是NAA還增加了不正常胚出現(xiàn)的幾率。盡管成熟期可以進(jìn)行生根，但胚芽葉不發(fā)育。除刺葉金合歡要在KB培養(yǎng)基中由形成層組織進(jìn)行增殖，大葉相思的胚性細(xì)胞較適合于在B5培養(yǎng)基上獲得。在大多數(shù)愈傷組織誘導(dǎo)和再生過(guò)程中，WPM和MS培養(yǎng)基都可以使用。體細(xì)胞胚的發(fā)生使用WPM，MS和一般的MS培養(yǎng)基。而萌發(fā)和成熟，在馬占相思，刺葉金合歡和刺球花中可以使用MS基本培養(yǎng)基或者1/2MS培養(yǎng)基。
林木傳統(tǒng)育種選育時(shí)間長(zhǎng)、效率低?；蚬こ虨榱帜居N開辟了一條誘人的新途徑，不僅可以大大地縮短育種周期，又可在基因水平上改造林木抗性遺傳物質(zhì)，更具科學(xué)性和精確性，提高了育種的目的性和可操作性。此外，還擴(kuò)大了育種的范圍，打破物種之間的生殖障礙，實(shí)現(xiàn)基因的共同性。隨著各種轉(zhuǎn)化體系的建立和逐步完善，以及林木基因工程基礎(chǔ)研究的深入，今后對(duì)林木進(jìn)行有目的、有針對(duì)性的遺傳改良會(huì)更加容易。轉(zhuǎn)基因林木的研究始于20世紀(jì)80年代，首例轉(zhuǎn)基因林木于1986年在楊樹上獲得成功。十幾年來(lái)，轉(zhuǎn)基因這一生物技術(shù)在提高林木抗性、改良品質(zhì)等方面的應(yīng)用發(fā)展十分迅速，技術(shù)上日趨完善。
目前，轉(zhuǎn)基因相思樹的研究還處于起步階段，國(guó)內(nèi)外有關(guān)轉(zhuǎn)基因相思樹的研究?jī)H限于幾篇零星的報(bào)道。獲得完整的轉(zhuǎn)基因植株需要3個(gè)要素建立高效的再生系統(tǒng)；構(gòu)建攜帶外源基因的合適載體系統(tǒng)；建立高效的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。其中高效再生系統(tǒng)的建立是成功獲得轉(zhuǎn)基因相思樹的重要前提。目前，已報(bào)道的相思樹的再生率都比較低，無(wú)論采用何種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，提高其轉(zhuǎn)化率顯得尤為關(guān)鍵。就轉(zhuǎn)化技術(shù)而言，基因槍法轉(zhuǎn)化具有不受轉(zhuǎn)化受體的限制、操作簡(jiǎn)單、可調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)，但難以控制轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)，篩選的工作量較大。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在相思樹轉(zhuǎn)基因方面已有成功的報(bào)道。Xie D Y，Hong Y(2002)用含質(zhì)粒pBI121的根癌農(nóng)桿菌LBA4404感染馬占相思體體外培養(yǎng)的莖段，獲得了轉(zhuǎn)NPTII基因的再生植株。
由于現(xiàn)有技術(shù)中相思樹的再生系統(tǒng)再生率比較低，轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化效率也比較低，因此，有必要開發(fā)一種相思樹的高效再生系統(tǒng)，以及利用該系統(tǒng)進(jìn)行的由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供相思樹的高效再生系統(tǒng)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供農(nóng)桿菌介導(dǎo)的相思樹高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用所述高效再生系統(tǒng)的相思樹的體外繁殖方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)中相思樹的再生系統(tǒng)再生率比較低；轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化效率也比較低；體外繁殖方法比較繁瑣復(fù)雜，效率不高。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)施1.通過(guò)合適的培養(yǎng)基，優(yōu)選MS培養(yǎng)基，進(jìn)行相思樹種子的培養(yǎng)，選擇相思樹子葉、下胚軸、節(jié)間、成熟的葉狀柄等作為外植體，在不同激素組合下誘導(dǎo)不定芽的再生，經(jīng)過(guò)不定芽的伸長(zhǎng)、生根以及生根苗的移栽試驗(yàn)確定相思樹的高效再生系統(tǒng)。
2.在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)含有目的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，通過(guò)常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)化上述高效再生系統(tǒng)，即接種于子葉、下胚軸以及離體培養(yǎng)或溫室生長(zhǎng)的相思樹幼嫩葉片(也稱葉狀柄)等外植體，經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)、誘導(dǎo)生根以及移栽試驗(yàn)確定農(nóng)桿菌介導(dǎo)的相思樹高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。
本發(fā)明的技術(shù)效果如下1.建立了相思樹的高效再生系統(tǒng)，該系統(tǒng)組成比較簡(jiǎn)單，建立所需時(shí)間較短，再生效率高，易重復(fù)。利用該系統(tǒng)，10天即誘導(dǎo)出愈傷組織(節(jié)結(jié))，40天誘導(dǎo)出不定芽，瘤狀愈傷組織(節(jié)結(jié))分化出不定芽的比例高達(dá)56.25％，不定芽經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，生根率達(dá)到100％，生根的小植株經(jīng)過(guò)馴化，可成功移栽于土壤中，再生植株的生長(zhǎng)表型正常。
2.利用上述高效再生系統(tǒng)，建立了土壤根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，通過(guò)該方法可成功地將外源基因?qū)氲街参镏校撓到y(tǒng)轉(zhuǎn)基因效率高，并且可進(jìn)行較大規(guī)模的轉(zhuǎn)化。
四

圖1為瘤狀愈傷圖。
圖2為瘤狀愈傷表面發(fā)生的大量不定芽圖。
圖3為不定芽的伸長(zhǎng)圖。
圖4為不定芽上產(chǎn)生的側(cè)根圖。
圖5為不定芽經(jīng)煉苗和移栽得到的植株圖。
圖6為經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的抗性瘤狀愈傷圖。
圖7為抗性瘤狀愈傷表面發(fā)生的大量不定芽圖。
圖8、9為經(jīng)含0.1mg/l TDZ的篩選培養(yǎng)基誘導(dǎo)的不定芽的伸長(zhǎng)圖。
圖10為經(jīng)轉(zhuǎn)化的不定芽的生根圖。
圖11為外源基因4CLI轉(zhuǎn)化的PCR檢測(cè)結(jié)果。泳道兩邊為2000bp標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker；CK-和CK+為陰性和陽(yáng)性對(duì)照；1-10為經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株中4CLI基因PCR擴(kuò)增的結(jié)果。
五具體實(shí)施例方式
以下具體實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作出解釋和說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的限制。
下列實(shí)施例中所用材料均為市售可得。
相關(guān)術(shù)語(yǔ)的縮寫如下BA 6-芐基腺嘌呤·CM椰乳·GA3赤霉酸·IBA 3-吲哚丁酸·KT激動(dòng)素·MS Murashige and Skoog(1962)medium·NAAα-萘乙酸·IAA吲哚-3-乙酸·TDZ1-phenyl-3-(1，2，3-thiadiazol-5-yl)Ureathidiazuron)·2，4-D 2，4-二氯苯氧乙酸實(shí)施例1厚莢相思樹的高效再生系統(tǒng)1.1植物材料與消毒處理成熟的種子于100℃水中處理1分鐘，再于蒸餾水中浸泡16小時(shí)，然后用70％的乙醇表面消毒5分鐘，再于0.1％的HgCl2中(加幾滴土溫20)消毒1分鐘，用無(wú)菌水沖洗3-4次，消毒的種子再于1/2MS培養(yǎng)基上(含0.4％的瓊脂)萌發(fā)。
1.2培養(yǎng)基的制備與培養(yǎng)條件培養(yǎng)基在121℃滅菌15分鐘。滅菌后用1N的NaOH(無(wú)菌的)溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH至5.8。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑用0.2μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾滅菌。除非特別指出，培養(yǎng)室溫度為28℃，于光照條件下(光照強(qiáng)度為26μmols-1m-2)培養(yǎng)，每天光照16h。
1.3瘤狀愈傷和不定芽的誘導(dǎo)種子經(jīng)表面消毒后接種于1/2強(qiáng)度、無(wú)糖MS培養(yǎng)基(含0.4％瓊脂)上，并于10-12天內(nèi)發(fā)芽。從60天齡的種子苗上取假葉，切成0.3×0.5-cm大小作為外植體。外植體在含有不同激素組合的培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天----TDZ和NAA不同濃度組合；KT和2，4-D不同濃度組合；KT和NAA不同濃度組合；BA和IAA不同濃度組合；以及BA和2，4-D不同濃度組合。每個(gè)處理包括100個(gè)外植體，重復(fù)兩次。所有培養(yǎng)基均加入5％(v/v)的椰乳，30g/l的蔗糖，以及0.4％(w/v)的瓊脂。統(tǒng)計(jì)綠色或紫綠色瘤狀愈傷的誘導(dǎo)率。
培養(yǎng)10天后，愈傷組織繼代，繼續(xù)在組成相同的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽。每個(gè)處理包括100個(gè)愈傷組織，重復(fù)兩次。每10天繼代一次。原始數(shù)據(jù)于培養(yǎng)40天后記錄，此時(shí)已有肉眼可見(jiàn)的不定芽發(fā)生。
1.4不定芽的伸長(zhǎng)和生根從含有0.5mg/l TDZ和0.5mg/l NAA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的帶有羽狀復(fù)葉的不定芽叢被用來(lái)進(jìn)行下一步試驗(yàn)。不定芽接種于含有GA3(0，0.5，1mg/l)和TDZ(0，0.1mg/l)的基本MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行兩個(gè)月的培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基均加入5％(v/v)的椰乳，30g/l的蔗糖，以及0.4％(w/v)的瓊脂。切下2-3cm長(zhǎng)的芽接種于含0.5mg/l IBA的1/2 MS培養(yǎng)基，進(jìn)行生根。
1.5生根苗的移栽生根培養(yǎng)經(jīng)煉苗后，將帶有至少15條側(cè)根的無(wú)菌苗取出。在自來(lái)水下溫和沖洗，洗凈生根苗基部的培養(yǎng)基。移栽到滅菌的基質(zhì)中，基質(zhì)含沙、蛭石、園土0.5∶0.5∶1(v/v)。保持80％的相對(duì)濕度，光照強(qiáng)度為26μmols-1m-2，每天光照16h。每三天澆一次水。
1.6結(jié)果1.6.1瘤狀愈傷誘導(dǎo)瘤狀愈傷最初發(fā)生于假葉片斷的切口處。所有種類的培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出瘤狀愈傷(見(jiàn)圖1)，且不同種類培養(yǎng)基間的效果差異不明顯。
1.6.2不定芽的誘導(dǎo)TDZ與NAA的組合，BA與IAA的組合成功誘導(dǎo)了不定芽的發(fā)生。經(jīng)過(guò)40天的培養(yǎng)，瘤狀愈傷的表面發(fā)生大量的不定芽(見(jiàn)圖2)。
TDZ與NAA的不同組合誘導(dǎo)不定芽再生率從1.6％到56.25％不等。0.5mg/l TDZ與0.5mg/l NAA的組合再生率達(dá)56.25％。而3mg/l BA與0.6mg/l IAA組合的再生率低于5％。其他激素組合只產(chǎn)生了次生瘤狀愈傷。
1.6.3不定芽的伸長(zhǎng)與生根含0.1mg/l TDZ的培養(yǎng)基有效誘導(dǎo)了不定芽的伸長(zhǎng)(見(jiàn)圖3)。伸長(zhǎng)后被轉(zhuǎn)到含0.5mg/l IBA的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根。幾乎所有的不定芽都在一個(gè)月內(nèi)產(chǎn)生了10條側(cè)根(見(jiàn)圖4)。煉苗和移栽也獲得了成功(見(jiàn)圖5)。
可見(jiàn)，建立了一個(gè)較簡(jiǎn)單高效的厚莢相思(A.crassicarpa.)通過(guò)器官發(fā)生的再生體系，以成熟厚莢相思假葉通過(guò)器官發(fā)生的方式成功地進(jìn)行了再生。
實(shí)施例2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的厚莢相思樹高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)2.1農(nóng)桿菌的培養(yǎng)(1)在含有合適的抗生素(即Kan 100mg/L，Str100mg/L)的YEB固體培養(yǎng)基上，把含有插入目的植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciensLBA4404菌株劃線涂板，于28℃培養(yǎng)48小時(shí)，該目的植物表達(dá)載體中含有楊樹的4CLI基因；(2)挑選步驟1中的活化的單菌落，接種于2ml的YEB(pH7.0)液體培養(yǎng)基中，該液體培養(yǎng)基中含有與步驟1中相同組成和濃度的抗生素(即Kan100mg/L，Str 100mg/L)，并于搖床上于28℃、220rpm條件下震蕩過(guò)夜培養(yǎng)；(3)取出震蕩過(guò)夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌，稀釋接種于20-50ml的YEB(pH7.0)液體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基的用量取決于待轉(zhuǎn)化植株外植體的數(shù)量)，該液體培養(yǎng)基中須添加與步驟1中相同組成和濃度的抗生素(即Kan100mg/L，Str 100mg/L)，并加入少量的乙酰丁香酮(AS)，于搖床上在28℃、220rpm條件下震蕩過(guò)夜培養(yǎng)；(4)低溫(4℃)離心(10000rpm，5分鐘)上述過(guò)夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌，棄上清，收集沉淀，沉淀用1/2的MS液體培養(yǎng)基稀釋備用。
2.2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化相思樹子葉、下胚軸以及離體培養(yǎng)或溫室生長(zhǎng)的相思樹幼嫩葉片(也稱葉狀柄)都可作為接種用的外植體，外植體的制備和接種方法按下列程序進(jìn)行(改良的葉盤法)(1)子葉和下胚軸轉(zhuǎn)化從萌發(fā)7-10天的無(wú)菌苗上切下幼嫩子葉及下胚軸，每個(gè)子葉切成兩半、并切去葉尖，下胚軸切成0.5cm長(zhǎng)，然后立即置于盛有步驟4制備的農(nóng)桿菌稀釋液中，浸染時(shí)間為10-15分鐘，并用手輕輕搖動(dòng)；(2)成熟葉片(葉狀柄)轉(zhuǎn)化成熟葉片可取自萌發(fā)60天左右的無(wú)菌苗；也可取自溫室培養(yǎng)的植物，對(duì)用作轉(zhuǎn)化的溫室培養(yǎng)植物，每周應(yīng)噴灑適量濃度的殺菌劑，轉(zhuǎn)化前再用20％(v/v)的市售的消毒液或5％的次氯酸鈉表面消毒(并添加幾滴土溫20)10分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次。在某些情況下，也可使用0.05-0.1的氯化汞進(jìn)行消毒，但對(duì)葉狀柄的生活力及轉(zhuǎn)化效率都有影響。然后再沿著葉脈把無(wú)菌的葉狀柄切成5-7平方毫米的方塊(并與葉脈垂直用無(wú)菌刀片輕輕制造一些傷口)，把新制備好的葉盤迅速侵入步驟4制備的農(nóng)桿菌稀釋液中，浸染時(shí)間為10-15分鐘，并用手輕輕搖動(dòng)；(3)迅速用鑷子取出按上述方法轉(zhuǎn)化的外植體，置于無(wú)菌濾紙上以吸收殘留在外植體上的農(nóng)桿菌液，然后再把外植體倒置于不含任何抗生素的再生培養(yǎng)基上黑暗條件下共培養(yǎng)2-3天(25℃)，使農(nóng)桿菌成功浸染侵染葉片；2.3轉(zhuǎn)化外植體的培養(yǎng)(1)取出暗培養(yǎng)后的外植體，用無(wú)菌水沖洗外植體3次，除去吸附在外植體表面的農(nóng)桿菌。如果外植體表面生長(zhǎng)有過(guò)多的農(nóng)桿菌，可在無(wú)菌水中加入500mg/L的羧芐青霉素，沖洗3次，以殺死除去吸附在外植體表面過(guò)多的農(nóng)桿菌。然后再把外植體置于含有抗菌素的選擇性培養(yǎng)基上于28℃下光照培養(yǎng)、以選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，抗性培養(yǎng)基的組成為再生培養(yǎng)基加上20mg/L的卡那霉素(Kan)和500mg/L的羧芐青霉素(Cb)；(2)繼代培養(yǎng)第一次繼代培養(yǎng)的時(shí)間為步驟6后的第7-10天進(jìn)行，把經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的外植體轉(zhuǎn)移到新配制的選擇性培養(yǎng)基上繼續(xù)選擇培養(yǎng)，選擇性培養(yǎng)基的配方組成如步驟6。以后的繼代培養(yǎng)以每?jī)芍転殚g隔進(jìn)行，培養(yǎng)條件如步驟6，選擇性培養(yǎng)基的配方組成如步驟6，直至愈傷組織形成不定芽為止；(3)把在選擇性培養(yǎng)基上形成不定芽的愈傷組織轉(zhuǎn)移至選擇性伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)使轉(zhuǎn)化的愈傷組織上的小芽伸長(zhǎng)，并殺死假陽(yáng)性植株，選擇性伸長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成為MS+3％蔗糖+5％椰乳+0.1mg/lTDZ+300mg/LCar+20mg/Lkan，該過(guò)程將繼續(xù)2個(gè)月作用，繼代培養(yǎng)周期和培養(yǎng)條件同步驟6；(4)把長(zhǎng)度2cm左右的抗性芽切下，置于選擇性生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，選擇性生根培養(yǎng)基的組成為1/2MS+3％蔗糖+5％椰乳+0.5mg/L IBA+300mg/LCar+20mg/LKan，繼代培養(yǎng)周期和培養(yǎng)條件同步驟6，2-3周后有根出現(xiàn)，但該過(guò)程一般需要一個(gè)多月。
2.4驗(yàn)證(1)從已生根的轉(zhuǎn)化植株上取1g作用的葉片，用微量法提取植物基因組DNA，通過(guò)PCR方法驗(yàn)證外源DNA的整合情況；(2)把經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證的轉(zhuǎn)基因相思樹移植到土壤中，于室內(nèi)練苗10天左右后，再置于溫室生長(zhǎng)，并從溫室生長(zhǎng)的植株上取幼嫩葉片進(jìn)一步通過(guò)PCR，Southern，Northern檢測(cè)。
2.5結(jié)果2.5.1轉(zhuǎn)化后抗性瘤狀愈傷瘤狀愈傷最初發(fā)生于假葉片斷的切口處。(見(jiàn)圖6)2.5.2轉(zhuǎn)化植株抗性不定芽的獲得經(jīng)過(guò)40天的培養(yǎng)，瘤狀愈傷的表面發(fā)生大量的不定芽。(見(jiàn)圖7)2.5.3轉(zhuǎn)化植株伸長(zhǎng)含0.1mg/L TDZ的篩選培養(yǎng)基有效誘導(dǎo)了不定芽的伸長(zhǎng)，同時(shí)殺死了假陽(yáng)性植株。(見(jiàn)圖8，9)2.5.4轉(zhuǎn)化植株生根在1/2MS+3％蔗糖+5％椰乳+0.5mg/L IBA+300mg/L Car+20mg/L Km培養(yǎng)基上成功生根。(見(jiàn)圖10)2.5.5轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果取10株苗PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化的4CLI基因，結(jié)果證明4CLI基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入相思樹植株，成功構(gòu)建了相思樹轉(zhuǎn)基因植株。(見(jiàn)圖11)利用所述高效再生系統(tǒng)的相思樹的體外繁殖方法可如實(shí)施例1同樣進(jìn)行。
參考文獻(xiàn)Simmons M H.The genus Acacia，inM.H.Simmons(Ed.)，Acacias of Australia，vol.1，Nelson，South Melbourne，19877-10.
Jones T C，Batchelor CA，Harris P J C，In vitro culture and propagation of Acacia species(A.bivenosa，A.holosericea，A.salicina，A.saligna and A.sclerosperma)，Intl.Tree Crops J.1990(6)183-192.
Palmberg C，A vital fuel wood gene pool is in danger，Unasylra 1981，13322-30.
Nangia S，Singh R，Micropropagation of Acacia tortilis hayne(Umbrella thorn)throughcotyledonary node culture，Indian J.Exp.Physiol，1996，1(2)77-79.
Rout G R，Samantaray S，Das P，Somatic embryogenesis and plant regeneration from callusculture of Acacia catechu*/a multipurpose leguminous tree，Plant Cell Tiss.Org.Cult.1995(42)283-285.
Rao G V R，Prasad M N V，Plant regeneration from the hypocotyl callus of Acaciaauriculiformis-multipurpose tree legume，J.Plant Physiol.1991，137625-627.
Bhaskar P，Subhash K，Micropropagation of Acacia mangium Willd.Through nodal bud culture，Indian J.Exp.Biol.1996，34590-591.
Galiana A，Tibok A，Duhoux E，In vitro propagation of the nitrogen fixing tree legume Acaciamangium Willd，Plant Soil 1991，135151-159Xie D，Hong Y，In vitro regeneration of Acacia mangium via organogenesis，Plant Cell Tiss.Org.Cult.，2001.a66167-173.
Xie D Y，Hong Y，Regeneration of Acacia mangium through somatic embryogenesis，Plant CellRep.，2001.b，2034-40.
Vengadesan G，Ganapathi A，Anand R P，Anbazhagan V R，In vitro organogenesis and plantformation in Acacia sinuata(Lour.)Merr，Plant Cell Tiss.Org.Cult.，2000，623-28.
Vengadesan G，Ganapathi A，Anand R P，Anbazhagan V.R，In vitro propagation of Acaciasinuata(Lour.)Merr.Via cotyledonary nodes，Agroforestry Systems，2002，559-15Garg L，Bhandari N W，Rani V，Bhojwani S S，Somatic embryogenesis and regeneration oftriploid plants in endosperm cultures of Acacia nilotica，Plant Cell Rep.，1996，15，855-858.
Ortiz B O C，Reyes M E P，Balch E P M，Somatic embryogenesis and plant regeneration inAcacia farnesiana and Acacia schaffneri，In vitro Cell Dev.Biol.Plant，2000，36268-272.
Douglas G C，McNamara J，Shoot regeneration from seedling explants of Acacia mangiumWilld，In vitro Cell Dev.Biol.2000，36(5)412-415.
Das P，Samantaray S，Rout G R，In vitro propagation of Acacia catechu，a xerophilous tree，Plant Tiss.Cult.1996，6(2)117-126.
Shahana S，Gupta S C，Somatic embryogenesis in a leguminous tree Acacia senegal(L.)Willd，inS.M.Jain，P.K.Gupta，R.J.
Marton(Eds.)，Somatic embryogenesis in woody plants，2000，6539-552.Xie D Y，Hong Y.Agrobacterium-mediated genetic transformation of Acacia mangium.PlantCell Rep，2002，20917-92權(quán)利要求
1.一種相思樹的高效再生系統(tǒng)，包括合適的相思樹外植體，包括相思樹子葉、下胚軸、節(jié)間、成熟的葉狀柄；誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其為添加不同激素組合的基本培養(yǎng)基，激素組合包括TDZ和NAA、KT和2，4-D、KT和NAA、BA和IAA、BA和2，4-D，組合中每種激素濃度均小于3mg/l，總濃度大于0.01mg/l。
2.如權(quán)利要求1的高效再生系統(tǒng)，其中外植體為60天的葉狀柄。
3.如權(quán)利要求1的高效再生系統(tǒng)，其中基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求1的高效再生系統(tǒng)，其中激素組合為TDZ和NAA或者3mg/l BA和0.6mg/lIAA。
5.如權(quán)利要求1的高效再生系統(tǒng)，其中激素組合TDZ和NAA的濃度分別為0.01-1.5mg/l和0-1mg/l。
6.如權(quán)利要求5的高效再生系統(tǒng)，其中激素組合TDZ和NAA的濃度均為0.5mg/l。
7.如權(quán)利要求1的高效再生系統(tǒng)，其中還包括不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，前者為含有0.1mg/l TDZ的基本培養(yǎng)基，后者為含有0.5mg/l IBA的基本培養(yǎng)基。
8.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的相思樹高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，包括含有外源目的基因的農(nóng)桿菌以及上述權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的高效再生系統(tǒng)。
9.一種相思樹的體外繁殖方法，包括選取合適的相思樹外植體，包括相思樹子葉、下胚軸、節(jié)間、成熟的葉狀柄；在含有0.5mg/l TDZ和0.5mg/l NAA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)10天，得到愈傷組織，在含有0.01-1.5mg/l TDZ和0-1mg/l NAA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)40天，得到不定芽；然后把不定芽轉(zhuǎn)移到含有0.1mg/l TDZ的MS含培養(yǎng)2個(gè)月；經(jīng)過(guò)伸長(zhǎng)的芽在含0.5mg/l IBA的1/2強(qiáng)度MS上培養(yǎng)1個(gè)月，生根，移栽得到再生植株。
全文摘要
本發(fā)明成功建立了厚莢相思樹(Acacia crassicarpa)通過(guò)器官發(fā)生的高效再生體系。該系統(tǒng)可利用厚莢相思樹子葉、下胚軸、節(jié)間、成熟的葉狀柄等各種外植體作為誘導(dǎo)再生材料在體外成功再生出完整的植株。通過(guò)在改良的MS培養(yǎng)基上添加多種不同組合濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在最佳條件下，成熟的葉狀柄可于10天即誘導(dǎo)出愈傷組織，40天誘導(dǎo)出不定芽，瘤狀愈傷組織分化出不定芽的比例高達(dá)56.25％。不定芽經(jīng)過(guò)伸長(zhǎng)和生根，生根的小植株經(jīng)過(guò)馴化，可成功移栽于土壤中，再生植株的生長(zhǎng)表型正常。該再生技術(shù)具有簡(jiǎn)單、高效、易重復(fù)特點(diǎn)。利用本發(fā)明提供的高效再生系統(tǒng)，本發(fā)明還建立了土壤根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，通過(guò)該方法可成功地將外源基因?qū)氲街参镏小?br> 文檔編號(hào)C12N15/82GK1724654SQ20051001194
公開日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2005年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日
發(fā)明者謝響明 申請(qǐng)人:謝響明