專利名稱：用于生產(chǎn)治療膿毒癥的重組人活化蛋白c的、包含密碼子優(yōu)化的方法
用于生產(chǎn)治療膿毒癥的重組人活化蛋白C的、 包含密碼子優(yōu)化的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)活化蛋白c的重組方法。本發(fā)明涉及構(gòu)建、 轉(zhuǎn)化、表達(dá)、純化和生產(chǎn)重組人活化蛋白c的方法。包含與目的基因結(jié)合的控制元件的DNA構(gòu)建體已經(jīng)被公開。該目的核酸序列已經(jīng)密碼 子優(yōu)化以允許在適宜的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)。發(fā)明背景Xigris (Drotrecoginalfa)是重組形式的人活化蛋白C。其是與源自 人血漿的活化蛋白C具有相同氨基酸序列的絲氨酸蛋白酶?；罨鞍證 是對(duì)感染進(jìn)行全身應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)物并具有抗血栓、前纖維蛋白溶解 (profib畫lytic )和抗炎癥的特性。Drotrecoginalfa (活化的)是分子 量大約55KD的糖蛋白。蛋白C的前體形式含有前導(dǎo)肽(成熟蛋白中沒(méi) 有)、9個(gè)Gla殘基的y-羧基谷氨酸(Gla)結(jié)構(gòu)域、短螺旋疏水氨基酸堆 疊、兩個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域、輕鏈和重鏈之間的連接肽、 激活肽，以及胰蛋白酶樣SP結(jié)構(gòu)域，其中催化三元體位于His-211, Asp-257和Ser-360。 EGF-結(jié)構(gòu)域的主要功能是提供蛋白-蛋白或者蛋白-細(xì)胞的相互作用。存在于EGF模體中的殘基也表現(xiàn)出與不同激活劑和底 物功能性地相互作用。另外，連接螺旋具有參與協(xié)調(diào)鈣離子結(jié)合到 EGF-I結(jié)構(gòu)域的殘基，該結(jié)構(gòu)域;陂預(yù)測(cè)起到神經(jīng)保護(hù)的作用。翻譯后修飾去掉了 二肽Lys-156-Arg-157,因此該單鏈形式轉(zhuǎn)變成 由二硫鍵連接的雙鏈分子。80。/。的酶原PC是這種形式。此外，氨基末 端Gla結(jié)構(gòu)域中谷氨酸殘基的羧化，EGF-I結(jié)構(gòu)域中Asp殘基的羥化和糖 基化是其它的翻譯后事件。盡管在糖基化結(jié)構(gòu)中存在一些不同，但 RhAPC和源自人血漿的APC具有相同的糖基化位點(diǎn)。人APC具有四個(gè) 天冬酰胺連4妻的N-糖基化位點(diǎn)。其唾液酸比其它血漿蛋白高5倍。人APC具有四個(gè)天冬酰胺連接的N-糖基化位點(diǎn)。其巖藻糖比其它 血漿蛋白高5倍，唾液酸高2倍?；罨鞍證通過(guò)抑制因子Va和VIIIa發(fā)揮 作用。體外數(shù)據(jù)顯示活化蛋白C通過(guò)其抑制纖溶酶原激活劑抑制物-1(PAI-1 )和限制活化的凝血酶激活的纖溶抑制物生成的能力而具有間 接前纖維蛋白溶解活性。另外，體外數(shù)據(jù)顯示了活化蛋白C可以通過(guò)抑 制單核細(xì)胞產(chǎn)生人腫瘤壞死因子、阻斷白細(xì)胞黏附到選擇素、和將凝 血酶-誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答限制在微血管內(nèi)皮中而發(fā)揮抗炎癥作用。已經(jīng)描述過(guò) 一 些在高等真核系統(tǒng)中表達(dá)重組蛋白的方法。CHO-K1, HEK293 (和變種)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如今將其本身建立為哺乳 動(dòng)物蛋白表達(dá)所選擇的主要系統(tǒng)。概述的方法適于將新合成的編碼重 組人Drotrecogin alfa的核酸序列轉(zhuǎn)染到適宜的哺乳動(dòng)物宿主中用于表達(dá)。下面4既述的方法適于生產(chǎn)具有生物活性的、重組可溶的重組活化 人蛋白C?，F(xiàn)有方法利用已建立的具有無(wú)活性人蛋白C酶原的互補(bǔ)DNA 的人類細(xì)胞系，其分泌蛋白到發(fā)酵培養(yǎng)基。通過(guò)用a-凝血酶，胰蛋白酶， 魯氏會(huì)蛇毒素因子X激活劑或者凝血酶和血栓調(diào)節(jié)蛋白的混合物裂解 人蛋白C,使其被酶促活化而獲得活化蛋白C,隨后被純化。然而，這 些活化方法包括污染的風(fēng)險(xiǎn)，并且生產(chǎn)成本更高。本研究旨在通過(guò)摻 入細(xì)胞相關(guān)的蛋白酶而直接從重組細(xì)胞中生產(chǎn)活化蛋白C。這些蛋白酶可以位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器中或者位于細(xì)胞膜上，其可 以在分泌期間或者分泌后立即裂解蛋白。因此，該策略已經(jīng);故用于在 從真核宿主細(xì)胞，即HEK293中分泌后直接生產(chǎn)重組活化蛋白C。該重組的酶將被指明用于降低具有高死亡風(fēng)險(xiǎn)的嚴(yán)重膿毒癥(即， 與急性器官衰竭相關(guān)的膿毒癥)成人患者的死亡率。


圖1是編碼Drotrecogin alfa或Xigns的非優(yōu)化型和密碼子優(yōu)化型 DNA核苷酸序列的雙序列比對(duì)。圖2是DROT cDNA和pcDNA3.1D/V5-His經(jīng)凝膠純化的限制性酶切片段。圖3是AVCIPpcDNA3.1 D/V5-His/Xigris假定克隆的限制性酶切分析。圖 4是4吏用內(nèi) 士刀pcDNA3.1-DROT cDNA的酶只寸 AVCIPpcDNA3.1 D/V5-His/Xigris克隆的限制性酶切分析。圖5是從頭合成的pcDNA3.1-DROT (合成的Xigris)和Xigris基因已經(jīng)確^人的序列間的序列比只于。圖6是從頭合成的pcDNA3.1-DROT-Opt (合成的—Xigris-Opt)與 Xigris-Opt基因已經(jīng)確認(rèn)的序列間的序列比對(duì)。圖7是pcDNA3.1DROT - /V5-His/Xigris cDNA的克隆# 4和Xigris 基因已經(jīng)確認(rèn)的序列間的序列比對(duì)。圖8是結(jié)構(gòu)圖pcDNA3. l-DROT- D/V5-His/Xigris。序列表SEQIDNOl:活化蛋白C的核苷酸序列； SEQIDN0 2:活化蛋白C的經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了包括與目的基因結(jié)合的控制元件的DNA構(gòu)建體，其 允許目的基因的表達(dá)。本發(fā)明的再一方面在于對(duì)從頭合成的核酸進(jìn)行 密碼子優(yōu)化以允許其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。該密碼子優(yōu)化的序列^皮 轉(zhuǎn)化到適宜的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中用于表達(dá)。發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明 實(shí)施例l用于表達(dá)重組人蛋白C (活化的)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的設(shè)計(jì)已經(jīng) 被改良以提供4個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)，其基于 一 種市售可得的載體 (例如分別來(lái)自Invitrogen或BD Biosciences的pcZ)A^4或/ /W五S), 其被改良為包括下述特征(a) 多克隆位點(diǎn)，用于插入包括其天然信號(hào)肽的人蛋白C的 cDNA。(b) 表達(dá)載體的設(shè)計(jì)還提供了獨(dú)立的(雙順?lè)醋?IRES介導(dǎo)的綠 色熒光蛋白的共表達(dá)，其使得能使用熒光輔助細(xì)胞分選來(lái)快速篩選高 效表達(dá)的轉(zhuǎn)染子。融合構(gòu)建體的合成 ,人頭方法就合成rhAPC cDNA-構(gòu)建體的編碼區(qū)而言，進(jìn)行一種從頭方法以使得針對(duì)要使用的特定哺乳動(dòng)物細(xì)胞而進(jìn)行更好的密碼子優(yōu)化。合成的cDNA構(gòu)建體的^:計(jì)也包括例如以下特征o —段Kozak共有序列(GCCACC),其后是起始密碼子(ATG) 以保證有效翻譯；o在cDNA的5，和3'端適宜的限制性位點(diǎn)以克隆到目的表達(dá)載體中。人活化蛋白C的核苷酸序列已經(jīng)由SEQ ID: 1所表示。在rhAPC 的編碼D N A序列中的密碼子，其已經(jīng)作為密碼子優(yōu)化過(guò)程的 一 部分#皮 改變以保證在諸如CHO Kl和HEK 293的哺乳動(dòng)物細(xì)力包系中最佳的重 組蛋白表達(dá)。核酸經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的序列已經(jīng)由SEQ ID NO:2所描述。核酸序列的優(yōu)化序列已經(jīng)由SEQ ID: 2所表示。圖1描述了編碼Drotrecogin alfa或Xigris的非優(yōu)化型和密碼子優(yōu) 化型的DNA核苷酸序列的密碼子優(yōu)化后的雙序列比對(duì)。實(shí)施例2Drotrecogin alfa ( DROT ) cDNA在PCDNA3.1D/V5-HIS哺乳動(dòng)物 細(xì)胞特異的表達(dá)載體中的亞克隆。利用自動(dòng)DNA測(cè)序確認(rèn)如上所示的乂人頭合成的cDNA分子 (DROT和DROT-Opt)的真實(shí)性之后，將DROT亞克隆到哺乳細(xì)i包 特異的表達(dá)載體 pcDNA3.1D/V5-His 中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)染用 (transfection-ready )的構(gòu)建體。下面給出具體步驟 A、試劑和酶1 、 QIAGEN凝膠提取試劑盒和PCR純化試劑盒。 2、 pcDNA 3.1D/V5-His載體DNA (Invitrogen )。酶 U/(il 10x緩沖液1、 HindIII 10 緩沖液E2、 Xhol 10 緩沖液E3、 T4DNA連接酶 40 連接酶緩沖液B、載體和插入片段的限制性酶切: 方法4吏用下述DNA樣品和限制酶:DNA樣品限制酶Rxn # 1載體(用于Xigris克隆)HindIII / XholRxn # 2 pBSK/ Xigns (#13)HindIII / Xhol限制性酶切反應(yīng)組分終濃度Rxn# 1Rxn# 2水-4pl4pl10x緩沖液lx2pl2^1DNA-10^110plHindIII0.5U41Xhol0.5U10xBSAlx2^1終體積20pl20pl混合反應(yīng)物，顛倒并在37。C孵育2小時(shí)。通過(guò)瓊脂糖凝力交電泳分 析限制性酶切。觀察到所期望的酶切類型。觀察到被切下來(lái)的約1400 bp 的基因片段(對(duì)于Rxn#2)和載體(Rxn# 1 )約5.5kb的載體骨架片 段。使用QIAGEN凝膠提取試劑盒，通過(guò)凝膠提取純化約1400 bp的 DROT插入片段和約5.5kb被酶切的載體pcDNA3.1D/V5-His片段。在 1%瓊脂糖凝膠上檢測(cè)純化的插入片段和載體片段。圖2表示了 DROT cDNA和pcDNA3， 1D/V5-His的經(jīng)凝月交純4匕的 限制性酶切片段。實(shí)施例3C、 pcDNA3.1D/V5-His骨架和DROT cDNA的連接 預(yù)測(cè)了被酶切且純化的載體和插入片段的DNA濃度(參考上述圖 7)和以下述方式建立連接組分 終濃度 Rxn # 1 (載體) Rxn # 2 (載體+插入片段)水 - 15^1 7^110xRxn緩沖液 lx 2|_d 2pl載體 -50ng 2nl 2pl4悉入片^: ~ 38ng 陽(yáng) 8plT4DNA連接酶 40U lpl 1 pl終體積 20nl 20|il 20nl輕輕混合反應(yīng)物，顛倒并在室溫孵育2-3小時(shí)。將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn) 化DH10感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)在含有氨芐青霉素的LB瓊脂糖平板上所獲得的菌落進(jìn)行篩選 并通過(guò)對(duì)所分離的質(zhì)粒DNA的限制性酶切分析進(jìn)行確認(rèn)。實(shí)施例4D、 pcDNA3.1DROT -/V5-His/Xigris假定克隆的限制性酶切分析從在含有氨千青霉素的LB瓊脂糖平板上獲得的菌落分別純化質(zhì) 粒DNA并通過(guò)對(duì)所分離的質(zhì)粒DNA的限制性酶切分析確認(rèn)目的 cDNA插入片段的存在。在圖中表示了 AVClPpcDNA3,iD/v5-His/Xigns 假定克隆的限制性酶切分析。才艮據(jù)若干含有pcDNA3. l-DROT - D/V5-His/Xigns的假定克隆的限 制性酶切后獲得的結(jié)果， 一些顯示出目的限制性模式的克隆被選擇用 于進(jìn)一步限制性酶切分析，其使用在內(nèi)部裂解AVCIP-Xigris cDNA的 限制酶以產(chǎn)生如下圖9所示的不同大小的片段。4吏用在內(nèi)部裂解pcDNA3.1-DROT cDNA的酶對(duì)AVCiPpcDNA3， lD/V5-His/Xigris克隆進(jìn)行限制性酶切分析。基于已知的內(nèi)部酶切位點(diǎn)的存在，大多數(shù)被選擇用于限制性圖i普 分析的pcDNA3. l-DROT D/V5-His / Xigris克隆產(chǎn)生了所期望的片段大 小，因此這些克隆進(jìn)一步^皮DNA測(cè)序分析所確i人。實(shí)施例5確認(rèn)/人頭合成的cDNA分子的真實(shí)性。利用DNA自動(dòng)測(cè)序?qū)τ缮虡I(yè)服務(wù)提供商所提供的從頭合成的 cDNA分子的真實(shí)性進(jìn)行確認(rèn)。E、通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)已選擇的pcDNA3.1-DROT D/V5-His/Xigris 克隆通過(guò)DNA自動(dòng)測(cè)序進(jìn)一 步確認(rèn)作為限制性圖語(yǔ)分析的結(jié)果所選擇 的pcDNA3.1隱DROT D/V5-ffis / Xigris克隆。名稱引物說(shuō)明序列T7測(cè)序引物Invitrogen試劑盒引物5， TAATACGACTCACTATAGGG 3'pcDNA3.1-DROT D/V5-His/Xigris克隆顯示出與模板序列相同。 在圖8中圖示了 DROT的圖譜，其<吏用/人頭合成的pcDNA3.1-產(chǎn) 生重組表達(dá)構(gòu)建體。實(shí)施例6rhAPC融合構(gòu)建體的保存和增殖 編碼rhAPC的cDNA構(gòu)建體的保存和增殖在諸如ToplO (Invitrogen )的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌纟田月包系中進(jìn)行。實(shí)施例75、在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)/穩(wěn)定的重組蛋白表達(dá)和上清液的產(chǎn)生a) 使用人胚腎細(xì)胞(HEK293 )進(jìn)行rhAPC構(gòu)建體的瞬時(shí)/穩(wěn)定表 達(dá)，其一皮剪切過(guò)的人腺病毒5 ( AD5 ) DNA所轉(zhuǎn)化，是FDA批準(zhǔn)進(jìn)4亍 工業(yè)應(yīng)用的主要的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。瞬時(shí)表達(dá)可用于才全測(cè)構(gòu)建體的表 達(dá)和快速獲得小量的重組蛋白。b) 或者， 一種方法，其允許選擇表現(xiàn)出快速地高效表達(dá)的大量細(xì) 胞而不需要獲得單個(gè)克隆。隨后，使用標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生表現(xiàn)出穩(wěn)定且高 效表達(dá)目的rhAPC蛋白的HEK293細(xì)胞。按照FDA要求，在整個(gè)過(guò)程中使用的改良培養(yǎng)技術(shù)，其利用化學(xué) 上明確的培養(yǎng)基(SigmaAldrich)而不是含血清培養(yǎng)基。實(shí)施例8純化過(guò)程的優(yōu)化在根據(jù)以上提及的推薦的功能/結(jié)合分析法確認(rèn)了可再現(xiàn)生物活性 后，將努力優(yōu)化純化過(guò)程以使產(chǎn)率最大化。因此，所述純化方法包括下述下游系列(train):a、 ^f吏用常^見過(guò)濾和切向流過(guò)濾方法開始凈化和濃縮；b、 超濾/透析過(guò)濾(基于切向流過(guò)濾)；c、 色譜(Chromo)步驟-I:使用針對(duì)活化蛋白C重鏈上活化位點(diǎn) 的單克隆抗體或針對(duì)人蛋白c輕鏈的y羧基谷氨酸結(jié)構(gòu)域的鈣依賴型 抗體進(jìn)行親和色譜；d、 色譜步驟-II:使用EMDfractogel進(jìn)行陰離子交換色譜；e、 色鐠步驟-III:流經(jīng)諸如cellufine sulfate的堿性陰離子交換劑以 除去DNA和宿主蛋白；f、 除去病毒和無(wú)菌過(guò)濾；g、 除去內(nèi)毒素；h、 制劑。
權(quán)利要求
1. 一種制備具有體內(nèi)生物活性的活化人蛋白C產(chǎn)物的方法，包括用編碼SEQ ID2核酸序列所編碼的蛋白的合成DNA序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，和從所述宿主細(xì)胞或其生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分離所述產(chǎn)物的步驟。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中編碼所述活化人蛋白C的經(jīng) 過(guò)密碼子優(yōu)化的核酸序列由SEQID: 3表示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
4. 才艮據(jù)4又利要求1所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞優(yōu)選地選自細(xì) 胞抹HEK293。
5. —種制備具有體內(nèi)生物活性的人重組活化蛋白C產(chǎn)物的方法， 包括用FIG No: 8的載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，和/人所述宿主細(xì)i包或 其生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分離所述產(chǎn)物的步驟。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述載體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞特 異的表達(dá)載體，最優(yōu)選如FIGNO: 8所示的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)活化蛋白C的重組方法。本發(fā)明涉及構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、表達(dá)、純化和生產(chǎn)重組人活化蛋白C的方法。包含與目的基因結(jié)合的控制元件的DNA構(gòu)建體已經(jīng)被公開。目的核酸序列已經(jīng)密碼子優(yōu)化以允許在適宜的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N9/64GK101228269SQ200680026924
公開日2008年7月23日 申請(qǐng)日期2006年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月24日
發(fā)明者V·莫拉瓦拉帕特爾 申請(qǐng)人:阿維斯塔金格蘭技術(shù)有限公司