專利名稱：組裝活化蛋白(aap)及其用于制備基本上由vp3組成的細小病毒顆粒的應(yīng)用的制作方法
組裝活化蛋白(AAP)及其用于制備基本上由VP3組成的細
小病毒顆粒的應(yīng)用本發(fā)明涉及編碼新的細小病毒蛋白“組裝活化蛋白”(AAP)的核酸，編碼的多肽，生產(chǎn)多肽的方法，AAP特異性抗體，核酸在多肽制備中的應(yīng)用，核酸或多肽在制備細小病毒顆粒中的應(yīng)用，以及通過提供除細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP3的編碼序列之外的序列片段Z來生產(chǎn)基本上由VP3組成的細小病毒顆粒的方法，所述序列片段Z為細胞中編碼AAP和表達VP3的核酸，并且片段Z處在Np-非依賴性啟動子的控制下。此外，本發(fā)明涉及基本上由VP3組成和/或通過上述方法可獲得的細小病毒顆粒，以及包括(i)異源啟動子和(ii)VP3編碼序列和/或片段Z的表達盒。本發(fā)明進一步涉及包括細小病毒顆粒或表達盒的藥物，尤其是疫苗，以及它們的應(yīng)用?；谕蛔兊募毿〔《窘Y(jié)構(gòu)蛋白的病毒樣顆粒(VLP)已被證明是合適的疫苗候選物(W0 2008/145401，在此引入?yún)⒖??；谶@種突變的細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白，生成用于呈遞耐受原或小抗原或甚至是單獨的表位的VLP。當(dāng)B細胞耐受性被破壞從而對患者產(chǎn)生療效時，這些VLP被證明是特別有益的。對于基于VLP的疫苗的臨床開發(fā)，生成理想的基于單一活性化合物/蛋白且盡可能純的產(chǎn)物一般是必須的。就VLP而言，這時的問題一般在于病毒通常由超過一種的蛋白組成，并且能夠包裝特定的病毒DNA或來自宿主細胞的非特定DNA。因此，期望獲得包含盡可能少的不同蛋白且優(yōu)選沒有核酸的“純”VLP。在文獻中，為有效生產(chǎn)這樣的顆粒，已經(jīng)進行了幾次嘗試。Rabinowitz等(如Rabinowitz等，1999)已經(jīng)通過接頭蛋白插入誘變改變了 AAV2 的結(jié)構(gòu)基因，以明確病毒體組裝和傳染性的關(guān)鍵組分。他們生成了突變體H2634，突變體 H2634包含r印和cap 0RF,以及在沈34位點的HaeIII限制性位點處的插入。重要的是， 由于r印ORF的存在，這種插入突變體表達各自的R印蛋白。它組裝完整的病毒體，并且衣殼似乎僅由VP3組成。作者認為，在細胞裂解物或純化的病毒體中檢測不到VPl和VP2的表達是檢測限的問題。Warrington等Q004)和WO 2004/027019還解決了在衣殼形成中單獨的衣殼蛋白的特定作用的問題，即限定全長肽可以被插入至AAV衣殼ORF而不破壞關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的位置。生成包含r印和cap ORF的構(gòu)建體，其中VP1、VP2和/或VP3的起始密碼子突變，這樣在R印存在下僅表達單一或兩個衣殼蛋白，Warrington等證明只要VP3蛋白存在就會形成包含基因組的顆粒。因此，表達VPl和/或VP2作為單一衣殼蛋白或一起作為衣殼蛋白的突變體不形成顆粒。于是他們從該結(jié)果中得出的結(jié)論是，VPl對于病毒感染是必須的，但是對于衣殼組裝和顆粒形成來說不重要，而VP2對于病毒傳染性來說似乎是不必要的。此外， 他們觀察到由具有突變的VPl和VP2起始密碼子的構(gòu)建體的單獨VP3的表達足以形成VLP。同樣地，Grieger等Q007)利用AAV2輔助質(zhì)粒pXR2 (包含r印和cap基因，Li等 (2008))通過VPl和VP2起始密碼子的誘變生成僅有VP3的顆粒。在R印存在下，只要它們?nèi)鄙賄Pl亞單位，僅有VP3的構(gòu)建體以及僅有VP2/VP3的構(gòu)建體的表達就會形成非感染性病毒顆粒。
根據(jù)他們的結(jié)果，即一旦在R印存在下，由表達VP3的突變體形成作為僅有的衣殼蛋白的包含基因組的AAV-樣顆粒，這些顆粒似乎就可以容易地獲得。以上描述的全部表達構(gòu)建體表達的R印蛋白不應(yīng)當(dāng)被考慮用于組裝優(yōu)選由一種蛋白組成且沒有DNA的VLP。R印不僅呈遞附著于VLP的另外的蛋白，還具有將病毒基因組和非特異性DNA包裝到預(yù)制的衣殼的作用(King等，2001)。應(yīng)避免DNA的包裝，因為VLP 很可能進入患者的細胞，從而轉(zhuǎn)染這種有害DNA，可能導(dǎo)致各種不利的效果。為確保僅有VP3 被表達，Hoque 等(1999a，1999b)和 Handa 等(JP2001169777)在異源啟動子控制下，在任何一種R印cds不存在下，生成僅包括VP3編碼序列(cds)的表達構(gòu)建體。令人驚奇的是，他們由這些表達構(gòu)建體中不能產(chǎn)生病毒顆粒。通過分析在VP3起始密碼子的不同5’位點開始表達的VP2的一系列缺失突變體，他們鑒定了對于VP3的核轉(zhuǎn)移來說必須的區(qū)域，并且發(fā)現(xiàn)衣殼蛋白的核定位效率與VLP的形成效率密切相關(guān)。他們觀察到只要位于VP2的cds中四和34位氨基酸之間的區(qū)域被呈遞，或換句話說只要VP3的 5’延伸的區(qū)域被呈遞，就會形成病毒顆粒。該區(qū)域的氨基酸基序為PARKRL，由此他們得出的結(jié)論是，它的功能是作為核定位信號(NLS)，其對于VP3易位進入核仁是重要的?？蛇x擇地，如果猿猴病毒40 (SV40)大T抗原的NLS被融合至VP3蛋白的N-末端 (NLSsv4(l-VP3)，也可以獲得衣殼。這種融合蛋白可以形成VLP，表明位于蛋白N-末端側(cè)的 VP2-特異性區(qū)域不是結(jié)構(gòu)所需的。由于該發(fā)現(xiàn)，作者推論VP3具有足夠的VLP形成信息，并且VP2僅對于衣殼蛋白的核轉(zhuǎn)移是必須的，其又是VLP形成的先決條件。由于他們使用的突變體構(gòu)建的方法，全部構(gòu)建體直接由位于編碼序列5’末端的 ATG起始密碼子開始。因為“位置效應(yīng)”(KoZak，20(^) —般將引起轉(zhuǎn)錄體的第一(最上游) ATG起始密碼子啟動翻譯，要被表達的主要蛋白和形成的顆粒將是N-末端延伸的VP3。僅小部分翻譯將從VP3另外的下游ATG起始密碼子開始。與Hoque等(如上文)和Handa等(如上文)相一致，使用他們描述的構(gòu)建體， 我們利用AAV2滴定ELISA (根據(jù)制造商Imogen (Heidelberg，Germany)的說明書定量，圖 15B)，既不在哺乳動物細胞也不昆蟲細胞中，在組成型啟動子控制下，不能由僅包括VP3的 cds的表達構(gòu)建體以定量的量(意味著存在< 101(1，尤其是< IO8衣殼/ml)檢測到僅由VP3 組成的VLP。在組成型啟動子控制下，我們不能由僅包括各自的cds、以ATG密碼子開始的表達構(gòu)建體檢測到僅表達VPl或VP2的AAV-樣顆粒。在Rep表達存在或不存在時，以及在腺病毒輔助基因的共遞送存在或不存在時，單獨的或以不同比率的進行不同組合的全部構(gòu)建體的衣殼生產(chǎn)效率處于AAV2滴定ELISA的較低檢測限(< IO8衣殼/ml，見上文)。我們證實，VLP可以由包括一些VP3起始密碼子5'序列和VP3編碼序列的表達構(gòu)建體生成，但是與Hoque等的結(jié)果相反，我們不能利用NLSsv4(1-VP3融合構(gòu)建體以可檢測的量定量衣殼組裝(》IO8衣殼/ml，參見實施例8)。因此，Hoque等的方法不適用于生產(chǎn)適合于商業(yè)化接種疫苗目的的大量純VLP。綜合來看，為了獲得商業(yè)上可行的工藝或產(chǎn)品，現(xiàn)有技術(shù)在Rep存在時利用表達系統(tǒng)不可避免地導(dǎo)致R印和DNA的包裝，或者在R印不存在時VP3VLP的產(chǎn)量太低。因此，本發(fā)明的目的是提供避免了以上的一個或多個缺點，用作基于VLP的疫苗的顆粒，以及生產(chǎn)所述顆粒的方法。特別地，期望基本上僅由一種類型的病毒蛋白組成的 VLP不包含DNA或僅包含非常少量的DNA，和/或它們可以以經(jīng)濟的方式，如以高產(chǎn)量生產(chǎn)。
該問題是通過提供基本上由VP3組成、基本上沒有VPl、VP2和R印蛋白的細小病毒顆粒來解決的。它們可以這樣來產(chǎn)生，即在rep-非依賴性啟動子控制下在細胞中由細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP3(VP3cds)的VP3編碼序列(cds)表達VP3。此外，在該方法中，編碼新鑒定的多肽的DNA序列片段(片段Z)(部分地)被表達，該多肽被命名為“組裝活化蛋白”(AAP)， 該DNA序列片段能夠得到高產(chǎn)量，例如每個細胞將形成大約IO5左右，優(yōu)選大約106，并且更優(yōu)選大約IO7個病毒顆粒。就一般的細小病毒衣殼組裝而言，這種新的蛋白的鑒定是全新的概念，特別是對于VP3衣殼，因為作為假定，在VP2蛋白，如假定的“PARKRL”基序或者用于VP3的異源核定位序列內(nèi)沒有序列基序是必需的(Hoque等，1999a, 1999b)。與本領(lǐng)域的描述相反，這些VLP不包含異源NLS或VP2蛋白。一旦在VP3中的一個或幾個優(yōu)選位點插入表位，就成功地組裝成呈遞表位的顆粒用于疫苗開發(fā)。采用這種方法，每毫升粗裂解物中形成1011，優(yōu)選大約1012，并且更優(yōu)選大約IO13個病毒顆粒，因此產(chǎn)量足夠用于商業(yè)上可行的產(chǎn)品。令人驚奇地并且符合其編碼多肽的功能，可以以順式或者反式提供序列片段Z，以組裝基本上由VP3組成的衣殼。進一步地，片段Z和VP3可以源自細小病毒科的相同或不同的屬，各自相互反式互補用于VP3顆粒組裝。以下定義解釋了在涉及本發(fā)明的產(chǎn)品、方法和應(yīng)用的上下文中如何解釋特定的術(shù)語?！癆A”用作氨基酸的縮寫，“nt”用作核苷酸的縮寫。根據(jù)本發(fā)明，“細小病毒”或“細小病毒的”涉及細小病毒科成員，其中所述野生型表達VP1、VP2和VP3作為衣殼蛋白。細小病毒科包含以下2個亞科分出的幾個屬細小病毒亞禾斗(Parvovirinae)(細小病毒屬(Parvovrius)、紅病毒屬(Erythrovirus)、依賴病毒屬(Dependovrius)、阿留申水貂病毒屬(Amdovirus)和博卡病毒屬(Bocavirus)和濃核病毒亞禾斗(Densovirinae)(濃核病毒屬(Densovirus)、艾特拉病毒屬(Iteravirrus) > 環(huán)星黑煙濃核病毒屬(Pefudensovirus)和康特拉病毒屬(Contravirus)(領(lǐng)域病毒學(xué)， 第四版，2001 年，第 2 卷，第 69 和 70 章，Lippincott Williams ffilkins, Philadelphia ； http // virus. Stanford, edu/parvo/parvovrius. html ；http: // www, ncbi. nlm. nih. gov/ ICTYdb/Ictv/fs parvo. htm#SubFamilyl)。野生型衣殼由三種結(jié)構(gòu)蛋白 VP1、VP2 和 VP3 組裝而成，它們以1 1 8的比率形成AAV衣殼的60個亞單位(Kronenberg等，2001)。因此，術(shù)語“VP3”代表病毒蛋白3。天然存在的細小病毒顆粒由包圍單鏈DNA基因組的二十面體衣殼組成。優(yōu)選的細小病毒是依賴病毒屬，包括AAV。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“血清型”代表以它們的特征抗原集來區(qū)分的一組密切相關(guān)病毒中的一類病毒。因此，血清型通過血清學(xué)分型(檢測在病毒表面上可識別的抗原) 來表征。因此，AAV 還可以選自源于 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、 AAV10、AAVll至AAV12和AAV13，特別是AAV2的血清型。細小病毒顆粒“基本上由VP3組成”或“基本上僅由VP3組成”意味著衣殼被組裝成至少98 %，優(yōu)選至少99 %，更優(yōu)選至少99. 6 %，并且基本上至少99. 8 %的VP3。這意味著僅1/50，優(yōu)1/100，更優(yōu)1/250，并且基本上僅1/500或更少的蛋白組裝衣殼為VP3的N-末端延伸的形式或完全不同的蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，衣殼被組裝成至少98%，優(yōu)選至少99%，更優(yōu)選至少99. 6%，并且基本上至少99. 8%的VP3，意味著僅1/50，優(yōu)1/100，更優(yōu)1/250和基本上僅1/500或更少的蛋白組裝衣殼為VP3的N-末端延伸的形式或不同的細小病毒蛋白。特別優(yōu)選的是，細小病毒衣殼僅由一種蛋白組成，該蛋白為其野生型序列的VP3 或其突變形式?！熬幋a序列”或“cds”是指直接確定其產(chǎn)物氨基酸(AA)序列的基因部分。因此， “VP3編碼序列”或“VP3cds”限定了 cap基因的一部分，根據(jù)該部分基因密碼子被翻譯成 VP3的氨基酸(AA)序列，可以是野生型或如本發(fā)明進一步限定的突變的。VP3cds位于cap ORF的3’末端，并且由編碼蛋氨酸的ATG核苷酸三聯(lián)體開始。根據(jù)所選擇的細小病毒個體，VP3cds被翻譯成大約533個Aas。以AAV2為例，主要衣殼蛋白VP3的cds可以根據(jù) Ruffing 等(1994)從 NCBI 登記號(http: // www, ncbi. nlm. nih. gov/) NC 001401(核苷酸 2809-4410)獲得，AA序列來自相應(yīng)的NCBI登記號YP_680428。根據(jù)本發(fā)明的方法，本發(fā)明的VP3cds編碼能夠形成顆粒的VP3蛋白。N-末端延伸的VP3蛋白包括VP2的一個或多個各自的Aas。因此，與其N-末端插入異源序列的VP3相比，VP2可以被看作是N-末端延伸的VP3，所述異源序列如下文進一步限定的標(biāo)簽(Tag)或表位。基因密碼子限定了三核苷酸序列之間的排布，被稱為“密碼子”和Aas。核酸序列中的三聯(lián)密碼子通常確定一個AA。“閱讀框”是DNA或RNA中連續(xù)的且不重疊的三核苷酸密碼子組。在mRNA鏈中有三種可能的閱讀框，而在雙鏈DNA分子中有六種可能的閱讀框，這事因為由雙鏈進行轉(zhuǎn)錄是可能的?！伴_放閱讀框”(ORF)是包含起始密碼子、通常具有三核苷酸倍數(shù)長度的后續(xù)區(qū)域和由終止密碼子終止的閱讀框。ORF可以編碼蛋白。一個或兩個核苷酸的插入明顯導(dǎo)致移動至不同的閱讀框(移碼突變)。通常，ATG用作起始密碼子。然而，來自AAV的VP2的已知的非典型起始密碼子有時也被使用?！巴蛔儭笔巧矬w遺傳物質(zhì)的核苷酸序列的改變。這種突變可能導(dǎo)致編碼的蛋白的改變，因而根據(jù)它們發(fā)生在哪兒以及它們是否改變編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和/或功能，可能有不同的影響。在結(jié)構(gòu)上，突變可以分為點突變，添加一個或多個額外的nt至DNA/添加一個或多個額外的AA至蛋白的插入，或者移走一個或多個nt/AA的缺失。nt/AA的“插入”通常是指將至少一個異源nt/AA插入至本發(fā)明的細小病毒蛋白的序列。在本文中“異源”是指與細小病毒蛋白的來源病毒相比是異源的。以細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白為例，插入的Aas可以簡單地被插入在細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白的兩個特定Aas之間。Aas的插入還可以與在插入位點處的細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白的特定Aas的缺失一起導(dǎo)致細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白的Aas全部替換(如10 個特定Aas被10個或更多個插入的Aas替換)或部分替換(如10個特定Aas被8個插入的Aas替換)。為啟動蛋白合成，除了開放閱讀框由接近其5’末端的起始密碼子開始外，在起始密碼子局部環(huán)境中必須滿足一些另外的序列要求。其中一種是“Kozak序列”。由特定mRNA 合成的蛋白的量取決于Kozak序列的活力。對于“強”共有序列，相對于被稱作第1號的翻譯起始密碼子而言。在位點+4(即共有序列中的G)和-3(即共有序列中的A或G)處的核苷酸必須都與共有序列相匹配(沒有第0號位點)。“適當(dāng)?shù)摹惫灿行蛄袃H有1個這樣的位點，而“弱”共有序列兩者都沒有。在-1和-2的cc并不保守，但是對于總體的強度是有貢獻的。還有證據(jù)表明在-6位點的G在翻譯啟動中是重要的。術(shù)語“同一性百分比”是關(guān)于兩個序列，特別是氨基酸序列的，其顯示在兩個序列比對中有多少個氨基酸或堿基是相同的。為了標(biāo)準(zhǔn)化，可以使用更長序列、更短序列或比對欄占兩種序列的長度。通常，使用序列比對軟件以確定序列的同一性百分比。用于一般序列比對工作的常見軟件工具包括例如用于比對的ClustalW和T-coffee，以及用于數(shù)據(jù)檢索的BLAST和FASTA3X。技術(shù)人員在評估同一性百分比時，將能夠選擇合適的方法或軟件及適當(dāng)?shù)脑O(shè)置?！昂怂岱肿印笨梢詾镽NA形式，如mRNA或cRNA，或者為DNA形式，包括例如如通過克隆獲得或化學(xué)合成技術(shù)產(chǎn)生或它們的組合獲得的cDNA和基因組DNA。DNA可以是三鏈、 雙鏈或單鏈的。單鏈DNA可以是編碼鏈，又被稱為有義鏈，或者可以是非編碼鏈，又被稱為無義鏈?！癛印-非依賴性啟動子”是在R印蛋白不存在時可以被活化的啟動子，在本發(fā)明的上下文中，R印代表由細小病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，尤其是如Muzyczka and BernS(2001)所描述的R印40、R印52、R印68和R印78。這些啟動子包括例如異源的組成型啟動子和誘導(dǎo)型
啟動子?！盎虮磉_”是來自基因，如DNA序列的遺傳信息被轉(zhuǎn)變成功能性基因產(chǎn)物，如蛋白或核酸的過程。因此，基因表達總是包括轉(zhuǎn)錄，但不必須包括翻譯成蛋白。rRNA和tRNA基因是分別被表達成rRNA和tRNA，并且不翻譯成蛋白的非蛋白編碼基因的實例。為了發(fā)生基因表達，優(yōu)選地，啟動子必須存在于基因附近以提供結(jié)合位點和募集酶以開始轉(zhuǎn)錄。基因表達的“關(guān)閉”是指基因表達被阻斷。其可以通過基因修飾(DNA序列的變化，包括其表達所必需的起始密碼子、至少部分cds或至少部分序列元件，如啟動子的突變或缺失)，或者通過用試劑，如短DNA或RNA寡核苷酸處理進行，該寡核苷酸具有與mRNA轉(zhuǎn)錄體或基因互補的序列。優(yōu)選地，后者用于瞬時關(guān)閉。"Poly(A) ”位于轉(zhuǎn)錄體的3’末端，指示在轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)之前的RNA處理過程中添加一系列腺嘌呤。這些所謂的poly(A)尾增強了 RNA的穩(wěn)定性。“序列片段Z”或“片段Z”是DNA片段，其包括(i) VP3起始密碼子上游的至少44個核苷酸和(ii)從起始密碼子開始的超過242個的VP3cds核苷酸，其源自(a)細小病毒，或(b)與源自AAV2(序列1，圖2)的片段Z的核苷酸序列至少60%，優(yōu)選80%，更優(yōu)選90 %，特別是99 %并且有利的是100 %相同的核苷酸序列，或(c)在65°C下，于乜SSC、0. SDS中，與AAV2的片段Z DNA分子的互補鏈雜交的核酸序列，或(d)可以用于反式互補實驗從而引發(fā)VP3 VLP組裝的核酸序列。這意味著片段Z的序列同時代表VP2和VP3cds的一部分，因為AAV衣殼基因由相同ORF的重疊序列、利用可選的mRNA剪切和可選的翻譯起始密碼子編碼。因此，VP2基因包含具有特定的5’區(qū)域的全部VP3基因序列(

圖1中的圖示)。要求保護的多肽或核酸的“功能活性變體”是指本發(fā)明上下文中所稱的多肽或核酸，其為通過如本文詳細描述的一種或多種突變獲得的變體，其具有功能活性是因為該變體保持了其生物功能，如其啟動VP3組裝的能力。生物活性可以在反式互補實驗中確定，其中由這樣的核酸表達這樣的多肽能夠啟動由VP3編碼構(gòu)建體組裝VP3 VLP，而所述VP3編碼構(gòu)建體在適合條件下的表達不足以用于VP3衣殼組裝。適合的不足的AAV2 VP3編碼構(gòu)建體為pCMV-VP3/^809或pCI_VP3。適合的實驗在實例，如實施例3中描述。優(yōu)選地，保持生物功能被定義為具有天然存在的AAP的至少50 %，優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少70 %，80 %或 90%，還更優(yōu)選95%的活性。如實施例3所描述的，可以進行互補實驗，并且通過ELISA (實施例1. 5)或通過免疫熒光(1.6)分析。兩種實驗都是基于通過單克隆抗體與組裝狀態(tài)中的病毒衣殼相結(jié)合來檢測病毒顆粒。例如單克隆抗體A20 (Imogen，Heidelberg, Germany)與AAV2和一些其他 AAV血清型的病毒衣殼相結(jié)合，對于相關(guān)性較遠的血清型可商購特異性抗體。如果沒有可用的特異性抗體，可以通過電子顯微鏡檢(例如參見Hoque等(1999b))，或蔗糖密度梯度分析 (實施例1. 3. 2.)檢測病毒衣殼。"VP3的延伸形式”包括一般幾個Aas在N-末端的延伸。這些N-末端延伸代表用于編碼VP2但不編碼VP3的序列的3’部分，因為AAV衣殼基因由相同ORF的重疊序列利用不同的起始密碼子(圖1)編碼。因此，N-末端延伸的VP3與N-末端截短的VP2相同，意味著部分VP2可以存在于VP3的N-末端延伸內(nèi)，但沒有完全和完整的野生型VP2蛋白被表達，如Ruffing等(1994)給出的例子和可從NCBI (登錄號:NC_001401)得到的。根據(jù)本發(fā)明，顆?；旧嫌蒝P3組成(如所定義的)，因此VP3的延伸形式非常稀少，而天然存在的顆粒包括的 VPl VP2 VP3 的比率為 1 1 8 (Kronenberg 等，2001)。為確定表達于特定樣品中的衣殼蛋白組成，可以使用蛋白免疫印跡(Western blot)分析。細胞裂解物或純化的VLP可以利用蔗糖梯度來分離，由凝膠電泳分析分離產(chǎn)物并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜，其中可以利用特異性針對靶蛋白的結(jié)合劑探測它們。單克隆抗體 Bl與全部三種衣殼蛋白反應(yīng)且可以被用于檢測VP3，而單克隆抗體A69僅與VPl和VP2反應(yīng)且可以被用于檢測截短的VP2。在本發(fā)明上下文中，“有效的顆粒形成”是指在粗裂解液中形成大約1011，優(yōu)選大約 IO12并且更優(yōu)選大約IO13個顆粒/ml的高顆粒滴度(對應(yīng)于每個轉(zhuǎn)染的細胞大約105，優(yōu)選大約IO6并且更優(yōu)選大約IO7個顆粒)。術(shù)語“大約”是指根據(jù)本發(fā)明，一般誤差范圍為士20%，特別是士 10%，尤其是士 5%。病毒顆粒滴度可以利用可商購的滴度ELISA試劑盒，由轉(zhuǎn)染的細胞(見上文)的裂解物以其未稀釋形式或稀釋形式來定量，所述滴度ELISA試劑盒是基于單克隆抗體A20 與組裝狀態(tài)的病毒衣殼的結(jié)合來測量病毒濃度的。如上文已經(jīng)描述的，如果抗體A20不與例如不同病毒血清型的衣殼相結(jié)合，顆粒滴度可以由電子顯微鏡顯像并由計數(shù)定量(Grimm 等，1999，Grimm 和 Kleinschmidt，1999，Mittereder 等，1996)。為分析蛋白表達和估計它的量，轉(zhuǎn)染的細胞的相同部分的細胞裂解物可以經(jīng)處理用于SDS-PAGE。通過凝膠電泳和轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜，可以利用特異性針對靶蛋白的結(jié)合劑(如單克隆抗體B1、A69、抗-GFP)來探測蛋白。蛋白翻譯的量可以由與蛋白特異性結(jié)合的結(jié)合劑的量來估算。這些復(fù)合物可以通過例如免疫組化染色、免疫熒光染色或放射性標(biāo)記來顯像和定量。術(shù)語“結(jié)合劑”是指與它各自的結(jié)合對象特異性相結(jié)合的分子。常規(guī)使用的結(jié)合劑是抗體，特別是單克隆抗體、如單鏈抗體或抗體片段的抗體衍生物。原則上，可以使用所有類別的抗體，優(yōu)選IgG抗體。同樣可以使用抗體的片段或多聚體。常規(guī)使用的片段是單鏈抗體、Fab-或(Fab)2-片段。其它合適的結(jié)合劑實例為蛋白支架，如anticalin或 1 ipocal in (Nygren和Skerra，2004)、受體或其部分(如可溶性T-細胞受體)、錨定蛋白、微體或核酸適體(aptamer)。術(shù)語“特異性結(jié)合”是指兩種分子A和B，優(yōu)選蛋白，相互結(jié)合從而生成復(fù)合物AB， 該復(fù)合物的親和力(KD = k。ff/k。n)為至少Kd = lX10_5mol/l，優(yōu)選至少1 X 10_7mol/l，更優(yōu)選至少1 X 10_8mOl/l，尤其是至少1 X 10_9mOl/l。“表位”是由免疫系統(tǒng)，特別是抗體、B-細胞或T-細胞識別的大分子的一部分。“模擬表位”是由源自結(jié)構(gòu)蛋白的線性序列的不同區(qū)域的幾個Aas組成的非線性結(jié)構(gòu)表位，這些區(qū)域由于衣殼的整體三級結(jié)構(gòu)而位置緊密相鄰，或者“模擬表位”是由源自非肽結(jié)構(gòu)，如碳水化合物殘基、核酸或脂質(zhì)的幾個Aas組成的非線性結(jié)構(gòu)表位，上述非線性結(jié)構(gòu)表位被抗體特異性結(jié)合。因此，通過模擬表位的結(jié)構(gòu)，模擬表位引起的抗體響應(yīng)與由表位激起的抗體響應(yīng)相同。在本發(fā)明的上下文中，模擬表位可以由單獨插入的肽序列組成(部分)，或者可以由插入的肽和細小病毒核顆粒AA殘基組成。在此所使用的術(shù)語“B-細胞表位”是指還包括模擬表位。因此，表位可以是線性的和結(jié)構(gòu)的。在涉及本發(fā)明的產(chǎn)品、方法和應(yīng)用的上下文中，術(shù)語“抗原”是指與將誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)所針對的任何靶抗原。這種靶抗原通常是易引發(fā)體液免疫響應(yīng)的抗原。它們通常是可以被翻譯后修飾的蛋白，例如糖基化蛋白。術(shù)語“免疫球蛋白”(縮寫Ig)是指在血清中天然存在的任何糖蛋白，其在對免疫抗原入侵的響應(yīng)中被誘導(dǎo)，并且通過根除病原體來保護宿主。總之，已知有五種屬于這類蛋白的人抗體:IgM、IgG、IgA、IgD 和 IgE0第一方面，本發(fā)明涉及一種核酸，所述核酸編碼包括選自以下氨基酸序列的多肽 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、 SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21 禾口 SEQ ID NO :22，或者編碼包括這些氨基酸序列中任何一種的功能活性變體的多肽，其中所述功能活性變體(i)具有與SEQ ID NO :1至22的氨基酸序列中任何一種至少60%相同的氨基酸序列，和/或(ii)由cDNA編碼，所述cDNA與選自以下的核酸序列SEQ ID NO :23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、 SEQ ID NO :42,SEQ ID NO :43 禾口 SEQ ID N0:44，或者與 SEQ ID NO :23 至 44 的核酸序列中任何一種互補的核酸序列在6x SSCJx Denhardt' s溶液、0. 5% SDS中，于40°C下雜交2 至12小時；和/或(iii)由細小病毒基因組的一部分編碼，所述細小病毒基因組的以部分包括的開放閱讀框(ORF)未在編碼VP1、VP2和VP3的框內(nèi)，包括多于378個的VP30RF核苷酸，
其中所述核酸不能表達任何一種功能性R印蛋白，尤其是不能表達R印40、R印52、 R印68、Itep78、VPl、VP2 和 VP3。已證明AAV2cap基因的目前未鑒定的產(chǎn)物的共表達有效啟動了 VP3組裝成二十面體衣殼。這種被命名為組裝活化蛋白或AAP的蛋白由cap基因的0RF2編碼(其中第一 ORF 編碼VP1、VP2和VP； )，并且分子量大約為23kDa。由蛋白免疫印跡估算的AAP分子量更大 (約30kDa)可能是由于翻譯后修飾。它的細胞定位是在核仁中，并且它指引VP蛋白到發(fā)生衣殼組裝的核仁。然而，單獨的VP3核仁定位不足以形成衣殼，表明AAP還在全長AAV基因組內(nèi)提供了額外的分子伴侶-類型、支架和/或成核作用。針對不同的細小病毒可以鑒別同源的多肽。圖觀中顯示了這種源自不同細小病毒cap基因的0RF2的預(yù)測的AAP蛋白序列的比對。因此，根據(jù)本發(fā)明的核酸優(yōu)選以編碼包括 SEQ ID NO :1(AAV2),SEQ ID NO 2 (AAVl)的氨基酸序列，或者 SEQ ID NO :5(AAV5)的氨基酸序列的多肽為特征。本發(fā)明設(shè)想天然存在的AAP可以被修飾且保持功能活性。例如為增加表達、穩(wěn)定性和/或活性，或者為利于更容易克隆構(gòu)建體，可以生成這種功能活性變體。因此，本發(fā)明還涉及功能活性變體，所述功能活性變體具有的氨基酸序列與SEQ ID NO=USEQ ID NO :2、 SEQ ID NO 3, SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9,SEQ ID NO :10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12,SEQ ID NO :13,SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、 SEQ ID NO :21和SEQ ID NO :22的氨基酸序列中任何一種至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，最優(yōu)選至少99%，并且特別是100%相同，和/或所述功能活性變體由cDNA編碼，所述cDNA與 SEQ ID NO 23,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO25,SEQ ID NO26,SEQ ID NO 27,SEQ ID N0: 28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO 43 和 SEQ ID NO 44 的核酸序列中的任何一種互補的核酸序列在6x SSC,5x Denhardt，s溶液、0. 5% SDS中，于45°C，更優(yōu)選 500C，更優(yōu)選55°C，更優(yōu)選60°C，尤其是65°C，并且有利地68°C下雜交。優(yōu)選地，所述功能活性變體由cDNA編碼，所述cDNA與SEQ ID NO 23的核酸序列或與SEQ ID NO 23的核酸
序列互補的核酸序列在6x SSC,5x 06池￡^肚，8溶液、0.5%303中，在上述特定的條件下雜 、-父。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述核酸編碼由選自以下氨基酸序列組成的多肽 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、 SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21 禾口 SEQ ID NO :22，或者編碼由這些氨基酸序列中的任何一種的功能活性變體組成的多肽，其中所述功能活性變體的定義同上。更優(yōu)選地，所述核酸編碼由選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 22的氨基酸序列組成的多肽。由于采用AAP的N-末端和C-末端截短實驗已發(fā)現(xiàn)，就AAV2的AAP的3’ -末端而言，從ATG28tl9開始與VP30RF重疊378nt，不能支持VP3衣殼組裝，而VP30RF的445個核苷酸在衣殼生產(chǎn)中與wt AAV大致同樣有效。因此，本發(fā)明的核酸的特征在于其包括多于378 個的 VP30RF 核苷酸(如多于 378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、 391、392、393、394、395、396、397、398、399個核苷酸)，優(yōu)選至少400個核苷酸(如至少400、 401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、 420、421、422、423、424個核苷酸)，更優(yōu)選至少425個核苷酸(如至少425、426、427、428、 429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444 或 445 個核苷酸)，和尤其是至少 445 個核苷酸(如 445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、 456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、 475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487 或 488、489、490、491、492、 493、494、495、496、497、498、499、500 或更多個核苷酸)。關(guān)于AAV2的AAP的5’ -末端，由具有VP3起始密碼子上游的44個核苷酸延伸的核酸編碼的N-末端截短的AAP在衣殼生產(chǎn)中與wt AAV大致同樣有效，條件是翻譯由框中插入的ATG開始至0RF2，并且若無ATG起始密碼子被插入效率更低(數(shù)據(jù)未給出)。由在 2858位點代替ACG的ATG開始的核酸編碼的N-末端截短的AAP未形成可檢測的衣殼。對于AAV4和AAV9，已證實起始于各自的VP3起始密碼子的VP3 cds表達構(gòu)建體足以用于進行可檢測的衣殼組裝，因而還編碼功能性AAP (變體)(數(shù)據(jù)未給出)。因此，本發(fā)明的核酸的特征在于其包括位于VP3起始密碼子的5’端直接延續(xù)處的鄰接VP2-編碼核苷酸的至少44個核苷酸(如44、45、46、47、48、49或50個核苷酸)、優(yōu)選至少 20 個核苷酸(如 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、41、42或43個核苷酸)、更優(yōu)選至少5個核苷酸(如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18或19個核苷酸)。核酸編碼AAP或其變體可以正好從VP3的3’起始密碼子起始，如從AAV4和 AAV9(上文)可以看出的。因而，在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸的特征在于其起始密碼子為VP3起始密碼子下游的4個核苷酸，優(yōu)選M個核苷酸，并且更優(yōu)選44個核苷酸處的ATG。因而，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸包括的核苷酸從VP3起始密碼子上游至少44個核苷酸和下游445個核苷酸(計算包括ATG)開始，優(yōu)選從VP3起始密碼子上游至少 20 個核苷酸(如 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、
40、41、42、43或 44 個核苷酸)和下游 425 個核苷酸(如 425、426、427、428、429、430、431、 432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444 或 445 個核苷酸)，并且尤其是從VP3起始密碼子上游至少5個核苷酸(如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或 19 個核苷酸)和下游 400 個核苷酸(如 400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、 411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423 或 424 個核苷酸)開始。因此， 本發(fā)明核酸的總長度為至少 489nt (如 489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、 500 或更多 nt)，優(yōu)選至少 445nt (如 445、446、447、448、449、450、451、452、453、妨4、455、 456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、 475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487 或 488nt)，和并且尤其是至少 405nt(如 405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、 422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443 或 444nt)。本發(fā)明的核酸能夠表達啟動VP3衣殼組裝的蛋白。它的特征在于它源自AAV2，并且它的翻譯起始密碼子(在野生型AAV2序列中發(fā)現(xiàn))為C2729TG、A2735CG, A2717TT或T272JG, 或者它源自另一種細小病毒并且它的翻譯起始密碼子位于與AVV2的翻譯起始密碼子同源的位點。另外的細小病毒的同源起始密碼子可以通過特定的比對(參見圖27)并且尋找由可能的非典型起始密碼子編碼的氨基酸而容易地確定。這種可能的非典型起始密碼子可以通過突變分析容易地鑒定，如實施例14中對AAV2C2729TG所做的分析。對于圖27中未給出的細小病毒，這種序列可以容易地被添加到特定的比對中。在優(yōu)選的實施方案中，AAP編碼ORF突變的方式是為了生成能夠改進開放閱讀框翻譯的ATG起始密碼子，而“改進的”是指與各自的野生型序列相比，AAP或其突變體的表達更高。優(yōu)選地，AAV2或其他細小病毒的同源位點的翻譯起始密碼子中的一個突變成ATG起始密碼子。由典型起始密碼子ATG開始翻譯通常會獲得最優(yōu)化的AAP或其變體的表達，因此當(dāng)AAP或其變體不是最優(yōu)化的時，導(dǎo)致衣殼組裝的產(chǎn)量增加。如果表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)變成各自病毒并不適應(yīng)的細胞，這就變得特別有益?？梢约俣ˋAP或其變體在非宿主細胞內(nèi)的表達將不是最優(yōu)化的。例如，本發(fā)明可以預(yù)見為得到高的衣殼產(chǎn)量，在昆蟲細胞或適合于桿狀病毒感染的其它細胞，酵母或細菌中制備衣殼時，AAP或其變體的最優(yōu)化表達可能是非常有益的或至關(guān)重要的。然而，處在順式情況下，這種AAP起始密碼子向ATG的突變可能減少衣殼的形成 (其中AAP由與編碼VP3的ORFl重疊的核酸編碼)，這種突變在反式情況下特別有益，其中 AAP的編碼不依賴于編碼VP3的ORFl (實施例14)。在本領(lǐng)域內(nèi)和本發(fā)明的一部分中已熟知的是，核酸的特征在于核酸的多肽編碼序列之后為poly(A)信號。在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的核酸包括驅(qū)動多肽-編碼序列轉(zhuǎn)錄的啟動子。在優(yōu)選的實施方案中，使用異源啟動子，即并不存在于AAP-編碼核酸來源的病毒中的啟動子， 或優(yōu)選不存在于任何細小病毒野生型基因組中的啟動子。在本文描述的方法中可以使用的啟動子并不限于本文描述的實例。可以是任何已知的或隨后發(fā)現(xiàn)的一種啟動子。組成型啟動子，例如連續(xù)轉(zhuǎn)錄的早期巨細胞病毒(CMV)啟動子(US 4，168，062)，在本發(fā)明中可以作為誘導(dǎo)型啟動子，如抗生素特異性或細胞特異性啟動子來使用。對于在哺乳動物細胞系統(tǒng)中的表達，使用CMV啟動子是特別優(yōu)選的，例如利用轉(zhuǎn)染方法在制備工藝中使用，而在昆蟲細胞中多角體蛋白啟動子(PolH)的使用是優(yōu)選的。誘導(dǎo)型異源啟動子是特別優(yōu)選的，因為它們可以被用于建立穩(wěn)定的VP3生產(chǎn)細胞。由于細小病毒中基因組組織的高度保守，本發(fā)明可以容易地轉(zhuǎn)用到其他細小病毒成員。在細小病毒中，作為本發(fā)明的核酸來源的優(yōu)選病毒是腺相關(guān)病毒(AAV)、鵝細小病毒、 鴨細小病毒和蛇細小病毒。優(yōu)選的AAV選自牛AAV(b-AAV)、犬AAV(CAAV)、小鼠AAV1、山羊 AAV、大鼠 AAV、禽 AAV (AAAV)、AAV1、AAV2、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、 AAVlU AAV12 和 AAV13，特別是 AAV2。在另一方面，本發(fā)明的核酸包括于表達盒、構(gòu)建體、載體或細胞系中。構(gòu)建體，一般為質(zhì)粒，通常是包括本發(fā)明的核酸和其他序列，如多克隆位點、復(fù)制起點、選擇標(biāo)記基因等的核酸。表達盒通常是一旦其位于細胞內(nèi)就能通過細胞轉(zhuǎn)錄和翻譯機制產(chǎn)生由本發(fā)明的核酸編碼的蛋白的構(gòu)建體。表達構(gòu)建體被設(shè)計成包含用作增強子或啟動子區(qū)域并且使得本發(fā)明的核酸有效轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列。它還通常包括poly (A)-位點，其隨后被多聚腺苷酸化，這對于核輸出、HiRNA翻譯和穩(wěn)定來說很重要。載體是用于將本發(fā)明的核酸引入細胞的構(gòu)建體。 依據(jù)被轉(zhuǎn)染的細胞，根據(jù)技術(shù)人員的標(biāo)準(zhǔn)技能來構(gòu)建載體。這些載體可以是用于磷酸鈣轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒，或病毒載體，如桿狀病毒。細胞系是適合用于表達AAP或其變體或者復(fù)制AAP (變體)編碼質(zhì)粒的實驗室細胞系。本發(fā)明的另一方面是由本發(fā)明的核酸編碼的多肽。主要的天然存在的多肽被稱為組裝活化蛋白(ΑΑΡ)。因此，由本發(fā)明的核酸編碼的這種多肽變體被稱為AAP變體。例如， 包括AAP蛋白和一種或多種其它肽的變體被稱為包括AAP的多肽。由0RF2(具有限定ORFl 的VP3起始密碼子)表達蛋白ΑΑΡ,計算的分子量大約為23kDa，并且能夠在核仁中提供VP3 的衣殼組裝。于全AAV基因組內(nèi)形成衣殼也是重要的。它將VP蛋白引向核仁并在那里發(fā)揮啟動組裝反應(yīng)的額外作用。本發(fā)明的另一方面是通過在宿主細胞中表達本發(fā)明的核酸來生產(chǎn)本發(fā)明的多肽， 即AAP或AAP變體的方法。這種生產(chǎn)一般適合于啟動細小病毒的衣殼形成，并且特別是包括VP3但沒有VPl和VP2和Rep蛋白的衣殼形成。合適的宿主細胞可以由技術(shù)人員根據(jù)自己的需要和偏好選擇。優(yōu)選的宿主細胞選自哺乳動物細胞系、特別是人細胞系，用于桿狀病毒感染的細胞系，細菌菌株和酵母菌株組成的目錄。本發(fā)明的另一方面是一般特異性結(jié)合AAP的抗體或結(jié)合劑。特別地，抗體特異性結(jié)合SEQ ID NO :1至22的序列中的任何一種。這些抗體可以被用于進一步研究AAP的功能，或者當(dāng)在異源表達系統(tǒng)中用作反式作用因子時，用以鑒定并且最優(yōu)化AAP表達水平，用于商業(yè)生產(chǎn)的細小病毒DNA或病毒樣顆粒。優(yōu)選的抗體的特征在于其特異性結(jié)合AAV2的 AAP(SEQ ID NO :1)。本發(fā)明的抗體可以是多克隆或單克隆的。本發(fā)明進一步包含相應(yīng)的抗體片段，如單鏈抗體、scFvs、Fab片段、納米抗體(nanobodies)或類似物，或者抗體多聚體。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的核酸在制備本發(fā)明的多肽，包括AAP和AAP變體中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的核酸或多肽在制備細小病毒和細小病毒顆粒中的應(yīng)用。AAP的鑒定使得制備這些病毒成為可能，這是以前未知的，因為為了增加產(chǎn)量或為了生成誘導(dǎo)型生產(chǎn)系統(tǒng)，利用穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染的生產(chǎn)細胞系將表達構(gòu)建體單獨最優(yōu)化?？梢酝ㄟ^使用異源啟動子而增強表達。特別地，可以在功能性Rep和VPl和VP2編碼序列不存在時制備顆粒，這樣能夠制備不包括任何功能性蛋白VPl、VP2、R印40、R印52、R印68和R印78的細小病毒顆粒。在關(guān)于形成這種病毒和顆粒的有效、快速和廉價生產(chǎn)系統(tǒng)的上下文中，所有這些因素都是重要的。本發(fā)明的一方面是生產(chǎn)基本上由VP3組成的細小病毒顆粒的方法，所述方法包括以下步驟(i)提供能夠由來自細小病毒VP3-編碼序列(cds)表達VP3的細胞，其中所述 VP3受r印-非依賴性啟動子控制，并且表達本發(fā)明的核酸編碼的蛋白，(ii)在有利于VP3 和來自本發(fā)明的核酸的蛋白表達的條件下孵育細胞，從而產(chǎn)生細小病毒顆粒，以及(iii) 任選地由細胞純化細小病毒顆粒，其中每個細胞形成至少IO5個病毒顆粒，并且沒有功能性 VP1、VP2、R印40、R印52、R印68和R印78蛋白表達。利用片段Z代替本發(fā)明的核酸同樣適用這種方法。
本發(fā)明的另一方面提供生產(chǎn)基本上由VP3組成的細小病毒顆粒的方法，所述方法包括以下步驟i.在r印-非依賴性啟動子控制下，于細胞中由來自細小病毒的VP3編碼序列 (cds)的表達VP3， 在r印-非依賴性啟動子控制下，于細胞中表達DNA序列片段(片段Z)，該DNA 序列片段包括(1) VP3起始密碼子上游的至少44個核苷酸，和(2)從起始密碼子開始的多于242個的VP3cds核苷酸，其源自a)細小病毒，或者b)與源自AAV2的片段Z的核苷酸序列(序列1，圖2)至少60%，優(yōu)選80%，更優(yōu)選90 %，特別是99 %，并且有利的是100 %相同的核苷酸序列，或者c)與AAV2的片段Z DNA分子(序列2)的互補鏈在4x SSC、0. 1 % SDS中，于65°C 下雜交的核酸序列，或者d)可以用于反式互補實驗以引起VP3VLP組裝的核酸序列，iii.在適合于VP3表達的條件下孵育細胞，以及iv.由細胞純化細小病毒顆粒，其中每個細胞形成大約IO5個，優(yōu)選大約IO6個，并且更優(yōu)選大約IO7個病毒顆粒， 并且基本上沒有VP1、VP2和R印蛋白(尤其是R印40、R印52、R印68和R印78)被表達。這些方法發(fā)明是基于由細小病毒科的病毒生成的顆粒，其中所述野生型表達VP1、 VP2和VP3作為衣殼蛋白?；旧嫌蒝P3組成的細小病毒顆粒可以通過在基本上不存在功能性VP1、VP2和R印，尤其是R印40、R印52、R印68和R印78蛋白表達時，表達細小病毒 VP3cds來生成。結(jié)果，純化的細小病毒顆粒基本上僅由一種衣殼蛋白組成。由于顆粒中不存在R印，Rep-介導(dǎo)的DNA包裝完全被避免。本發(fā)明提供了高滴度的基本上由VP3組成的細小病毒顆粒，除了別的之外，其適合用于疫苗開發(fā)。本領(lǐng)域內(nèi)熟知的是，單獨的VP3不能組裝成衣殼。在本發(fā)明的上下文中，編碼被命名為AAP的新的多肽的核酸、序列元件Z (片段Z)分別被鑒定，如果它們在細胞中表達，就介導(dǎo)VP3顆粒的組裝，并且VP3并不需要另外的病毒蛋白用于衣殼組裝。幾條證據(jù)線索得出的結(jié)論是，VP3需要源自cap基因的RNA用于衣殼組裝?？梢砸苑词教峁┑腣P3衣殼組裝所需的這種因子在融合至gfp的cap基因片段(VP2N-gfp)中。 由這種cap基因片段(編碼VP1、VP2和VP3的0RF)的第一 ORF表達蛋白不是必須的，因為在cap基因的相關(guān)區(qū)域中包含終止密碼子的幾個構(gòu)建體也提供輔助作用。通過蛋白免疫印跡分析不能檢測來自通讀轉(zhuǎn)錄體的VP2N-gfp的表達。這種蛋白表達從非常規(guī)的翻譯起始位點開始并且之后是終止密碼子，這種蛋白表達的可能性很小且它們的量非常低。這種 VP2N-gfp的蛋白表達還不足以激發(fā)VP3的衣殼組裝。這已通過利用替代密碼子表達這種蛋白導(dǎo)致高VP2N-gfp蛋白水平，但未導(dǎo)致VP3衣殼組裝而明確地證明。由于這種密碼子的改變暗示核苷酸序列的改變，因此清楚地顯示出正確的核苷酸序列對于組裝輔助作用來說是必須的，而不是第一 ORF表達的蛋白。最終，通過質(zhì)粒提供不能在第一 ORF中轉(zhuǎn)錄的正確核苷酸序列也不能形成衣殼組裝，這對正確的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄是必需的提出了質(zhì)疑。如圖2所示，片段Z包括VP3起始密碼子上游至少44個核苷酸和下游多于242個核苷酸。優(yōu)選地，片段Z不包括全長VP3cds。片段Z的序列可以源自圖2中所列出的許多不同細小病毒中的一種，圖2中給出細小病毒AAV1、AAV2、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAVlO, AAVll和b_AAV的片段Z的各自區(qū)域的核苷酸序列的一些實例。該列表并不限于此處給出的細小病毒。另外的序列可以容易地通過其VP3起始密碼子的位置來比對并被選擇作為片段Z。核苷酸序列還可以通過它與源自AAV2的片段Z的核苷酸序列(SEQ ID NO 45,見下文)至少60%，優(yōu)選80%，更優(yōu)選90%，特別是99%，并且有利的是100%的序列同一性來選擇作為片段Z。此外，在虹SSC、0. 1%SDS中，于65°C下與AAV2的片段Z DNA 分子(SEQ ID N0:46，見下文)的互補鏈雜交的核苷酸序列也可以用于反式互補實驗中，以作為片段Z引發(fā)VP3VLP的組裝。特別優(yōu)選的是片段Z源自AAV2，并且包括SEQ ID NO :45。源自AAV2的DNA序列片段Z的核苷酸序列(SEQ ID NO :45，在圖2中也給出)ltcggacagcc accagcagcc ccctctggtc tgggaactaa tacgatggct51acaggcagtg gcgcaccaat ggcagacaat aacgagggcg ccgacggagtIOlgggtaattcc tcgggaaatt ggcattgcga ttccacatgg atgggcgaca151gagtcatcac caccagcacc cgaacctggg ccctgcccac ctacaacaac201cacctctaca aacaaatttc cagccaatca ggagcctcga acgacaatca251ctactttggc tacagcaccc cttgggggta ttttgac可以被用于雜交實驗以鑒定未知的DNA片段作為片段Z的SEQ ID NO :45的反式和互補序列(SEQ ID NO 46)lgtcaaaatac ccccaagggg tgctgtagcc aaagtagtga ttgtcgttcg51aggctcctga ttggctggaa atttgtttgt agaggtggtt gttgtaggtgIOlggcagggccc aggttcgggt gctggtggtg atgactctgt cgcccatcca151tgtggaatcg caatgccaat ttcccgagga attacccact ccgtcggcgc201cctcgttatt gtctgccatt ggtgcgccac tgcctgtagc catcgtatta25lgttcccagac cagagggggc tgctggtggc tgtccga為了啟動VP3cds和片段Z序列或本發(fā)明的核酸的轉(zhuǎn)錄，選擇一種或兩種“R印-非依賴性啟動子”。為了表達VP3和片段Z，在不存在細小病毒因子R印時使用r印-非依賴性啟動子，避免存在細小病毒因子Rep是因為Rep具有將病毒基因組和非特異性DNA包裝到細小病毒顆粒中的作用。出于本發(fā)明的目的，避免病毒或非特異性DNA的包裝，因為細小病毒顆?？梢詿o意地被用作為基因治療載體。通過將“R印-非依賴性啟動子”用于VP3表達和片段Z或本發(fā)明核酸的轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶在不存在Rep蛋白表達時可以啟動轉(zhuǎn)錄，使得在不存在R印蛋白尤其是R印40、R印52、R印68和R印78時能夠制備衣殼。例如，R印-非依賴性啟動子是異源組成型或誘導(dǎo)型啟動子。因此，在本發(fā)明的一方面中，本發(fā)明的核酸包括驅(qū)動多肽-編碼序列轉(zhuǎn)錄的啟動子。在優(yōu)選的實施方案中，使用不存在于任何一種細小病毒野生型基因組的異源啟動子。可以用于在此描述方法的啟動子并不限于在此描述的實例?？梢允且阎幕螂S后發(fā)現(xiàn)的任何一種啟動子。組成型啟動子，例如連續(xù)轉(zhuǎn)錄的早期巨細胞病毒(CMV)啟動子(US 4, 168, 062)在本發(fā)明中可以用作誘導(dǎo)型啟動子，如抗生素特異性或細胞特異性啟動子。對于在哺乳動物細胞系統(tǒng)中的表達，使用CMV啟動子是特別優(yōu)選的，例如利用轉(zhuǎn)染方法在制備工藝中使用，而在昆蟲細胞中使用多角體蛋白啟動子(PolH)是優(yōu)選的。誘導(dǎo)型異源啟動子是特別優(yōu)選的，因為它們可以被用于建立穩(wěn)定的VP3生產(chǎn)細胞。用于VP表達的適合條件是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的，并且原則上可以被轉(zhuǎn)變成僅表達 VP3。為產(chǎn)生細小病毒或特定的細小病毒顆粒，各自的DNA序列必須被轉(zhuǎn)染至細胞中。在實施例中描述了一個方案。然而，不同的轉(zhuǎn)染方法，不同的細胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞可以替換使用。例如Grimm等Q002)以及Grieger和SamulskU2005)描述了不同的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的方法得到高產(chǎn)量的細小病毒顆粒，其中每個轉(zhuǎn)染的細胞形成大約105，優(yōu)選大約106，并且更優(yōu)選大約IO7個病毒顆粒。這些數(shù)字對應(yīng)于每毫升粗裂解物大約1011，優(yōu)選大約IO12并且更優(yōu)選大約IO13個顆粒。VP3顆粒的商業(yè)應(yīng)用需要提供高產(chǎn)量顆粒的有效生產(chǎn)方法。所述顆粒可以通過本文和現(xiàn)有技術(shù)公開的方法來純化。特別優(yōu)選的是，片段Z的序列或本發(fā)明的核酸和VP3cds以使得產(chǎn)生僅由VP3組成
的細小病毒顆粒的方式被安排和表達。在上下文中，“僅由......組成”是指沒有其他蛋白
質(zhì)分子作為顆粒的一部分可以通過常規(guī)方法，如蛋白免疫印跡被檢測到。這種顆?？梢园ㄆ渌肿踊螓}，如水和其它緩沖液組分。此外，所述顆?？梢园w粒在組裝期間被偶然封裝在細胞內(nèi)的分子。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方案，片段Z或本發(fā)明的核酸的序列不與VP3cds重疊，使得細小病毒顆粒僅由VP3組成。這避免在顆粒中存在亞化學(xué)計量數(shù)量的N-末端延伸的VP3 蛋白(參見實施例4)。這種少量的N-末端延伸的VP3蛋白最有可能不影響顆粒的活性或產(chǎn)量。然而，在藥物控制方面，得到單一蛋白產(chǎn)物是有利的。因此，特別優(yōu)選的是，本發(fā)明的細小病毒顆粒僅是由VP3組裝的。為此目的，通過本領(lǐng)域人員熟知的方法將VP1、VP2和R印，尤其是R印40、R印52、Rep68和R印78在細胞中的表達關(guān)閉，因為例如各自起始密碼子的缺失或突變，蛋白的特定cds的缺失(全部或部分)，或者蛋白的特定cds的突變，阻礙功能性基因產(chǎn)物的表達(實例在例如Warrington等 (2004)中描述)。對大部分真核mRNA中翻譯啟動位點的選擇似乎通過掃描機制進行，其預(yù)測與5’ 末端的接近程度在確定起始密碼子中發(fā)揮主要作用。這種“位置效應(yīng)”導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄體的第一 (大多是上游的)ATG起始密碼子啟動翻譯(Kozak，2002)。就細小病毒/AAV衣殼蛋白的表達而言，這意味著較少的剪切的轉(zhuǎn)錄體主要用于由第一 ATG合成VPl，然而VP3的翻譯主要由它的ATG起始密碼子啟動，該ATG起始密碼子是主要的剪切的轉(zhuǎn)錄體的大部分上游ATG。這種主要的剪切的RNA還編碼VP3起始位點的上游的VP2的不常見ACG起始密碼子。因此，除由主要的剪切的轉(zhuǎn)錄體有效合成的VP3之外，VP2在一定程度上被表達(Becerra等，1988 ；Becerra等，1985)。通常，位置效應(yīng)在突變失活或移除正常起始位點和翻譯轉(zhuǎn)移至下游起始位點的情況下也是明顯的。因此，沉默的內(nèi)在ATG密碼子可以被活化，并且翻譯效率被提高，這是在一些疾病狀態(tài)中熟知的問題(KOzak，2002)?？紤]到這些知識，誘變VPl和VP2起始密碼子以使它們的表達失活，可以活化截短蛋白由在野生型中沉默的下游位點開始的翻譯(如Warrington等Q004)所描述，以及實施例2. 2中觀察到的)。因而，除已知用于衣殼蛋白的主要起始密碼子外，這種替代起始密碼子優(yōu)選是缺失或突變的，以確保VP3是唯一被表達的衣殼蛋白。僅表達VP3而關(guān)閉其他任何衣殼蛋白可以通過所描述的蛋白免疫印跡來控制。在進一步優(yōu)選的實施方案中，用于VPl和VP2的編碼序列(并不編碼VP3序列) 完全從編碼VP3的表達盒中缺失，而VPl和VP2的編碼序列并不編碼VP3序列。在這種情況中，以反式提供片段Z或本發(fā)明的核酸從而能夠產(chǎn)生VP3衣殼。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，片段Z或本發(fā)明的核酸的DNA序列之后為poly(A) 信號。所述Poly(A)信號能夠恢復(fù)多聚腺苷酸化機制，一旦基因轉(zhuǎn)錄結(jié)束，就在RNA分子上添加延伸的腺嘌呤(poly(A)尾)。這種處理步驟增強在細胞內(nèi)由片段Z轉(zhuǎn)錄的因子的穩(wěn)定性。Poly(A)信號如來自SV40大T-抗原的poly (A)是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的，并且常規(guī)應(yīng)用于各種表達盒和構(gòu)建體中。我們分析了在VP3起始密碼子5'的不同位點開始表達的一系列缺失突變體，分析表明突變體PCMV-VP3/2765仍然能夠引起衣殼組裝(實施例幻。因而，如上文已經(jīng)描述的，片段Z必須包括VP3起始密碼子上游至少44個核苷酸。由于通過利用5’端延伸了一些核苷酸的片段Z提高了顆粒形成的效率，優(yōu)選的是片段Z分別包括VP3起始密碼子上游至少113個核苷酸，或特別至少198個核苷酸。在我們的實驗中，我們選擇的提供AAV2的片段Z的構(gòu)建體從核苷酸沈96(對應(yīng)于VP3起始密碼子上游的113個核苷酸)開始。在圖 2中列出了與加下劃線的VP3起始密碼子相關(guān)的不同血清型的序列。根據(jù)在各自的NCBI登錄號給出的核苷酸序列，可以容易地在5’或3’方向延伸序列(比較圖2的圖例)。如果片段Z的5，延伸序列包括0RF1、0RF2或0RF3中的VPl和/或VP2的翻譯起始密碼子或者任何其它ATG起始密碼子，它們必須通過突變或缺失被失活，以表達VP3作為唯一的衣殼蛋白。進一步地，片段Z必須包括多于242個的VP3起始密碼子下游核苷酸。優(yōu)選的是， 片段Z包括從起始密碼子開始的VP3cds的多于大約275個核苷酸、多于大約300個核苷酸、 多于大約325個核苷酸、多于大約350個核苷酸、多于大約375個核苷酸、多于大約400個核苷酸、多于大約425個核苷酸，并且最優(yōu)選多于大約445個核苷酸。特別優(yōu)選的片段Z在大約核苷酸32M處(對應(yīng)于VP3起始密碼子下游大約445個核苷酸)終止。由片段Z編碼的活性分子最有可能是擴散性分子，即命名為AAP的蛋白?；诤啿⒒蛎艽a子，我們最優(yōu)化了片段Z的序列以得到能在Z內(nèi)編碼的推定擴散性蛋白潛在的更高表達，Z處在還編碼衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的第一閱讀框(ORFl)中，從而保持在ORFl 中編碼的蛋白的AA序列未改變，但是通過修飾DNA序列干擾由其它ORF編碼的蛋白序列。 然而，這種密碼子-最優(yōu)化的片段不能介導(dǎo)顆粒形成，因為不再有病毒顆粒還可以被檢測到(實施例5，圖6)。另一方面，在片段Z內(nèi)將終止密碼子插入至0RF1，使得ORFl的蛋白合成被關(guān)閉，但是僅導(dǎo)致ORFl的DNA序列有較小的改變，并且不干擾0RF2的蛋白合成，仍然能夠有效形成顆粒(實施例6，圖8)。特別優(yōu)選的是，片段Z的突變包括在第一或第三閱讀框中至少一個用于蛋白翻譯的一個終止密碼子。結(jié)果，沒有具有18AA或以上長度的蛋白可以由這些片段Z的閱讀框翻譯，尤其是沒有生成VP2蛋白或其部分。因而，其主要優(yōu)點在于沒有VP2或其部分包括于顆粒中。作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，在片段Z或本發(fā)明的核酸內(nèi)的VP3的主要翻譯起始密碼子ATG(AA 203，根據(jù)AAV2的VPl編號(Girod等，1999))突變。進一步優(yōu)選的是，VP3 的較少的替代起始密碼子(AA 211和AA 235 (Warrington等，2004))中的一個或兩個也突變。在更優(yōu)選的實施方案中，可以被用于VP3翻譯起點的全部ATG密碼子突變(許多可能的那些列于Warrington等，2004)，以完全避免由提供片段Z的表達構(gòu)建體翻譯VP3。由于片段Z的產(chǎn)物和本發(fā)明核酸的編碼功能以反式作用元件為特征，意味著片段 Z和本發(fā)明的核酸編碼擴散性分子，片段Z或本發(fā)明核酸的序列可以在相同或不同的核酸分子上作為cap基因或其部分，如VP3cds提供給細胞。在優(yōu)選的實施方案中，提供的片段Z或本發(fā)明的核酸相對于VP3cds為“順式”。如果提供片段Z/本發(fā)明的核酸相對于用于編碼VP3的表達盒為“順式”，意味著片段Z/本發(fā)明的核酸和VP3的表達由相同的一個啟動子驅(qū)動。片段Z/本發(fā)明的核酸的序列可以位于 VP3cds的上游或下游。用于編碼片段Z和VP3的序列可以直接連接可變數(shù)量的核苷酸或被其分開(圖3. 1)。在本發(fā)明的更多特定實施方案中，片段Z/本發(fā)明的核酸直接位于VP3cds的上游。 由于片段Z/本發(fā)明的核酸包括多于242個的VP3起始密碼子下游核苷酸，并且這種序列不必然重復(fù)存在，直接跟隨的VP3cds必然僅提供VP30RF的剩余DNA序列(圖3. 1. a中給出圖解)。在這種情況下，亞化學(xué)計量數(shù)量的N-末端延伸的VP3被表達并且存在于衣殼中(實施例4)。為了不增加這部分N-末端延伸的VP3，不在片段Z/本發(fā)明的核酸5’末端或上游分別添加新的或缺失現(xiàn)有的起始密碼子是本發(fā)明的一項重要實施方案。此外，僅有與片段Z/本發(fā)明的核酸不重疊的VP3-特異性cds可以被容易地突變。 與片段Z/本發(fā)明的核酸重疊的VP3cds的突變還能改變由片段Z/本發(fā)明的核酸編碼的擴散性分子的序列。結(jié)果，在一些情況下，擴散性分子將不再有活性。這種情況下的突變包括沉默突變以及例如表位的插入。為了增加VP3cds突變的可能性，使重疊最小化，即分開片段Z/本發(fā)明的核酸和VP3cds是有益的。這可以以順式方式進行，其中一個啟動子驅(qū)動不包含對于片段Z來說重要的VP3起始密碼子上游44個核苷酸的VP3cds的表達，和位于這種VP3cds之前或之后的單獨的片段Z的表達。特別優(yōu)選的是，提供的片段Z/本發(fā)明的核酸相對于VP3cds為“反式”。如果提供的片段Z/本發(fā)明的核酸相對于用于編碼VP3的表達盒為“反式”，意味著片段Z/本發(fā)明的核酸和VP3的表達由各自的啟動子驅(qū)動(與“順式”相反，見上文)。片段Z的序列/本發(fā)明的核酸可以位于相同構(gòu)建體上的VP3cds的上游或下游，或者與VP3cds不同的表達構(gòu)建體上(實例列于圖3. 2中)。在這種情況下，片段Z僅包括VP3cds的5 ‘末端，因此它主要的優(yōu)點在于沒有 N-末端延伸的VP3(見下文)可以被表達并且整合到衣殼中。因此，如果提供的用于編碼 VP3和片段Z的序列為反式，推測可以獲得更多純的顆粒組合物，優(yōu)選僅由結(jié)構(gòu)蛋白VP3組成。反式構(gòu)型的一個優(yōu)點在于VP3cds可以容易地被修飾，例如最優(yōu)化其用于表達細胞系的密碼子使用，以進一步增加產(chǎn)量而不改變片段Z/本發(fā)明的核酸的序列。還可以進行其它修飾，如突變、插入、標(biāo)簽等而不影響片段Z/本發(fā)明的核酸?？梢约僭O(shè)在之前嘗試確定片段Z和VP3cds的重疊序列中的VP3內(nèi)的插入位點時，可能有用的插入位點未被確定為也干擾片段Z的表達或干擾AAP的功能的插入位點。因此，這些序列的功能或者以無重疊的順式設(shè)置，或者優(yōu)選以反式設(shè)置來分開，使得VP3編碼序列能夠進行非依賴性誘變。這種誘變具有多種商業(yè)應(yīng)用。在生產(chǎn)新的基因治療載體的過程中，形成嵌合型細小病毒Cap序列的限制可以被克服。幾個研究組嘗試直接開發(fā)AAV，其涉及在一種血清型上隨機誘變而成的病毒庫的形成(Koerber等，2008)，利用已知的AAV血清型衣殼序列，通過使用STEP和 shuffling方法來形成多種隨機組合的衣殼(Ward和Walsh，2009，Li等，2008)。以相似的方法，AAP的非依賴性表達可以被用于確定耐受配體(被用于以其他細胞為靶點)、B-細胞表位(被用于生成表位特異性疫苗)或缺失/替換(被用于病毒的去靶向或減少病毒的抗原性)的另外的插入位點。片段Z/本發(fā)明的核酸和VP3cds的反式構(gòu)型的另一個優(yōu)點在于，一種構(gòu)建體可以被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染至生產(chǎn)細胞系，而其它構(gòu)建體可以被瞬時轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，包括片段Z/本發(fā)明核酸的表達盒可以穩(wěn)定地被轉(zhuǎn)染至適合于VP3有效表達的細胞系，形成單一生產(chǎn)細胞系。然后，這種生產(chǎn)細胞系被特異性VP3cds瞬時轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)(如用病毒感染)，致使這種 VP3表達和各自的顆粒形成。因此，一種生產(chǎn)細胞系可以被用于生產(chǎn)不同的顆粒。給出確定用于制備藥物的生產(chǎn)細胞系所需的時間和費用，這形成相當(dāng)大的調(diào)節(jié)優(yōu)勢。出于這個原因， 特別優(yōu)選的是，在各自的表達構(gòu)建體上提供片段Z/本發(fā)明的核酸和VP3cds。通過以反式向細胞提供用于編碼特定血清型的VP3的表達盒，這種設(shè)置可以另外被用于例如生成不同血清型的AAV/細小病毒顆粒，所述細胞已經(jīng)被一種血清型的片段Z/ 本發(fā)明的核酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染。一般地，特異性針對選自以下的AAV血清型的VP3cds可以被用于轉(zhuǎn)染已經(jīng)用僅一種血清型如AAV2的片段V本發(fā)明的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞:AAV1、AAV2、 AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12 和 AAV13。從而，可以容易地生成由所選擇的血清型如AAVl顆粒的VP3組成的AAV顆粒。對于AAVl和AAV2，我們證明片段Z/本發(fā)明核酸的表達介導(dǎo)VP3的衣殼組裝，所述VP3不僅由從相同血清型克隆的構(gòu)建體表達，而且由從其它血清型，即分別為AAV2和AAVl克隆的構(gòu)建體表達(實施例21)。 然而，一般不能期望各個血清型彼此互補，但是在如在此所描述的反式互補實驗中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地鑒定來自一種細小病毒/血清型的AAP與來自不同種細小病毒/血清型的VP3的各自的配對，以得到VP3VLP的組裝。例如，如果已獲得可以被用于生產(chǎn)來自不同細小病毒或AAV血清型的VP3VLP的表達特異性AAP的穩(wěn)定細胞系，可以使用交叉互補。 可以選擇用于時間和成本效益高的高滴度VLP生產(chǎn)的各種組合。同樣地，其它的方法是可能的，并且一種特定的VP3cds可以以反式被表達盒轉(zhuǎn)染，所述表達盒提供選自用于編碼片段Z的許多不同序列的片段Z/本發(fā)明的核酸，如選自不同的AAV血清型/細小病毒的。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，細小病毒顆粒不包含R印蛋白，尤其是任何功能性R印40、R印52、R印68和R印78蛋白。在此通過說明書給出了這種實施方案的詳細內(nèi)容。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，僅/最多1/50的表達的結(jié)構(gòu)蛋白，優(yōu)選最多1/100，更優(yōu)選最多1/250，并且基本上僅/最多1/500的結(jié)構(gòu)蛋白是VP3的N-末端延伸形式。特別優(yōu)選的是不包含任何具有VP3的N-末端延伸形式的結(jié)構(gòu)蛋白的細小病毒顆粒， 或者反之亦然，沒有結(jié)構(gòu)蛋白是VP3的N-末端延伸形式。如果片段Z和VP3cds的序列重疊，并且在相同啟動子(順式形式)的控制下表達，VP3cds的ATG起始密碼子主要被用作
26蛋白翻譯的起始，而僅很小比例的蛋白翻譯開始于上游。除了 VP3cds外，所得到的小部分蛋白包含對應(yīng)于編碼VP2而不是VP3的序列的3’部分的幾個Aas的N-末端延伸。綜合來看，這些VP3的5’延伸形式的表達在蛋白免疫印跡(實施例4)中是可見的，但是僅占結(jié)構(gòu)蛋白的1/50，優(yōu)選占細小病毒顆粒結(jié)構(gòu)蛋白的1/100，更優(yōu)選1/250，并且基本上僅1/500。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，僅/最多1/50的表達的結(jié)構(gòu)蛋白，優(yōu)選最多1/100，更優(yōu)選最多1/250，并且基本上僅/最多1/500的結(jié)構(gòu)蛋白是本發(fā)明的多肽，即 AAP或其變體。然而沒有在宿主細胞上顯示出對AAP的特定影響，可能對細小病毒載體或顆粒的醫(yī)藥應(yīng)用有影響，原則上有盡可能少的雜質(zhì)是有益的。病毒R印蛋白與基因組和病毒DNA相結(jié)合，并且被認為在DNA包裝中發(fā)揮作用。為了將AAV作為疫苗使用，并且避免對抗包裝的DNA的非特異性反應(yīng)或不期望的基因轉(zhuǎn)移，細小病毒顆粒盡可能不含DNA是特別優(yōu)選的。因此，細小病毒顆粒于不存在Rep蛋白表達時在細胞中產(chǎn)生。由此，在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，僅1/100的顆粒，優(yōu)選1/1，000，并且更優(yōu)選僅1/10，000的顆粒包含DNA。特別優(yōu)選的是，沒有細小病毒顆粒包含DNA。優(yōu)選最多1/100，更優(yōu)選僅/最多1/1，000，甚至更優(yōu)選僅/最多1/10，000的顆粒包含任何DNA。 結(jié)果，在實現(xiàn)接種疫苗目的之前，破壞包裝的DNA的失活步驟(如Y -輻射或UV-輻射)不是必須的。根據(jù)本發(fā)明，細小病毒優(yōu)選選自腺相關(guān)病毒(AAV)、牛AAV (b-AAV)、犬AAV (CAAV) 和禽 AAV (AAAV)。特別優(yōu)選的 AAV 選自AAV-1、AAV-2、AAV_3b、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、 AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12 和 AAV13，特別是 AAV-2。AAVl 至 AAV12 指明了限定的腺相關(guān)病毒(AAV)血清型。如在此更詳細地描述的，特別優(yōu)選的是，VP3cds進一步包括至少一種突變。所述突變是與各自的野生型細小病毒序列相比較，優(yōu)選選自一種或多種缺失、一種或多種插入， 一種或多種替代以及這些突變的組合。在本發(fā)明的實施方案中，VP3cds包括一種或多種沉默突變。通過引入不引起VP3 蛋白的AA序列改變的DNA突變，最優(yōu)化VP3cds的密碼子使用是可能的，如增強它的表達。 由于基因密碼子的簡并性，一種AA可以由多于一種的密碼子確定，例如AA谷氨酸由密碼子 GAA和GAG確定。因此，對于結(jié)構(gòu)蛋白VP3的各種AA，可以分別選擇以更高效率被翻譯和突變cds的那些密碼子。如已論述的，這些突變不改變蛋白的AA序列，這是為什么它們被稱為沉默的，但是這些突變當(dāng)然改變了包括由片段Z/本發(fā)明的核酸編碼的擴散性分子的核苷酸序列。由于這個原因，本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案是，僅部分VP3cds由插入或使用密碼子最優(yōu)化來修飾，例如以得到在選擇條件下VP3的更高表達，該選擇條件是指與片段Z的序列不重疊，或如以上文任何部分所描述的，以反式形式處在VP3cds內(nèi)。在優(yōu)選的實施方案中，VP3cds的一種或多種突變導(dǎo)致位于VP3VLP表面的一種或多種突變。結(jié)構(gòu)蛋白的表面定位區(qū)域可以通過分析晶體結(jié)構(gòu)來確定，這對于AAV2是已知的 (Xie等，2002)。如果所選擇血清型的晶體結(jié)構(gòu)還不可用，所選擇的VP3序列可以與具有已知晶體結(jié)構(gòu)的至少一種不同血清型的VP3序列進行比對，以鑒別感興趣的同源區(qū)域。比對可以使用可商購的軟件，例如Multialign(Corpet，1988)和其所描述的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)進行。在進一步優(yōu)選的實施方案中，VP3cds的一種或多種突變導(dǎo)致位于VP3的N-末端的一種或多種突變。優(yōu)選地，N-末端被定義為各自VP3的N-末端10個氨基酸，優(yōu)選N-末端5個氨基酸，特別是N-末端2個氨基酸。特別優(yōu)選的是位于N-或C-末端的插入或者對應(yīng)于N-或C-末端的直接插入的插入，優(yōu)選直接在AA 203(1-203)的C-末端的插入。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的插入是插入至選自以下位點的一個或多個位點1力61、 1-266、 1-381、 1-447、 1-448、 1-453、 1-459、 1-471、 1-534、 1-570、 1-573、 1-584、 1-587、 1-588、1-591、1-657、1-664、1-713 和 1-716，優(yōu)選 1-261、1-453、1-534、1-570、1-573 和 1-587，特別是 1-587。所使用的命名1-###涉及插入位點，其中###指定相對于AAV-2的VPl蛋白的AA 編號，然而這意味著插入可以直接位于特定AA的N-或C-末端，優(yōu)選直接位于特定AA的 5Aas N-或C-末端的序列中一種AA的C-末端，優(yōu)選特定AA的N-或C-末端的3種AA， 更優(yōu)選2種AA，特別是1種AA。對于除了 AAV-2之外的細小病毒，如果可用的話，相應(yīng)的插入位點可以通過進行AA比對或通過比較衣殼結(jié)構(gòu)來鑒別。這種比對在細小病毒AAV-1、 AAV-2、AAV-3b、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-10、AAV-11、b-AAV、GPV、B19、MVM、 FPV 禾口 CPV(W0 2008/145400 的圖 3)中進行。其后引入插入并且指定位置的AA位點被加上下劃線。同樣地，能夠?qū)⒉迦胍胫辆o鄰下劃線AA的5個直接鄰近的Aas，因為這些同樣位于AAV2衣殼中的環(huán)(loop)內(nèi)。例如，插入位點1-587對應(yīng)于以下突出標(biāo)示的Aas中的一種之前和/或之后的插入AAVl 的 FQSSS TDPAT,AAV2 的 IjQRGMmzRQAAT，AAV-3b 的 LQSSM TAPTT，AAV-6 的 LQSS運 TDPAT，AAV-7 的 LQAAM TAAQT，AAV-8 的 LQQQM TAPQIAAVlO 的 IjQQAM TGPIV,AAVll 的 NQNAI TAPIT 禾口AAV-5 的 NQSSI TAPAT。進一步地，插入位點1-453對應(yīng)于以下各10個Aas的N-或C-末端的直接插入， 優(yōu)選突出標(biāo)示的AA的C-末端的直接插入AAV-I 的 QNQSe SAQNK,AAV-2 的 NTPSG453TTTQS，AAV-3b 的 GTTS遼 TTNQS，AAV-6 的 QNQS^ SAQNK,AAV-7 的 SNPGG TAGNR,AAV-8 的 QTTGG TANTQ,AAV-10 的 QSTGG TQGTQ,AAV-Il 的 SGETL NQGNA,以及AAV-5 的 FVSTM NTGGV。涉及AAV2序列，AAV和本發(fā)明包括的其它細小病毒的插入位點列于表1。
表1 用于細小病毒的插入位點
權(quán)利要求
1.一種核酸，所述核酸編碼包括選自以下序列的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20,SEQ ID NO :21和SEQ ID NO :22，或者編碼包括這些氨基酸序列中的任何一種的功能活性變體的多肽，其中所述功能活性變體(i)具有與SEQID NO :1至22的氨基酸序列中任何一種至少60%相同的氨基酸序列， 和/或(ii)由cDNA編碼，所述cDNA和選自以下序列的核酸序列SEQID NO :23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、 SEQ ID NO :42,SEQ ID NO :43 禾口 SEQ ID NO :44，或者和與 SEQ ID NO :23 至 44 的核酸序列中任何一種互補的核酸序列，在6x SSC,5x Denhardt，s溶液、0. 5% SDS中，于40°C下雜交 2至12小時；和/或(iii)由細小病毒基因組的一部分編碼，所述細小病毒基因組的一部分包括未在編碼 VPU VP2和VP3的框內(nèi)的開放閱讀框(ORF)，且包括多于378個的VP30RF核苷酸，其中所述核酸不能表達任何一種功能蛋白，尤其是不能表達R印40、R印52、R印68、 R印78、VP1、VP2 和 VP3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸編碼包括SEQID NO=USEQ ID NO 2的氨基酸序列，或者SEQ ID NO 5的氨基酸序列的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的核酸，其中所述功能活性變體具有的氨基酸序列與 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO :21 禾口 SEQ ID NO :22 的氨基酸序列中任何一種至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %， 更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少99%和特別是100%相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的核酸，其中所述功能活性變體由cDNA編碼，所述 cDNA 和與 SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO :27、 SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID N0:31、SEQ ID NO 32, SEQ ID N0: 33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO 39,SEQ ID NO 40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43 禾口 SEQ ID NO :44 的核酸序列中任何一種互補的核酸序列在6x SSC、5x Denhardt，s溶液、0. 5% SDS中，于45°C， 更優(yōu)選50 V，更優(yōu)選55°C，更優(yōu)選60°C，尤其是65°C并且有利的68°C下雜交。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的核酸，其中所述功能活性變體由cDNA編碼，所述cDNA和SEQ ID NO :23的核酸序列，或者和與SEQ ID NO :23的核酸序列互補的核酸序列，在 6x SSC、5x Denhardt' s 溶液、0.5% SDS 中雜交。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的核酸，其特征在于，所述核酸包括多于378個的VP30RF的核苷酸，優(yōu)選至少400個VP30RF的核苷酸，更優(yōu)選至少425個VP30RF的核苷酸， 特別是至少445個VP30RF的核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的核酸，其特征在于，所述核酸包括直接位于VP3 起始密碼子5’端上游的鄰近VP2-編碼核苷酸的至少44個核苷酸，優(yōu)選至少20個核苷酸， 更優(yōu)選至少5個核苷酸，或者其特征在于，所述核酸的起始密碼子為位于VP3起始密碼子下游4個核苷酸，優(yōu)選M個核苷酸并且更優(yōu)選44個核苷酸處的ATG。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的核酸，其特征在于，所述核酸能夠表達啟動VP3 衣殼組裝的蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的核酸，其特征在于，所述核酸源自AAV2，并且所述核酸的翻譯起始密碼子為C2729TG、A2735CG、A2717TT或T272tlTG,或者所述核酸源自另一種細小病毒，并且所述核酸的翻譯起始密碼子位于AAV2的翻譯起始密碼子的同源位點。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的核酸，所述核酸包括產(chǎn)生ATG起始密碼子的突變從而能夠改進開放閱讀框的翻譯，優(yōu)選地，其中所述AAV2的翻譯起始密碼子或其他細小病毒的同源位點中的一個被突變成ATG起始密碼子。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的核酸，其特征在于，所述核酸的多肽編碼序列之后為Poly(A)信號。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的核酸，其特征在于，所述核酸包括驅(qū)動多肽-編碼序列轉(zhuǎn)錄的啟動子，優(yōu)選異源啟動子，特別是誘導(dǎo)型異源啟動子。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的核酸，其特征在于，所述核酸源自腺相關(guān)病毒 (AAV)、鵝細小病毒、鴨細小病毒和蛇細小病毒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的核酸，其特征在于，所述AAV選自牛AAV(b-AAV)、犬 AAV(CAAV)、小鼠 AAV1、山羊 AAV、大鼠 AAV、禽 AAV(AAAV), AAVU AAV2、AAV3b、AAV4、AAV5、 AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12 和 AAV13，特別是 AAV2。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的核酸，所述核酸包括于表達盒、構(gòu)建體、載體或細胞系中。
16.一種由權(quán)利要求1至14中任一項所述的核酸編碼的多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的多肽，其中所述多肽為組裝活化蛋白(ΑΑΡ)。
18.—種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的多肽的方法，所述方法包括在宿主細胞中表達根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞選自哺乳動物細胞系、特別是人細胞系，用于桿狀病毒感染的細胞系，細菌菌株和酵母菌株。
20.一種特異性結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求17所述的多肽的抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的抗體，其特征在于，所述抗體特異性結(jié)合AAV2的AAP(SEQ ID NO. 1)。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的核酸在制備如權(quán)利要求16或17中任一項所述的多肽中的應(yīng)用。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的核酸或者根據(jù)權(quán)利要求16或17中任一項所述的多肽在制備細小病毒顆粒中的應(yīng)用。
24.如權(quán)利要求23所述的核酸或多肽在制備不包括功能蛋白VP1、VP2和R印，特別是R印40、R印52、Rep68和R印78中任何一種的細小病毒顆粒中的應(yīng)用。
25.—種生產(chǎn)基本上由VP3組成的細小病毒顆粒的方法，所述方法包括以下步驟i.提供能夠由細小病毒的VP3-編碼序列(cds)表達VP3的細胞，其中所述VP3在 rep-非依賴性啟動子控制下，并且表達根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的核酸編碼的蛋白， 在有利于VP3表達和由根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的核酸的表達蛋白的條件下孵育細胞，從而生產(chǎn)細小病毒顆粒，以及 iii.任選地從細胞中純化細小病毒顆粒， 其中每個細胞形成至少IO5個病毒顆粒，并且沒有功能性VP1、VP2和R印，尤其是R印40、R印52、R印68和R印78蛋白表達。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述每個細胞形成至少IO6個，并且優(yōu)選至少 IO7個病毒顆粒。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或沈中任一項所述的方法，其中所述功能蛋白VP1、VP2和R印， 尤其是R印40、R印52、R印68和R印78在細胞中的蛋白表達被關(guān)閉。
28.根據(jù)權(quán)利要求25至27中任一項所述的方法，其中提供的根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的核酸相對于VP3cds為順式。
29.根據(jù)權(quán)利要求25至觀中任一項所述的方法，其中提供的根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的核酸相對于VP3cds為反式。
30.根據(jù)權(quán)利要求25至四中任一項所述的方法，其中所述細小病毒顆粒不包含功能性 R印蛋白，尤其是R印40、Itep52、Rep68和R印78中的任何一種。
31.根據(jù)權(quán)利要求25至30中任一項所述的方法，其中最多1/50的表達的結(jié)構(gòu)蛋白，優(yōu)選最多1/100，更優(yōu)選最多1/250，最優(yōu)選最多1/500的表達的結(jié)構(gòu)蛋白是根據(jù)權(quán)利要求16 所述的多肽，并且特別是沒有結(jié)構(gòu)蛋白是根據(jù)權(quán)利要求16所述的多肽。
32.根據(jù)權(quán)利要求25至31中任一項所述的方法，其中最多1/100的顆粒，優(yōu)選最多 1/1，000的顆粒，更優(yōu)選最多1/10，000的顆粒包含DNA，并且特別是沒有顆粒包含DNA。
33.根據(jù)權(quán)利要求25至32中任一項所述的方法，其中所述VP3cds包括一種或多種突變。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述VP3cds的突變是選自以下突變的突變一種或多種缺失，一種或多種插入，一種或多種替換，以及它們的組合。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34中任一項所述的方法，其中所述VP3cds包括一種或多種沉默突變。
36.根據(jù)權(quán)利要求33至35中任一項所述的方法，其中所述VP3cds的一種或多種突變導(dǎo)致位于VP3VLP表面上的一種或多種突變。
37.根據(jù)權(quán)利要求33至36中任一項所述的方法，其中所述VP3cds的一種或多種突變導(dǎo)致位于VP3的N-末端的一種或多種突變。
38.根據(jù)權(quán)利要求33至37中任一項所述的方法，其中所述VP3cds的一種或多種突變導(dǎo)致一種或多種在選自以下位點的一個或多個位點的插入1_261、1-266, 1-381、1-447、 1-448、 1-453、 1-459、 1-471、 1-534、 1-570、 1-573、 1-584、 1-587、 1-588、 1-591、 1-657、 1-664、1-713 和 1-716，優(yōu)選 1-261、1-453、1-534、1-570、1-573 和 1-587，特別是 1-587。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述兩種插入是插入選自以下位點的兩個位點:1-261, 1-453、1-534、1-570、1-573 和 1-587，優(yōu)選 1-261 與 1-587 的組合，1-261 與 1-453的組合，或者1-453與1-587的組合。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述突變在VP3的三個位點進行，優(yōu)選在位點 453插入和在位點587插入的組合與其他突變的組合。
41.根據(jù)權(quán)利要求33至40中任一項所述的方法，其中所述VP3包括至少一種與病毒異源的表位。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述VP3蛋白的表位為B-細胞表位。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42中任一項所述的方法，其中所述B-細胞表位被插入至1-453 和/或1-587，特別是插入至AAV1、AAV2或AAV4的1-453和/或1-587。
44.根據(jù)權(quán)利要求25至43中任一項所述的方法，其中所述VP3被包括于融合蛋白中。
45.根據(jù)權(quán)利要求25至44中任一項所述的方法，其中所述VP3包括至少一種用于與配體結(jié)合的標(biāo)簽。
46.根據(jù)權(quán)利要求33至45中任一項所述的方法，其中所述VP3包括至少一種另外的突變。
47.根據(jù)權(quán)利要求25至46所述的方法可獲得的細小病毒顆粒。
48.一種基本上由VP3組成的細小病毒顆粒，i.其中所述VP3任選地包括一種或多種突變，和 其中所述VP3不包含異源的核定位信號，并且iii.其中所述顆粒不包含功能性R印蛋白，尤其是R印40、R印52、R印68和R印78中的任何一種。
49.根據(jù)權(quán)利要求47或48中任一項所述的細小病毒顆粒，其中所述衣殼僅由VP3組成。
50.根據(jù)權(quán)利要求47至49中任一項所述的細小病毒顆粒，其中所述VP3的突變是如權(quán)利要求33至46中任一項所述的突變。
51.一種VP3表達盒A，所述VP3表達盒A包括異源啟動子和如權(quán)利要求25至46所述的VP3cds，其中所述VP3的轉(zhuǎn)錄由異源啟動子驅(qū)動，并且其中所述表達盒能夠基本上僅表達 VP3。
52.一種組合型表達盒，所述表達盒包括異源啟動子、如權(quán)利要求25至46所述的 VP3cds和如權(quán)利要求1至14所述的核酸，其中所述VP3的表達和如權(quán)利要求16至17中任一項所述的多肽的表達由所述一種異源啟動子驅(qū)動。
53.一種試劑盒，所述試劑盒包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求51所述的VP3表達盒和至少一種包括于根據(jù)權(quán)利要求15所述的表達盒中的核酸。
54.一種試劑盒，所述試劑盒包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求52所述的組合型表達盒和手ππ冊。
55.一種用作藥物的根據(jù)權(quán)利要求47至50中任一項所述的細小病毒顆粒。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的細小病毒顆粒，其中所述藥物還包括一種或多種賦形劑。
57.根據(jù)權(quán)利要求55或56中任一項所述的細小病毒顆粒，其中所述藥物為疫苗。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的細小病毒顆粒，其中所述疫苗還包括一種或多種佐劑。
59.根據(jù)權(quán)利要求55至58中任一項所述的細小病毒顆粒，其用于預(yù)防或治療自體免疫性疾病、傳染性疾病、腫瘤、過敏性疾病、代謝性疾病、(慢性)炎性疾病、神經(jīng)性疾病、成癮或者被用于眼科。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的細小病毒顆粒，其中所述自體免疫性疾病和/或慢性炎性疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和克羅恩病。
61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的細小病毒顆粒，其中所述腫瘤適合用單克隆抗體治療。
62.根據(jù)權(quán)利要求59所述的細小病毒顆粒，其中所述過敏性疾病選自哮喘、過敏和過敏性鼻炎。
63.根據(jù)權(quán)利要求59所述的細小病毒顆粒，其中所述神經(jīng)性疾病為阿爾茨海默病。
64.根據(jù)權(quán)利要求59所述的細小病毒顆粒，其中所述代謝性疾病為動脈硬化癥。
65.根據(jù)權(quán)利要求59所述的細小病毒顆粒，其中所述眼科疾病為與年齡相關(guān)的黃斑變性。
66.根據(jù)權(quán)利要求55至65中任一項所述的細小病毒顆粒，其用于阻斷B-細胞耐受的方法中。
67.根據(jù)權(quán)利要求55至66中任一項所述的細小病毒顆粒，其中所述細小病毒突變的結(jié)構(gòu)蛋白在基因治療中不作為載體使用。
68.如權(quán)利要求55至56和59至66中任一項所述的細小病毒顆粒在基因治療中的應(yīng)用。
69.一種生產(chǎn)基本上由VP3組成的細小病毒顆粒的方法，所述方法包括以下步驟i.在r印-非依賴性啟動子的控制下，于細胞中由細小病毒的VP3編碼序列(cds)表達VP3, 在r印-非依賴性啟動子控制下，于細胞中表達DNA序列片段(片段Z)，所述DNA序列片段包括(1)VP3起始密碼子上游至少44個核苷酸，和(2)從起始密碼子開始的多于242個的VP3cds核苷酸，其源自a)細小病毒，或者b)與源自AAV2(圖2)的片段Z的核苷酸序列至少60%，優(yōu)選80%，更優(yōu)選90%，特別是99 %，并且有利的是100 %相同的核苷酸序列，或者c)與AAV2的片段ZDNA分子的互補鏈在虹SSC、0. 1% SDS中于65°C下雜交的核酸序列，或者d)可以用于反式互補實驗以引起VP3VLP組裝的核酸序列，iii.于適合VP3表達的條件下孵育細胞，以及iv.從細胞中純化細小病毒顆粒，其中每個細胞形成大約IO5個，優(yōu)選大約IO6個，并且更優(yōu)選大約IO7個病毒顆粒， 并且基本上沒有VP1、VP2和R印，尤其是R印40、R印52、R印68和R印78蛋白表達。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述片段Z的序列與VP3cds不重疊，致使細小病毒顆粒僅由VP3組成。
71.根據(jù)權(quán)利要求69或70中任一項所述的方法，其中所述VP1、VP2和R印，尤其是 R印40、R印52、R印68和Rep78的蛋白表達被關(guān)閉。
72.根據(jù)權(quán)利要求69至71中任一項所述的方法，其中所述片段Z的DNA序列之后為 poly(A)信號。
73.根據(jù)權(quán)利要求69至72中任一項所述的方法，其中所述片段Z包括VP3起始密碼子上游至少44個核苷酸，優(yōu)選113個核苷酸，并且更優(yōu)選198個核苷酸。
74.根據(jù)權(quán)利要求69至73中任一項所述的方法，其中所述片段Z包括從起始密碼子開始的VP3cds的多于242個核苷酸，優(yōu)選多于大約275個核苷酸，多于大約300個核苷酸，多于大約325個核苷酸，多于大約350個核苷酸，多于大約375個核苷酸，多于大約400個核苷酸，多于大約425個核苷酸，并且最優(yōu)選多于大約445個核苷酸。
75.根據(jù)權(quán)利要求69至74中任一項所述的方法，其中所述片段Z包括至少一種突變。
76.根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法，其中所述片段Z的突變包括至少一種用于蛋白翻譯的終止密碼子。
77.根據(jù)權(quán)利要求69至76中任一項所述的方法，其中提供的所述片段Z相對于VP3cds 為順式。
78.根據(jù)權(quán)利要求69至77中任一項所述的方法，其中提供的所述片段Z相對于VP3cds 為反式。
79.根據(jù)權(quán)利要求69至78中任一項所述的方法，其中所述細小病毒顆粒不包含Rep蛋白。
80.根據(jù)權(quán)利要求69至79中任一項所述的方法，其中僅1/50的表達的結(jié)構(gòu)蛋白，優(yōu)選1/100，更優(yōu)選1/250，最優(yōu)選1/500的結(jié)構(gòu)蛋白是VP3的N-末端延伸形式，并且特別是沒有結(jié)構(gòu)蛋白是VP3的N-末端延伸形式。
81.根據(jù)權(quán)利要求69至80中任一項所述的方法，其中僅1/100的顆粒，優(yōu)選1/1000的顆粒，更優(yōu)選僅1/10000的顆粒包含病毒DNA，并且特別是沒有顆粒包含任何一種病毒DNA。
82.根據(jù)權(quán)利要求69至81中任一項所述的方法，其中所述細小病毒選自腺相關(guān)病毒 (AAV)、牛 AAV (b-AAV)、犬 AAV (CAAV)和禽 AAV (AAAV)。
83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中所述AAV選自AAV-1、AAV-2、AAV_3b、AAV-4、 AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-Il 和 AAV-12，特別是 AAV-2。
84.根據(jù)權(quán)利要求69至83中任一項所述的方法，其中所述VP3cds還包括一種或多種突變。
85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法，其中所述VP3cds的突變是選自以下突變的突變一種或多種缺失、一種或多種插入、一種或多種替換，以及這些突變的組合。
86.根據(jù)權(quán)利要求84或85中任一項所述的方法，其中所述VP3cds包括一種或多種沉默突變。
87.根據(jù)權(quán)利要求84至86中任一項所述的方法，其中所述VP3cds的一種或多種突變導(dǎo)致位于VP3VLP表面上的一種或多種突變。
88.根據(jù)權(quán)利要求84至87中任一項所述的方法，其中所述VP3cds的一種或多種突變導(dǎo)致位于VP3N-末端的一種或多種突變。
89.根據(jù)權(quán)利要求84至88中任一項所述的方法，其中所述VP3cds的一種或多種突變導(dǎo)致一種或多種在選自以下位點的一個或多個位點的插入1_261、1-266, 1-381、1-447、 1-448、 1-453、 1-459、 1-471、 1-534、 1-570、 1-573、 1-584、 1-587、 1-588、 1-591、 1-657、1-664、1-713 和 1-716，優(yōu)選 1-261、1-453、1-534、1-570、1-573 和 1-587，特別是 1-587。
90.根據(jù)權(quán)利要求89所述的方法，其中所述兩種插入在選自以下位點的兩個位點進行:1-261, 1-453、1-534、1-570、1-573 和 1-587，優(yōu)選 1-261 與 1-587 的組合，1-261 與 1-453的組合，或1-453與1-587的組合。
91.根據(jù)權(quán)利要求84至89中任一項所述的方法，其中所述VP3包括至少一種與病毒異源的表位。
92.根據(jù)權(quán)利要求91所述的方法，其中所述VP3蛋白的表位為B-細胞表位。
93.根據(jù)權(quán)利要求91或92中任一項所述的方法，其中所述B-細胞表位被插入至1-453 和 / 或 1-587，特別是至 AAV-U AAV-2 或 AAV-4 的 1-453 和 / 或 1-587。
94.根據(jù)權(quán)利要求85至93中任一項所述的方法，其中所述VP3被融合至第二蛋白或多肽。
95.根據(jù)權(quán)利要求85至94中任一項所述的方法，其中所述VP3包括至少一種用于與配體結(jié)合的標(biāo)簽。
96.根據(jù)權(quán)利要求85至95中任一項所述的方法，其中所述VP3包括至少一種另外的突變。
97.根據(jù)權(quán)利要求69至96所述的方法可獲得的細小病毒顆粒。
98.基本上由VP3組成的細小病毒顆粒， i.其中所述VP3包括一種或多種突變，和ii其中所述VP3不包含異源的核定位信號(NLS)，和 iii.其中所述顆粒不包含R印蛋白。
99.根據(jù)權(quán)利要求97或98所述的細小病毒顆粒，其中所述衣殼僅由VP3組成。
100.根據(jù)權(quán)利要求97至99中任一項所述的細小病毒顆粒，其中所述VP3的突變是如權(quán)利要求85至96中任一項所述的突變。
101.表達盒A，所述表達盒A包括異源啟動子和根據(jù)權(quán)利要求69和84至96所述的 VP3cds，其中所述VP3的轉(zhuǎn)錄由異源啟動子驅(qū)動，并且其中所述表達盒基本上僅表達VP3， 特別優(yōu)選的是所述表達盒僅表達VP3的表達盒。
102.表達盒B，所述表達盒B包括異源啟動子和根據(jù)權(quán)利要求69和73至76所述的片段Z，其中所述片段Z的轉(zhuǎn)錄由異源啟動子驅(qū)動。
103.表達盒C，所述表達盒C包括異源啟動子、根據(jù)權(quán)利要求69和84至96所述的 VP3cds、以及根據(jù)權(quán)利要求69和73至76所述的片段Z，其中所述VP3和片段Z的表達由所述一種異源啟動子驅(qū)動。
104.一種試劑盒，所述試劑盒包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求101所述的表達盒A和至少一種根據(jù)權(quán)利要求102所述的表達盒B。
105.一種試劑盒，所述試劑盒包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求103所述的表達盒C。
106.一種藥物，所述藥物包括根據(jù)權(quán)利要求97至100中任一項所述的細小病毒顆粒。
107.根據(jù)權(quán)利要求106所述的藥物，其還包括一種或多種賦形劑。
108.根據(jù)權(quán)利要求106或107中任一項所述的藥物，其中所述藥物為疫苗。
109.根據(jù)權(quán)利要求108所述的疫苗，其還包括一種或多種佐劑。
110.根據(jù)權(quán)利要求106至109中任一項所述的藥物，其用于預(yù)防或治療自體免疫性疾病、腫瘤、過敏性疾病、代謝性疾病、炎性疾病、神經(jīng)性疾病，或者被用于眼科。
111.根據(jù)權(quán)利要求106至110中任一項所述的藥物，其用于阻斷免疫耐受。
112.根據(jù)權(quán)利要求106至111中任一項所述的藥物，其中所述疾病不是傳染性疾病。
113.根據(jù)權(quán)利要求106至112中任一項所述的藥物，其中所述細小病毒突變的結(jié)構(gòu)蛋白在基因治療中不作為載體使用。
114.如權(quán)利要求97至100所述的包括至少一種與細小病毒異源的B-細胞表位的細小病毒顆粒在制備疫苗中的應(yīng)用，其優(yōu)選用于預(yù)防或治療自體免疫性疾病和/或慢性炎性疾病，優(yōu)選類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或克羅恩病，腫瘤、過敏性疾病、哮喘、阿爾茨海默病、動脈硬化癥、代謝性疾病、炎性疾病、神經(jīng)性疾病或被用于眼科，尤其是其中所述藥物如權(quán)利要求 106至113所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼新的細小病毒蛋白“組裝活化蛋白”(AAP)的核酸，編碼的多肽，生產(chǎn)多肽的方法，AAP特異性抗體，核酸在多肽制備中的應(yīng)用，核酸或多肽在制備細小病毒顆粒中的應(yīng)用，以及在細胞中通過提供除細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP3的編碼序列之外的序列片段Z/AAP編碼核酸，并且在rep-非依賴性啟動子控制下表達VP3和片段Z來生產(chǎn)基本上由VP3組成的細小病毒顆粒的方法。此外，本發(fā)明涉及基本上由VP3組成的和/或通過上述方法獲得的細小病毒顆粒，以及包括(i)異源啟動子和(ii)VP3編碼序列和/或片段Z的表達盒。本發(fā)明進一步涉及包括細小病毒顆粒或表達盒的藥物，尤其是疫苗，以及它們的應(yīng)用。
文檔編號A61K39/23GK102341406SQ201080010540
公開日2012年2月1日 申請日期2010年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日
發(fā)明者佛羅萊恩·桑塔格, 克斯廷·勒克斯, 尤爾根·克萊舒密特, 馬庫斯·奧雷 申請人:德國癌癥研究中心, 麥迪金股份公司