專利名稱：一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于纖維堆囊菌發(fā)酵技術領域，涉及一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法。
背景技術：
埃博霉素B (Epothilone B, EP0-906)是由纖維堆囊菌產生的一種已進入臨床抗腫瘤治療研究的藥物。目前埃博霉素的發(fā)酵產量很低，主要由兩個原因。第一是埃博霉素對其生產菌株有毒性抑制作用，這在很大程度上限制了埃博霉素的發(fā)酵產量。雖然可以利用大孔吸附樹脂XAD-16來解決這方面的困難，但樹脂對發(fā)酵液中其他物質的非特異性吸附也為埃博霉素產量的提高帶來新的困難。第二，纖維堆囊菌復雜的細胞行為。它們往往在固體培養(yǎng)基上能良好的生長、代謝并產生埃博霉素，但在液體培養(yǎng)基中生長時代謝行為往往會發(fā)生改變；如細胞·成團生長，并且內外細胞的狀態(tài)不一致；細胞存在自溶性現(xiàn)象；代謝狀態(tài)不穩(wěn)定等。因此開發(fā)一種能夠作為埃博霉素生產菌株的固體化材料，并將其用于發(fā)酵液中將極大地增加埃博霉素的產量。多孔陶瓷作為一種新型陶瓷材料，一直倍受生物、環(huán)保領域科研人員的青睞，這是因為它作為生物催化劑的載體具有氣孔率高、化學穩(wěn)定性好、比表面積大、體積密度小以及耐高溫、耐腐蝕等特點，另外多孔陶瓷還具備無毒害作用、穩(wěn)定性優(yōu)異、傳質性能好、機械強度高、生物親合性好、操作簡單、價廉易得等優(yōu)點。

發(fā)明內容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，為纖維堆囊菌生產埃博霉素B提供生長代謝的固體附著面，從而提高發(fā)酵產量，降低抗腫瘤藥物埃博霉素的生產成本。為達到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，包括以下步驟I)將纖維堆囊菌接種于M26固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)得到的菌體接種于M26液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)；2)將經M26液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的液體，高速攪拌使菌體均勻打散后，離心收集沉淀，加入無菌水重懸得纖維堆囊菌到菌懸液；3)按IOOmL發(fā)酵液接種5 IOmg菌種的比例,將纖維堆囊菌菌懸液接種于發(fā)酵液中，然后加入菌種質量50 400倍經發(fā)酵液浸泡處理過的硅藻土基多孔陶瓷材料塊，在25 35°C，180 220rpm 搖床培養(yǎng) 72 96h。所述在溫度28 30°C，轉速180 200r/min下?lián)u床培養(yǎng)72 96h。所述的纖維堆囊菌為纖維堆囊菌ATCC25532。所述在M26固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時其培養(yǎng)條件為30°C下，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 96h ；
所述在M26液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時其培養(yǎng)條件為30°C，200rpm搖床振蕩培養(yǎng)72 96h。步驟2)所述的高速攪拌時間為10 20min。步驟2)和步驟3)所述的離心過程是在4°C下,8000rpm,離心lOmin。所述的多孔陶瓷的孔徑在5 10 μ m,比表面積為40 50m2/g,能夠吸附固定粘細菌。所述的多孔陶瓷抗折強度為15 20MPa，吸水率達到50%。所述的多孔陶瓷的處理為多孔陶瓷塊經150°C高溫滅菌10 30min，自然冷卻后，加入發(fā)酵液完全覆蓋多孔陶瓷塊并高出10 50mm，常溫下?lián)u晃O. 5 lh，靜置I 2h后傾去發(fā)酵液，100 105°C
干燥后待用。所述的多孔陶瓷塊在發(fā)酵時懸浮在發(fā)酵液中。所述的IOOmL發(fā)酵液中多孔陶瓷塊的加入量為I 2g。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果本發(fā)明的基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，在埃博霉素B發(fā)酵生產時，通過添加硅藻土基多孔陶瓷對生產菌株纖維堆囊菌提供附著物，幫助其在培養(yǎng)液中固定，這樣可以為在液體環(huán)境中生長的粘細菌細胞提供一個固體附著面，從一定程度上滿足粘細菌生長代謝產生埃博霉素的 固體培養(yǎng)微環(huán)境，克服游離發(fā)酵培養(yǎng)時成團成片生長所帶來的傳質不均勻、代謝不穩(wěn)定等難題。進一步，本發(fā)明的基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，埃博霉素生產菌株被硅藻土基多孔陶瓷固定，也有利于緩解埃博霉素對其生產菌株的反饋抑制作用，從而提高發(fā)酵產量，降低抗腫瘤藥物埃博霉素的生產成本，本發(fā)明的基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，從所要固定的微生物菌體粘細菌聚集擴展的生長特點出發(fā)，所采用的硅藻土基多孔陶瓷的孔徑在5 10 μ m，抗折強度為15 20MPa，比表面積為40 50m2/g，吸水率達到50%，能夠良好的吸附固定粘細菌，吸附量達到了 10 15mg/g，并且在吸附固定粘細菌過程中磨損較少。本發(fā)明的基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，簡單易行，可以進行工業(yè)化操作，為埃博霉素的工業(yè)化生產奠定了現(xiàn)實性基礎。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。本發(fā)明提供硅藻土基多孔陶瓷吸附固定埃博霉素生產菌株的方法，從所要固定的微生物菌體粘細菌聚集擴展的生長特點出發(fā)，選擇合適的硅藻土基多孔陶瓷，孔徑在5 10 μ m，抗折強度為15 20MPa，比表面積為40 50m2/g，吸水率達到50%。進一步，給出以下制備方法I)稱取過60目篩的生娃藻土 40g,煅燒娃藻土 35g,粘土 15g,混合后加入20g水，在球磨機中球磨30min，將得到的漿液倒入搪瓷盤中，于105°C下干燥過夜。2)將干燥后的料漿研磨后過40目篩，再加入過80目篩的木屑lg，石蠟Ig進行混合后過40目篩3次,使其混合均勻；緩慢噴灑2g水后過3次40目篩，進行整粒，裝入密封袋密封靜置3h。3)將經整粒的混合粉料用粉末壓片機在5MPa下壓制尺寸為Φ 10X 20mm樣品；4)將成型后的樣品在300 C干媒3h后，放入電阻爐中1000 C保溫30min使造孔劑(木屑和石蠟)揮發(fā)，得到硅藻土基多孔陶瓷?；诙嗫滋沾晌焦潭ɡw維堆囊菌的埃博霉素B的發(fā)酵生產方法，包括以下步驟1.多孔陶瓷的前處理將尺寸為Φ20 X IOmm的硅藻土基多孔陶瓷塊于150°C高溫滅菌30min，自然冷卻。將維堆囊菌發(fā)酵用發(fā)酵液加到多孔陶瓷樣品中，完全覆蓋樣品后高出約50_，常溫下緩慢搖晃lh，靜置2h后傾去發(fā)酵液，多孔陶瓷干燥待用。2.菌懸液制備將一環(huán)新鮮的纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)接種于M26固體培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 96h ;將培養(yǎng)后的菌體接入IOOmL的M26液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)72 96h ;培養(yǎng)結束后倒棄一部分液體，將剩余的液體轉移至含有攪拌子和玻璃珠的三角瓶中，磁力攪拌器上高速攪拌10 20min，使菌團打散打勻為止，離心收集打勻的菌體，重懸于30 50mL的無菌水中，形成菌懸液。用無菌水將菌懸液稀釋10 20倍后，離心收集沉淀，沉淀烘干后稱干重，可得菌懸液稀釋后的濃度，再換算成原來菌懸液的濃度，單位為mg/mL。在進行下一步發(fā)酵培養(yǎng)時可以按照一定的接種量來量取菌懸液，防止接種量過大而引起的傳質不良或溶氧不足等現(xiàn)象的發(fā)生。3.發(fā)酵培養(yǎng)按IOOmL接種5 IOmg菌種的比例,將纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)菌懸液接種于發(fā)酵液中，然后加入菌種質量50 400倍預處理過的多孔陶瓷，在25 35°C，180 220rpm搖床培養(yǎng)72 96h。以上所用到的菌種、培養(yǎng)基具體為所述的菌種為纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)即可,具體的可選用纖維堆囊菌ATCC25532。M26固體培養(yǎng)基成分為瓊脂20g/L，土豆淀粉8. 0g/L，大豆蛋白胨2. 0g/L，葡萄糖2. 0g/L，酵母粉 2. 0g/L, MgSO4 · 7Η201· 0g/L, CaCl2L 0g/L, EDTA_Fe3+lmL/L，微量元素 ImL/L，調節(jié)pH為7. 2 ；M26液體培養(yǎng)基成分為土豆淀粉8. 0g/L,大豆蛋白胨2. 0g/L,葡萄糖2. 0g/L,酵母粉 2. 0g/L, MgSO4 · 7Η201· 0g/L, CaCl2L 0g/L, EDTA_Fe3+lmL/L，微量元素 lmL/L，調節(jié) pH 為7. 2。發(fā)酵培養(yǎng)時發(fā)酵液成分為酵母粉20g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氫鈉2g/L、磷酸氫二鈉 2g/L、MgSO4 · 7H205g/L、FeSO4 · 7Η200· lg/L、CaCl25g/L、MnCl2O. lg/L 和葡萄糖 IOg/L，調節(jié)pH為7. 2。發(fā)酵培養(yǎng)結束后，按照埃博霉素B常規(guī)提取純化方法分離得到。而在發(fā)酵培養(yǎng)結束后，測定多孔陶瓷吸附固定粘細菌量，由于多孔陶瓷在吸附固定粘細菌過程中受到發(fā)酵液長時間的沖刷，會使其邊緣受到一定的磨損，所以要用灼燒干重法；即稱取一定量的固定化載體95°C干燥至恒重，質量為Hi0,再在電阻爐中500°C灼燒Ih,自然冷卻后稱重Iii1,貝U菌體干重為mQ — 檢測結果表明對粘細菌的吸附固定量能夠達到 20mg/g。綜上所述，本方法通過向埃博霉素B的生產菌株纖維堆囊菌培養(yǎng)液中，加入經處理過的多孔陶瓷，為在液體環(huán)境中生長的纖維堆囊菌提供一個固體附著面，滿足粘細菌生長代謝產生埃博霉素的固體培養(yǎng)微環(huán)境，從而提高發(fā)酵產量，降低抗腫瘤藥物埃博霉素的生產成本。多孔陶瓷載體與菌體的結合量受溫度、轉速、載體量等因素的影響，升高一定的溫度可以提高菌體向多孔陶瓷表面積空隙內擴散遷移的速率，若溫度太高，又容易解吸；較高的轉速可以達到較好的傳質效果，有利于菌體的生長于固定，但也不能超過菌體的最高培養(yǎng)轉速；多孔陶瓷載體的載體量同樣也會影響載體與菌體的結合，當載體量過多時，隨著菌體的生長，總菌體量過大，妨礙了培養(yǎng)基的傳質擴散，導致發(fā)酵液中溶氧不足，難以維持菌體的呼吸生長需要。本發(fā)明所提供的方法選擇的條件適宜(IOOmL發(fā)酵液中接種5 10mg，多孔陶瓷載體量I 2g，溫度28 30°C，搖床轉速180 200r/min，時間72 96h)，操作步驟簡單易行，可以放大至工業(yè)化生產，為埃博霉素的工業(yè)化生產奠定了實驗基礎。下面給出具體的發(fā)酵實施例。實施例1
一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生產埃博霉素B的方法，包括以下步驟I)將尺寸為Φ20Χ10 ·ι的硅藻土基多孔陶瓷在150°C下，高溫滅菌30min，自然冷卻后，裝入三角瓶中，加入發(fā)酵液，液面完全覆蓋多孔陶瓷樣品后高出約50mm，常溫下緩慢搖晃lh，靜置2h后傾去發(fā)酵液，多孔陶瓷105°C干燥后待用。2)將一環(huán)新鮮的纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)接種于M26固體培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h ；將培養(yǎng)后的菌體接入IOOml的M26液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)72h ；培養(yǎng)結束后倒棄一部分液體，將剩余的液體轉移至含有攪拌子和玻璃珠的三角瓶中，磁力攪拌器上高速攪拌lOmin，使菌團打散打勻為止，離心收集打勻的菌體，將其懸浮在3OmL的無菌水中；用無菌水把ImL的菌懸液稀釋至10mL，放入提前稱重好的刻度離心管(質量為amg)中，4°C 8000rpm離心IOmin后，棄去上清液，在105°C的恒溫干燥箱中烘干至恒重，稱重(質量為b mg),則菌體的干重為(b — a) mg ;換算至菌懸液的濃度為(b — a) mg/mL。3)取IOmL稀釋過的菌懸液，接入含有IOOmL發(fā)酵液和2g多孔陶瓷的500mL培養(yǎng)瓶中，30°C 200rpm搖床培養(yǎng)96h。實施例2一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生產埃博霉素B的方法，包括以下步驟I)將尺寸為Φ20Χ IOmm的娃藻土基多孔陶瓷在150°C下，高溫滅菌30min,自然冷卻后，裝入三角瓶中，加入發(fā)酵液，液面完全覆蓋多孔陶瓷樣品后高出約50mm，常溫下緩慢搖晃lh，靜置2h后傾去發(fā)酵液，多孔陶瓷105°C干燥后待用。2)同例I中的方法一定濃度的制備菌懸液。3)取5ml稀釋過的菌懸液，接入裝有IOOmL發(fā)酵液和Ig多孔陶瓷的500mL培養(yǎng)瓶中，28°C 180rpm搖床培養(yǎng)96h。實施例3一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生產埃博霉素B的方法，包括以下步驟I)將尺寸為Φ20Χ10·ι的硅藻土基多孔陶瓷在150°C下，高溫滅菌30min，自然冷卻后，裝入三角瓶中，加入發(fā)酵液，液面完全覆蓋多孔陶瓷樣品后高出約50mm，常溫下緩慢搖晃lh，靜置2h后傾去發(fā)酵液，多孔陶瓷105°C干燥后待用。2)同例I中的方法制備一定濃度的菌懸液。3)取IOml稀釋過的菌懸液，接入裝有IOOmL發(fā)酵液和1. 5g多孔陶瓷的500mL培養(yǎng)瓶中，30°C 220rpm搖床培養(yǎng)96h。實施例4一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生產埃博霉素B的方法，包括以下步驟I)將尺寸為Φ20Χ1 0πιπι的硅藻土基多孔陶瓷在150°C下，高溫滅菌30min，自然冷卻后，裝入三角瓶中，加入發(fā)酵液，液面完全覆蓋多孔陶瓷樣品后高出約50mm，常溫下緩慢搖晃lh，靜置2h后傾去發(fā)酵液，多孔陶瓷105°C干燥后待用。2)同例I中的方法制備一定濃度的菌懸液。3)取8ml稀釋過的菌懸液，接入裝有IOOmL發(fā)酵液和2g多孔陶瓷的500mL培養(yǎng)瓶中，30°C 220rpm搖床培養(yǎng)72h。用500mL的培養(yǎng)瓶要比平時所用的250mL或300mL的培養(yǎng)瓶的傳質效果好，由于所用的菌體纖維堆囊菌是嚴格好氧的，因此必須保證良好的溶氧環(huán)境。實施例5一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生產埃博霉素B的方法，包括以下步驟I)將尺寸為Φ20Χ10πιπι的硅藻土基多孔陶瓷在150°C下，高溫滅菌30min，自然冷卻后，裝入三角瓶中，加入發(fā)酵液，液面完全覆蓋多孔陶瓷樣品后高出約50mm，常溫下緩慢搖晃lh，靜置2h后傾去發(fā)酵液，多孔陶瓷105°C干燥后待用。2)同例I中的方法制備一定濃度的菌懸液。3)取8ml稀釋過的菌懸液，接入裝有IOOmL發(fā)酵液和1. 5g多孔陶瓷的500mL培養(yǎng)瓶中，30°C 200rpm搖床培養(yǎng)72h。
權利要求
1.一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將纖維堆囊菌接種于M26固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)得到的菌體接種于M26液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)； 2)將經M26液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的液體，高速攪拌使菌體均勻打散后，離心收集沉淀，力口入無菌水重懸得纖維堆囊菌到菌懸液； 3)按IOOmL發(fā)酵液接種5 IOmg菌種的比例,將纖維堆囊菌菌懸液接種于發(fā)酵液中，然后加入菌種質量50 400倍經發(fā)酵液浸泡處理過的硅藻土基多孔陶瓷材料塊，在溫度25 35°C，180 250r/min 搖床培養(yǎng) 72 96h。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，其特征在于，所述在溫度28 30°C，轉速180 200r/min下?lián)u床培養(yǎng)72 96h。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，其特征在于，所述的纖維堆囊菌為纖維堆囊菌ATCC25532。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，其特征在于，所述在M26固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時其培養(yǎng)條件為30°C下，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 96h ； 所述在M26液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時其培養(yǎng)條件為30°C，200rpm搖床振蕩培養(yǎng)72 96h。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，其特征在于，步驟2)所述的高速攪拌時間為10 20min ； 步驟2)和步驟3)所述的離心過程是在4°C下,8000rpm,離心lOmin。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生的方法，其特征在于，所述的多孔陶瓷為硅藻土基多孔陶，其孔徑在5 10 ym，比表面積為40 50m2/g，能夠吸附固定粘細菌。
7.根據(jù)權利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生的方法，其特征在于，所述的多孔陶瓷為硅藻土基多孔陶，其抗折強度為15 20MPa，吸水率達到50%。
8.根據(jù)權利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵生的方法，其特征在于，所述的多孔陶瓷的處理為 多孔陶瓷塊經150°C高溫滅菌10 30min，自然冷卻后，加入發(fā)酵液完全覆蓋多孔陶瓷塊并高出10 50mm,常溫下?lián)u晃0. 5 Ih,靜置I 2h后傾去發(fā)酵液，100 105°C干燥后待用。
9.根據(jù)權利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，其特征在于，所述的多孔陶瓷塊在發(fā)酵時懸浮在發(fā)酵液中。
10.根據(jù)權利要求1所述的一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，其特征在于，所述的IOOmL發(fā)酵液中多孔陶瓷塊的加入量為I 2g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于多孔陶瓷吸附固定纖維堆囊菌發(fā)酵的方法，屬于微生物發(fā)酵制藥領域。本方法將制備得到的多孔陶瓷用發(fā)酵液進行處理后干燥待用；將纖維堆囊菌分別經M26固體、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，得到菌懸液；將菌懸液稀釋后接種于發(fā)酵液中，再向其中加入經處理過的多孔陶瓷，振蕩培養(yǎng)。本發(fā)明提供硅藻土基多孔陶瓷吸附固定埃博霉素生產菌株的方法，在埃博霉素B發(fā)酵生產時，通過對其生產菌株纖維堆囊菌進行固定，這樣可以為在液體環(huán)境中生長的粘細菌細胞提供一個固體附著面，本方法能夠提高發(fā)酵產量，降低抗腫瘤藥物埃博霉素的生產成本，操作步驟簡單易行，可以放大至工業(yè)化生產，為埃博霉素的工業(yè)化生產奠定了實驗基礎。
文檔編號C12R1/01GK103045675SQ20121056362
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月22日 優(yōu)先權日2012年12月22日
發(fā)明者龔國利, 劉麗麗, 王娜 申請人:陜西科技大學