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      用于鑒定病原體的寡核苷酸微陣列的制作方法

      文檔序號(hào):433181閱讀:196來(lái)源:國(guó)知局

      專(zhuān)利名稱(chēng)::用于鑒定病原體的寡核苷酸微陣列的制作方法用于鑒定病原體的寡核苷酸微陣列本申請(qǐng)要求于2005年12月30日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/755,504的權(quán)益。發(fā)明背景本發(fā)明涉及用于檢測(cè)檢驗(yàn)樣品中病原體存在情況的檢驗(yàn)試劑盒和方法。檢驗(yàn)樣品可以獲自患者或者來(lái)自可能含有病原體的食物或飲料的來(lái)源。諸如腦炎、腦膜炎、腦(脊)膜炎、肺炎、腸胃炎、心內(nèi)膜炎、尿道感染的疾病由病原體感染引起。病原體包括不同的細(xì)菌、病毒、真菌和原生動(dòng)物。不同的致病性感染往往具有類(lèi)似的癥狀,這致使難以提供感染或疾病的起因的確診。例如,腦炎和腦(脊)膜炎患者一般都會(huì)出現(xiàn)發(fā)燒、頭痛和驚厥??焖俣鴾?zhǔn)確地鑒定引起這些癥狀的病原體對(duì)于確定開(kāi)出什么藥方至關(guān)重要。當(dāng)前用于鑒定病原體的診斷方法包括鏡檢、微生物培養(yǎng)、血清免疫測(cè)試和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。這些方法需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格訓(xùn)練的人員而且非常費(fèi)時(shí)。按照常規(guī)的PCR方法,將含有起模板作用的基因的檢驗(yàn)樣品與設(shè)計(jì)成用于擴(kuò)增具有特定長(zhǎng)度的至少一種基因的至少一對(duì)PCR引物混合。通過(guò)使所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并使其染色,就可使PCR產(chǎn)物顯現(xiàn)。按照PCR方法,根據(jù)所顯現(xiàn)的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度來(lái)鑒定檢驗(yàn)樣品中所含的基因。在同一樣品中可以擴(kuò)增多對(duì)引物以便更有效地篩選多種基因。然而,隨著引物試劑中所含PCR引物的數(shù)量增多,在電泳凝膠上的"噪聲"也隨之增多。當(dāng)由于非特異性退火產(chǎn)生PCR產(chǎn)物時(shí),"噪聲"就會(huì)出現(xiàn)。出于此原因,當(dāng)使用PCR反應(yīng)時(shí),難以確定不只是僅少數(shù)基因存在。此外,有必要設(shè)計(jì)好引物,以使經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物在分辨率有限的電泳凝膠上可以辨別。要設(shè)計(jì)出可產(chǎn)生適當(dāng)?shù)目煞直鍼CR產(chǎn)物且噪聲低的引物并不容易并且耗時(shí)。因此,嚴(yán)格的基于PCR/電泳的方法對(duì)于篩選大量基因表達(dá)是低效的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于檢測(cè)生物樣品或檢驗(yàn)樣品中的目標(biāo)核酸的方法和檢驗(yàn)試劑盒。使用寡核苦S吏微陣列快速地高通量篩選病原體的存在情況。寡核苷酸微陣列含有已知病原體的各種聚核苷酸(探針),并且以一個(gè)雜交測(cè)定來(lái)鑒別病原體。一方面,本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)易而快速地確定生物樣品或4金驗(yàn)樣品中是否存在含有目標(biāo)核酸的多核苷酸的方法。另一方面,本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)生物樣品或檢驗(yàn)樣品中病原體的目標(biāo)核酸的方法,所述方法包括利用與不止一種病原體中的保守區(qū)結(jié)合的一對(duì)或更多對(duì)引物來(lái)擴(kuò)增樣品中的目標(biāo)核酸;使擴(kuò)增的目標(biāo)核酸與寡核苷酸微陣列接觸;且檢測(cè)目標(biāo)核酸與探針的結(jié)合情況,其中與特定病原體探針結(jié)合則表明樣品中存在該病原體。所述微陣列包括含與不同病原體互補(bǔ)的多核苷酸序列的兩種或以上的探針或者探針組。又一方面,本發(fā)明涉及一種辨別樣品中的大腸桿菌(E.coli)和沙門(mén)氏菌的方法。所述方法包括利用與大腸桿菌和沙門(mén)氏菌中的保守區(qū)結(jié)合的一對(duì)或更多對(duì)引物擴(kuò)增樣品中的核酸;使擴(kuò)增的目標(biāo)核酸與寡核普酸微陣列接觸;且檢測(cè)核酸與作為指示樣品中存在大腸桿菌和/或沙門(mén)氏菌的探針的結(jié)合情況。所述《效陣列包括含與大腸桿菌和沙門(mén)氏菌中的可變區(qū)互補(bǔ)的多核苷酸序列的兩種或以上探針。在另一方面,本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)在生物樣品或片全驗(yàn)樣品中病原體的目標(biāo)核酸的試劑盒,所述試劑盒包括至少一對(duì)引物和寡核苷酸微陣列,所述微陣列包含固定化在固相支持體上的至少一種探針。根據(jù)以下的說(shuō)明且結(jié)合附圖,并通過(guò)例示闡明本發(fā)明原理,本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)將顯而易見(jiàn)。附圖簡(jiǎn)述圖1A和圖1B顯示了16SrDNA的細(xì)菌DNA序列的保守引物區(qū)和可變探針區(qū)。圖2A和圖2B顯示了18SrDNA的真菌DNA序列的保守引物區(qū)和可變探針區(qū)。圖3是本發(fā)明實(shí)施方案的圖式概述。發(fā)明詳述1.病原體術(shù)語(yǔ)"病原體"指的是疾病因子或致病因子。術(shù)語(yǔ)病原體最通常是指感染性生物體。它們包括^f旦不限于細(xì)菌、病毒、真菌和原生動(dòng)物。本發(fā)明的方法和試劑盒可用于鑒定已經(jīng)引起傳染病或食物中毒的病原體和微生物。病原體的實(shí)例包括但不限于立克次氏體、衣原體、支原體、螺旋體、鏈球菌、沙門(mén)氏菌(almonella)、葡萄球菌、支原體、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(丄.mo朋c;;toge/1^)、腦膜炎奈瑟氏菌(TV.附em力g^fes)、大腸桿菌、流感嗜血斥干菌(//./w/7we"zae)、布氏疏螺》走體C8.6wg<ior/en')、鉤端螺旋體、變形菌、厭氧菌(anaecrobacter)、結(jié)核分支桿菌(M.似Z^rw/a^)、腸球菌、脊髓灰質(zhì)炎病毒l、腸道病毒71、腸道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾柯病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒ll、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯薩奇病毒A13、柯薩奇病毒A15、柯薩奇病毒A18、柯薩奇病毒A20、柯薩奇病毒A21、柯薩奇病毒B3-A、柯薩奇病毒B3-C、HSV-l和HSV-2。2.生物樣品和檢驗(yàn)樣品文中所用的術(shù)語(yǔ)"生物樣品"是指取自生物體或生物體的組分(例如細(xì)胞)的樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中,生物體是哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中,生物體是人類(lèi)。樣品可以是任何生物組織或生物液體。通常生物樣品取自患者。這些樣品包括但不限于組織、細(xì)胞、血液、血清、腦脊液、尿、細(xì)胞裂解物、血漿、糞便、唾液、血細(xì)胞、細(xì)針活4企樣品、腹膜液和胸膜液,或來(lái)自以上樣品的細(xì)胞。生物樣品同樣包括組織切片,例如用于組織學(xué)用途的冰凍切片。在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及一種方法,其中生物樣品選自組織、細(xì)胞、血液、血清、腦脊液、尿、細(xì)胞裂解物、血漿、糞便、唾液、血細(xì)胞、細(xì)針活纟企樣品、腹膜液和胸膜液,或來(lái)自以上樣品的細(xì)胞。本文所用的術(shù)語(yǔ)"檢驗(yàn)樣品"是指取自非活體來(lái)源的樣品。檢驗(yàn)樣品的來(lái)源包括但不限于食物、飲料、土壤、地下水、海水和湖底沼澤水。在這些檢驗(yàn)樣品中通常含有病原體和被病原體感染的細(xì)胞。根據(jù)是否存在特定病原體的目標(biāo)核酸來(lái)鑒定生物樣品和檢驗(yàn)樣品的病原體。在某些實(shí)施方案中,目標(biāo)核酸包括病原體的基因組材料、線(xiàn)粒體DNA、rRNA、tRNA、mRNA、病毒RNA、質(zhì)粒DNA以及它們的片段。根據(jù)癥狀和感染途徑,病原體被分類(lèi)成眾多組別。為了對(duì)應(yīng)多個(gè)組別,制備出多種目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑和寡核苷酸孩i陣列。使用目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑和寡核苷酸微陣列,它們根據(jù)癥狀而選擇。因此,可以在根據(jù)癥狀和感染途徑所預(yù)測(cè)的病原體之中高度準(zhǔn)確地鑒定出真正的病原體。3.目標(biāo)核酸目標(biāo)核酸是待檢驗(yàn)的病原體所固有的多核苷酸。此多核苷酸是遺傳材料,其包括基因組DNA/RNA、線(xiàn)粒體DNA、rRNA、tRNA、mRNA、病毒RNA和質(zhì)粒DNA。通過(guò)檢測(cè)病原體特有的目標(biāo)核酸的存在情況,可以推斷病原體自身的存在情況。類(lèi)似地,存在對(duì)病原體的屬特異性的目標(biāo)核酸則表明了存在該屬成員。術(shù)語(yǔ)"核苷酸序列"或"核酸"或"多核苷酸"可交換使用并且指的是核苷酸的雜聚物或這些核苷酸的序列。"寡核苷酸"指的是約50個(gè)或以下核香酸的多核苷酸。這些術(shù)語(yǔ)同樣指的是DNA或RNA,它們可以是單鏈或雙鏈的,并且可以相對(duì)于cDNA而言代表正義《連或負(fù)義鏈。本文的序列中,A是腺嘌呤,C是胞嘧啶,T是胸腺嘧t定,G是鳥(niǎo)噪呤,而N是A、C、G或T(U)??梢灶A(yù)期,若多核苷酸是術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)的"或"互補(bǔ)性"指的是通過(guò)堿基配對(duì)多核苷酸的自然結(jié)合。例如,序列5'-AGT-3,與互補(bǔ)的序列3'-TCA-5,結(jié)合。兩條單鏈分子之間的互補(bǔ)性可以是"部分的,,,致使只有某些核酸結(jié)合;或者可以是"完全的,,,致使在單鏈分子之間存在完全互補(bǔ)性。核酸鏈之間的互補(bǔ)程度顯著地影響核酸鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度。本文所用的術(shù)語(yǔ)"純化的"或"基本上純化的"指的是所指示的核酸或多肽以基本上不存在其他生物大分子(諸如多核苷酸、蛋白質(zhì)等)的情況下存在。本文所用的術(shù)語(yǔ)"分離的"指的是核酸與在該核酸天然來(lái)源中與其一起存在的至少一種其他組分分離。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述核酸僅在(如果有的話(huà))溶劑、緩沖劑、離子或正常地存在于核酸溶液中的其他組分存在的情況下存在。術(shù)語(yǔ)"分離的"和"純化的"不包括存在于它們的天然來(lái)源中的核酸。本文所使用的"基本上等同的"或"基本上類(lèi)似的"指的是由于一個(gè)或更多個(gè)置換、缺失或添加而不同于參比序列的核苷酸序列,而所述置換、缺失或插入的實(shí)際結(jié)果并不導(dǎo)致參比序列與被試序列之間不利的功能相異。通常此基本上等同的序列有不超過(guò)約35%的不同(即與相應(yīng)的參比序列相比,基本上等同序列中個(gè)別核苷酸的置換、添加和/或缺失的數(shù)量除以基本上等同序列中核苷酸的總數(shù)量約等于0.35或更少)。這種序列被認(rèn)為與所示序列具有65%的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的基本上等同的序列與參比序列有不超過(guò)30%不同(70%序列同一性);在此實(shí)施方案的變體中,有不超過(guò)25%不同(75。/。序列同一性);在此實(shí)施方案的又一個(gè)變體中,有不超過(guò)20%不同(80%序列同一性);在此實(shí)施方案的又一個(gè)變體中,有不超過(guò)10%不同(90。/。序列同一性);在此實(shí)施方案的又一個(gè)變體中,有不超過(guò)5%不同(95%序列同一性)。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述核苷酸序列具有至少約65%的同一性。在其它實(shí)施方案中,所述核苷酸序列具有至少約75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性。在某些方面,本發(fā)明涉及制備"目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑"。目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑可以或是目標(biāo)核酸自身或是擴(kuò)增的目標(biāo)核酸。使用常規(guī)的技術(shù)將目標(biāo)核酸序列從生物樣品和檢驗(yàn)樣品中分離。根據(jù)要分離的是什么類(lèi)型的多核苷酸(DNA還是RNA)來(lái)確定所用的技術(shù)。分離技術(shù)也可以根據(jù)待調(diào)查的病原體的類(lèi)型和生物/檢驗(yàn)樣品的量來(lái)作出修改。4.檢測(cè)試劑在某些實(shí)施方案中,在與寡核苷酸微陣列雜交之前,目標(biāo)核酸先被擴(kuò)增以產(chǎn)生"目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑,,。在其他實(shí)施方案中,在與寡核香酸微陣列雜交之前,目標(biāo)核酸不被擴(kuò)增,這時(shí)"目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑"和目標(biāo)核酸是等同的。在一個(gè)實(shí)施方案中,用一種或更多種標(biāo)記分子標(biāo)記目標(biāo)核酸或所擴(kuò)增的目標(biāo)核酸。標(biāo)記分子的附著有利于在與寡核芬酸微陣列雜交時(shí)檢測(cè)目標(biāo)核酸或所擴(kuò)增的目標(biāo)核酸??梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知熟的許多方法中的任一種摻入標(biāo)記分子。在一個(gè)實(shí)施方案中,可以在制備樣品的目標(biāo)核酸中的擴(kuò)增步驟時(shí),同時(shí)摻入標(biāo)記分子。因此,例如使用包含標(biāo)記分子的引物或核苷酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)將提供含有所述標(biāo)記分子的擴(kuò)增產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中,標(biāo)記分子包括生物素、-茲珠、熒光染料、放射性標(biāo)記、酶、比色標(biāo)記、有色玻璃或塑料珠。在一個(gè)實(shí)施方案中,如前文所述,使用含有標(biāo)記分子的核苷酸(熒光素標(biāo)記的UTP和/或CTP)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增,致使標(biāo)記摻入到所轉(zhuǎn)錄的核酸中。作為選擇,標(biāo)記分子可以直接加到原始目標(biāo)核酸(例如mRNA、polyA、mRNA、cDNA等)中。使標(biāo)記分子附著核酸的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知,這些方法包括例如通過(guò)經(jīng)由激酶反應(yīng)4吏目標(biāo)核酸磷酸化來(lái)進(jìn)行切口平移或末端標(biāo)記,隨后通過(guò)核酸接頭使樣品核酸與標(biāo)記分子連接。適用于本發(fā)明的可檢測(cè)標(biāo)記分子包括通過(guò)波譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)的方法可檢測(cè)的任何組合物。本發(fā)明的有用標(biāo)記分子包括生物素,用標(biāo)記的鏈霉抗生物素綴合物染色;磁珠(例如Dynabeads頂);熒光染料(例如熒光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白等);放射性標(biāo)記(例如3仏125I、35S、14(:或3¥);酶(例如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶和在ELISA中通常使用的其他酶);以及比色標(biāo)記,諸如膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、橡膠等)珠。教導(dǎo)使用這些標(biāo)記的專(zhuān)利包括美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。在一個(gè)實(shí)施方案中,標(biāo)記分子是含摻入所擴(kuò)增目標(biāo)核酸中的標(biāo)記分子的核苷酸。含標(biāo)記分子的核苷酸可以是用突光物質(zhì)(Cy3、Cy5等)或生物素標(biāo)記的核苷酸(單體),因?yàn)樗哂懈邫z測(cè)靈敏度而且易于操作。含標(biāo)記分子的核苷酸被帶入通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增的多核苷酸中,并對(duì)擴(kuò)增的多核苦酸進(jìn)行標(biāo)記。在用生物素標(biāo)記核苷酸的情況下,被標(biāo)記的多核普酸通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)顯現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明包括通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)核酸的擴(kuò)增步驟,以及檢測(cè)在PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在含目標(biāo)核酸的多核苷酸的基因檢測(cè)步驟。在基因檢測(cè)步驟中,例如使用寡核苷酸微陣列來(lái)檢測(cè)多核苷酸的存在情況。5.目標(biāo)核酸擴(kuò)增步驟在某些實(shí)施方案中,目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑通過(guò)擴(kuò)增目標(biāo)核酸來(lái)提供。在一個(gè)實(shí)施方案中,使用PCR擴(kuò)增目標(biāo)核S臾;險(xiǎn)測(cè)試劑。在目標(biāo)核酸擴(kuò)增步驟中,使用樣品提取物、用于擴(kuò)增含目標(biāo)核酸的多核苷酸的基因檢測(cè)引物試劑以及標(biāo)記性核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)。樣品提取物是如下獲得的提取物按照用于提取并純化DNA或RNA的已知的多核苷酸提取方法來(lái)提取并純化檢驗(yàn)樣品中所含的多核苷酸。樣品提取物在PCR反應(yīng)中作為模板使用。如果一種核酸與第二種核酸兩者在嚴(yán)格條件下與同一探針核酸雜交,則此核酸與第二種核酸基本上相同?;旧舷嗤暮怂嶂g的同源性可以為80%、90%、95%或以上。為了進(jìn)行基因擴(kuò)增步驟,讓樣品提取物、病原體鑒定引物試劑、-故標(biāo)記的核苦酸以及PCR反應(yīng)所必需的其他試劑和酶于一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行PCR反應(yīng)。通過(guò)RCR反應(yīng)擴(kuò)增多核苷酸。通常,理想的是在與寡核苷酸微陣列雜交之前擴(kuò)增核酸樣品。合適的擴(kuò)增方法包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(Innis等,PCRProtocols.AguidetoMethodsandApplication.AcademicPress,Inc.SanDiego,(1990))、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(參見(jiàn)Wu和Wallace,Genomics,4:560(1989);Landegren等,Science,241:1077(1988);和Barringer等,Gene,89:117(1990))、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Kwoh等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:1173(1989》、自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(Guatelli等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87:1874(1990))。在一個(gè)實(shí)施方案中,使用PCR擴(kuò)增目標(biāo)核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中,使用反轉(zhuǎn)錄酶(RT)-PCR擴(kuò)增目標(biāo)核酸。在又一實(shí)施方案中,使用TthDNA聚合酶(可得自例如Promega(Cat.No.M210A))進(jìn)行PT-PCR。TthDNA聚合酶是取自嗜熱真細(xì)菌嗜熱棲熱菌(rAemwsAermop/H7w力HB-8的酶的重組體形式,是在74。C下復(fù)制DNA的熱穩(wěn)定酶,并且在95。C下表現(xiàn)出20分鐘的半衰期。TthDNA聚合酶在鎂存在下催化核苷酸沿5,—3'的方向聚合成雙鏈DNA,而在錳存在下使用RNA模板沿5,~>3,的方向使核苦酸聚合成DNA。TthDNA聚合酶經(jīng)常用于PCR、RT-PCR、反轉(zhuǎn)錄以及在升高溫度下的引物延伸反應(yīng)。本發(fā)明的擴(kuò)增方法利用了以下酶活性DNA聚合酶和依賴(lài)DNA的RNA聚合酶。用于本發(fā)明方法和組合物的DNA聚合酶能夠按照本發(fā)明的方法實(shí)施引物延伸。因此,所選聚合酶是能夠使核酸引物沿著目標(biāo)核酸模板延伸的聚合酶,所述目標(biāo)核酸模板至少主要由脫氧核糖核香酸組成。聚合酶能夠從多核香酸置換核S灸鏈,其中所述多核苷酸是所述置換鏈與之結(jié)合的多核苷酸。任何反轉(zhuǎn)錄酶皆可用于本發(fā)明的實(shí)施中,包括但不限于SuperscriptRTII、"regular"MMLV-RT、AMVRT或者它們的組合。當(dāng)樣品提取物中不存在預(yù)測(cè)的病原體時(shí),以及當(dāng)樣品提取物中不存在多核苷酸時(shí),則在PCR產(chǎn)物中不存在擴(kuò)增的多核苷酸,并且在隨后的檢測(cè)基因步驟中檢測(cè)不出多核苷酸。當(dāng)樣品提取物中存在預(yù)測(cè)的病原體時(shí),來(lái)源于所述病原體的多核香酸則在PCR反應(yīng)中充當(dāng)模板。通過(guò)病原體鑒定引物試劑中的相應(yīng)擴(kuò)增引物與模板結(jié)合,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行,由此擴(kuò)增出含病原體所固有的目標(biāo)核酸的多核苷酸。標(biāo)記性核苷酸被帶入所擴(kuò)增的多核苷酸(DNA)中,即被帶入PCR反應(yīng)產(chǎn)物中。由此PCR反應(yīng)產(chǎn)物被標(biāo)記。用于擴(kuò)增目標(biāo)核酸的引物根據(jù)從選自以下的病原體中分離的多核苷酸來(lái)設(shè)計(jì)細(xì)菌、病毒、真菌和原生動(dòng)物。在其他實(shí)施方案中,用于擴(kuò)增目標(biāo)核酸的引物根據(jù)從選自以下的病原體中分離的多核苷酸來(lái)設(shè)計(jì)立克次氏體、衣原體、支原體、螺旋體、鏈球菌、沙門(mén)氏菌、葡萄J求菌、支原體、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(厶、腦膜炎奈瑟氏菌(iV.mem'wg"cfes)、大腸桿菌、流感嗜血桿菌(H^/7wewzae)、布氏疏螺旋體(凡6wrgc/or/en')、鉤端螺旋體、變形菌、厭氧菌、結(jié)核分支桿菌(M.^&rcM/a^)、腸球菌、脊髓灰質(zhì)炎病毒l、腸道病毒71、腸道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾纟可病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒11、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯薩奇病毒A13、柯薩奇病毒A15、柯薩奇病毒A18、柯薩奇病毒A20、柯薩奇病毒A21、柯薩奇病毒B3-A、柯薩奇病毒B3-C、HSV-1和HSV-2。在一些實(shí)施方案中,PCR利用了含從以上所列病原體的至少一種中分離的多核苦酸序列的引物。在某些實(shí)施方案中,特定的引物對(duì)能夠與不止一種病原體的多核苷酸退火。此引物對(duì)可退火至某些病原體中保守的區(qū)域。然而,引物對(duì)鄰接的核苷S^f列是可變區(qū)。使用此引物對(duì)使多種病原體的核酸序列能夠被擴(kuò)增,而且還允許這些病原體在與寡核苷酸微陣列雜交時(shí)能夠得以辨別。當(dāng)使用來(lái)自許多細(xì)菌和真菌的16S/18SrDNA基因的兩個(gè)相同區(qū)作為引物時(shí),這兩個(gè)區(qū)通過(guò)PCR擴(kuò)增提供了197個(gè)堿基對(duì)(細(xì)菌)或248個(gè)堿基對(duì)(真菌)的DNA片段。在引物區(qū)之間的DNA片段中發(fā)現(xiàn)許多低保守區(qū),這些低保守區(qū)提供了探針以根據(jù)其特定序列通過(guò)雜交來(lái)辨別病原體。參見(jiàn)出示了16SrDNA的細(xì)菌DNA序列的圖1A和1B。出示了這兩個(gè)保守的引物區(qū)以及這兩個(gè)保守區(qū)之間的可變的探針區(qū)。圖2A和2B出示了真菌DNA序列的所述18SrDNA片段中的引物區(qū)和t笨4十區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中,PCR利用含選自SEQIDNO:l-12(表l)的多核苷酸的引物。引物對(duì)的一些組合包括SEQIDNO:l和2;SEQIDNO:1和4;SEQIDNO:1和6;SEQIDNO:3和2;SEQIDNO:3和4;SEQIDNO:3和6;SEQIDNO:5和2;SEQIDNO:5和4;SEQIDNO:5和6;SEQIDNO:5和6;SEQIDNO:7和8;SEQIDNO:9和10和/或SEQIDNO:11和12。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>序列后面的數(shù)字指的是在各種模板上引物退火的核苷酸位置。6.微陣列"微陣列"是在固相支持體表面上形成的離散區(qū)的線(xiàn)性或者二維微點(diǎn)陣,每一個(gè)離散區(qū)都具有確定的區(qū)域。使用下文描述的展示策略中的一種,將與目標(biāo)核酸序列或其亞序列互補(bǔ)的寡核苷酸纟笨針^(敞陣列固定在固相支持體上。本發(fā)明的方法使用含展現(xiàn)與一種或更多種目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)性的探針的寡核普酸微陣列。通常這些探針是DNA,并且以高密度的微陣列(即"基因芯片,,)的方式固定在固體表面上?;旧先魏慰赡艿幕?substrate)都可為本發(fā)明所利用?;梢允且灶w粒、鏈、沉淀物、凝膠、薄片、管、球體、容器、毛細(xì)管、墊、切片、薄膜、平皿、載玻片等存在的生物基片、非生物基片、有機(jī)基片、無(wú)機(jī)基片或它們的任何組合。基片可以具有任何適宜的形狀,例如圓盤(pán)、方形、球形、環(huán)形等?;ǔJ瞧降模梢猿尸F(xiàn)多種可供選擇的表面結(jié)構(gòu)。例如,基片可以含有于其上進(jìn)行合成的凸起區(qū)或凹陷區(qū)。選擇基片及其表面來(lái)提供合適的光吸收特征。例如,基片可以是聚合的朗繆爾-布羅杰特膜、功能化玻璃(fimctionalizedglass)、Si、Ge、GaAs、GaP、Si02、SiN4、改性硅或者眾多種類(lèi)的凝膠或聚合物中的任一種,諸如(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯或他們的組合。其他基片材料將在本領(lǐng)域技術(shù)人員查閱此公開(kāi)內(nèi)容時(shí)顯而易見(jiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中,基片是平片玻璃。各種策略可用于使寡核苷S吏探針微陣列定制和展現(xiàn)在基片上,藉此使雜交圖語(yǔ)和可推斷出的關(guān)于目標(biāo)核酸的序列信息最大化。例示性展現(xiàn)和定制策略在PCT專(zhuān)利公開(kāi)說(shuō)明書(shū)WO94/12305中描述,該文獻(xiàn)在此引作參考。探針可以是寡脫氧核糖核香酸或寡核糖核芬酸,或者是能夠通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)與目標(biāo)核S交序列雜交的以上核苷酸聚合物的修飾形式。修飾形式包括2,-0-曱基寡核糖核苷酸和所謂的PNA,在PNA中寡脫氧核糖核苷酸通過(guò)肽鍵而非通過(guò)磷酸二酯鍵連接。探針可以通過(guò)任何鍵與支持體連接(例如3'、5'或通過(guò)堿基)。3'連接更常用,因?yàn)檫@樣定位與用于寡核苷酸固相合成的化學(xué)法相一致。眾多的單個(gè)探針被固定在基片上的離散位置中,以便辨別目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑與每種類(lèi)型探針的雜交。眾多離散的單一探針中的每一個(gè)4皮稱(chēng)為"點(diǎn)"。點(diǎn)的尺寸可以在直徑0.7mm至lmm左右,在每個(gè)點(diǎn)中有0.35至40jiMDNA。例如,用于檢驗(yàn)鏈球菌和沙門(mén)氏菌兩種病原體的多核苷酸存在情況的DNA微陣列可具有兩個(gè)點(diǎn)一個(gè)由鏈球菌探針組成,另一個(gè)由沙門(mén)氏菌探針組成。在某些實(shí)施方案中,有6、12、24、36、56、64、96、108或384個(gè)不同的探針點(diǎn)固定在一個(gè)基片上。在一個(gè)實(shí)施方案中,微陣列可以是1.5mm2。在一些微陣列中,所有探針的長(zhǎng)度都相同。其他微陣列使用不同長(zhǎng)度的探針。探針的長(zhǎng)度可以變化以?xún)?yōu)化特定的雜交條件。優(yōu)化雜交條件以減少"噪聲,,。通過(guò)改變雜交反應(yīng)的pH、溫度和離子條件來(lái)修改雜交條件。術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格,,用來(lái)指明通常在本領(lǐng)域中理解為核酸序列之間需要高度互補(bǔ)性以便雜交得以發(fā)生的條件。嚴(yán)格條件可以包括高度嚴(yán)格條件,例如于65。C下,在0.5MNaHPO4、7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、lmMEDTA中進(jìn)行雜交。在寡核香酸雜交的情況下,其他例示性的嚴(yán)格雜交條件包括于37。C下,在6xSSC/0.05。/。焦磷酸鈉中洗滌。更高溫度例如48。C、55°C、60。C和64。C可用于更長(zhǎng)的寡核普酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及進(jìn)一步包括洗滌寡核苷酸微陣列和檢測(cè)標(biāo)記分子存在情況的方法。例如于68。C下在O.lxSSC/0.1%SDS中進(jìn)行洗滌,和在適度的嚴(yán)格條件下進(jìn)行洗滌(即于42"下在0,2xSSC/0.1%SDS中進(jìn)行洗滌)。在一些實(shí)施方案中,探針被設(shè)計(jì)成與從病原體中分離的多核苷酸互補(bǔ),所述病原體選自細(xì)菌、病毒、真菌、原生動(dòng)物。在其他實(shí)施方案中,探針被設(shè)計(jì)成與從選自以下的病原體中分離的多核苷酸互補(bǔ)立克次氏體、衣原體、支原體、螺旋體、鏈球菌、沙門(mén)氏菌、葡萄球菌、支原體、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Z.mowcj;to取w&y)、腦膜炎奈瑟氏菌mem'wgri(ie力、大腸桿菌、流感嗜血桿菌(H!'wj7wenzae)、布氏疏螺旋體(及Zmrg(ior/en')、鉤端螺旋體、變形菌、厭氧菌、結(jié)核分支桿菌(M似&rcw/ay")、腸球菌、脊髓灰質(zhì)炎病毒l、腸道病毒71、腸道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾柯病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒ll、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯薩奇病毒A13、柯薩奇病毒A15、柯薩奇病毒A18、柯薩奇病毒A20、柯薩奇病毒A21、柯薩奇病毒B3-A、柯薩奇病毒B3-C、HSV-l和HSV-2。在另一個(gè)實(shí)施方案中,探針選自SEQIDNO:13-52(表2)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>艾柯病毒11ctg鄉(xiāng)agcacatwccc滅ccaaggggcagtgt41艾柯病毒12ctgtggageaagtgcccauaacccagtgggtggcitt42艾才可病毒2643柯薩奇病毒A13ceatggagcaa.gtga她oaatocagtgatattott44柯薩奇病毒A1545柯薩奇病毒A1846柯薩奇病毒A20ueatgg效geaggcggtoacagaeeagtgaetagcstt47柯薩奇病毒A21eeacggagcaac.cgetcac.aacccagtgagtaggtt48柯薩奇病毒B3-A49柯薩奇病毒B3-Cctgc;ggagcatgGa卿acaagt;cagtgggtegcgt50HSV-1gttgggecacgegcccccegagctggtggaeggctxcgg51HSV-2gcttggtgaegcgcgcgcccagctectoeacggcetcqg52業(yè)已開(kāi)發(fā)出若干技術(shù)來(lái)設(shè)計(jì)、合成、雜交和解釋上文所述類(lèi)型的高密度寡核苷s臾微陣列??梢允褂霉庖龑?dǎo)合成(lightdirectedsynthesis)以在基片表面建立寡核香酸探針(Fodor等,Sa'e打ce,251:767-73(1991))。光引導(dǎo)合成使基于半導(dǎo)體的光刻法與固相化學(xué)合成相聯(lián)合。該方法起始于當(dāng)用光化學(xué)可移除的保護(hù)基團(tuán)修飾的接頭與固體基片即基片表面連接的時(shí)候。已經(jīng)合成了帶光不穩(wěn)定的保護(hù)基的接頭與亞磷酰胺,并由Pease等,尸A^S",91:11241-11245(1994)描述。光通過(guò)光刻掩膜被引導(dǎo)到合成表面的特定區(qū)域,并激活這些區(qū)域以便進(jìn)行隨后的化學(xué)偶聯(lián)。將具有光不穩(wěn)定保護(hù)基的一系列核苷酸中的第一個(gè)與基片一起溫育,化學(xué)偶聯(lián)發(fā)生在在前述步驟中已被闡明的那些位置上。然后光通過(guò)掩膜的不同部分被定向到下一個(gè)合成位置,構(gòu)建出化學(xué)步驟,即規(guī)定合集的聚核苷酸探針,而每一種探針在基片的表面上都具有它自己唯一的地址。寡核香酸^f效陣列與擴(kuò)增產(chǎn)生的焚光標(biāo)記DNA或RNA雜交,雜交通過(guò)落射焚光共焦顯微鏡(epi-fluorescenceconfocalmicroscopy)進(jìn)行檢測(cè)(Fodor等,1993)。在一個(gè)實(shí)施方案中,寡核苷酸微陣列具有含被測(cè)的每一種病原體所固有的全部探針的點(diǎn)。因此,本發(fā)明涉及用于檢測(cè)生物樣品或檢驗(yàn)樣品中的病原體的目標(biāo)核酸的方法。所述方法包括制備目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑;并使目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑與寡核芬酸微陣列接觸。在一些實(shí)施方案中,病原體選自鏈球菌、沙門(mén)氏菌、葡萄球菌、支原體、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(丄.wowoqytogewas)、腦膜炎奈瑟氏菌(TV.mem'"g"Vfes)、大腸桿菌、流感嗜血桿菌(//.zVwe"zae)、布氏疏螺旋體(及Zn^gcfor/en')、鉤端螺旋體、變形菌、厭氧菌、結(jié)核分支桿菌(M.f/^en:M/ow'力、腸球菌、脊髓灰質(zhì)炎病毒l、腸道病毒71、腸道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾柯病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒ll、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯薩奇病毒A13、柯薩奇病毒A15、柯薩奇病毒A18、柯薩奇病毒A20、柯薩奇病毒A21、柯薩奇病毒B3-A、柯薩奇病毒B3-C、HSV-1和HSV-2。在一些實(shí)施方案中,寡核苷酸微陣列包含探針,所述探針包含從以上列舉的病原體的至少一種中分離的多核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中,探針包含選自SEQIDNO:13-52的多核苷酸序列。7.試劑盒在某些方面,本發(fā)明還涉及用于^r測(cè)檢驗(yàn)樣品中病原體的目標(biāo)核酸的試劑盒。所述試劑盒包括至少一對(duì)引物,和包含至少一種探針的寡核苷酸微陣列。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述引物對(duì)包含選自IDNO:1-12的引物。在另一個(gè)實(shí)施方案中,探針包含選自SEQIDNO:13-52的多核苷酸序列。本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)行更詳細(xì)的解釋。本發(fā)明的實(shí)施例和實(shí)施方案應(yīng)該被認(rèn)作是闡述性而非限制性的,本發(fā)明并非旨在受限于文中所給出的細(xì)節(jié),而是可以在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍和等同范圍內(nèi)作出^務(wù)改。8.實(shí)施例實(shí)施例1DNA微陣列制備方法1.玻璃表面洗滌將潔凈的載玻片浸入H2SCVH2022:1中30分鐘。用H20洗滌3次,然后用曱醇洗滌2次。在加壓空氣流中吹干,然后在80。C下烘IO分鐘。2.玻璃的硅烷化在2%N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三曱氧基硅烷(EDA)的lmM醋酸溶液中于室溫(RT)下超聲處理30分鐘。用H20洗滌3次,然后用曱醇洗滌2次。在N2氣流中吹干,然后在ll(TC下烘15分鐘。3.用異雙官能交聯(lián)劑修飾硅烷化載玻片于室溫下浸入交聯(lián)劑溶液(含384mgPDITC(2mmol)的80ml含10%無(wú)水吡啶的DMF)2小時(shí)。用DMF沖洗3次,然后用二氯乙烷沖洗2次。在N2中吹干。4.微陣列印跡和DNA固定化于60%濕度下在活化的載玻片上點(diǎn)上含40(aM麗2-寡脫氧核苷酸(ODN)的0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.0)。于37。C飽和濕度下反應(yīng)1小時(shí)以上。用水沖洗并浸沒(méi)在含6-氨基己醇(100mM)的水溶液中。用100。C的水洗滌2-3分鐘,然后在加壓空氣下吹干。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>DNA固定化結(jié)構(gòu)實(shí)施例2DNA微陣列雜交方法1.PCR擴(kuò)增和標(biāo)記將lplDNA樣品加入到lOO(ilPCR反應(yīng)緩沖液中,所述反應(yīng)緩沖液含有10mMTris-HCl(pH9.0)、50mMKCl、3.75mMMgC12、0.1%TritonX-IOO、O.lmMdNTP(每種)和0.2jliMCy5標(biāo)記的引物(每種)。然后加入5uTaqDNA聚合酶,按以下溫度條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增i).96°C2分鐘ii).95°C20秒iii).60°C20秒iv).72°C30秒回到步驟ii),28個(gè)循環(huán)v).72°C2分鐘總反應(yīng)時(shí)間約1小時(shí)20分鐘。2.DNA微陣列雜交用5倍體積的含0.75MNaCl、75mM檸檬酸鈉和0.1%SDSpH7.2的雜交緩沖液稀釋PCR溶液。于61。C下雜交1小時(shí)。3.DNA微陣列洗涂將雜交后的載玻片用0.3MNaCl、30mM檸檬酸鈉和0.1%SDS在50。C下洗滌15分鐘,共洗滌3次,然后用0.3MNaCl、30mM檸檬酸鈉在50。C下洗滌15分鐘。用水沖洗然后在加壓空氣中干燥。4.微陣列讀取DNA微陣列雜交結(jié)果通過(guò)FuJiFilm熒光掃描儀FLA3000讀取,用HeNe激光(633nm)激發(fā)Cy5。用打包軟件ArrayGuage分析信號(hào)密度。實(shí)施例3從由患者分離的組織切片中直接收集細(xì)胞。使用任何已知的方案從這些細(xì)胞中提取DNA。使用兩對(duì)引物SEQIDNO:l-2和SEQIDNO:7-8通過(guò)PCR擴(kuò)增約2-10ng的DNA。將["P]-dCTP包括在PCR反應(yīng)中,以標(biāo)記擴(kuò)增的DNA,從而產(chǎn)生帶標(biāo)記分子的目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑。帶標(biāo)記分子的目標(biāo)核酸^r測(cè)試劑經(jīng)由離心柱(spincolumn)純化以除去多余的pP]-dCTP,在95。C下溫育變性,隨后直接在冰上冷卻。然后在高嚴(yán)格條件下,使變性的帶標(biāo)記分子的目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑在含探針的寡核苷酸微陣列存在下溫育,所述探針含SEQIDNO:13-52。雜交在0.5MNaHP04、7。/。十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mMEDTA中于65。C下進(jìn)行2小時(shí),隨后在0.1xSSC/0.1%SDS中于68。C下洗滌3次。此微陣列曝光于X射線(xiàn)膠片并顯影出放射自顯影圖。實(shí)施例4從任何一般的飲用水源(例如來(lái)自貯水池或來(lái)自水)中分離飲用水樣品。將樣品濃縮和/或過(guò)濾以分離任何病原體。使用任何已知的方案從這些細(xì)胞中提取DNA。使用兩對(duì)引物SEQIDNO:1-2和SEQIDNO:7-8通過(guò)PCR擴(kuò)增約2-10ng的DNA。將["P]-dCTP包括于PCR反應(yīng)中,以標(biāo)記擴(kuò)增DNA,從而產(chǎn)生帶標(biāo)記分子的目標(biāo)核酸4企測(cè)試劑。帶標(biāo)記分子的目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑經(jīng)過(guò)離心柱純化以除去多余的[32P]-dCTP,在95。C下溫育變性,隨后直接在冰上冷卻。然后在高嚴(yán)格條件下,使變性的帶標(biāo)記分子的目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑在含探針的寡核苦酸微陣列存在下溫育,所述4采針含有SEQIDNO:13-52。雜交在0.5MNaHP04、7。/。十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mMEDTA中于65°C下進(jìn)行2小時(shí),隨后在0.1xSSC/0.1%SDS中于68。C下洗滌3次。此微陣列曝光于X射線(xiàn)膠片并顯影放射自顯影圖。盡管已用了至少一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明,但在閱讀本說(shuō)明書(shū)時(shí),許多變更和修改對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。因此,意圖在于所附權(quán)利要求書(shū)應(yīng)考慮現(xiàn)有技術(shù)盡可能寬泛地被解釋為包括所有的這些變更和修改。權(quán)利要求1.一種用于檢測(cè)生物樣品或檢驗(yàn)樣品中一種或更多種病原體的目標(biāo)核酸的方法,所述方法包括利用結(jié)合不止一種病原體的保守區(qū)的一對(duì)或更多對(duì)引物來(lái)擴(kuò)增樣品中的目標(biāo)核酸;使擴(kuò)增的目標(biāo)核酸與寡核苷酸微陣列接觸,所述微陣列包括含與不同病原體互補(bǔ)的多核苷酸序列的兩種或以上探針或兩個(gè)或以上的探針組;檢測(cè)目標(biāo)核酸與探針的結(jié)合情況,其中與特定病原體探針結(jié)合則意味著在樣品中存在該病原體。2.權(quán)利要求1的方法,其中所述病原體選自鏈球菌、沙門(mén)氏菌、葡萄球菌、支原體、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(丄.mowocjtogewe力、腦膜炎奈瑟氏菌(TV.wem'"gritfes)、大腸桿菌、流感嗜血桿菌(HZ^/7wew加e)、布氏疏螺旋體(S.6wrgtfor/en')、鉤端螺旋體、變形菌、厭氧菌、結(jié)核分支桿菌(M./的ercw/a^)、腸球菌、脊髓灰質(zhì)炎病毒l、腸道病毒71、腸道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾柯病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒11、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯薩奇病毒A13、柯薩奇病毒A15、柯薩奇病毒A18、柯薩奇病毒A20、柯薩奇病毒A21、柯薩奇病毒B3-A、柯薩奇病毒B3-C、HSV-1和HSV-2。3.權(quán)利要求2的方法,其中所述探針選自SEQIDNO:13-52。4.權(quán)利要求3的方法,其中所述目標(biāo)核酸是大腸桿菌和沙門(mén)氏菌,而所述探針選自SEQIDNO:14-17和22-26。5.權(quán)利要求1的方法,其中所述擴(kuò)增步驟包括利用選自SEQIDNO:1-12的一對(duì)或更多對(duì)引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。6.權(quán)利要求5的方法,其中所述引物選自下述引物對(duì)SEQIDNO:1和2;SEQIDNO:1和4;SEQIDNO:1和6;SEQIDNO:3和2;SEQIDNO:3和4;SEQIDNO:3和6;SEQIDNO:5和2;SEQIDNO:5和4;SEQIDNO:5和6;SEQIDNO:5和6;SEQIDNO:7和8;SEQIDNO:9和10;以及SEQIDNO:11和12。7.權(quán)利要求6的方法,其中所述引物對(duì)是SEQIDNO:l-2和SEQIDNO:7-8。8.權(quán)利要求5的方法,其中所述探針包括選自SEQIDNO:13-52的多核苷酸序列。9.權(quán)利要求8的方法,其中微陣列包括來(lái)自至少一種病原體的2種或以上探針。10.權(quán)利要求1的方法,其中所述生物樣品選自組織、細(xì)胞、血液、血清、腦脊液、尿、細(xì)胞裂解物、血漿、糞便、唾液、血細(xì)月包、細(xì)針活檢樣品、腹膜液和胸膜液,或來(lái)自以上樣品的細(xì)胞。11.權(quán)利要求1的方法,其中所述微陣列包括與普通癥狀有關(guān)的病原體的探針。12.權(quán)利要求1的方法,其中所述樣么陣列包括與普通感染途徑有關(guān)的病原體的探針。13.—種辨別樣品中的大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的方法,所述方法包括利用結(jié)合大腸桿菌和沙門(mén)氏菌中的保守區(qū)的一對(duì)或更多對(duì)引物擴(kuò)增樣品中的核酸;使擴(kuò)增的目標(biāo)核酸與寡核苷酸微陣列接觸,所述微陣列包括含與大腸桿菌和沙門(mén)氏菌中的可變區(qū)互補(bǔ)的多核苷酸序列的兩種或以上探針;檢測(cè)核酸與作為指示大腸桿菌和沙門(mén)氏菌在樣品中存在的探針的結(jié)合情況。14.權(quán)利要求13的方法,其中所述微陣列包括大腸桿菌的兩個(gè)或以上探針組以及沙門(mén)氏菌的兩個(gè)或以上探針組,其中每個(gè)探針組包括與所述病原體互補(bǔ)的兩種或以上不同的纟笨針。15.權(quán)利要求13的方法,其中所述引物對(duì)選自SEQIDNO:1-6。16.權(quán)利要求15的方法,其中所述探針選自SEQIDNO:14-17和22-26。17.—種用于^r測(cè)檢驗(yàn)樣品中至少一種病原體的目標(biāo)核酸的試劑盒,所述試劑盒包含選自SEQIDNO:l-12的至少一對(duì)引物,以及包含至少一種探針的寡核苷酸微陣列,所述探針含有選自SEQIDNO:13-52的多核普酸序列,所述探針被固定在固相支持體上。18.權(quán)利要求17的試劑盒,其中所述引物對(duì)選自下述引物對(duì)SEQIDNO:1和2;SEQIDNO:1和4;SEQIDNO:1和6;SEQIDNO:3和2;SEQIDNO:3和4;SEQIDNO:3和6;SEQIDNO:5和2;SEQIDNO:5和4;SEQIDNO:5和6;SEQIDNO:5和6;SEQIDNO:7和8;SEQIDNO:9和10;以及SEQIDNO:11和12。19.權(quán)利要求18的試劑盒,其中所述探針選自SEQIDNO:14-17和22-26。20.權(quán)利要求17的試劑盒,其中所述至少一種探針包含來(lái)自?xún)煞N或以上病原體的兩種或以上纟笨針。全文摘要一種用于檢測(cè)檢驗(yàn)樣品中病原體的目標(biāo)核酸的方法,所述方法包括制備目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑和使目標(biāo)核酸檢測(cè)試劑與寡核苷酸微陣列接觸。還描述了一種用于檢測(cè)檢驗(yàn)樣品中病原體的目標(biāo)核酸的試劑盒。所述試劑盒包括至少一對(duì)引物和含有至少一種探針的寡核苷酸微陣列。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101400801SQ200680053490公開(kāi)日2009年4月1日申請(qǐng)日期2006年12月29日優(yōu)先權(quán)日2005年12月30日發(fā)明者L·徐,Y·古申請(qǐng)人:霍尼韋爾國(guó)際公司
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