專利名稱：一種利用纖維堆囊菌高效生產(chǎn)埃博霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體的說涉及一種埃博霉素的高效生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
粘細(xì)菌(Myxobacteria)是最高等的革蘭氏陰性原核生物類群，具有復(fù)雜的多細(xì)胞行為，在細(xì)胞分化、發(fā)育和生物進(jìn)化研究中占有重要地位。粘細(xì)菌可產(chǎn)生異常豐富的次級代謝產(chǎn)物，而且產(chǎn)物生物活性作用的多樣性可以與著名的鏈霉菌類群相比擬，在微生物新藥的開發(fā)研究中是極好的菌種資源。
纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)屬于粘細(xì)菌的溶纖維素類群，它產(chǎn)生的大環(huán)類酯類化合物埃博霉素(epothilone)具有促微管聚合的活性，是目前引起醫(yī)藥界廣泛關(guān)注的抗癌物質(zhì)。Epothilone能與真核細(xì)胞中的微管骨架結(jié)合，導(dǎo)致染色體分離受阻，細(xì)胞核不能分裂，作用的有效濃度為10～20ng/ml。
Epothilone最早在纖維堆囊菌Sorangium cellulosum90菌株中發(fā)現(xiàn)。是由纖維素堆囊菌(Sorangium cellulosum)分泌的一類大環(huán)內(nèi)酯類化合物，目前發(fā)現(xiàn)有兩種天然衍生物，分別稱為埃博霉素A(分子式C26H39NO6S)與埃博霉素B(分子式為C27H39NO6S)，分子結(jié)構(gòu)如式(I)所示。它們的外觀如無色的油，在乙酸乙酯中結(jié)晶形成粉末。

埃博霉素(Epothilones)有與紫杉醇(Taxol)相似的作用機(jī)制，對治療癌癥有較好的療效。但Epothilones與紫杉醇相比有如下優(yōu)點(diǎn)。
1.Epothilones的結(jié)構(gòu)比紫杉醇更為簡單，其離體抑制的效果比紫杉醇強(qiáng)2000～5000倍，并且?guī)Ъ谆腂的作用效果比A基本上大2倍。
2.Epothilones有更好的水溶性，且更易通過發(fā)酵來獲得。
3.Epothilones不是P2糖蛋白的底物，對多藥耐藥細(xì)胞有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。因而埃博霉素的抗腫瘤性能不但要比紫杉醇的強(qiáng)得多，而且其抗腫瘤譜可能廣得多。Epothilones有顯著選擇性的抗乳腺腫瘤細(xì)胞與結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的活性。
4.施用紫杉醇會(huì)伴隨一些臨床的副作用(如中性白細(xì)胞減少癥、外周神經(jīng)病變、脫發(fā)與過敏反應(yīng))。
目前已有一些關(guān)于纖維堆囊菌株在發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵合成Epothilones的實(shí)驗(yàn)的報(bào)道，以及關(guān)于影響Epothilones合成的營養(yǎng)控制的研究，但是現(xiàn)有Epothilones的生產(chǎn)方法普遍存在產(chǎn)量不穩(wěn)定以及其產(chǎn)量偏低等問題。
為了達(dá)到Epothilones用于制藥的目的，就必須得到足夠量的含有Epothilones的發(fā)酵液混合物。至今為止，在粘細(xì)菌特別是其Soce90菌株中提取Epothiliones已經(jīng)在文獻(xiàn)中有所報(bào)道。為了能提取到相對高濃度的Epothilones，以前在即將提取的發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)常加入以聚苯乙烯為材料的樹脂，例如AmberliteXAD-1180。然而這種方法的缺點(diǎn)在于，在大規(guī)模的應(yīng)用中會(huì)引發(fā)一系列的問題。發(fā)酵罐的閥門會(huì)被樹脂小球損害；管道可能會(huì)堵塞并且儀器可能會(huì)由于機(jī)械摩擦力而導(dǎo)致更大的磨損。樹脂是多孔滲水物質(zhì)，因此會(huì)有較大的內(nèi)表面積(大約825m2/g)，在高壓滅菌的過程中，內(nèi)部的空氣就無法一起被滅菌。所以在實(shí)際大規(guī)模應(yīng)用中，就不能用添加樹脂的方法。但是，如果不添加樹脂，在發(fā)酵培養(yǎng)基中又難以提取到較高濃度的Epothiliones。
目前為止，從粘細(xì)菌中獲得Epothiliones并應(yīng)用于工業(yè)技術(shù)生產(chǎn)領(lǐng)域而又沒有上述缺點(diǎn)的方法，仍處于尋求階段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有埃博霉素生產(chǎn)方法存在的各種問題，提供一種利用纖維堆囊菌高效生產(chǎn)埃博霉素的方法。
纖維堆囊菌購于German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ，Brauuschweig，Germany)，通過對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行改良，并添加環(huán)式糊精或環(huán)式糊精的衍生物到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使得發(fā)酵培養(yǎng)基更加適合菌體生長，Epothiliones的產(chǎn)量更高。由于環(huán)式糊精分子內(nèi)存在疏水的空穴，而分子外親水，這樣不僅可以吸附產(chǎn)物同時(shí)不影響菌體的生長，還可以減弱產(chǎn)物抑制的現(xiàn)象。此外能將Epothiliones從發(fā)酵液中提取出來。
本發(fā)明利用纖維堆囊菌生產(chǎn)埃博霉素的方法，具體包括如下步驟(1)前培養(yǎng)將已滅菌的培養(yǎng)基G52加入到搖瓶中，然后接入纖維堆囊菌到搖瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為3～4天，培養(yǎng)條件為120～250rpm，29～31℃；所述培養(yǎng)基G52為干酵母粉 2g/LMgSO41g/LCaCl21g/L脫脂奶粉 2g/L馬鈴薯淀粉88/L無水葡萄糖2g/LEDTA-Fe(III)-Na 1ml/L調(diào)pH至7.4，120℃滅菌20分鐘；前培養(yǎng)的目的在于活化菌種，培育菌種。
(2)中間培養(yǎng)將已滅菌的培養(yǎng)基G52加入到發(fā)酵槽中，然后接入前培養(yǎng)物到發(fā)酵槽中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為3～4天，培養(yǎng)條件為29～31℃，200～300rpm，通風(fēng)量為每升液體培養(yǎng)基每分鐘0.5升空氣，120～122℃，pH7.4；中間培養(yǎng)的目的在于使菌種生長進(jìn)入對數(shù)生長期，為接下來的發(fā)酵培養(yǎng)做好準(zhǔn)備。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵罐中加入已滅菌的1B12改良培養(yǎng)基，接著加入已滅菌的環(huán)式糊精或其衍生物，然后將中間培養(yǎng)物接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為6～7天，培養(yǎng)條件為20～35℃，120～250rpm，即可得到含有埃博霉素的發(fā)酵液；環(huán)式糊精及其衍生物的添加是以其水溶液形式添加的，糊精及其衍生物添加的量為1克糊精或其衍生物/每100ml發(fā)酵液。添加的糊精或其衍生物溶液體積為整個(gè)發(fā)酵液體積的10％。發(fā)酵液的體積包括培養(yǎng)基體積、糊精溶液體積和中間培養(yǎng)物體積。
所述1B12改良培養(yǎng)基為馬鈴薯淀粉 20g/L胰蛋白胨 11g/LMnCl41mg/LK2HPO40.06g/LZnCl21mg/LCuSO41mg/LEDTA-Fe(III)-Na8mg/L調(diào)pH至7.8，120℃滅菌20分鐘。
上述步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵的第三天加入添加4mg/L氨基酸和4mg/L生長因子。最佳的氨基酸是丙氨酸，最佳的生長因子是乙酸鉀。
上述步驟(1)所述前培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)條件是180rpm，30℃，搖瓶位移50mm。
上述步驟(2)所述中間培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)條件是30℃，250rpm，通風(fēng)量為每升液體培養(yǎng)基每分鐘0.5升空氣，121℃，pH7.4。
上述步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)條件是25℃，180rpm，pH7.8。
上述生產(chǎn)埃博霉素的方法，還包括埃博霉素的分離純化，其方法為①發(fā)酵液經(jīng)離心、過濾，得到的濾液與樹脂按體積比65∶1，攪拌混合，離心，得到的樹脂先用去離子水洗滌，然后用異丙醇洗滌，得到的洗滌液中加入水，萃取其中的異丙醇，剩下的水相中再用乙酸乙酯萃取，得到的乙酸乙酯萃取物在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮、干燥，即可得粗結(jié)晶。將所得粗結(jié)晶加入異丙醇中，振蕩，過濾，然后在真空干燥器中干燥，得到epothilones B白色晶體；對所得白色晶體進(jìn)一步通過反相色譜柱RP-18柱純化，乙腈作為洗脫液，最后用乙酸乙酯∶甲苯＝2∶3的混合液來結(jié)晶，即可得到epothilone A。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果1.本發(fā)明在發(fā)酵液中添加了環(huán)式糊精，由于環(huán)式糊精分子內(nèi)存在疏水的空穴，而分子外親水，這樣不僅可以吸附產(chǎn)物同時(shí)不影響菌體的生長，還可以減弱產(chǎn)物抑制的現(xiàn)象。
2.本發(fā)明改良了Epothilone的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分，并且對發(fā)酵條件液進(jìn)行了改良，使其更適合Epothilone的產(chǎn)生，提高了產(chǎn)量。
3.本發(fā)明在發(fā)酵完畢進(jìn)行提取時(shí)才加入樹脂XAD-16吸附產(chǎn)物，有效的得到了較高濃度的Epothilone。
具體實(shí)施例方式
一般種子液的接種量為10％(V/V)，發(fā)酵液的接種量為20％(V/V)。需要注意的是，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成是按最終體積來計(jì)算的。比如20L的培養(yǎng)物就包括18L的1B12改良培養(yǎng)基+2L的G52種子液，也就是說20L的發(fā)酵液只含有18L的發(fā)酵培養(yǎng)基。
實(shí)施例1、菌種的活化從-80℃冰箱中取出纖維堆囊菌DSM11999，首先將菌種置于冰水中使之緩慢升溫溶化，取1ml轉(zhuǎn)入10ml的G52培養(yǎng)基中(置50ml搖瓶)培養(yǎng)3天，180rpm，30℃，搖瓶位移25mm。然后取5ml此G52培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入45ml的G52培養(yǎng)基中(置200ml搖瓶)培養(yǎng)3天，180rpm，30℃，搖瓶位移25mm。再取50ml的G52培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入450ml的G52培養(yǎng)基中(置2L搖瓶)培養(yǎng)3天，180rpm，30℃，搖瓶位移50mm。培養(yǎng)基G52為干酵母粉2g/L，MgSO41g/L，CaCl21g/L，脫脂奶粉2g/L，馬鈴薯淀粉8g/L，無水葡萄糖2g/L，EDTA-Fe(III)-Na 1ml/L，調(diào)pH至7.4，120℃滅菌20分鐘；2、維持培養(yǎng)取50ml的上述培養(yǎng)物加入到450ml的G52培養(yǎng)基中(在2升的搖瓶中)培養(yǎng)。
3、搖瓶中前培養(yǎng)1×450ml的G52培養(yǎng)基(置于2升搖瓶中)接入50ml的維持培養(yǎng)物，培養(yǎng)4天，180rpm，30℃，pH7.4，搖瓶位移50mm。目的在于活化菌種，培育菌種。
4、中間培養(yǎng)90升的G52培養(yǎng)基置于150升的發(fā)酵槽中，接入10升的前培養(yǎng)物，培養(yǎng)4天，培養(yǎng)條件為30℃，250rpm，通風(fēng)量為每升液體培養(yǎng)基每分鐘0.5升空氣，121℃，pH7.4。目的在于使菌種達(dá)到對數(shù)生長期，為接下來的發(fā)酵培育做好準(zhǔn)備。
5、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵在750L的發(fā)酵罐中進(jìn)行，加入350升滅菌的1B12改良培養(yǎng)基和50升滅菌的2-羥丙基-β-環(huán)式糊精溶液(含2-羥丙基-β-環(huán)式糊精5000g)，然后接入100升的中間培養(yǎng)物。此培養(yǎng)持續(xù)6天，培養(yǎng)條件為25℃，180rpm，pH7.8。在發(fā)酵的第三天加入4mg/L丙氨酸和4mg/L乙酸鉀。1B12改良培養(yǎng)基為馬鈴薯淀粉20g/L，胰蛋白胨11g/L，MnCl41mg/L，K2HPO40.06/L；ZnCl21mg/L，CuSO41 mg/L，EDTA-Fe(III)-Na 8mg/L，調(diào)pH至7.8，120℃滅菌20分鐘。
6、產(chǎn)物的分離純化①500升的發(fā)酵物經(jīng)離心、過濾，得到的發(fā)酵液與樹脂按體積比65∶1，攪拌2h，產(chǎn)物從環(huán)式糊精中轉(zhuǎn)移到樹脂中，離心，得到的樹脂先用12升的去離子水洗滌解吸附，然后用異丙醇洗滌2次，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到有機(jī)相，每次用30升的異丙醇攪拌30min，得到的洗滌液中加入水，萃取其中的異丙醇，剩下的水相中再用乙酸乙酯萃取3次，得到的乙酸乙酯萃取物在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮、干燥，即可得粗結(jié)晶。
②以上獲得的粗結(jié)晶懸浮于1ml異丙醇中，于25℃振蕩24小時(shí)，過濾之后，在真空干燥器中干燥，得到epothilones B的白色晶體。epothilone B中還含有少量的epothilone A，可以進(jìn)一步通過反相色譜柱RP-18柱來純化，乙腈作為洗脫液。最后，用乙酸乙酯∶甲苯＝2∶3的混合液來結(jié)晶，即可得到epothiloneA。
對比例同樣采用纖維堆囊菌DSM11999，按照實(shí)施例的生產(chǎn)方法生產(chǎn)epothilones。不同之處有三點(diǎn)一、不使用1B12改良培養(yǎng)基，改為使用1B12培養(yǎng)基；二、不添加糊精；三、不添加丙氨酸和乙酸鉀。
對實(shí)施例和對比例的產(chǎn)物進(jìn)行分析每個(gè)搖瓶中添加2％(V/V)XAD-16樹脂，180rpm搖2h。使樹脂充分吸附培養(yǎng)物中的產(chǎn)物。然后用150um的尼龍篩過濾，過濾后的樹脂用少許水洗滌，水是極性溶劑，用水洗滌可以解吸附樹脂中的產(chǎn)物，洗滌液裝入容器。
再用60ml異丙醇(＞99％)洗滌樹脂，濾液裝入密封管中，于室溫下在Rota-Mixer(Labinco BV，Netherlands)上搖3min，然后取2ml液體，離心，取上清液用于HPLC。
HPLC結(jié)果將實(shí)施例所得到的粗晶體溶于1ml異丙醇，濃縮，采用HPLC分析可知epothilones產(chǎn)量為16.2mg/L；將對比例所得到的粗晶體溶于1ml異丙醇，濃縮，采用HPLC分析可知epothilones產(chǎn)量為11mg/L。可見，采用本發(fā)明的生產(chǎn)方法所得到的epothilones產(chǎn)量比采用原有方法的產(chǎn)量提高了47.3％。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)埃博霉素的方法，是利用纖維堆囊菌發(fā)酵生產(chǎn)，其特征是通過改良纖維堆囊菌的發(fā)酵培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)埃博霉素的方法，其特征在于還包括添加環(huán)式糊精到發(fā)酵培養(yǎng)基中。
3.如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)埃博霉素的方法，其特征在于包括如下步驟(1)前培養(yǎng)將已滅菌的培養(yǎng)基G52加入到搖瓶中，然后接入纖維堆囊菌到搖瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為3～4天，培養(yǎng)條件為120～250rpm，29～31℃；所述培養(yǎng)基G52為干酵母粉2g/LMgSO41g/LCaCl21g/L脫脂奶粉2g/L馬鈴薯淀粉 8g/L無水葡萄糖 2g/LEDTA-Fe(III)-Na 1ml/L調(diào)pH至7.4，120℃滅菌20分鐘；(2)中間培養(yǎng)將已滅菌的培養(yǎng)基G52加入到發(fā)酵槽中，然后接入前培養(yǎng)物到發(fā)酵槽中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為3～4天，培養(yǎng)條件為29～31℃，200～300rpm，通風(fēng)量為每升液體培養(yǎng)基每分鐘0.5升空氣，120～122℃，pH7.4；(3)發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵罐中加入已滅菌的1B12改良培養(yǎng)基，接著加入已滅菌的環(huán)式糊精或其衍生物，然后將中間培養(yǎng)物接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為6～7天，培養(yǎng)條件為20～35℃，120～250rpm，即可得到含有埃博霉素的發(fā)酵液；所述1B12改良培養(yǎng)基為馬鈴薯淀粉20g/L胰蛋白胨 11g/LMnCl41mg/LK2HPO40.06g/LZnCl21mg/LCuSO41mg/LEDTA-Fe(III)-Na 8mg/L調(diào)pH至7.8，120℃滅菌20分鐘。
4.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)埃博霉素的方法，其特征在于步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵的第三天加入添加4mg/L氨基酸和4mg/L生長因子。
5.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)埃博霉素的方法，其特征在于步驟(1)所述前培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是180rpm，30℃。
6.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)埃博霉素的方法，其特征在于步驟(2)所述中間培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是30℃，250rpm，通風(fēng)量為每升液體培養(yǎng)基每分鐘0.5升空氣，121℃，pH7.4。
7.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)埃博霉素的方法，其特征在于步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是25℃，180rpm，pH7.8。
8.如權(quán)利要求3～7所述的生產(chǎn)埃博霉素的方法，其特征在于還包括埃博霉素的分離純化，其方法為①發(fā)酵液經(jīng)離心、過濾，得到的濾液與樹脂按體積比65∶1，攪拌混合，離心，得到的樹脂先用去離子水洗滌，然后用異丙醇洗滌，得到的洗滌液中加入水，萃取其中的異丙醇，剩下的水相中再用乙酸乙酯萃取，得到的乙酸乙酯萃取物在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮、干燥，即可得粗結(jié)晶。
9.如權(quán)利要求8所述的生產(chǎn)埃博霉素的方法，其特征在于所述分離純化方法還包括如下步驟將所得粗結(jié)晶加入異丙醇中，振蕩，過濾，然后在真空干燥器中干燥，得到epothilones B白色晶體；對所得白色晶體進(jìn)一步通過反相色譜柱RP-18柱純化，乙腈作為洗脫液，最后用乙酸乙酯∶甲苯＝2∶3的混合液來結(jié)晶，即可得到epothilone A。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用纖維堆囊菌高效生產(chǎn)埃博霉素的方法。本發(fā)明通過對纖維堆囊菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行改良，并添加環(huán)式糊精或環(huán)式糊精的衍生物到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使得發(fā)酵培養(yǎng)基更加適合菌體生長，埃博霉素的產(chǎn)量更高。
文檔編號C12R1/01GK1769468SQ200510100338
公開日2006年5月10日 申請日期2005年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月19日
發(fā)明者羅立新, 陸一鳴, 汪薇, 潘力 申請人:華南理工大學(xué)