專利名稱：活化蛋白c的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種新的活化蛋白C的方法。該方法提供一種簡便有效的手段，使蛋白C從酶原形式轉(zhuǎn)變成活化蛋白C?；罨鞍證的先有技術(shù)方法包括用在溶液中的高濃度凝血酶，或在一起的凝血酶和凝血調(diào)變蛋白(thrombomodulin)，或其他價(jià)格昂貴的用于活化作用的酶來處理蛋白C的無活性酶原形式。本發(fā)明提供一種用固定的凝定酶使蛋白C活化的方法，從而避免使用凝血調(diào)變蛋白，并產(chǎn)生易于從固定的凝血酶絡(luò)合物中純化的活化蛋白C分子。
蛋白C在調(diào)節(jié)血液凝固中所起的作用蛋白C是一種依賴于維生素K的血漿蛋白，在控制止血作用方面具有重大的生理作用。蛋白C作為一個(gè)無活性分子被合成，此處稱之為“初生蛋白C”。初生蛋白C經(jīng)復(fù)雜的加工，產(chǎn)生很多不同的無活性分子，如同下面所作出的更加充分的敘述。此處將蛋白C的無活性分泌形式稱作為“酶原蛋白C”。在血液中，通過涉及凝血調(diào)變蛋白一凝血酶絡(luò)合物的反應(yīng)，發(fā)生蛋白C的活化作用。經(jīng)活化的蛋白C及其輔助因子蛋白S一起，是一種具有重要生理學(xué)意義的抗凝劑。活化的蛋白C能防止血管內(nèi)血栓癥，并控制原有血塊的擴(kuò)大?；罨问降鞍證的作用機(jī)理以及無活性凝血酶轉(zhuǎn)變成活性蛋白酶的活化機(jī)理在近些年內(nèi)已被闡明(文獻(xiàn)綜述見J.E.Gardiner and J.H.Griffin，Progress in Hematology，Vol.ⅩⅢ，PP.265-278，ed.Elmer B.Brown，Grune andStratton，Inc，1983)。
蛋白C的活化作用涉及凝血酶，即凝血鏈鎖反應(yīng)最終的絲氨酸蛋白酶，以及稱之為凝血調(diào)變蛋白的、與內(nèi)皮細(xì)胞膜相聯(lián)的糖蛋白。凝血調(diào)變蛋白與凝血酶形成一個(gè)牢固緊密的化學(xué)計(jì)量絡(luò)合物。當(dāng)凝血調(diào)變蛋白與凝血酶絡(luò)合時(shí)，完全改變了凝血酶的功能性質(zhì)。在正常情況下，凝血酶將纖維蛋白原凝成塊，使血小極活化，并將凝血因子Ⅴ和Ⅷ轉(zhuǎn)變成它們的活化形式Ⅴa和Ⅷa。最后，凝血酶使蛋白C活化，但是很慢而且效能不高。反之，與凝血調(diào)變蛋白絡(luò)合的凝血酶并不使纖維蛋白原凝成塊，不使血小板活化，或不將凝血因子Ⅴ和Ⅷ轉(zhuǎn)變成它們的活化相應(yīng)物Ⅴa和Ⅷa，但變?yōu)榉浅Ｓ行У牡鞍谆罨瘎?。通過凝血調(diào)變蛋白-凝血酶，蛋白C的活化作用速率常數(shù)比單獨(dú)用凝血酶時(shí)高1000倍以上。
為了解活化蛋白C如何下調(diào)血液凝固，下面對(duì)凝固酶系統(tǒng)進(jìn)行簡略的敘述。最好把凝固系統(tǒng)作為包括各酶原依次連續(xù)性活化成為各種活性的絲氨酸蛋白酶的鏈鎖反應(yīng)來考察。該鏈鎖反應(yīng)最終產(chǎn)生凝血酶，它經(jīng)過有限的蛋白分解，將血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成不溶性的凝膠纖維蛋白。在凝固鏈鎖反應(yīng)中，兩件關(guān)鍵的事情是一、通過凝血因子Ⅸa使凝血因子Ⅹ子轉(zhuǎn)變成Ⅹa;二、通過凝血因子Ⅹa，使凝血酶原轉(zhuǎn)變成凝血酶。這兩種反應(yīng)在細(xì)胞表面發(fā)生，最顯著地在血小板表面，同時(shí)兩種反應(yīng)均需輔助因子。主要的輔助因子(因子Ⅴ和Ⅷ)在系統(tǒng)中作為相應(yīng)的無活性前體流通，但當(dāng)開頭幾個(gè)凝血酶分子形成時(shí)，凝血酶便返回來通過有限的蛋白分解使輔助因子活化。被活化的輔助因子Ⅴa和Ⅷa加速了高凝血酶原轉(zhuǎn)變成凝血酶，也加速了因子Ⅹ轉(zhuǎn)變成因子Ⅹa，速率大約提高5個(gè)數(shù)量級(jí)?；罨鞍證優(yōu)先作用于蛋白的降解和水解，并不可逆地破壞凝血因子Ⅴa和Ⅷa(無活性凝血因子Ⅴ和Ⅷ的活化形式)。反之，凝血因子Ⅴ和Ⅷ對(duì)活化的蛋白C來說是非常差的底物。
活化蛋白C的一個(gè)重要輔助因子是蛋白S，它是另一種依賴維生素K的血漿蛋白。蛋白S使活化蛋白C介導(dǎo)的因子Ⅴa和Ⅷa的水解增加25倍。
蛋白C作為治療劑蛋白C被公認(rèn)為一個(gè)有價(jià)值的治療劑(見歐洲專利公開No.0215548和美國專利No.4，775，624，此處作為參考文獻(xiàn))。經(jīng)活化的蛋白C是一種常用的抗凝劑(如肝素及口服羥基香豆精抗凝劑)具有更大治療指數(shù)的新抗血栓劑，在凝血酶再生之前，酶原蛋白C和活化蛋白C者均無效，因?yàn)閷⒛蜃英鹾廷D(zhuǎn)變成Ⅴa和Ⅷa需要凝血酶;這兩種輔助因子的活化形式對(duì)活化蛋白C來說是較好的底物。活化酶原蛋白C時(shí)也需要凝血酶，因?yàn)闆]有凝血調(diào)變蛋-凝血酶絡(luò)合物，蛋白C酶原是不能被轉(zhuǎn)變成其活性相應(yīng)物的。
活化蛋白C是一種按照要求的抗凝劑，因?yàn)榛罨鞍證是使輔助因子Ⅴa和Ⅷa失活而起作用的。因?yàn)橐蜃英跫阿D(zhuǎn)變成它們的活化的相應(yīng)物Ⅴa和Ⅷa時(shí)需要凝血酶，蛋白C僅僅在凝血酶再生之后才起到抗凝劑作用。與活化蛋白C相反，常用的抗凝劑只需給予病人，在整個(gè)循環(huán)中維持恒定的抗凝狀態(tài)，因此，大大增加了并發(fā)出血癥的危險(xiǎn)，這種危險(xiǎn)性超過了蛋白C或活化蛋白C所引起的。所以，活化蛋白C是一種按照要求的、在臨床上廣泛作為肝素和羥基香豆精的代用品使用的抗凝劑。
在某些疾病狀態(tài)中(例如遺傳性的蛋白C缺乏)，蛋白C酶原具有重大治療重要性。在先天性純合子(homozygous)蛋白C缺乏情況下，患者個(gè)人早在童年時(shí)代就因暴發(fā)性紫癜而死亡，這是一種彌散性血管內(nèi)凝血異常常見的致死形式。在雜合子(heterozygous)蛋白C缺乏情況下，患者個(gè)人忍受厲害的周期性的血栓塞發(fā)作。臨床上充分證實(shí)設(shè)計(jì)用來治療血友病B或凝血因子Ⅸ缺乏的血漿蛋白濃縮物(含蛋白C作為雜質(zhì))，對(duì)預(yù)防和治療雜合蛋白C缺乏情況下的血管內(nèi)凝塊有效。在血栓狀態(tài)下(如彌散性血管內(nèi)凝固)以及在易發(fā)生血栓的疾病狀態(tài)下(如嚴(yán)重創(chuàng)作，大外科手術(shù)和癌癥)，也已被注意到蛋白C的濃度出現(xiàn)反常的偏低。
雖然蛋白C酶原形式對(duì)治療目的是十分有用的，將蛋白C的活化形式給予病人，某些疾病狀態(tài)能得到更有效的治療。在下列疾病狀態(tài)下，例如，心肌梗塞或深度靜脈血栓形式(特別發(fā)生在下肢外科手術(shù)之后)，病人有正常深度水平的蛋白C酶原，尚無足夠的活化蛋白C來制止血栓生成或支持除去原有的血栓。之所以不能使活化蛋白C的生成達(dá)到足夠的量是由于凝血調(diào)變蛋白不充分所造成。但是，不管什么原因，對(duì)這些疾病狀態(tài)的有效治療所需要的是活化蛋白C，并不是酶原。本發(fā)明提供了一種使蛋白C活化的新方法，訪法采用的是固相的凝血酶，而不是凝血酶/凝血調(diào)變蛋白的絡(luò)合物。
人蛋白C的合成和活化作用初生蛋白C能用下列圖解描繪
pre-pro-初生人蛋白C的氨基酸殘基1-42為人蛋白C的信號(hào)肽及前肽，對(duì)指導(dǎo)蛋白C的分泌和r-羧基化十分重要。
LC -初生蛋白C的氨基酸殘基43-197，一旦經(jīng)轉(zhuǎn)譯后修飾，就組成雙鏈酶原(自單鏈酶原除去KR二肽而成，如下所討論)和蛋白C的活化形式的輕鏈(LC)。
KR -初生人蛋白C的氨基酸殘基198-199;這些殘基確信要被除去(基于與牛蛋白C的同源性)，可能通過包括最初的裂解(在殘基197-198之間或在199-200之間)隨后通過羥肽酶或氨酞酶作用，形成雙鏈蛋白C的兩步程序。
AP -初生蛋白C的氨基酸殘基200-211組成起活化作用的肽，它從蛋白C的酶原形試中除，去得到活化蛋白C。
AHC -初生蛋白C的氨基酸殘基212-461，一旦經(jīng)轉(zhuǎn)譯后修飾，組成活化蛋白C的活化重鏈(AHC)。
ⅡC -蛋白C酶原的二鏈形式的重鏈，一旦經(jīng)轉(zhuǎn)譯后修飾，組成氨基酸殘基200-461，即AP和AHC。
人蛋白C酶原是在肝中合成的絲氨酸蛋白酶前體，并存在于血液中，為表達(dá)完整的生物學(xué)活性，蛋白C需要進(jìn)行轉(zhuǎn)譯后的修飾，此修飾過程需要維生素K。該成熟的、雙鏈的、由二硫鍵連接的蛋白C酶原，由一個(gè)單鏈前體通過限制性蛋白水解作用而產(chǎn)生。這種限制性蛋白水解作用被確信包括pre-pro肽的裂解和除去，該肽由在細(xì)胞內(nèi)加工過程中生成的氨基酸殘基1-42所組成;從細(xì)胞中分泌初生多肽;以及除去氨基酸殘基198和199以形成在酶原中觀察到的雙鏈。酶原活化成活性絲氨酸蛋白酶的過程涉及ARG-LEU肽鍵(殘基211和212)的蛋白水解。后者裂解釋放出構(gòu)成雙鏈酶原分子較大鏈(重鏈)氨基末端的十二肽(殘基200-211)。蛋白C受到明顯地糖基化作用，成熟的酶含約23%碳水合物。蛋白C也含有若干不平常的氨基酸，包括r-羧基谷氨酸和β羥基天冬氨酸(赤-L-β羥基天冬氨酸)。r-羧基谷氨酸(gla)由谷氨酸殘基經(jīng)r-谷氨酰基羧化反應(yīng)而成，該反應(yīng)借助于需要維生素K作為輔助因子的肝微粒體羧化酶。
人蛋白C的活化作用也能用圖解表示并說明如下。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)該明白，圖解中所示的步驟順序不一定反映體內(nèi)的途徑。
本發(fā)明提供一種采用固相凝血酶使蛋白C酶原活化的新方法。
為了本發(fā)明的目的，在此處所公開的說明書和權(quán)利要求書中，下列術(shù)語定義如下。
本發(fā)明所描述的蛋白質(zhì)或肽鏈中的氨基酸殘基的縮寫如下三字母縮寫 氨基酸殘基 一字母縮寫PHE 苯丙氨酸 FLEU 亮氨酸 LILE 異亮氨酸 IMET 蛋氨酸 MVAL 纈氨酸 VSER 絲氨酸 SPRO 脯氨酸 PTHR 蘇氨酸 TALA 丙氨酸 ATYR 酪氨酸 YHIS 組氨酸 HGLN 谷氨酰胺 QASN 天冬氨酰胺 NLYS 賴氨酸 KASP 天冬氨酸 DGLU 谷氨酸 ECYS 半胱氨酸 CTRP 色胺酸 WTRG 精氨酸 R
GLY 甘氨酸 GEnh或增強(qiáng)子-BK病毒增強(qiáng)子。
r-羧基化反應(yīng)-在谷氨酸r碳原子上加上一個(gè)羧基的反應(yīng)。
r-羧化蛋白-蛋白內(nèi)某些谷氨酸殘基已經(jīng)過羧基化的蛋白。
初生蛋白-mRNA轉(zhuǎn)錄本剛轉(zhuǎn)譯過來的未經(jīng)任何轉(zhuǎn)譯后修飾的多肽。然后諸如谷氨酸殘基的r-羧基化以及天冬氨酸殘基羥基化這樣的轉(zhuǎn)譯后修飾可以在蛋白從mRNA轉(zhuǎn)錄本全部被轉(zhuǎn)譯之前發(fā)生。
蛋白C的活性-人蛋白C的任何性質(zhì)蛋白水解，酰胺解，酯解以及生物學(xué)(抗凝固或纖維蛋白溶解)等活性。測定蛋白抗凝活性的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，參見文獻(xiàn)(Grinnell等，1987，Biotechnology51189)。
酶原-蛋白水解酶的無酶催化活性的前體。此處所用蛋白C酶原指的是蛋白C的分泌的、無活性形式，無論是單鏈還是雙鏈。
本發(fā)明提供使蛋白C活化的新方法，該方法包括下列步驟a)使無活性蛋白C與固相的凝血酶相接觸，以及b)從固相凝血酶和其他的污染物中純化活化的蛋白C。
雖然幾種產(chǎn)生無活性人蛋白C酶原和無活性的初生人蛋白C的方法已經(jīng)被敘述(見歐洲專利公開215548和美國專利4，775，624，以此處將其方法指導(dǎo)通過參考文獻(xiàn)編入)，但公開材料并沒有提供采用固相凝血酶使蛋白C活化的方法。取而代之，到目前為止所產(chǎn)生的蛋白C酶原已被下列物質(zhì)處理過，例如溶解狀態(tài)的α-凝血酶、胰蛋白酶、Russell氏蝰蛇毒因子X的活化劑，或凝血酶和血栓緩和素的混合物，以便得到活化蛋白C。所有這些活化方法使得重組生產(chǎn)活化的人蛋白C效率低，有污染的危險(xiǎn)以及成本較高。某些活化反應(yīng)一定要嚴(yán)密的加以監(jiān)控，以使蛋白分解在起活化作用的肽被裂解之后停止-，否則的話，所產(chǎn)生的活化蛋白C被裂解并變的無活性。此外，維持在溶解狀態(tài)的α-凝血酶有自身消化的趨勢，所以需要向反應(yīng)混合物中連續(xù)添加α-凝血酶。本發(fā)明采用固相凝血酶使蛋白C活化的方法消除了凝血酶自身消化的問題，以及對(duì)凝血調(diào)變蛋白的需要。本發(fā)明的方法不僅能用于活化由DNA重組技術(shù)形成的人蛋白C酶原，而且能用于天然存在的，從血漿中分離的人蛋白C的活化。Kisiel，W.(1979，J.Clin.Invest.64761-769)公開了這樣一種從血漿中分離蛋白C的方法，本文將該方法編入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。此外，本發(fā)明的方法也可用于活化蛋白C的衍生物，如Bang等人的敘述(見歐洲專利公開No.EP-0-323 149)。包括新的糖基化作用型式的人蛋白C重組分子也可采用本發(fā)明的新的固相凝血酶方法進(jìn)行活化。
通常，本發(fā)明的方法可通過將凝血酶固定于任何支持樹脂上得以實(shí)施。所用凝血酶的類型取決于若干因素，特別是費(fèi)用和安全性。盡管人、馬、大鼠或小鼠的凝血酶在市場上都能買到，但牛凝血酶通常是優(yōu)選的，因?yàn)樗淮罂赡鼙蝗梭w內(nèi)病毒污染。有幾類凝血酶，例如α-凝血酶，β-凝血酶和δ-凝血酶也能買到，并在本發(fā)明中是有用的，但α凝血酶是優(yōu)選的。
許多不同類型的固體支持物都可用來固定凝血酶(用于活化蛋白C)，但瓊脂糖凝膠(Sepharose)和瓊脂糖(agarose)是優(yōu)選的。一種帶有N-羥基琥柏酰亞胺(NHS)酯類作為交聯(lián)試劑的瓊脂糖親和性支持物是最優(yōu)選的。凝血酶含有賴氨酸殘基，其ε-氨基在非氨基緩沖液如HEPES中被連接到柱子上，調(diào)節(jié)HEPES緩沖液的PH到大約7.6，以便維持凝血酶的穩(wěn)定性，而且使賴氨酸變得足以去質(zhì)子化。在酯內(nèi)的碳原子通過去質(zhì)子化的賴氨酸進(jìn)行親核性攻擊，從而讓凝血酶結(jié)構(gòu)上的賴氨酸殘基取代酯基。該反應(yīng)是很溫和的，凝血酶能保持穩(wěn)定。
一旦凝血酶結(jié)合到支持物上，固相的凝血酶就能用適宜的緩沖液平衡，而且為了活化作用，可加入蛋白C。在批量反應(yīng)中，固相的凝血酶能和蛋白C相接觸，或者讓蛋白C通過含有固相凝血酶的柱子。蛋白C可通過一長柱子處理或用一短柱子循環(huán)處理，并在反應(yīng)過程中任何給定的點(diǎn)上檢定其活化程度。固相凝血酶的方法比先前的可溶性凝血酶方法更有效，因?yàn)楣滔嗄覆幌笕芙鉅顟B(tài)的凝血酶那么容易降解。固相凝血酶的柱子是可以重復(fù)利用的，通常多達(dá)15次。固相凝血酶的方法比先前的固相凝血酶/凝血調(diào)變蛋白方法更有效，因?yàn)樵谀?凝血調(diào)變蛋白方法中所用的凝血調(diào)變蛋白不是以共介鍵結(jié)合到固相支持物上，可能會(huì)污染活化蛋白C的最后洗脫液。當(dāng)單獨(dú)使用經(jīng)固相的凝血酶時(shí)，這種交叉污染是不明顯的(＜1ppm)。
活化蛋白C的活性能通過各種各樣的方法加以監(jiān)控，盡管最普通的是“Xa因子-步凝集測試法”或“活化部分促凝血酶原激酶的時(shí)間(APTT)的凝集測試法”。兩種測試在文獻(xiàn)中都有敘述(Grinnell等，1987.Biotechnology 51189-1192)，該方法全部被列為本發(fā)明參考文獻(xiàn)。Bang還公開了一些活化方法(美國專利No.4，775，624，審定日期1988年10月4日)，該方法全部被列為本發(fā)明參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明方法的第一步是將大約50mg牛α-凝血酶溶解于約25ml50mMHEPES緩沖液(pH7.6)中。然后用大約500ml非常冷的高純度水洗滌25ml瓶裝的Affi-GelTM-10微球，在從微球內(nèi)排出過量水份之后，將濕的微球加到凝血凝酶溶液中，并在4℃下于旋轉(zhuǎn)混合器中緩和地混合1-2小時(shí)。將100ul1M甘氨酸(pH8.0)加到溶液中，于4℃下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)1-16小時(shí)，以封閉Affi-GelTM10樹脂上未反應(yīng)的位點(diǎn)。
凝血酶微球(T-微球)被分裝到二支消過毒的50ml聚苯乙烯管內(nèi)，并在半速或更慢速度下離心30-60秒鐘。將管子放在冰上，讓T-微球沉降1-2分鐘，然后移出上清液并棄去。每個(gè)管里留下大約1.25mlT-微球。
向每個(gè)試管中加入約35ml由20mM Tris-HCl(pH.4)和200mM NaCl組成的洗滌緩沖液，然后將其倒置，直到所有T-微球重新懸浮。如前面那樣將管子離心，然后放在冰上使之完全沉淀，取出上清液并棄去。將該洗滌步驟重復(fù)10-15次，然后檢驗(yàn)最后的上清液中酰胺分解活性，以檢出未結(jié)合的或被沖洗掉的凝血酶。如果在405nm下光密度變化少于0.002/min，T-微球即可備用。如果光密度太高，應(yīng)重復(fù)洗滌步驟，直至達(dá)到適當(dāng)?shù)乃健?br> 一旦上清液顯示出適當(dāng)?shù)募兌?，就可制?5%的T-微球懸浮液，即每毫升經(jīng)過離心的T-微球加入3ml由20mM Tris-HCl(pH7.4)，和200mM NaCl洗滌緩沖液，如果在洗滌緩沖液中于4℃保持消毒狀態(tài)，T-微球能貯存較長一段的時(shí)間。
通過在1.5ml聚丙烯微量離心管中37℃下進(jìn)行試驗(yàn)性活化2-3小時(shí)而測試T-微球懸浮液活化蛋白C的能力。通過Crinnell等人公開的S-2238酰胺分解步驟和抗凝活性步驟，均能測定蛋白C的功能活性，見文獻(xiàn)(1987，Biotechnology 51189-1192)。旋轉(zhuǎn)含有蛋白C、固相凝血酶的微量離心管，每次30-60分鐘，直到蛋白C的功能活性達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。
本發(fā)明通過以下范例作進(jìn)一步闡明。
實(shí)例1牛α-凝血酶的固相化將一瓶大約5mg無熱原質(zhì)的高純度牛凝血酶(得自Miles Laboratories，Inc.，1121 Myrtle，Box 2000，Elkhart，Indiana 46515或ICN Pharmaceuticals，Inc.，26201 Miles Road，Cleveland，Ohio，44128)溶解于25ml 50mM HEPES緩沖液(pH7.6)中。將25ml商標(biāo)為Affi-GelTM10的瓶裝微球(Bio-Rad Laboratories，P.O.Box 708，220Maple Avenue，Rockville Centre，New York 11571)置于150ml多孔玻璃漏斗中，用大約300-500ml冷的高純度的水洗滌，在每次添加水后，將微球重新拌成漿狀并且勿讓其干燥。微球很脆，并且易被碎裂。
將凝血酶溶液轉(zhuǎn)移到一支消毒的50ml聚苯乙烯離心管中，加入洗滌過的微球，加蓋塞住，內(nèi)容物于40℃在旋轉(zhuǎn)混合器中旋轉(zhuǎn)1-2小時(shí)，讓其緩和地混勻。其次，加入100μl 1M甘氨酸溶液(pH8.0)，封閉Affi-GelTM-10樹脂上未反應(yīng)位點(diǎn)。重新將管子塞緊并于4℃旋轉(zhuǎn)1-16小時(shí)。凝血酶微球(T-微球)被分成2份，各置于50ml聚苯乙烯離心管中。放在冰浴內(nèi)進(jìn)一步冷卻。后置于階式頂型臨床離心機(jī)中(轉(zhuǎn)速約1000-2000rpm)，在半速或低于半速下離心60秒鐘。小心地將管子移入冰浴并讓其在1-2分鐘之后出現(xiàn)沉降。用消毒吸管將上清液從每個(gè)管子中移出。每管約有12.5ml T-微球留下來。
向每個(gè)管子內(nèi)加入約35ml T-微球洗滌緩沖液[20mM Tris-HCl(pH7.4)，200mM NaCl]，塞緊，用手輕輕地倒轉(zhuǎn)過來，直到T-微球重新懸浮。在用消毒吸管吸出上清液之前，將管子在半速下離心60秒鐘，然后放入冰浴1-2分鐘。該洗滌步驟重復(fù)約10-15次，以除去污染的內(nèi)毒素，甘氨酸和凝血酶。
然后用S-2238酰胺分解測定法檢驗(yàn)上清液。將25mg瓶裝HelenaLaboratories出品的S-2238底物溶解在18ml 20mM Tris-HCl，150mMNaCl(pH7.4)中，該緩沖液經(jīng)0.2mm Acrodisc過濾器消毒過濾。其次，配制“稀釋緩沖液”，由20mM Tris-HCl，(pH7.4)，150mM NaCl3mM CaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)所組成。為檢驗(yàn)瀝濾凝血酶的T-微球，可按以下原始記錄的操作步驟進(jìn)行。在一次性使用的微量比色杯中，100μl T-微球上清液與600μl“稀釋緩沖液”和300μl S-2238底物的溶液相混合。比色杯用封口薄膜封住，然后倒轉(zhuǎn)混勻。在波長405nm下將光密度讀數(shù)4分鐘。如果每分鐘光密度值差(△O.D./min)為0.002或更小，則表明T-微球是足夠干凈的。如果其差大于0.002，則按原始記錄要求，一定要重復(fù)洗滌步驟，直到T-微球不含瀝濾了的凝血酶。
一旦T-微球顯得干凈，就在離心管邊上刻度，以計(jì)量T-微球的相對(duì)體積。然后加入三倍體積的T-微球洗滌緩沖液，以達(dá)到稀釋至25%(1→4)的目的。如果在消毒條件下保存，T-微球在此溶液中，于4℃下可長時(shí)間貯存。
為測驗(yàn)T-微球?qū)罨鞍證的能力，將400μl重新懸浮的T-微球轉(zhuǎn)移到1.5ml聚丙烯微量離心管中，在半速下離心60秒鐘，然后小心地除去上清液。將500μl高質(zhì)量的非活化的重組人蛋白C(1mg/ml)的樣品和10μl 0.2mM EDTA(pH7.4，用來除去鈣)一起加到T-微球中。將管子加蓋，緩和地倒轉(zhuǎn)數(shù)次，然后如前那樣進(jìn)行離心。從上清液移出100μl樣品，并和900μl T-微球“稀釋緩沖液”混合，在波長280nm下進(jìn)行光密度讀數(shù)，以確保樣品在重組人蛋白C(rHPC)中為1mg/ml。
反應(yīng)管重新加蓋，在37℃下旋轉(zhuǎn)2-4小時(shí)。在30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)及4小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，將管子離心并移出10μl樣品，稀釋該10μl樣品，使得終濃度為10μg/ml rHPC。將該稀釋的樣品50μl加到650μl“活性測定用稀釋緩沖液”和300μl S-2238底物中，然后緩和地倒轉(zhuǎn)將其混勻。在波長405nm下進(jìn)行光密度讀數(shù)4分鐘。如果光密度的變化大于0.1/分鐘，表明rHPC是完全有活性的。
實(shí)例2γHPC的活化重組HPC的制備大體上按照以下方法指導(dǎo)進(jìn)行，Bang等，美國專利4，775，624和Grlnnell等，1987，Biotechnology 51189-1194。100ml FFQ(Pharmacla Fast Flow Q)樹脂按制造商所推薦的方法嚴(yán)格地制備而得。然后將FFQ樹脂用含有20mM Tris，0.15M NaCl，2mM EDTA和2mM苯甲脒的緩沖液(pH7.4)平衡。將EDTA和苯甲脒加到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，終濃度分別為4mM和5mM。在線性流速為20cm·h時(shí)，將培養(yǎng)基通過FFQ柱(3×16cm)。將柱子首先用300ml(3個(gè)柱子體積)含20mM Tris，0.15M NaCl，2mM EDTA，2mM苯甲脒的溶液(pH7.4)洗滌，然后用300ml(3個(gè)柱子體積)含有20mM Tris，0.15M NaCl，10mM CaCl和2mM苯甲脒的溶液(pH7.4)洗滌。將此第二次洗脫液用經(jīng)典的陰離子交換步驟濃縮。
將純化的含γHPC的溶液通過消毒的0.2μm Acrodisc過濾器過濾到聚丙烯容器內(nèi)。γHPC的濃度在1-10mg/ml范圍內(nèi)(在20mM Tris，pH7，4，0.15M NaCl中，不存在CaCl2的情下，即“活化前緩沖液”)。將實(shí)例1產(chǎn)生的T-微球用T-微球洗滌緩沖液洗滌，然后離心，棄去上清液。大約5-7ml T-微球已足夠活化多達(dá)45ml純凈的γHPC。
將在“活化前緩沖液”中的γHPC加到T-微球中去，然后加入EDTA到終濃度為0.5mM。將管加蓋，在37℃緩和地旋轉(zhuǎn)。定時(shí)移出等分試樣，按實(shí)例1的方法指導(dǎo)測定酰胺分解活性。經(jīng)用此法處理過的蛋白C被發(fā)現(xiàn)在2小時(shí)內(nèi)具有100%的活性。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員還會(huì)認(rèn)識(shí)到許多與本發(fā)明所述的特定物質(zhì)和方法等價(jià)的物質(zhì)和方法(采用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法)。這樣的物質(zhì)和方法也認(rèn)為在本發(fā)明范圍之內(nèi)，并包括在下列權(quán)利要求書中。
權(quán)利要求
1.一種使蛋白C活化的方法，該方法包括下列步驟a)使非活化蛋白C與固相的凝血酶接觸以及b)從固相的凝血酶和其他污染物中純化活化蛋白C。
2.權(quán)利要求1的方法，其中凝血酶選自由牛凝血酶，與凝血酶，人凝血酶，小鼠凝血酶和大鼠凝血酶組成的一組凝血酶。
3.權(quán)利要求1的方法，其中凝血酶選自由α-凝血酶，β-凝血酶和γ-凝血酶組成的一組凝血酶。
4.權(quán)利要求1的方法，其中凝血酶被固定在瓊脂糖上。
5.權(quán)利要求1的方法，其中凝血酶被固定在瓊脂糖凝膠上。
6.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白C選自由牛蛋白C，人蛋白C和人蛋白C衍生物組成的一組蛋白C。
7.權(quán)利要求6的方法，其中蛋白C是人蛋白C。
8.權(quán)利要求2的方法，其中凝血酶是牛α-凝血酶，
9.權(quán)利要求8的方法，其中牛α-凝血酶被固定在瓊脂糖上。
10.權(quán)利要求9的方法，其中蛋白C是人蛋白C。
全文摘要
無論是衍生自血漿還是產(chǎn)生自DNA重組工程的蛋白C分子的活化，都能通過蛋白C分子與固相凝血酶相接觸而達(dá)到目的。本發(fā)明方法比采用凝血酶/凝血調(diào)變蛋白絡(luò)合物更為有效，并消除了凝血酶自身降解的問題。
文檔編號(hào)C12N9/64GK1050043SQ9010746
公開日1991年3月20日 申請(qǐng)日期1990年9月5日 優(yōu)先權(quán)日1989年9月5日
發(fā)明者殷秀慈 申請(qǐng)人:伊萊利利公司