專利名稱：針對活化蛋白c的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明一般性地涉及抗體領域。更具體地，本發(fā)明描述了選擇性針對活化蛋白 C(activated protein，APC)的單克隆抗體和抗體片段的鑒定和用途。2.相關(guān)領域的描述血液凝固是由多種血液成分或因子的復雜相互作用組成的過程，其最終導致纖維 蛋白凝集。一般地，參與凝血“級聯(lián)”的血液成分是酶前體或酶原-無酶活性的蛋白質(zhì)，其 通過活化劑的作用轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?。血液凝固的調(diào)節(jié)很大程度上由活化蛋白C(APC)實現(xiàn) 的促凝血因子(pro-coagulation factor) Va和VIIIa的蛋白水解失活通過酶作用完成 (Esmon,1989)。蛋白C是APC的前體，其為有力的天然抗凝血劑。蛋白C由與凝血調(diào)節(jié)蛋白(TM) 復合的凝血酶所活化。內(nèi)皮細胞蛋白C受體(EPCR)增強了所述活化。TM和EPCR可被炎性 介質(zhì)(例如腫瘤壞死因子)所下調(diào)，由Esmon(1999)綜述。也已發(fā)現(xiàn)在一些形式的敗血癥 休克特別是腦膜炎球菌血癥中TM和EPCR減少。因為EPCR和TM在內(nèi)皮上表達，所以不可 能在不除去血管的情況下直接確定它們的功能的好壞。APC通過蛋白水解性切割和下調(diào)促凝血因子(pro-coagulant factor)起到抗凝 血劑作用。APC還具有作為抗凋亡劑、抗炎癥分子和細胞保護劑的重要功能?？赏ㄟ^除去 APC來治療關(guān)鍵因子喪失(例如在血友病中缺乏因子VIII)導致止血失調(diào)的出血疾病，或者 在外傷過程導致暫時性止血損傷的外傷患者中。但是，這樣的治療除了除去抗凝血活性之 外，還可導致除去APC有益功能的不希望的有害后果。因此，希望有一種選擇性靶向APC的 抗凝血活性而同時保留所述分子的其它功能完好無損的治療劑。

發(fā)明內(nèi)容
已經(jīng)開發(fā)并在本文中描述了治療出血疾病的方法，其涉及使用識別活化蛋白C但 是不識別未活化蛋白C的單克隆抗體。在這點上，本發(fā)明還提供了選擇性結(jié)合和/或阻斷 活化蛋白C中蛋白水解活性位點的單克隆抗體。在某些實施方案中，這些抗體可抑制活化 蛋白C的抗凝血活性，但是可不影響未活化蛋白C的任何活性。在某些實施方案中，這些抗 體還可保留活化蛋白C的細胞保護作用。因此，本發(fā)明的方法還包括利用這些單克隆抗體 進行治療，其中希望選擇性抑制活化蛋白C的抗凝血活性。因此，本發(fā)明的某些一般方面涉及單克隆抗體，其中所述抗體結(jié)合并抑制活化蛋 白C，但是不結(jié)合或抑制未活化蛋白C。例如，本發(fā)明的某些實施方案涉及單克隆抗體，其中 所述抗體結(jié)合并抑制活化蛋白C的抗凝血活性，但是不結(jié)合或抑制未活化蛋白C的活化。在 某些實施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體是HAPC1573。結(jié)合并抑制活化蛋白C及其抗凝血活性的本發(fā)明抗體可以在體內(nèi)和/或體外起作用。本發(fā)明涉及其他單克隆抗體，例如抑制活化或未活化蛋白C與內(nèi)皮細胞蛋白C受 體(EPCR)或磷脂結(jié)合并抑制未活化蛋白C活化的抗體。在某些方面，此類抗體結(jié)合小鼠未 活化蛋白C的Gla結(jié)構(gòu)域?？梢栽隗w外或體內(nèi)情形下利用這些抗體。本發(fā)明的抗體可以例如是鼠抗體，本發(fā)明的抗體可以例如是人源化抗體。本發(fā)明 的抗體可以包含在藥物組合物中，其中所述藥物組合物還包含可藥用載體。本發(fā)明的抗體 還可用于其中抗體與細胞在體外或體內(nèi)接觸的方法中。本發(fā)明還涉及在對象中抑制活化蛋白C的抗凝血活性的方法，其包括向所述對象 (例如哺乳動物，如人)施用有效量的本發(fā)明抗體。在涉及施用本發(fā)明抗體的本發(fā)明方法或 任何其它方法中，在某些實施方案中，活化蛋白C的細胞保護作用可以不降低，或者可保持 在正常水平內(nèi)。本發(fā)明還涉及在對象中抑制活化蛋白C的酰胺裂解活性的方法，其包括向所述對 象施用有效量的本發(fā)明抗體。本發(fā)明還涉及治療需要凝血的對象的方法，其包括向所述對象施用有效量的本發(fā) 明抗體。這些對象可患有例如血友病或出血。本文還涉及治療患有敗血癥的對象的方法，其包括施用有效量的本發(fā)明抗體。這 些方法還可利用施用活化蛋白C。本發(fā)明還涉及治療患有血友病的對象的方法，其包括向所述對象施用有效量的本 發(fā)明抗體。本發(fā)明的抗體還可用于例如在對象中調(diào)節(jié)止血或者在對象中調(diào)節(jié)血栓形成的方 法，其包括施用有效量的本發(fā)明抗體。這些方法還可利用施用活化蛋白C。本發(fā)明的某些方法涉及抑制未活化蛋白C的活化的方法，其包括向?qū)ο笫┯糜行?量的本發(fā)明單克隆抗體。這些方法中所用的抗體還可抑制活化或未活化蛋白C與內(nèi)皮細胞 蛋白C受體(EPCR)或磷脂的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的對象可以是例如哺乳動物，如小鼠、大鼠、兔、狗、馬或人。除非另作說明，否則本文所述的任何抗體均可以是抗體片段。例如，所述抗體可以 進一步限定為Fab'、Fab、F(ab' ) 2、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fv，或scFv，其都是眾所周知的抗體 片段類型。除非另作說明，否則本發(fā)明的抗體也包括這些片段。如下文所述，術(shù)語“抗體”用于表示具有抗原結(jié)合區(qū)域的任何抗體樣分子，包括抗 體片段例如Fab'、Fab、F(ab' ) 2、單結(jié)構(gòu)域抗體(DAB)、Fv、scFv (單鏈Fv)等。制備和使 用多種基于抗體的構(gòu)建物和片段的方法在本領域中是眾所周知的。制備和表征抗體的手 段也是本領域中眾所周知的(參見例如Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory，1988 ；在此通過引用并入本文)。本發(fā)明的另一個方面涉及包含替代性互補決定區(qū)(或⑶R)以及構(gòu)架區(qū)(或FR) 的可變區(qū)。CDR是所述可變區(qū)內(nèi)通常賦予抗原特異性的序列。本發(fā)明還涵蓋包含足以賦予抗原結(jié)合之可變區(qū)序列的抗體部分?？贵w部分包括但 不限于Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv、SFv, scFv(單鏈Fv)，無論是由蛋白水解切割完整抗體 (例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割)產(chǎn)生還是由重組方法產(chǎn)生，其中操縱完整重鏈和輕鏈 的cDNA來產(chǎn)生重鏈和輕鏈的片段，它們分別產(chǎn)生或者作為同一多肽的部分而產(chǎn)生。
本發(fā)明范圍內(nèi)的mAb還包括對應于人抗體、動物抗體和其組合的序列。本文所用 的術(shù)語“嵌合抗體”包括具有與另一分子(例如來自人抗體的恒定結(jié)構(gòu)域)融合的來自動 物抗體(例如大鼠或小鼠抗體)之可變區(qū)的抗體。一種嵌合抗體類型“人源化抗體”具有 發(fā)生了改變的可變區(qū)(通過誘變或CDR接枝)以(盡可能地)匹配人可變區(qū)的已知序列。 CDR接枝包括將來自具有所需特異性之抗體的CDR接枝到人抗體的FR上，由此用人序列替 換大量的非人序列。因此，人源化抗體更接近地匹配(在氨基酸序列上)已知人抗體序列。 通過將小鼠單克隆抗體人源化，降低了人抗小鼠抗體(或HAMA)應答的嚴重程度。本發(fā)明 還包括全人抗體，其盡可能多地避免了 HAMA應答。下文更詳細地描述人源化抗體的產(chǎn)生。本文所用的“可藥用載體”任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、表面活性劑、抗 氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn) 定劑、凝膠、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、染料等材料及其組合，其對于 本領域技術(shù)人員來說是公知的(參見例如Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company，1990，1289-1329頁)。任何常規(guī)載體除非與活性成分不相容， 否則均考慮將其用于治療或藥物組合物中。在用于細胞時，術(shù)語“接觸”在本文中用于描述本發(fā)明化合物被遞送到靶細胞或者 處于與靶細胞直接相鄰的位置。如說明書和/或權(quán)利要求書中所用的術(shù)語“有”(例如“有效量”)意為足夠?qū)崿F(xiàn) 所期望的、預計的或者計劃的結(jié)果。術(shù)語“基本上”及其變化形式定義為在很大程度上但是并不一定完全地，如本領域 普通技術(shù)人員所理解的，在一個非限制性實施方案中，基本上表示10%、5%、1%或0.5% 以內(nèi)的范圍。術(shù)語“抑制”、“減少”或“防止”或這些術(shù)語的任何變化形式，在用于權(quán)利要求和/ 或說明書時包括任何可測量的減少或者完全抑制，以實現(xiàn)所需結(jié)果。例如，可以是相比于 正常而言活性減少或降低 5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%, 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更多或其中引出的任何范圍。在本申請全文中，術(shù)語“約”用于表示包括用于測定數(shù)值的裝置或方法的固有誤差 變化，或者研究對象之間存在的變化的值。例如，“約”可以是在10%、優(yōu)選5%、更優(yōu)選1%、 最優(yōu)選0.5%內(nèi)。在權(quán)利要求和/或說明書中與術(shù)語“包括”或“包含”聯(lián)用時，單數(shù)形式可能意為 “一個/種”，但是也與“一個或多個”、“至少一個”以及“一個或多于一個”的含義一致。除非明確指明可選方案是唯一的或者可選方案是互斥的，否則在權(quán)利要求中術(shù)語 “或”的使用意為“和/或”，盡管本公開內(nèi)容支持表示唯一可選以及“和/或”的定義。本說明書中和權(quán)利要求書中所用的表述“包括”(以及任何形式的包括)、“具 有”(以及任何形式的具有)、“包含”(以及任何形式的包含)或“含有”(以及任何形式的 含有)是包含性質(zhì)的或者開放式的，不排除其它未陳述的要素或方法步驟。本發(fā)明涉及說明書中所述任何實施方案可針對本發(fā)明的任何化合物、方法或組合 物而實施，反之亦然。通過下述詳細說明，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。但是，應當 理解的是，盡管指出了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但詳細說明和具體實施例僅以舉例說明的
6方式給出，因為從本詳細說明出發(fā)在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的多種變化和修改對于本領域技 術(shù)人員來說是顯而易見的。


下列附圖構(gòu)成本說明書的一部分，其用于進一步說明本發(fā)明的某些方面。參考這 些附圖的一個或多個并結(jié)合本文給出的具體實施方案的詳細說明可更好地理解本發(fā)明。圖 IAPC ELISA 標準曲線。圖2HAP 1573增強APC在內(nèi)皮上的結(jié)合。圖3HAPC1573促進APC內(nèi)化進EA細胞。圖4HAPC1573改變APC對發(fā)色底物的酰胺裂解活性。圖5在血漿凝血測定中HAPC1573阻斷APC抗凝血活性。圖6HAPC1573增強APC對組蛋白的切割。圖7A-B HAPC1573對APC針對組蛋白之細胞保護作用的影響。圖8A-C MPC1609和MAPC1591抑制APC抗凝血活性。(圖8A)在無或有125nM MPC1609或MAPC1591存在的情況下將bEnd3細胞與IOOnM FL-APC 一起在冰上孵育15分 鐘，進行流式細胞術(shù)。(圖8B)在無或有IOOnM MPC1609或MAPC1591存在的情況下將bEnd3 細胞與IOOnM蛋白C和5nM凝血酶一起在37攝氏度下孵育15分鐘，通過PCa發(fā)色底物測 定APC活性。(圖8C)使用200ng/ml在有或無5 μ g/ml MPC1609或MAPC1591存在的情況 下測定單級血漿凝固時間。一式兩份進行蛋白C活化和凝血測定，所有誤差均在5%以內(nèi)。圖9MPC1609而不是MAPC1591使小鼠惡化成在亞致死劑量的LPS下死亡。將IOmg/ kg LPS以及10mg/kg MPC1609或MAPC1591靜脈內(nèi)注射給BL6小鼠，標明了存活率。圖10A-D用LPS和MPC1609或MAPC1591攻擊的小鼠的體溫、血清IL_6、BUN和肌 酐水平。將鹽水、10mg/kg LPS 或者 10mg/kg LPS 與 10mg/kg MPC1609 或 MAPC1591 靜脈內(nèi) 注射給BL6小鼠(每組4只小鼠)。攻擊小鼠3小時或18小時后測定(圖10A)小鼠體溫， (圖10B)血清IL-6，(圖10C-D)血清BUN和肌酐水平。圖11A-C、MAPC1591增強APC對組蛋白的切割。(圖11A)將Opti-ΜΕΜ中的100 微克/毫升牛胸腺組蛋白H3(左圖)或H4(右圖)在含或不含IOOnM APC以及存在或不存 在200nM MAPC1591的情況下在37攝氏度下孵育1小時。然后將樣品進行SDS-PAGE和考 馬斯藍染色。(圖11B)在有或沒有APC (IOOnM)和MAPC1591 (200nM)的情況下將EA. hy926 細胞與牛胸腺組蛋白(50微克/毫升)一起在37攝氏度下培養(yǎng)1小時。通過PI(FL3)陽 性染色的流式細胞術(shù)測定細胞死亡。(圖11C)將鹽水、10mg/kg LPS或者10mg/kg LPS與 10mg/kg MAPC1591或MPC1609靜脈內(nèi)注射給BL6小鼠。攻擊后18小時取血漿樣品，對其進 行SDS-PAGE并使用山羊抗組蛋白H3抗體進行蛋白質(zhì)印跡。示例性實施方案的描述本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)這樣的單克隆抗體，其選擇性結(jié)合活化蛋白C但不結(jié)合未活化蛋 白C并且特異性抑制活化蛋白C的抗凝血活性。下文更詳細地描述本發(fā)明的這些及其它方面。A.抗體結(jié)構(gòu)抗體包含具有共同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白大家族?？贵w由四條多肽構(gòu)成，其形成類似于字母Y的三維結(jié)構(gòu)。通常，抗體由兩條不同的多肽構(gòu)成，即重鏈和輕鏈?？贵w分子由一個 或多個Y單元構(gòu)成，每個Y包含兩條重鏈和兩條輕鏈?？贵w分子通常由三個功能結(jié)構(gòu)域組成Fc、Fab和抗原結(jié)合位點。Fc結(jié)構(gòu)域位于Y 的底部。Y的臂包含F(xiàn)ab結(jié)構(gòu)域?？乖Y(jié)合位點位于Y的每個臂的末端。Y的臂支點處的 區(qū)域是絞鏈區(qū)。有五種不同類型的重鏈多肽，其命名為α、δ、ε、Y和μ。有兩種不同類型的輕 鏈多肽，其命名為κ和λ?？贵w通常含有僅僅一種類型的重鏈以及僅僅一種類型的輕鏈， 盡管任何輕鏈都可與任何重鏈結(jié)合。每個重鏈多肽的羧基端稱為恒定(Fe)區(qū)。每個重鏈和輕鏈多肽的氨基端稱為可 變(V)區(qū)。在鏈的可變區(qū)內(nèi)有高變區(qū)，其被稱為互補性決定區(qū)(CDR)。一個重鏈和一個輕鏈 的可變區(qū)聯(lián)合形成抗原結(jié)合位點。每個重鏈和每個輕鏈包含三個CDR?？乖Y(jié)合位點的6 個CDR確定了形成實際抗原結(jié)合部位的氨基酸殘基。CDR的可變性導致了抗原識別的多樣 性。B.本發(fā)明單克隆抗體的制備本發(fā)明涉及能夠與另一分子“特異性結(jié)合”的分子的生產(chǎn)和用途。如本文使用的， 如果結(jié)合依賴于分子各自的結(jié)構(gòu)，則稱分子能夠“特異性結(jié)合”另一個分子。抗體結(jié)合免疫 原的已知能力是“特異性結(jié)合”的一個實例。這種相互作用與非特異性結(jié)合不同，所述非特 異性結(jié)合涉及化合物種類，與其化學結(jié)構(gòu)無關(guān)(例如蛋白質(zhì)與硝酸纖維素的結(jié)合，等)。最 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體會顯示“高特異性結(jié)合”，使得它們不能或基本上不能結(jié)合密切相關(guān) 的異源分子。事實上，本發(fā)明的優(yōu)選單克隆抗體顯示結(jié)合活化蛋白C的能力，但是基本上不 能結(jié)合未活化蛋白C。在另一些實施方案中，所述單克隆抗體通過結(jié)合和阻斷APC的蛋白水 解活性位點而僅特異性抑制APC的抗凝血活性。因此，在一個實施方案中，這些分子包括例如通過mAb的蛋白水解切割產(chǎn)生的片 段(例如(F(ab' )、F(ab' ) 2)，或者例如可通過重組手段產(chǎn)生的單鏈免疫球蛋白。這些 抗體衍生物是單價的。在一個實施方案中，這些片段可彼此組合，或者與其它抗體片段或受 體配體組合，形成“嵌合”結(jié)合分子。重要地，此類嵌合分子可含有能夠結(jié)合同一分子中不 同表位的取代基，或者它們可能夠結(jié)合活化蛋白C表位以及“未活化蛋白C”表位。單克隆抗體可容易地通過眾所周知的方法來制備，例如美國專利4，196，265中舉 例說明的那些，其在此通過引用并入本文。通常，方法涉及首先用所選的抗原(例如本發(fā)明 的多肽或多核苷酸)以足以提供免疫應答的方式免疫合適的動物。嚙齒類動物例如小鼠和 大鼠是優(yōu)選的動物。然后，將來自免疫動物的脾細胞與永生化骨髓瘤細胞融合。當所述免 疫動物是小鼠時，優(yōu)選的骨髓瘤細胞是小鼠NS-I骨髓瘤細胞。將所述融合的脾/骨髓瘤細胞培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基中，以選擇來自母細胞的融合 脾/骨髓瘤細胞。將融合細胞與未融合的母細胞混合物分離開，例如，通過添加阻斷組織培 養(yǎng)基中核苷酸從頭合成的物質(zhì)。示例性以及優(yōu)選的物質(zhì)是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和偶氮絲氨 酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻斷嘌呤和嘧啶的從頭合成，而偶氮絲氨酸僅阻斷嘌呤合成。當 使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤時，培養(yǎng)基中補充次有黃嘌呤和胸苷作為核苷酸來源。當使用偶 氮絲氨酸時，培養(yǎng)基中補充有次黃嘌呤。該培養(yǎng)提供了用于選擇特定雜交瘤的雜交瘤群體。通常，雜交瘤的選擇通過單克
8隆稀釋在微量滴定板中培養(yǎng)細胞來進行，然后檢測各個克隆上清與抗原多肽的反應性。然 后，無限擴增所選克隆，以提供單克隆抗體。例如，為產(chǎn)生單克隆抗體，將包含多肽的約1-200 μ g抗原腹膜內(nèi)注射給小 鼠。通過注射與佐劑例如完全弗氏佐劑(含有殺死的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的免疫應答非特異性刺激物)組合的抗原來刺激B淋巴細胞生長。在第一 次注射后的某個時間(例如至少兩周)，通過注射第二劑與弗氏不完全佐劑混合的抗原對 小鼠進行加強。第二次注射后數(shù)周，對小鼠進行尾部取血，通過針對放射性標記抗原的免疫沉淀 測定血清效價。優(yōu)選地，重復進行加強和測定效價的過程直至獲得合適的效價。取出具有 最高效價的小鼠脾，用注射器將脾勻漿獲得脾淋巴細胞。通常，來自免疫小鼠的脾含有約 5X107至2X108個淋巴細胞。被稱為骨髓瘤細胞的突變淋巴細胞獲得自實驗動物，其中這些細胞已經(jīng)通過多種 眾所周知的方法誘導生長。骨髓瘤細胞缺乏核苷酸生物合成的補救途徑。由于骨髓瘤細胞 是腫瘤細胞，所以它們可在組織培養(yǎng)物中無限增殖，因此稱為永生化。已經(jīng)建立了多種來自 小鼠和大鼠的骨髓瘤細胞培養(yǎng)細胞系，例如鼠NS-I骨髓瘤細胞。在適于促進融合的條件下，將骨髓瘤細胞與來自注射抗原/多肽的小鼠或大鼠脾 的產(chǎn)生抗體之正常細胞相組合。融合條件包括例如存在聚乙二醇。所得融合細胞是雜交瘤 細胞。類似于骨髓瘤細胞，雜交瘤細胞在培養(yǎng)物中無限生長。通過在選擇培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)中培養(yǎng)，將雜交 瘤細胞與非融合的骨髓瘤細胞分離開。未融合的骨髓瘤細胞缺乏從補救途徑合成核苷酸所 必需的酶，因為它們在氨基蝶呤、甲氨蝶呤或偶氮絲氨酸存在下被殺死。未融合淋巴細胞在 組織培養(yǎng)物中也不會繼續(xù)生長。因此，只有成功融合的細胞(雜交瘤細胞)可以在選擇培 養(yǎng)基中生長。每個存活的雜交瘤細胞產(chǎn)生一種抗體。然后，對這些細胞篩選對抗原/多肽具有 免疫反應性之特異性抗體的產(chǎn)生。有限稀釋雜交瘤分離出單細胞雜交瘤。多次連續(xù)稀釋雜 交瘤，在使稀釋物生長之后，檢測上清中單克隆抗體的存在。然后大量培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的克 隆，以產(chǎn)生適宜量的抗體。Liaw等人(2003)(在此通過引用并入本文)描述了某些抗人活化蛋白C和人未活 化蛋白C的小鼠單克隆抗體的制備。當所述抗體或其片段用于治療目的時，將其“人源化”以減弱任何免疫反應可能是 理想的。這些人源化抗體可以在體外或體內(nèi)情形下進行研究。例如可以通過用相應非免 疫原性部分替代抗體的免疫原性部分來產(chǎn)生人源化抗體(即嵌合抗體)。Robinson等人， PCT 申請 PCT/U. S. 86/02269 ；Akira 等人，EP 申請 184，187 ；Taniguchi，EP 申請 171，496 ； Morrison 等人，EP 申請 173，494 ；Neuberger 等人，PCT 申請TO 86/01533 ；Cabilly 等人，EP 申請 125，023 ；Better 等人(1988) ；Liu 等人(1987) ；Liu 等人(1987) ；Sun 等人(1987)； Nishimura等人(1987) ；Wood等人(1985) ；Shaw等人(1988)；所有這些在此通過引用并入 本文。“人源化”嵌合抗體的一般性綜述由Morrison (1985)以及Oi等人(1986)提供；其在 此通過引用并入本文。或者，合適的“人源化”抗體可通過⑶R或CEA替換來產(chǎn)生。Jones等人(1986)；Verhoeyan等人(1988) ；Beidler等人(1988)；所有這些在此通過引用并入本文。D.藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物包含溶解或分散于可藥用載體中的有效量的一種或多種抗 體、治療劑或添加物質(zhì)。本發(fā)明的水性組合物包含溶解或分散于可藥用載體或水介質(zhì)中的 有效量抗體。短語“可藥用”表示在適當?shù)厥┯媒o動物或人時不產(chǎn)生不利、過敏或其它不良 反應的分子實體和組合物。本文使用的“可藥用載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、表面活 性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥 物、藥物穩(wěn)定劑、凝膠、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、染料等材料及其 組合，其對于本領域技術(shù)人員來說是公知的(參見例如Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company，1990，1289-1329 頁，其在此通過引用并入本 文)。這些介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領域中眾所周知的。任何常規(guī)介質(zhì)或 試劑除非與所述活性成分不相容，否則均考慮用于所述治療組合物中。還可將補充性活性 成分加入所述組合物中。對于人施用而言，制劑應滿足FDA生物學標準所要求的無菌、無熱 源、一般安全性和純度標準。適當時，所述生物材料應充分透析以除去不希望的小分子量分子和/或凍干用以 更容易地配制到所期望載體中。然后，所述活性化合物一般配制成用于胃腸外施用，例如配 制成用于通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、病變內(nèi)或者甚至腹膜內(nèi)進行注射。通常，這些組合 物可制備為可注射形式，液體溶液或混懸液；也可制備成適用于在注射之前添加液體以制 備溶液或混懸液的固體形式；還可將所述制劑乳化。適于注射使用的藥物形式包括無菌水溶液或分散體；包含芝麻油、花生油或丙二 醇水溶液的制劑；以及用于即時制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。在所有情況下，所 述形式必須是無菌的，并且必須是易于注射程度的流體。其在制備和儲存條件下必須是穩(wěn) 定的，必須防止微生物(例如細菌和真菌)污染。所述活性化合物作為游離堿或可藥用鹽的溶液可在適當?shù)鼗煊斜砻婊钚詣├?羥丙基纖維素的水中制備。也可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中制備分散體。在 普通的儲存和使用條件下，這些制劑含有防止微生物生長的防腐劑。本發(fā)明的抗體可制備成游離堿、中性或鹽形式的組合物?？伤幱名}包括酸加成鹽 (與蛋白質(zhì)的游離氨基形成)，以及與無機酸(例如鹽酸或磷酸)或者有機酸(例如醋酸、 草酸、酒石酸、扁桃酸)等形成的酸加成鹽。與游離羧基形成的鹽也可來自無機堿(例如氫 氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)以及有機堿(例如異丙胺、三甲胺、組 氨酸、普魯卡因)等等。所述載體還可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙 二醇和液體聚乙二醇等)以及其合適的混合物，以及植物油?？梢岳缤ㄟ^使用包衣(例 如卵磷脂)、通過保持所需粒度(在分散體的情況下)以及通過使用表面活性劑來保持合適 的流動性?？赏ㄟ^多種抗細菌劑和抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞 血酸、硫柳汞等)防止微生物作用。在許多情況下，包含等滲劑(例如糖或氯化鈉)是優(yōu)選 的。所述可注射組合物的延長吸收可通過在所述組合物中包含延遲吸收的試劑(例如單硬 脂酸鋁和明膠)來實現(xiàn)。
必要時，可通過將所需量的活性化合物與多種上述其它成分摻入合適的溶劑中， 隨后過濾除菌來制備無菌注射溶液。通常，通過將多種無菌活性成分摻入無菌載體中來制 備分散體，所述載體含有基本分散介質(zhì)和上文列舉的其它所需的成分。在用于制備無菌注 射溶液的無菌粉末的情形下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干技術(shù)，它們從之前經(jīng)過濾 除菌的溶液產(chǎn)生所述活性成分加任何額外所需成分的粉末。還涉及用于直接注射的更濃縮 或高濃縮溶液的制劑，其中設想使用DMSO作為溶劑，導致非?？焖俚拇┩?，將高濃度活性 劑遞送到小的區(qū)域。配制之后，將溶液以與劑型(dosage formulation)相容的形式和治療有效的量施 用。所述制劑容易地以多種劑型施用，例如上文所述的注射液類型，還可使用藥物釋放膠囊寸。例如，對于水溶液的胃腸外施用，如果必要，所述溶液應該適當?shù)鼐彌_，首先用 足夠的鹽水或葡萄糖使得液體稀釋劑等滲。這些特定的水溶液尤其適合于靜脈內(nèi)、肌 內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)和腹膜內(nèi)施用。就此而論，在本公開內(nèi)容的指導下，可利用的無菌水性介 質(zhì)對本領域技術(shù)人員來說是公知的。例如，一劑可溶于1毫升等滲NaCl溶液中，添加 到IOOOml皮下灌注流體或者注射到輸注的預定部位(參見例如，"Remington' s PharmaceuticalSciences〃 第 15 版，1035-1038 頁和 1570-1580 頁)。根據(jù)所治療對象的 情況，劑量必然會發(fā)生一些變化。在任何情況下，負責施用的人會確定對于單個對象的合適 劑量。除了配制用于胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射)的化合物之外，其它可藥用 形式包括例如片劑或用于經(jīng)口施用的其它固體；脂質(zhì)體制劑；延時釋放膠囊；以及任何其 它目前使用的形式，包括霜劑。在某些實施方案中，涉及使用脂質(zhì)體和/或納米顆粒，以配制和施用所述抗體和/ 或其類似物。脂質(zhì)體的形成和用途通常是本領域技術(shù)人員公知的，也如下文所述。納米膠囊通常能以穩(wěn)定且可再生的形式包封化合物。為了避免由于胞內(nèi)聚合物超 負荷造成的副作用，應當利用能夠體內(nèi)降解的聚合物來設計這些超細顆粒(約0.1微米大 小)。設想將滿足這些要求的可生物降解聚烷基-氰基丙烯酸酯納米顆粒用于本發(fā)明，這些 顆?？扇菀椎刂圃臁Ｖ|(zhì)體由分散于水介質(zhì)中并自發(fā)形成多層同心雙層囊泡(也稱為多層囊泡 (multilamellar vesicles,MLV))的磷脂形成。MLV —般具有25納米至4微米的直徑。對 MLV超聲導致形成直徑在200-500埃范圍內(nèi)的小單層囊泡(SUV)，其在核心中含有水溶液。下列信息也可用于產(chǎn)生脂質(zhì)體制劑。當分散于水中時，磷脂可形成除了脂質(zhì)體之 外的多種結(jié)構(gòu)，這取決于脂質(zhì)與水的摩爾比。在低比值時，脂質(zhì)體是優(yōu)選結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體的物 理性質(zhì)取決于PH、離子強度和二價陽離子的存在。脂質(zhì)體可顯示出對離子和極性物質(zhì)的低 透過性，但是在高溫下發(fā)生顯著改變了其透過性的相變。所述相變包括從致密堆積的有序 結(jié)構(gòu)(稱為凝膠狀態(tài))變?yōu)槭杷啥逊e的低有序結(jié)構(gòu)(稱為流體狀態(tài))。這在特征性相變溫 度下發(fā)生，導致對離子、糖和藥物的透過性增加。脂質(zhì)體通過四種不同機制與細胞相互作用被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬細胞(例如巨 噬細胞和中性粒細胞)胞吞；通過非特異性弱疏水作用或靜電力或者通過與細胞表面組分 的特異性相互作用而吸附于細胞表面；通過將脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層插入質(zhì)膜而與漿細胞膜融合，同時將脂質(zhì)體內(nèi)含物釋放進細胞質(zhì)；以及將脂質(zhì)體脂質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎せ騺喖毎?反 之亦然)，而沒有任何與脂質(zhì)體內(nèi)含物的結(jié)合。盡管可以有超過一種的機制同時作用，改變 脂質(zhì)體制劑可改變起作用的作用機制。所述治療劑可包含不同類型的載體，這取決于是以固體、液體還是氣霧劑形式施 用，以及對于比如注射的施用途徑而言是否需要無菌。本發(fā)明可以下列方式施用靜脈 內(nèi)、真皮內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病變內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃 體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、表面(topically)、腫瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、囊泡內(nèi)、粘 膜、心包內(nèi)、臍帶內(nèi)、眼內(nèi)、經(jīng)口、表面、局部、吸入(例如氣霧劑吸入)、注射、輸注、連續(xù)輸 注、局部輸注直接漫沒靶細胞、通過導管、通過灌洗、在霜劑中，在脂質(zhì)組合物(例如脂質(zhì) 體)中，或者通過其它方法或任何上述的組合，如本領域普通技術(shù)人員公知的(參見例如 Remington' sPharmaceutical Sciences，第 18 片反 Mack Printing Company，1990，在此通 過引用并入本文)。施用給動物患者的本發(fā)明組合物的實際劑量可根據(jù)物理和生理因素例如體重、病 癥嚴重程度、待治療疾病的類型、之前或同時的治療性介入、患者的特發(fā)病以及施用途徑來 確定。在任何情況下，由對施用負責的醫(yī)生為單個對象確定組合物中活性成分的濃度和合 適的劑量。在某些實施方案中，藥物組合物可包含例如至少約0. 的活性化合物。在其它 一些實施方案中，活性化合物可為單位重量的約2 %至約75 %，或者例如約25 %至約60 %， 以及可由其中得出的任何范圍。在另一些非限制性實例中，每次施用的劑量還可為約1微 克/千克體重、約5微克/千克體重、約10微克/千克體重、約50微克/千克體重、約100 微克/千克體重、約200微克/千克體重、約350微克/千克體重、約500微克/千克體重、 約1毫克/千克體重、約5毫克/千克體重、約10毫克/千克體重、約50毫克/千克體重、 約100毫克/千克體重、約200毫克/千克體重、約350毫克/千克體重、約500毫克/千 克體重、約1000毫克/千克體重以及可由其中得出的任何范圍。在從本文所列數(shù)字衍生范 圍的非限制性實例中，基于上文所述的數(shù)字，可施用約5毫克/千克體重至約100毫克/千 克體重、約5微克/千克體重至約500毫克/千克體重等等。在任何情況下，所述組合物可包含多種抗氧化劑，以延遲一種或多種成分的氧化。在所述組合物是液體形式的實施方案中，載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其包括但 不限于水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、脂質(zhì)(例如甘油三酯、植物 油、脂質(zhì)體)及其組合?？赏ㄟ^下列方式維持合適的流動性，例如，使用包衣劑例如卵磷脂； 通過分散在載體例如液體多元醇或脂質(zhì)來維持所需粒徑；使用表面活性劑例如羥丙基纖維 素；或其組合。在許多情況下，優(yōu)選的是包含等滲劑例如糖、氯化鈉或其組合。在另一些實施方案中，可在本發(fā)明中使用的滴眼劑、洗鼻液(nasalsolution)或 噴霧劑、氣霧劑或吸入劑。這些組合物一般設計成與靶組織類型相容。在非限制性實例中， 洗鼻液通常是設計成以滴劑或噴霧劑施用到鼻道的水溶液。制備鼻溶液使得它們在許多方 面類似于鼻分泌物，從而維持正常的纖毛作用。因此，在一些優(yōu)選實施方案中，水性洗鼻液 通常是等滲的或稍加緩沖，以維持約5. 5至約6. 5的pH。另外，如果需要，可將類似于眼科 制劑所用的抗微生物防腐劑、藥物或合適的藥物穩(wěn)定劑包含在所述制劑中。例如，多種可商 購鼻制劑是公知的，包括藥物例如抗生素或抗組胺劑。
12
在某些實施方案中，將抗體制備成用于通過經(jīng)口攝入的此類途徑來施用。在這些 實施方案中，所述固體組合物可包括例如溶液、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊(例如硬殼 或軟殼明膠膠囊)、持續(xù)釋放制劑、口含組合物、錠劑、酏劑、混懸劑、糖漿、薄片劑(wafer) 或者其組合。經(jīng)口組合物可直接摻入到膳食食物中。用于經(jīng)口施用的優(yōu)選載體包括惰性稀 釋劑、可吸收食用載體或其組合。在本發(fā)明的另一些方面，所述經(jīng)口組合物可制備成糖漿或 酏劑。糖漿或酏劑可包含例如至少一種活性劑、甜味劑、防腐劑、調(diào)味劑、染料、防腐劑或其 組合。在某些優(yōu)選實施方案中，經(jīng)口組合物可包含一種或多種粘合劑、賦形劑、崩解劑、 潤滑劑、調(diào)味劑和其組合。在某些實施方案中，組合物可包含下列的一種或多種粘合劑例 如黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠或其組合；賦形劑例如磷酸氫鈣、甘露醇、乳糖、淀粉、 硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂或其組合；崩解劑例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸或其 組合；潤滑劑例如硬脂酸鎂；甜味劑例如蔗糖、乳糖、糖精或其組合；調(diào)味劑例如薄荷、冬青 油、櫻桃調(diào)味品、橙調(diào)味品等等；或上述的組合。當劑量單位形式是膠囊時，其可含有除上述 材料類型之外的載體，例如液體載體。多種其它材料可作為包衣存在，或者以其它方式修飾 劑量單位的物理外形。例如，片劑、丸劑或膠囊可用蟲膠、糖或兩者包衣。適于其它施用方式的另外制劑包括栓劑。栓劑是多種重量和形狀的固體劑型，通 常用于插入直腸、陰道或尿道用藥。在插入后，栓劑軟化、融化或溶于腔內(nèi)流體中。通常，對 于栓劑來說，傳統(tǒng)載體可包括例如聚烷撐二醇、甘油三酯或其組合。在某些實施方案中，栓 劑可由包含例如約0. 5%至約10%、優(yōu)選約至約2%的活性成分的混合物形成。所述組合物在制備和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，必須防止微生物(例如細菌和真 菌)的污染作用。應當理解的是，內(nèi)毒素污染最低限度應維持在安全水平，例如低于0. 5ng/ mg蛋白質(zhì)。在一些特定實施方案中，通過在組合物中使用延遲吸收的物質(zhì)例如單硬脂酸鋁、 明膠或其組合，可帶來注射組合物的延長吸收。E.藥盒本文所述的任何組合物均可包含在藥盒中。因此，所述藥盒包含在合適的容器裝 置中的本發(fā)明抗體和/或其它物質(zhì)。本發(fā)明人設想了可包含在藥盒中的其它組分。本發(fā)明 的治療性藥盒包含在合適的容器裝置中在可藥用制劑中的抗體可藥用制劑。所述藥盒可具 有單個容器裝置和/或其可具有針對各個化合物的不同容器裝置。當所述藥盒的組分在一種和/或多種液體溶液中提供時，所述液體溶液是水溶 液，無菌水溶液是特別優(yōu)選的。所述抗體還可配制成可注射組合物，在這種情況下，所述容 器裝置本身可以是注射器、移液管和/或其它類似裝置，從其中將所述試劑施加到身體的 患病區(qū)域、注射到動物中和/或甚至施加到所述藥盒的其它成分中和/或與其混合。但是，所述藥盒的組分可以干燥粉末的形式提供。當以干燥粉末形式提供試劑和/ 或組分時，所述粉末可以通過添加合適溶劑而重構(gòu)。設想所述溶劑還可在另一個容器裝置 中提供。所述容器裝置一般包括西林瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器和/或其它容器裝置中的 至少一個，所述抗體/抗體制劑被置于其中，優(yōu)選合適地分配在其中。所述藥盒還可包含第 二容器裝置，用于容納無菌可藥用緩沖液和/或其它稀釋劑。
本發(fā)明的藥盒還通常包含用于緊密固定地容納西林瓶以進行銷售的裝置，例如注 塑和/或吹塑的塑料容器，所述西林瓶被放置于其中。不論容器的數(shù)目和/或類型如何，本發(fā)明的藥盒還可包含工具和/或與其包裝在 一起，所述工具用于協(xié)助將所述最終抗體注射/施用和/或放置于動物體內(nèi)。此工具可以 是注射器、移液管、鉗子和/或任何此類醫(yī)學上批準的遞送工具。F.實施例包含下列實施例以展示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領域技術(shù)人員應當理解的是， 下文實施例公開的方法代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實施中工作良好的方法，因此可被認 為構(gòu)成其實施的優(yōu)選形式。但是，本領域技術(shù)人員應當理解的是，在本公開內(nèi)容的教導下， 在公開的具體實施方案中可進行許多改變，并仍獲得類似或相似的結(jié)果，而不脫離本發(fā)明 的精神和范圍。實施例1-篩選、鑒定和使用本發(fā)明人MAb的方法材料。如之前所述制備人蛋白C、牛凝血酶(Esmon等人，1993 ；在此通過引用以 整體并入本文)。重組 APC(Xigris)來自 Eli Lilly。Spectroxyme PCa 來自 American Diagnostica0 1_棕櫚?；鵢2_油酰基-磷脂酰膽堿(PC)、1_棕櫚?；鵢2_油?；字?絲氨酸(PS)和1-棕櫚?；?2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(PE)來自Avanti Polar Lipids, Inc.。人內(nèi)皮細胞來源的EA. hy926細胞被維持在補充了 10 %胎牛血清、L-谷氨酰胺和 HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)的 DMEM(Dulbecco' s modified Eagle' s medium)中。 用來自Molecular Probes的熒光素-EX蛋白標記試劑盒根據(jù)制造商說明制備熒光素標記 的APC(FL-APC)。在這些實施例中，沒有用“活化的”修飾的“蛋白C”指未活化蛋白C。小鼠抗人蛋白C和APC單克隆抗體的產(chǎn)生。通過標準技術(shù)開發(fā)抗人蛋白C或APC 的小鼠單克隆抗體(mAb) (Rezaie and Esmon，1992)。篩選蛋白C或APC的特異性mAb。通過FACS篩選mAb阻斷FL-APC與EA. hy926 細胞結(jié)合的能力而獲得了人蛋白C mAb 1574和1580(HPC1575和HPC1580)。簡要地，將 EA. hy926細胞與50nM FL-蛋白C和IOOnM多種抗蛋白C的單克隆抗體在含有0. 5% BSA、 3mM CaCl2和0.6福MgCl2的HBSS(Hanks‘平衡鹽溶液)緩沖液中一起在冰上孵育30分 鐘，對其進行FACS分析。通過ELISA測定篩選mAb與APC結(jié)合而不與蛋白C結(jié)合的能力 而獲得了人 APC mAb 1573 (HAPC 1573)。簡言之，用 15mM Na2C03、35mM NaHC03、pH9. 6 的緩 沖液中的5微克/毫升不同的mAb在4攝氏度下包被96孔MaxiSorp板(NUNC)過夜。用 含有ImM CaCl2的TTBS (含有0. 05%吐溫-20的TBS) (TTBS鈣緩沖液)清洗所述板，用在 TBS(20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, ρΗ7. 5)中 0. 明膠封閉 1 小時，用 TTBS 鈣緩沖液再次 清洗，與TTBS鈣緩沖液中的lOOng/ml蛋白C或APC —起孵育1小時。用TTBS鈣緩沖液清 洗之后，將所述板與2微克/毫升生物素化的HPC1580 —起孵育1小時，再次用TTBS鈣緩沖 液清洗，用TTBS鈣緩沖液中1微克/毫升鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物一起孵育另外1 小時。用TTBS鈣緩沖液最后一次清洗并添加對硝基苯磷酸鹽液體底物(Sigma)后，在Vmax 徽板讀數(shù)儀上讀取405nm處的終點吸光度。針對血漿中APC的ELISA測定。所述測定從前述用于篩選針對APC的mAb的ELISA 測定改變而來。簡言之，用5微克/毫升HAPC1573包被所述板，用含有IX酪蛋白(Vector Lab)的TBS封閉，再次用TTBS鈣緩沖液清洗。將重組APC以0-8ng/ml摻入到含有IOmM苯甲脒、ImMEDAT和0.25X酪蛋白緩沖液(稀釋緩沖液)或1 4稀釋的人血漿的TTBS中，將 所述板中的樣品孵育1小時。用TTBS鈣緩沖液清洗后，將板與含IOmM苯甲脒、5mM CaCl2 和0. 25X酪蛋白緩沖液的TTBS中1微克/毫升生物素化的HPC1575 —起孵育1小時。用 TTBS鈣緩沖液清洗后，將所述板與含IOmM苯甲脒、5mM CaCl2和0. 25X酪蛋白緩沖液的TTBS 中0. 5微克/毫升的鏈霉親和素-HRP —起再孵育1小時，用TTBS鈣緩沖液再次清洗，用 Ultra-TMB底物(Pierce)顯色。在添加0. 5M H2SO4停止HRP酶促反應后讀取0D450。mAb對內(nèi)皮細胞上FL-APC結(jié)合的影響。在存在或不存在多種濃度HAPC1573或 HPC1575 的情況下，將 EA. hy926 細胞與含 0. 5% BSA、3mMCaCl2 和 0. 6mM MgCl2 的 HBSS 緩沖 液中的50nM FL-APC在冰上一起孵育30分鐘，對其進行FACS分析。在血漿凝固測定中mAb對APC抗凝血活性的影響。使用ST4凝血儀器 (Diagnostica Stago)在改良的因子Xa單級凝固測定中確定mAb對血漿中APC抗凝血活 性的影響。在標準測定中，向人正常血庫血漿添加調(diào)節(jié)量的X-CP(來自魯塞爾蝰蛇毒的因 子X-活化酶)，以在含0. 1% BSA的TBS中磷脂囊泡(最終10微克/毫升40% PE,20% PS 和40% PC w/v)和CaCl2 (6. 25mM)混合物中得到30s的凝固時間。通過添加CaCl2起始凝 固。在添加CaCl2之前，添加APC (最終200ng/ml)或HAPC1573 (最終20微克/毫升)。mAb對于APC對發(fā)色底物的酰胺裂解活性的影響。通過添加50mMHEPES、1 OOmM NaCl、pH7. 5緩沖液中的50微升0_2mM系列稀釋的Spectrozyme PCa來測定在存在或 不存在66. 7nM HPC1555或HAPC1573的情況下HBSS緩沖液(含有0. 1 %牛血清白蛋白、 3mMCaCl2、0. 6mMMgCl2 的 HBSS)中 50 微升 IOnM APC 的酰胺裂解活性。組蛋白細胞毒性測定。在存在或不存在Opti-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中IOOnM APC和200nM HAPC1573的情況下，將EA. hy926細胞與牛胸腺組蛋白H3或H4 (Roche)在37 攝氏度下一起孵育1小時，然后在添加10微克/毫升碘化丙啶(PI)后在室溫下孵育5分 鐘。清洗細胞，用EDTA/PBS使其脫壁，進行針對PI陽性染色的流式細胞術(shù)。實施例2-篩選、鑒定和使用本發(fā)明的人MAb的結(jié)果HAPC1573增強內(nèi)皮上的APC結(jié)合。為了檢測HAPC1575對內(nèi)皮上APC的結(jié)合是否 具有任何影響，本發(fā)明人將EA. hy926細胞與FL-APC在存在或不存在HAPC1573或HPC1575 的情況下一起孵育，通過流式細胞術(shù)測定細胞上FL-APC的結(jié)合。流式細胞術(shù)的頻率分布圖 顯示HAPC1573增強了內(nèi)皮上的FL-APC結(jié)合，而HPC1575抑制所述細胞上FL-APC的結(jié)合 (圖2)。HAPC1573促進內(nèi)皮上的APC內(nèi)化，F(xiàn)L-APC可通過APC的Gla結(jié)構(gòu)域與細胞上的 EPCR的相互作用內(nèi)化到EA. hy926細胞中，EPCR阻斷性Ab (JRK1494)或Gla結(jié)構(gòu)域阻斷性 Ab (HPC1575)可阻斷此內(nèi)化(圖3)。HAPC1573可促進FL-APC內(nèi)化進細胞，EPCR阻斷性Ab 可完全阻斷此作用(圖3)。HAPC1573改變APC針對發(fā)色底物的酰胺裂解活性。因為HAPC1573識別ELISA板 和內(nèi)皮細胞上的APC，本發(fā)明人研究了 HAPC1573是否可影響APC針對發(fā)色底物的酰胺裂解 活性。合成肽底物通常是小分子，約幾百道爾頓的分子量，針對血漿中絲氨酸蛋白酶的多 數(shù)抗體對這些小底物的酶活性沒什么影響。但是，HAPC1573顯著改變了 APC對其發(fā)色底物 Spectrozyme PCa 的動力學參數(shù)(圖 4)。在 HAPCl573 存在時，APC 對 Spectrozyme PCa 的 km為15nM，而在Ab不存在或者HPC1555存在時則為270nM。在HAPC1573存在時，APC對 SpectrozymePCa的kcat為18，而在Ab不存在或者HPC1555存在時則為67。在HAPC1573存在時APC對小肽底物的重大改變表明，該mAb識別APC中接近活性位點的表位，Ab與抗 原的相互作用顯著增加了 APC對小肽底物的親和力，而降低了產(chǎn)物從APC催化部位離開的速率。HAPC1573阻斷血漿中APC抗凝血活性。圖5顯示，在因子Xa起始單級血漿凝固 測定中HAPC1573幾乎完全消除了 APC的延時作用，表明HAPC1573與APC的相互作用阻止 APC切割因子Va。HAPC1573對APC切割細胞外組蛋白的影響。最近，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)APC可切割細胞 外組蛋白，并保護內(nèi)皮免受組蛋白的細胞毒性(稿件正在準備中)。因為HAPC1573改變了 APC對發(fā)色底物的酰胺裂解活性并阻斷血漿中APC的抗凝血活性，本發(fā)明人研究了此mAb是 否可影響APC切割細胞外組蛋白H3和H4以及影響APC為內(nèi)皮提供針對組蛋白H3和H4細 胞毒性的細胞保護作用。出乎意料地，HAPC1573不抑制而實際上提高APC對組蛋白H3和H4的切割(圖 6)。一致地，HAPC1573不抑制而是略微增強APC在內(nèi)皮上抗組蛋白H3和H4的細胞保護活 性(圖 7A-B)。實施例3-篩選、鑒定和使用本發(fā)明的人MAb的討論蛋白C由與內(nèi)皮上凝血調(diào)節(jié)蛋白復合的凝血酶所活化。與體內(nèi)活性凝血酶的數(shù)秒 短促壽命不同，人APC在其產(chǎn)生后在循環(huán)中具有約20分鐘的半衰期(Berg等人，2003)。因 此，可以測定血漿中的APC水平，從而研究在多種病理生理條件下的調(diào)控。目前可用于測定APC的方法基于酶捕獲測定，其使用捕獲APC的抗體，然后用發(fā)色 底物測定APC活性。因為這些測定中所用的所有抗體都不僅識別APC而且還識別其酶原 (蛋白C)，又由于在正常循環(huán)中蛋白C濃度是APC的約1000倍，所以使用這些方法測定APC 不是臨床相關(guān)的。在診斷和治療中，用于APC測定的快速且有力的方法是令人期望的。上 文的結(jié)果顯示，一種mAb (即HAPC1573)識別APC而不識別蛋白C，證明開發(fā)出了用于體內(nèi) 測定血漿中APC水平的方便的ELISA方法。通常，用此方法測定含有l(wèi)ng/ml APC的血漿樣 品需要不到4小時的時間，而使用酶捕獲測定則需要19個小時或者甚至數(shù)周(Gruber and Gr if fen, 1992 ；Liaw 等人，2003)。最近的研究顯示，APC的抗凝血活性對于其細胞保護功能不是必要的，但是APC對 PARI的切割活性可能對其抗凋亡作用來說是必不可少的(Mosnier等人，2004)。但是，已 經(jīng)不僅在表達EPCR的內(nèi)皮細胞中而且在其細胞表面上不表達EPCR的其它細胞(例如神經(jīng) 元和角化細胞)中顯示出APC的細胞保護作用(Guo等人，2004 ;Berg等人，2003)，表明可 能存在PARI介導的APC信號轉(zhuǎn)導之外的機制。HAPC1573改變了 APC對發(fā)色肽底物的切割 活性，在血漿凝固測定中也阻斷了 APC抗凝血活性，表明此mAb識別APC活性位點附近的表 位，并在抗體_抗原結(jié)合后改變其催化活性。另一方面，HAPC1573不抑制而且實際上增強APC對細胞外組蛋白的切割，并且增 強APC在內(nèi)皮上針對組蛋白的細胞保護活性，表明APC切割活化因子V和VIII的抗凝血活 性對其通過切割細胞外組蛋白的細胞保護活性而言不是必需的。與抗凝血活性無關(guān)的對細 胞外組蛋白的切割可能是APC調(diào)節(jié)炎癥和細胞保護的分子機制之一。HAPC1573可例如用于治療A型血友病患者。APC切割因子VIIIa和因子Va，因此 負性調(diào)節(jié)血液凝固。在A型血友病患者中，因子VIII水平低，在這些患者中APC造成的因子Va失活可能是調(diào)節(jié)止血和血栓形成的主要途徑。最近的臨床報告證明對APC切割有抗性的 因子V Laiden突變體對A型血友病患者的出血癥狀是有益的(van' t Zant等人，1997)。 mAb例如HAPC1573阻斷體內(nèi)APC對因子Va的抗凝血活性可能是A型血友病治療的一種替 代途徑，尤其是對于具有高水平因子VIII抑制劑而使得因子VIII替代治療不會非常有效 的患者。HAPC1573的另一種可能的臨床應用是治療穩(wěn)態(tài)被破壞、可能大出血以及推遲外科 手術(shù)以恢復穩(wěn)態(tài)的外傷患者。使用HAPC1573治療可選擇性恢復前凝血狀態(tài)，而不消除活化 蛋白C的細胞保護或抗炎活性。HAPC1573的另一種可能的臨床應用是其與APC相組合用于敗血病的治療。APC目 前是唯一被FDA批準用于嚴重敗血病的藥物。其在患者中的出血副作用是由于APC的抗凝 血活性造成的。HAPC1573阻斷APC的抗凝血活性，而維持甚至增強APC的細胞保護作用。 考慮到其出血副作用，此mAb-APC復合物可能是比單獨的APC更好的治療劑。實施例4-篩選和使用本發(fā)明小鼠單克隆抗體的方法材料和方法按照標準方法在本實驗室產(chǎn)生重組小鼠蛋白C、APC、大鼠mAb MPC1609 和MAPC1591。用來自Molecular Probes的熒光素-EX蛋白標記試劑盒根據(jù)制造商的說明 制備熒光素標記的APC(FL-APC)。動物研究。根據(jù)俄克拉荷馬州醫(yī)學研究基金的動物管理和使用委員會批準的動物 方案，將6至12周齡雄性BL6小鼠用于本研究。細胞培養(yǎng)。將bEnd3細胞(小鼠腦來源的內(nèi)皮細胞系)在補充了 10%胎牛血清、 L-谷氨酰胺的 DMEM(Dulbecco' s modified Eagle' s medium)中培養(yǎng)。將 EA. hy926 細 胞(人內(nèi)皮細胞系)在補充了 10%胎牛血清、L-谷氨酰胺和HAT (次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸 苷)的DMEM中培養(yǎng)。內(nèi)皮上的FL-APC結(jié)合和蛋白C活化。在存在或不存在125nMMPC1609或MAPC1591 的情況下，將bEnd3細胞與含0.5% BSA、3mMCaCl2和0. 6mM MgCl2的HBSS緩沖液中的IOOnM FL-APC在冰上一起孵育15分鐘，對其進行FACS分析。mAb對內(nèi)皮細胞上蛋白C活化的影響。用HBSS緩沖液(含有0. 牛血清白蛋白、 3mM CaCl2、0.6mM MgCl2)將24孔板中的bEnd3細胞清洗一次，與含0. 1 μ M蛋白C和0. 1 μ M MPC1609或MAPC1591的HBSS緩沖液一起預孵育5分鐘。通過添加總體積0. 2ml的5nM牛 凝血酶起始活化反應。在37攝氏度下15分鐘后，通過向反應中添加50微升?？鼓?III (1. 67mg/ml)停止反應。將50微升上清轉(zhuǎn)移到96孔微板中，使用在IOOmM NaCl、50mM HEPES-NaOH,pH7. 5 緩沖液中的 50 微升 0. 4mMSpectrozyme PCa 底物的 405nm 的 Vmax 確定 蛋白C的活化速率。APC抗凝血活性測定。使用ST4凝血儀器(Diagnostics Stago)在改良因子Xa 單級凝固測定中測定mAb對血漿中APC抗凝血活性的影響。在該測定中，向血漿(50%小 鼠血漿和50%人正常血庫血漿)中添加調(diào)節(jié)量的X-CP(來自魯塞爾蝰蛇毒的因子X-活化 酶)，以在含0. 1 % BSA的磷脂囊泡(最終10微克/毫升40%磷脂酰乙醇胺、20%磷脂酰絲 氨酸和 40%磷脂酰膽堿，w/v)和 CaCl2 (6. 35mM，在 20Mm Tris-HCl、150mM NaCl 緩沖液(pH 7. 5)中混合物中得到30s的凝血時間。通過添加CaCl2起始凝血。在添加CaCl2之前，添加 APC (最終200ng/ml)和MPC1609 (最終5微克/毫升)或MAPC1591 (最終5微克/毫升)。
17
組蛋白細胞毒性測定。在存在或不存在Opti-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中IOOnM APC和200nM MAPC1591的情況下，將EA. hy926細胞與50微克/毫升牛胸腺組蛋白(Sigma) 在37攝氏度下一起孵育1小時，然后在添加10微克/毫升碘化丙啶(PI)后在室溫下孵育 5分鐘。清洗細胞，用PBS中0. 526mM EDTA使其脫壁，進行針對PI陽性染色的流式細胞術(shù)。IL-6、BUN和肌酐測定。在Vitros 250化學分析儀(Ortho-ClinicalDiagnostics) 上分析小鼠血清的BUN和肌酐。通過Quantikine Colorimetric夾心法ELISA(R&D Systems)測定血清 IL-6。實施例5-篩選和使用本發(fā)明小鼠單克隆抗體的結(jié)果MPC1609抗蛋白C和APC，并且可抑制蛋白C和APC在內(nèi)皮上的結(jié)合(圖8A，數(shù)據(jù) 未顯示)。MAPC1591抗APC，但是不抗蛋白C，并且可增強APC在內(nèi)皮上的結(jié)合(圖8A，數(shù)據(jù) 未顯示)。MPC1609存在時，內(nèi)皮上蛋白C的活化顯著降低(圖8B)。MAPC1591還在一定程 度上減少了蛋白C的活化，可能由于其增強了 APC在所述細胞上的結(jié)合(圖8B)。在血漿凝 固測定中，MPC1609和MAPC1591都可完全抑制APC抗凝血活性(圖8C)?；谶@些體外研 究，本發(fā)明人得出以下結(jié)論MPC1609通過掩蔽蛋白C或APC中負責蛋白C或APC在內(nèi)皮或 磷脂上的結(jié)合的Gla結(jié)構(gòu)域來抑制蛋白C和APC在內(nèi)皮或磷脂上的結(jié)合。MAPC1591通過 與APC活性位點周圍表位的相互作用識別APC，但是不識別蛋白C，此相互作用很可能通過 阻止APC切割因子Va來抑制APC抗凝血活性。為了研究APC在LPS誘導的敗血癥休克中保護作用的分子機制，本發(fā)明人將亞致 死劑量的LPS與MPC1609或MAPC1591注射到小鼠中，發(fā)現(xiàn)注射LPS和MPC1609的小鼠在48 小時內(nèi)全部死亡，而注射LPS和MAPC1591的小鼠全部存活(圖9)。輸注后18小時，注射 LPS和MPC1609的小鼠顯示嚴重的敗血癥休克癥狀，包括低體溫，外周血中高中性粒細胞、 低淋巴細胞和低血小板計數(shù)(圖10A，數(shù)據(jù)未顯示)。血清IL-6水平在這些小鼠中非常高 (圖10B)，但是在這些小鼠和注射LPS加MAPC1591的小鼠之間沒有觀察到心臟、肺、肝、脾、 胸腺和外周血中IL-6mRNA水平的顯著性差異(數(shù)據(jù)未顯示)，表明IL-6的從頭合成可能 不是敗血癥休克小鼠中持續(xù)高IL-6水平的主要原因。注射LPS和MPC1609的小鼠中血清 BUN和肌酐水平比其它小鼠的高(圖10C-D)，表明這些小鼠中發(fā)生的急性腎衰竭，可能是由 于IL-6清除緩慢造成的。令人感興趣地是，注射LPS和MAPC1591的小鼠中BUN和肌酐水 平甚至比僅注射LPS的小鼠中的水平還低(圖10C)，表明在LPS攻擊時MAPC1591和APC的 復合物對腎的體內(nèi)保護可能比APC更有效。細胞外組蛋白可見于活化的嗜中性粒細胞和巨噬細胞以及凋亡的細胞上 (Brinkmann等人，2004 ；Radic等人，2004)，它們對哺乳動物細胞有細胞毒性(Abakushin 等人，1999 ；Currie等人，1997 ；Kleine等人，1997)。APC可切割組蛋白H3和組蛋白H4， MAPC1591不抑制而是事實上增強APC對這些組蛋白的切割(圖10A)。APC可減少組蛋白對 內(nèi)皮的細胞毒性，MAPC1591可增強此APC細胞保護活性(圖11B)。在注射LPS和MPC1609 后的敗血病小鼠血清中檢測到細胞外組蛋白，而未在注射LPS或LPS和MAPC1591的小鼠中 檢測到(圖11C)，表明蛋白C活化不足、循環(huán)中細胞外組蛋白的存在與小鼠在敗血癥休克 中的致死性之間的體內(nèi)相關(guān)性。綜合這些體外數(shù)據(jù)與體內(nèi)結(jié)果，本發(fā)明人可通過MAPC1591 將APC的細胞保護活性與其抗凝血活性區(qū)分開來，不依賴于抗凝血活性的APC對細胞毒性 組蛋白的切割提供了 APC防止小鼠發(fā)生LPS誘導敗血癥休克的新的分子機制。
實施例6-篩選和使用本發(fā)明小鼠單克隆抗體的討論蛋白C通路在凝血和炎癥的調(diào)節(jié)中起到重要的作用(Esmon，2006)。已經(jīng)證明人 APC顯著降低嚴重敗血病中的死亡率，并且已被批準用作針對嚴重敗血病治療的第一種藥 物(Bernard等人，2001)。但是，對敗血癥中APC保護作用的分子機制仍然知之甚少。誘變研 究表明，APC的抗凝血活性顯然對APC對內(nèi)皮細胞的抗凋亡作用是非必需的(Mosnier等人， 2004)，APC信號轉(zhuǎn)導的抗炎和抗凋亡作用在內(nèi)皮細胞中是由蛋白酶活化的受體-1 (PAR-I) 介導的(Reiwald等人，2002)。但是，在LPS攻擊時，PAR-I缺陷型小鼠具有與野生型對照小 鼠類似的表型，表明PAR-I可能不是體內(nèi)APC調(diào)節(jié)炎癥和細胞保護的主要因素(Pawlinski 等人，2004 ；Camerer 2006)。考慮到APC在體內(nèi)調(diào)節(jié)病理生理功能的核心作用，本發(fā)明人制 備了兩種抗小鼠蛋白C和小鼠APC的mAb，并在LPS誘導的小鼠敗血癥休克中使用這兩種 mAb研究知之甚少的APC保護作用機制。在本公開內(nèi)容的教導下，不需過度實驗即可制備和實施本文公開和要求權(quán)利保護 的所有組合物和/或方法。盡管以優(yōu)選實施方案的形式對本發(fā)明的組合物和方法進行了描 述，但是對于本領域技術(shù)人員而言顯而易見的是，在不背離本發(fā)明構(gòu)思、精神和范圍的情況 下，可對本文所述的組合物和/或方法以及在所述方法的步驟或步驟順序進行改變。更具 體地說，顯然可用化學和生理上相關(guān)的某些物質(zhì)來取代本文所述的物質(zhì)，而實現(xiàn)相同或相 似的結(jié)果。所有這些對于本領域技術(shù)人員來說顯而易見的類似取代和修改認為落在如所附 權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思之內(nèi)。參考文獻本申請全文中提及的參考文獻，包括下列參考文獻，以提供作為舉例的程序性或 其它補充本文所述內(nèi)容之細節(jié)的程度，在此通過引用特別地并入本文U. S. Patent 4, 196, 265Abakushin et al.，Biochemistry(Mosc.) ,64 :693_698，1999.Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor Press, Cold Spring Harbor, New York,1988.Beidler et al.，J. Immunol.，141 :4053_4060，1988.Berg et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 =4423-4428, 2003.Bernard et al. , New England J. Medicine, 344 :699_709，2001.Better et al. ，Science,240 :1041_1043，1988.Brinkmann, Science,203 :1532_1535，2004.Camerer，Blood,107 :3912_3921，2006.Currie et al.，Biochim. Biophys. Acta, 1355 =248-258,1997.EP Appln. 125, 023EP Appln. 171，496EP Appln. 173，494EP Appin. 184，187Esmon, In :Natural anticoagulants and their pathways,Handbook of Exper. Pharm.，132 447-476, Born et al. (Eds.)，Springer-Verlag, NY,1999.Esmon, J. Biol. Chem.，264 ；4743—4746，1989.
Esmon, Proteolytic Enzymes in Coagulation, Fibrinolysis, and Comp1ementActivation, Part A,222 359-385,1993.Esmon,Semin.Thromb. Hemost. ,32 Suppl 1 :49_60，2006.Gruber and Griffin, Blood, 79 :2340-2348,1992.Guo et al. , Neuron. ,41 :563_572，2004.Jones et al. , Nature,321 :552_525，1986.Kleine et al. , Am. J. Physiol 273 :C1925_C1936，1997.Liaw et al. , J. Thrombosis and Haemostasis, 1 :662_670,2003.Liu et al.，J. Immunol.，139 :3521 -3526，1987.Liu et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 :3439-3443,1987.Morrison, Science,229 :1202_1207，1985.Mosnier et al. ，Blood，104 :1740_744，2004.Nishimura et al. ，Cane. Res. ,47 :999-1005,1987.Oi et al. , Bio Techniques, 4 -.214, 1986.Pawlinski et al. ，Blood，103 :1342_1347，2004.PCT Appln. PCT/U. S. 86/02269PCT Appln. WO 86/01533Radic et al.，J. Immunol.，172 :6692_6700，2004.Remington' s Pharmaceutical Sciences,18th Ed., Mack Printing Company, 1289-1329，1990.Remington' s Pharmaceutical Sciences, 15th Ed.，1035-1038 and 1570—1580， 1990.Rezaie and Esmon，J.Biol. Chem.，267 :26104_26109，1992.Riewald et al.，Science, 296 :1880_1882，2002.Shaw et al. , J. Natl. Cancer Inst.，80 :1553-1559，1988·Sun et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，84 :214_218，1987.van，t Zant et al. , Blood, 90 (8) :3067_3072，1997.Verhoeyan et al.，Science,239 :1534，1988.Wood et al.，Nature, 314 =446-449, 1985.
20
權(quán)利要求
單克隆抗體，其中所述抗體結(jié)合活化的蛋白C并抑制抗凝血活性，但是不結(jié)合未活化的蛋白C或者抑制其活化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中所述與活化蛋白C的結(jié)合發(fā)生在活化蛋白C的 活性位點，并且不抑制活化蛋白C的細胞保護作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，其進一步限定為HAPC1573。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中所述對活化或未活化蛋白C的抑制是在體內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中所述對活化或未活化蛋白C的抑制是在體外。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中所述抗體是鼠抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中所述抗體是人抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中所述抗體是人源化抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中所述抗體是抗體片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的單克隆抗體，其中所述抗體片段進一步限定為Fab'、Fab、 F(ab' )2、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fv或scFv。
11.單克隆抗體，其中所述抗體抑制活化或未活化蛋白C與內(nèi)皮細胞蛋白C受體 (EPCR)或磷脂的結(jié)合，并抑制未活化蛋白C的活化。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的單克隆抗體，其中所述抗體與小鼠未活化蛋白C的Gla結(jié)構(gòu)域纟口口。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的單克隆抗體，其中所述對活化或未活化蛋白C的抑制是在體內(nèi)。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的單克隆抗體，其中所述對活化或未活化蛋白C的抑制是在體外。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的單克隆抗體，其中所述抗體是鼠抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的抗體，其中所述抗體是人抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求11的抗體，其中所述抗體是人源化抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求11的抗體，其中所述抗體是抗體片段。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的抗體，其中所述抗體片段進一步限定為Fab'、Fab、F(ab')2、 單結(jié)構(gòu)域抗體、Fv或scFv。
20.包含權(quán)利要求1的抗體以及可藥用載體的藥物組合物。
21.包含權(quán)利要求11的抗體以及可藥用載體的藥物組合物。
22.抑制對象中活化蛋白C的抗凝血活性的方法，其包括向所述對象施用有效量的權(quán) 利要求1的單克隆抗體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述單克隆抗體不降低活化蛋白C的細胞保護作用。
24.抑制對象中活化蛋白C的酰胺裂解活性的方法，其包括向所述對象施用有效量的 權(quán)利要求1的抗體。
25.治療需要凝血的對象的方法，其包括向所述對象施用有效量的權(quán)利要求1的抗體。
26.治療需要凝血的對象的方法，其包括向所述對象施用有效量的權(quán)利要求11的抗體。
27.治療患敗血癥的對象的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求1的抗體。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其還包括施用活化蛋白C。
29.治療患敗血癥的對象的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求11的抗體。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其還包括施用活化蛋白C。
31.治療患血友病的對象的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求1的抗體。
32.治療患血友病的對象的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求11的抗體。
33.調(diào)整對象中止血的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求1的抗體。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述對象是外傷患者。
35.調(diào)整對象中止血的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求11的抗體。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述對象是外傷患者。
37.調(diào)整對象中血栓形成的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求1的抗體。
38.調(diào)整對象中血栓形成的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求11的抗體。
39.抑制未活化蛋白C的活化的方法，其包括向?qū)ο笫┯糜行Я康臋?quán)利要求11的單克 隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了選擇性結(jié)合并抑制活化蛋白C而不結(jié)合或抑制未活化蛋白C的單克隆抗體。其它抗體既抑制活化蛋白C又活化未活化蛋白C。本文描述了使用這些抗體的治療方法以及篩選和檢測這些抗體的方法。
文檔編號A61K39/395GK101918453SQ200880121024
公開日2010年12月15日 申請日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月26日
發(fā)明者徐俊, 查爾斯·埃斯蒙 申請人:俄克拉荷馬醫(yī)學研究基金會