專利名稱::Hbv-dna的定量方法,用于檢測(cè)hbv-dna的引物和探針,及包含它們的試劑盒的制作方法HBV-DNA的定量方法,用于檢測(cè)HBV-DNA的引物和探針,及包含它們的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域:
[1]本發(fā)明涉及通過PCR雜交過程對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)進(jìn)4亍定量的方法,還涉及所述定量方法中采用的引物和4罙針。本發(fā)
背景技術(shù):
[2]乙型肝炎病毒(HBV)是來自于嗜肝DNA病毒科的特異性作用于人體的病毒。據(jù)了解全世界約有5億人口感染了HBV。HBV的潛伏期為60至110天。經(jīng)過不同水平的臨床周期后,90-95%感染了HBV的患者會(huì)完全康復(fù),但對(duì)于未從感染中康復(fù)的患者,HBV基因組DNA被插入并整合至患者的干細(xì)胞基因組DNA中,直至其發(fā)展成為慢性活動(dòng)性肝炎,肝硬化,肝癌等。與其它疾病一樣,HBV感染可引起慢性病毒感染疾病淋巴腺瘤和慢性腎衰竭。相應(yīng)地,HBV的慢性感染具有極高的死亡率,可形成更為嚴(yán)重的疾病形式,并最纟冬導(dǎo)至丈患者死亡(DonGanem等人,Ann.Rec.Biochem.,651(1987):R.P.Beasley等人,Lancet,1129(1981):D.A.Shafritz等人,newEnglandJ.ofMedicine,1067(1981):S.N.Zaman等人,Lancet1,1357(1985))。[3]同時(shí),通過分子生物學(xué)領(lǐng)域的最新進(jìn)展,可對(duì)HBV基因組的完整序列進(jìn)4亍克隆(Siddiqui,A.等人,Proc.Natl.Aca.Sci,U.S.A.Vol.76,p4664,1979;Sninsky,JJ.等人,Nature.Vol.279,p346,1979;以及Chamay,P.等人,Nucl.AcidsRes.,Vol7,p335,1979)。止匕夕卜,HBV其它病毒蛋白的編碼區(qū)已得到鑒定(歐洲專利申請(qǐng)13828,20251和38765;Galibert等人Nature,Vol.281,p646-650,1979;Pasek等人,Naturevol.282,p575-579,1979;以及Valenzuela等人,nature,Vol.280,p815-819,1979)。HBV為DNA病毒,4旦與逆專爭錄病毒相類似、,HBV具有以RNA作為才莫板合成DNA的逆轉(zhuǎn)錄::舌寸生(Ganem和Varmus,Annu.Rev.Biochem.56:651-693,1987)。[4]盡管韓國最近的HBV感染率已有所下降,據(jù)估計(jì)HBV4夷帶者比率已達(dá)到8%,因此韓國仍屬于HBV疾病頻發(fā)區(qū)域。特別地,幼兒和兒童由HBV發(fā)展為慢性乙型肝炎的比率分別為50%禾口20%。對(duì)于成年人,HBV疾病通常急性發(fā)作,但對(duì)于3-5%的成年人,該HBV疾病慢性發(fā)作。慢性乙型肝炎4支難治愈,且有專支多病例顯示HBV發(fā)展成為肝硬化或肝癌。因此,HBV感染是一種嚴(yán)重的疾病。[5]HBV的血清分型可分為adw,adr,ayw,ayr等亞型。這些亞型具有不同的遺傳結(jié)構(gòu),且它們的分布同樣隨地區(qū)而變化。包:括韓國在內(nèi)的東亞;t也區(qū)最常見的亞型為adw和adr亞型。[6]HBV定量檢測(cè)是一種4企測(cè)感染HBV的患者血清中存在的DNAs的#史量的4企測(cè)。最近該4企測(cè)^皮認(rèn)為是測(cè)定HBV復(fù)制活'1"生的良好指標(biāo)。HBV的定量檢測(cè)可通過如下方式進(jìn)行向HBV患者施用治療劑并觀察HBVDNA的凄t量是否下降或上升以作為治愈的信號(hào)。因此HBV的定量4全測(cè)對(duì)于^L察患者的HBV感染的發(fā)展以及一驗(yàn)i正抗病毒藥劑的療效絕對(duì)有必要。[7]目前在韓國用于診斷患者HBV感染和觀察其療效的it斷試劑大部分從國外進(jìn)口。特別地,所有用于HBV-DNA定量4全測(cè)的試劑(該試劑被施用于患者,并以HBVDNA^t量下降作為治療成功標(biāo)志,或?qū)⑵渖仙鳛橹委熓?biāo)志來觀察治療效果)均在國外生產(chǎn)。其中有一種或多種產(chǎn)品專供給韓國。[8]凈爭別i也,部分韓國醫(yī)藥公司(例如Dong-APharmaceutical,Green-Cross,Shin-JinMedics等)可生產(chǎn)4叉能確i人患者是否受HBV作用的抗原-抗體反應(yīng)-篩選試劑,^f旦尚未有醫(yī)藥司才艮據(jù)HBV-DNA的定量一會(huì)測(cè)的分子生物學(xué)方法開發(fā)和生產(chǎn)用于HBV-DNA定量4企測(cè)的^式劑。[9]同時(shí),只于于由國外醫(yī)藥7>司生產(chǎn)的HBV-DNA定量測(cè)i式"i式劑,Chiron公司(由Bayer提供)生產(chǎn)分支DNA產(chǎn)品;Digen乂A司生產(chǎn)捕獲HBV-DNA產(chǎn)品;而Roche公司同樣生產(chǎn)該種產(chǎn)品。[10]才艮據(jù)Chiron的QuantiplexHBV-DNA分析,可通過PCR-擴(kuò)增過程擴(kuò)增帶標(biāo)記的分支DNA,然后通過化學(xué)發(fā)光法測(cè)定f斤述分支DNA的數(shù)量。此處的發(fā)光度與HBV-DNA的數(shù)量成比例。才艮據(jù)Digen的第二代雜交捕獲法,將RNA探針與未經(jīng)擴(kuò)增步驟^是耳又的HBV-DNA進(jìn)行雜交,向其結(jié)合RNA-DNA抗體,然后通過〗匕學(xué)發(fā)光法測(cè)定DNA的凄t量。該RNA-DNA雜交反應(yīng)分析中的發(fā)光度與HBV-DNA的婆t量成比例。才艮才居以Roche生產(chǎn)的AmplicorHBV進(jìn)行的檢測(cè)測(cè)試,通過PCR擴(kuò)增過程擴(kuò)增HBV-DNA,將擴(kuò)增的HBV-DNA與探針雜交,然后通過酶免疫測(cè)定(顯色法)檢測(cè)DNA的數(shù)量。[11]
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題[12]以上4是及的產(chǎn)品能夠;險(xiǎn)測(cè)不同范圍的HBV-DNA,^f旦這些產(chǎn)品同樣具有缺點(diǎn),例如它們不能對(duì)在韓國和東亞其它地區(qū)最為普遍的adr和adw亞型4朱提供足夠的特異性;或者這些產(chǎn)品可能引起假陽性反應(yīng)等。此外,由于上文提及的產(chǎn)品不是通過化學(xué)發(fā)光法便是通過酶免疫測(cè)定來才企測(cè)HBV-DNA凄t量,因此在HBV-DNA4企測(cè)的定量方法以及實(shí)施該才企測(cè)所用的設(shè)備上的選擇就非常小。[13]為了解決現(xiàn)有技術(shù)的上述問題,本發(fā)明目的在于提供^r測(cè)HBV-DNA的新型定量方法以及^f吏用該方法的4全測(cè)試劑盒。技術(shù)方案[14]本發(fā)明涉及通過PCR-雜交過程對(duì)HBV-DNA進(jìn)4亍定量的方法,還涉及所述方法中采用的引物和探針。本發(fā)明的另一目的在于提供包含所述引物和探針的HBV-DNA檢測(cè)試劑盒。[15]上述用于4全測(cè)HBV-DNA的診斷試劑盒具有如下特4正[16]首先,該診斷試劑盒對(duì)在韓國和東亞其它地區(qū)最為普遍的HBV亞型adr和adw具有特別高的準(zhǔn)度和4青度(纟支術(shù)竟?fàn)幃a(chǎn)品開發(fā))。其次,該試劑盒提供了能夠在免疫測(cè)試(酶免疫測(cè)定和4匕學(xué)發(fā)光法)相關(guān)的任意設(shè)備中相容應(yīng)用的試劑,從而使用戶無需為每一種檢測(cè)方法額外開支購買其它設(shè)備(試劑的相容性使用)。第三,該診斷試劑盒提供了在一個(gè)雜交反應(yīng)中同時(shí)涉及兩個(gè)探針的試劑,這可導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度的提升,從而增強(qiáng)了該試劑的靈敏度。[17]綜上所述,本發(fā)明用于檢測(cè)HBV-DNA的診斷試劑是通過國內(nèi)技術(shù)生產(chǎn)的新型診斷試劑,其技術(shù)目的如上所示,因此,本發(fā)明在解決外國產(chǎn)品的^t術(shù)和經(jīng)濟(jì)問題上具有優(yōu)勢(shì)。[18][19]發(fā)明構(gòu)成[20]本發(fā)明涉及通過PCR過程對(duì)乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)進(jìn)^f于定量的方法,其特征在于所述方法采用具有序列號(hào)為l和2的引物,以及序列號(hào)為3和4的纟果針。[21]本發(fā)明進(jìn)一步涉及HBV-DNA的定量方法,其特征在于通過采用過氧化物酶(POD)的酶免疫測(cè)定或通過采用^5咸性磷酸酶(AP)的化學(xué)發(fā)光法對(duì)HBV-DNA定量。[22]此外,本發(fā)明涉及通過PCR雜交過禾呈進(jìn)行HBV-DNA定量所采用的具有序列號(hào)1或2的引物,以及具有序列號(hào)3或4的探針。[23]本申請(qǐng)還涉及用于才企測(cè)HBV-DNA的試劑盒,其特征在于包含具有序列號(hào)1或2的引物,以及具有序列號(hào)3或4的探針。[24]本發(fā)明進(jìn)一步涉及HBV-DNA的定量方法,4全測(cè)HBV-DNA的試劑盒,以及引物和探針,其特征在于所述HBV的亞型為adr或adw。[25][26]根據(jù)本發(fā)明,采用特別指定的引物(序列號(hào)1和2)對(duì)HBV變異最少的特定區(qū)域的堿基序列進(jìn)行擴(kuò)增,在微孔中釆用特別指定的探針(序列號(hào)3和4)雜交擴(kuò)增后的產(chǎn)品,然后將所得產(chǎn)品與具有標(biāo)記酶的抗體結(jié)合,/人而通過^見察所述結(jié)合酶的作用產(chǎn)生的顯色(吸光度)量或發(fā)光(發(fā)光度)量來測(cè)定HBV-DNA數(shù)量。前引物的5'端連接有生物素,擴(kuò)增產(chǎn)物與鏈霉親和素結(jié)合,并附著在孩丈孔上。在5'端連接了DIG的探針與前引物的擴(kuò)增鏈的堿基序列互補(bǔ)。用戶既可采用將POD酶連4妄至4笨針的DIG后進(jìn)4亍的酶免疫測(cè)定作為檢測(cè)方法,也可采用將AP酶連接至探針的DIG后進(jìn)行的化學(xué)發(fā)光法作為測(cè)定方法。在所述多^罙針中,兩類揮:針同時(shí)與DNA鏈雜交,從而增強(qiáng)了信號(hào)強(qiáng)度。[27]顯色強(qiáng)度和發(fā)光度與HBV-DNA量成比例。因此,本發(fā)明的試劑盒具有可根據(jù)用戶目的同時(shí)用于顯色法(通過采用酶免疫測(cè)定)和發(fā)光法(通過采用化學(xué)發(fā)光計(jì))的出色相容性。所述的HBV-DNA定量方法對(duì)于觀察HBV-感染患者的發(fā)展以及驗(yàn)證抗病毒藥劑的治療效果非常必要。[28]圖1顯示了顯色法(采用酶免疫測(cè)定分析4義)的要點(diǎn)。首先,將具有特定;咸基序列的DNA產(chǎn)物放入孩W14反,然后與生物素和鏈霉親和素結(jié)合以將雙鏈DNA附著至固相。在不具有生物素的DNA鏈脫附后,將附著的DNA鏈與具有DIG標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。將DIG與POD(過氧化物酶)結(jié)合,通過POD作用;容解底物,與作為顯色劑的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)反應(yīng)生成顏色。顯色強(qiáng)度可通過分光光度計(jì)(ELISA4僉測(cè)儀)4企測(cè)。吸光度強(qiáng)度與HBV-DNA的凄t量成比例。[29]圖2顯示了發(fā)光法(采用化學(xué)發(fā)光計(jì))的要點(diǎn)。首先,將具有特定堿基序列的DNA產(chǎn)物放入微孔板,然后與生物素和鏈霉親和素結(jié)合以爿尋雙鏈DNA附著至固相。在不具有生物素的DNA《連脫附后,將附著的DNA鏈與具有DIG標(biāo)記的4笨針進(jìn)行雜交反應(yīng)。通過與AP(堿性磷酸酶)結(jié)合的DIG的作用,CDP發(fā)光底物成為發(fā)光體??赏ㄟ^發(fā)光計(jì)對(duì)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。該發(fā)光度與HBV-DNA的凄t量成比例。[30]如本發(fā)明所述的用于PCR雜交反應(yīng)或用于才企測(cè)HBV-DNA的所述探針和引物可基于對(duì)HBV亞型adr和adw具有特異性的共有序列進(jìn)行合成。[31]所述亞型adr的完整基因組序列披露于J.Gen.Virol.66(PT1),195-200(1985),NCBI編號(hào)V00867等;所述亞型adw的完整基因組序列4皮露于Dokl.Biochem.271,246-249(1984),CBI編號(hào)V00866等。在本發(fā)明中,正義引物(序列號(hào)1)基于HBV亞型adr和adw的完整基因組序列位置1432-1453的石咸基序歹'J;反義引物(序歹'j號(hào)2)基于其位置1581-1604的堿基序列;探針1(序列號(hào)3)基于其位置1435-1460的堿基序列;而探針2(序列號(hào)4)基于其位置550-1570的石威基序列。本發(fā)明的4笨針或引物可通過自動(dòng)合成法等方法合成得到。[32]本發(fā)明的4罙針或引物可通過進(jìn)一步轉(zhuǎn)4b以包含用于i貪斷和4冢測(cè)的可測(cè)標(biāo)i己。此類多種標(biāo)i己為本領(lǐng)i或所^^知,適當(dāng)?shù)牟攀竞灠?,^旦不限于,生物素,DIG等。本領(lǐng)域的才支術(shù)人員可采用所述標(biāo)記獲得本發(fā)明的探針或引物的標(biāo)記變體。[33]本發(fā)明中^f吏用的引物采用具有序列號(hào)1的正義引物和具有序列號(hào)2的反義引物的混合物溶液以及具有序列號(hào)3的探針1和具有序列號(hào)4的探針2的混合溶液。該引物和探針的堿基序列如下表1所示。[34]表1項(xiàng)目堿基序列正義引物5'-ccgtcggcgctgaatcccgcgg-3'(序列號(hào)1)反義引物生4勿素-5'曙acgtgcagaggtgaagcgaagtgc-3'(序列號(hào)2)探針1DI:G-5'-tcggcgctgaatcccgcggacgaccc-3'(序歹'J號(hào)3)探針2DIG-5'-cgtctgtgccttetctgc陽3'(序列號(hào)4)[35][36]顯色法和發(fā)光法的之間的區(qū)別如下文表2所示,除所示區(qū)別外,該兩個(gè)方法相同。[37]表2顯色法發(fā)光法所用的酶過氧化物酶(POD)石威性磷酸酶(AP)所用的底物過氧化氫CDP-star'M測(cè)量儀器吸光度測(cè)量4義器發(fā)光光度計(jì)標(biāo)準(zhǔn)試劑的濃度(pg/ml)0.5,100,1000,20000.5,跳2000,5000[38][39]圖l顯示了顯色法(采用酶免疫測(cè)定分析儀)的要點(diǎn)。[40]圖2顯示了發(fā)光法(采用化學(xué)發(fā)光計(jì))的要點(diǎn)。[41]圖3顯示了用于雜交反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖,其中顯示了擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為173bp。[42]圖4顯示了用于顯色反應(yīng)(用于檢測(cè)吸光度)的微孔氺反。[43]圖5顯示了用于發(fā)光計(jì)的樣走孔板。圖6顯示了基于標(biāo)準(zhǔn)樣品顯色法重復(fù)性結(jié)果繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。[45]圖7顯示了基于標(biāo)準(zhǔn)樣品發(fā)光法重復(fù)性結(jié)果纟會(huì)制的標(biāo)準(zhǔn)曲線》[46]圖8顯示了本發(fā)明和Digen產(chǎn)品的顯色法測(cè)試結(jié)果的比較。[47]圖9顯示了本發(fā)明和Digen產(chǎn)品的發(fā)光法測(cè)試結(jié)果的比較。[48]圖IO顯示了顯色法和發(fā)光法之間的關(guān)系。[49]實(shí)施方式[50]實(shí)施例[51]以下本發(fā)明通過工作實(shí)施例的方式進(jìn)行更具體的解釋。下文提供的工作實(shí)施例僅作提供范例之用,因此本發(fā)明的范圍不限于所示的實(shí)施例。[52][53〗實(shí)施例1.酶免疫測(cè)定分析義的使用[54]試劑的組成[55]1.HBV-DNA提取過程[56]1)溶解試劑(02.NNaOH)[57]2)中和試劑(0.2NHC1)[58][59]2.擴(kuò)增和雜交反應(yīng)[60]*HBV-DNA的擴(kuò)增[61]1)具有冷凍脫水的PCR反應(yīng)試劑(包含2.5U的聚合酶,250jiM的四類4亥i臾,10mM的Tris-HCl,40mM的KC1,MgCl2以及穩(wěn)定著色劑,且在脫水狀態(tài)下貯存)的試管[62]2)PCR緩沖〉容液(包含lOOpM的引物和lpM的d-UTP的純凈水)[63]3)4氐濃度陽性對(duì)照[64]4)中濃度陽性對(duì)照[65]5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣品[66]標(biāo)準(zhǔn)〉容液的濃度1.0.5pg/ml[67]2.100pg/ml[68]3.1000pg/ml[69]4.2000pg/ml#標(biāo)準(zhǔn)樣品可采用購得的ATCC39630HBV菌4朱并參照美國專利4,942,125,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2606-2610,1981等進(jìn)行制備。[71][72]*雜交反應(yīng)測(cè)i式溶液[73]1)用于附著反應(yīng)的^爰沖'溶液(PBS,0.05°/。的Tween20)[74]2)DNA變性測(cè)試溶液(0.2NNaOH)[75]3)涂覆了鏈霉親和素的微孔板[76]4)用于雜交反應(yīng)的纟爰沖纟容液(4XSSC,20mMHEPES,2mMEDTA,0.15%tween20,0.5%BSA且pH為7.2)[77]5)DIG標(biāo)記4笨針[78]6)結(jié)合POD(過氧化物酶)的抗體以及稀釋溶液(PBS)[79]7)底物溶液過氧化氫[80]8)顯色劑(四曱基聯(lián)苯胺:TMB)[81]9)終止溶液碌u酸[82]IO)洗滌溶液(IXPBS,0.05%tween20)網(wǎng)[84]測(cè)試過程1.提耳又HBV國DNA[86]將50^1的測(cè)試血清與50^il的溶解測(cè)試溶液混合。在40rpm下振蕩,并將混合物在37。C的溫度下反應(yīng)30分鐘。通過與測(cè)試體相同的方式纟是耳又標(biāo)準(zhǔn)樣品1至4的各兩個(gè)樣品。添加5(^1的中和》爰沖〉容液并混合,然后12000G離心IO分鐘沉淀該混合物。采用5^1上清液進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。[87][88]2.PCR[89]將5(al提取DNA,45^1PCR緩沖溶液與干預(yù)備混合物相混合以獲得總計(jì)50pi1的主混合溶液(擴(kuò)增反應(yīng)溶液)。該擴(kuò)增條件i殳置為(l)在95。C下3分鐘,(2)[在94。C下40秒,在60。C下40秒并且在72。C下40秒]*25次循環(huán),以及(3)在72。C下7分鐘。擴(kuò)增約一€時(shí)1小時(shí)。[90]就此而言,圖3顯示了用于雜交反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖,其中顯示了擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為173bp。泳道l為具有100bp階梯的才示i己DNA,;永道2禾口3為;農(nóng)度均為0.5pg/ml的才示準(zhǔn)才羊品,而;永道4,5詳口6是5農(nóng)度分另'J為100pg/ml,1000pg/ml和2000pg/ml的才示;隹測(cè)試〉容液。圖3顯示在標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不大于100pg/ml時(shí)的測(cè)試結(jié)果為陰性,在濃度為1000pg/ml時(shí)顯示了清晰可見的條帶,證明了該差異耳又決于DNAs的#1量。[91]擴(kuò)增反應(yīng)后,將150|al純凈水與50^1的PCR擴(kuò)增溶液相混合。[92]3.雜交反應(yīng)[94]將用于附著反應(yīng)的150|il緩沖溶液放入孩么孔,添加lOjil的稀釋PCR擴(kuò)增〉容液并混合。在40rpm下#展蕩,將混合物在溫度為50。C的箱中反應(yīng)一小時(shí)。向混合物添加lOO(il的DNA變性溶液,然后在室溫下反應(yīng)20分鐘。在反應(yīng)過程中以對(duì)雜交反應(yīng)緩沖液1Ul/ml的比例按需制備探針。反應(yīng)結(jié)束后,以洗滌溶液洗滌產(chǎn)物5次,并將洗滌溶液摔凈。然后將lO(Hil的制備探針溶液放入微孔。在溫度為5CTC的水箱中40rpm振蕩,反應(yīng)一'J、時(shí)。在反應(yīng)過程中以對(duì)稀釋溶液1:1000的比例4安需制備酶。反應(yīng)結(jié)束后,以洗滌;容液洗滌反應(yīng)產(chǎn)物5次。將洗滌溶液摔凈后,將100|al的稀釋酶溶液(結(jié)合抗DIG抗體的POD)放入各微孔。在溫度為37°C的水箱中40rpm沖展蕩,反應(yīng)30分鐘。在反應(yīng)過禾呈中以1:1的比例混合4安需制備底物溶液和顯色劑。反應(yīng)結(jié)束后,以洗滌:容液洗滌反應(yīng)產(chǎn)物5次。將洗滌溶液摔凈后,將通過稀釋制備的等量的顯色測(cè)試溶液100[il注射進(jìn)入各微孔,然后將產(chǎn)物在暗室中反應(yīng)15分鐘。向各^敬孑L添力o100|il反應(yīng)纟冬止;容液以終止反應(yīng),并以酶免疫測(cè)定分才斤4義在450波長下測(cè)定吸光度(顯色強(qiáng)度)(參照620nm)。[95]在這一方面,圖4顯示了顯色反應(yīng)的樣i孔板(用于測(cè)定吸光度),且在圖4中的微孔板以透明材料制成以允許光透過。反應(yīng)的變化也可用肉眼觀察。然而,為進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量,可采用分光光度計(jì)(ELISA4企測(cè)4義)。[96][97]輸出結(jié)果[98]標(biāo)準(zhǔn)樣品1:0.5pg/1[99]標(biāo)準(zhǔn)樣品2:100pg/ml[100]標(biāo)準(zhǔn)才羊品3:1000pg/ml[101]標(biāo)準(zhǔn)樣品4:2000pg/ml[102]根據(jù)上述測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)樣品1-4的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后將各測(cè)試體的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算HBV-DNA濃度(Pg/ml)。[103][104]結(jié)果的解釋[105]0.5pg/ml及以上的濃度可i人為是陽'〖生。為測(cè)定該濃度是否有上升或下降的趨勢(shì),可將結(jié)果彼此進(jìn)行比較。如果測(cè)得濃度與施用前測(cè)得的值相比顯著下降或顯示陰性反應(yīng),則認(rèn)為該藥物(如干護(hù)G素等抗病毒劑)對(duì)該病毒具有治療歲丈果。與之相反,如果該濃度與施用前測(cè)得的〗直相比才艮本未下降或者反而上升,則i人為該藥物根本不具有治療效果。臨床醫(yī)生實(shí)際解釋為當(dāng)該濃度大于或等于200pg/ml時(shí),該藥物沒有治療效果,這與lOOOpg/ml,2000pg/ml等濃度相似。本測(cè)試的目的在于4企測(cè)施用前和施用后測(cè)得值的變化程度以觀察病毒的發(fā)展,因此,這與單次測(cè)試不同。[106][107]實(shí)施例2.化學(xué)發(fā)光計(jì)的使用[108]i式劑的纟且成[109]1.HBV畫DNA提耳又過程[110]1)溶解測(cè)試溶液(0.2NNaOH)[111]2)中和測(cè)試溶液(0.2NHC1)[II2]2.擴(kuò)增和雜交反應(yīng)[113]*HBV-DNA的擴(kuò)增[114]1)具有冷凍脫水的PCR反應(yīng)試劑(包含2.5U的聚合酶,250jiM的四類核酸,10mM的Tris-HCl,40mM的KC1,MgCl2以及穩(wěn)定著色劑,且在脫水狀態(tài)下貯存)的試管[115]2)PCR緩沖溶液(包含lOOpiM的引物和IpM的d-UTP的純凈水)[U6]3)低濃度陽性對(duì)照[117]4)中濃度陽性對(duì)照[118]5)《會(huì)制標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)才羊品[119]標(biāo)準(zhǔn)〉容液的濃度1.0.5pg/ml[120]2.lOOpg/ml[121]3.2000pg/ml[122]4.5000pg/ml[123]#標(biāo)準(zhǔn)樣品可采用購得的ATCC39630HBV菌4朱并參照美國專利4,942,125,Pro"Natl.Acad.Sci.USA78:2606-2610,1981等進(jìn)行制備。[124][125]*雜交反應(yīng)測(cè)試^容液[126]1)用于附著反應(yīng)的緩沖液(PBS,0.05%的Tween20)[127]2)DNA變性測(cè)試溶液(0.2NNaOH)[l28]3)涂覆了鏈霉親和素的孩i才反孔[129]4)用于雜交反應(yīng)的姿爰沖;容'液(4XSSC,20mMHEPES,2mMEDTA,0J5%tween20,0.5%BSA且pH為7.2)[130]5)DIG標(biāo)記^罙針[131]6)結(jié)合AP(堿性磷酸酶)的抗體以及稀釋溶液(PBS)[132]7)底物溶液產(chǎn)品名稱CDR-star(Roche提供);2隱氯—5-(4[l,2-二喁丁基-3,2-(5-氯)-三環(huán)[3,3,l,l]癸烷]-4基)苯基磷酸二鈉]);P33]8)洗滌溶液(IXPBS,0.05%tween20)[134][135]測(cè)試過程[136]HBV-DNA揭:耳又過程和PCR過程(1和2)如上文實(shí)施例1所示。[137][138]3.雜交反應(yīng)[139]將用于附著反應(yīng)的150jal緩沖溶液放入孩丈孑U添加lOfxl的稀釋PCR擴(kuò)增溶液并混合。在40rpm下振蕩,將混合物在溫度為50。C的釜中反應(yīng)一'卜時(shí)。向混合物添加100^1的DNA變性:容液,然后在室溫下反應(yīng)20分鐘。在反應(yīng)過考呈中以對(duì)雜交反應(yīng)IC沖液1Ul/ml的比例按需制備探針。反應(yīng)結(jié)束后,以洗滌溶液洗滌產(chǎn)物5次,并將洗滌溶液摔凈。然后將100jal的制備探針溶液放入"f效孔。在溫度為5(TC的水箱中40rpm振蕩,反應(yīng)一'卜時(shí)。在反應(yīng)過程中以對(duì)稀釋〉容液1:1000的比例4安需制備酶。反應(yīng)結(jié)束后,以洗滌溶液洗滌反應(yīng)產(chǎn)物5次。將洗滌溶液摔凈后,將100^1的f希釋酶溶液(結(jié)合抗DIG抗體的POD)力文入各樣i孔。在溫度為37°C的水箱中40rpm才展蕩,反應(yīng)30分4中。在反應(yīng)過禾呈中以1:1的比例混合4安需制備底物溶液和顯色劑。反應(yīng)結(jié)束后,以洗滌溶液洗滌反應(yīng)產(chǎn)物5次。將洗滌溶液摔凈后,將通過稀釋制備的等量的顯色測(cè)試溶液lOOfil注射進(jìn)入各樣i孔,然后將產(chǎn)物在暗室中反應(yīng)15分鐘。在所述的15分鐘內(nèi),以化學(xué)發(fā)光計(jì)在466nm下斥企測(cè)發(fā)光度。[140]在這一方面,圖5顯示了用于檢測(cè)發(fā)光的微孔板,且可以理解該微孔板由不透明材料制成使光不能透過,從而防止影響其它樣L孔。該反應(yīng)中的變化無法用肉眼觀察,因此必須使用發(fā)光計(jì)來觀j察該變化。[141][142]輸出結(jié)果[143]標(biāo)準(zhǔn)樣品1:0.5pg/1[144]標(biāo)準(zhǔn)才羊品2:100pg/m[145]標(biāo)準(zhǔn)樣品3:2000pg/ml標(biāo)準(zhǔn)樣品4:5000pg/ml[147]才艮據(jù)上述測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)樣品1-4的發(fā)光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后將各測(cè)試體的發(fā)光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算HBV-DNA濃度(pg/ml)。同[149]結(jié)果解釋[150]與上述實(shí)施例1才目同。[151][152]實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1.質(zhì)量保證[153]在顯色法中測(cè)得的濃度范圍為0.5-2000pg/ml,而在發(fā)光法中為0.5-5000pg/ml(參照?qǐng)D6和7)。然而,顯色法在2000pg/ml及以上濃度的線性^氐于發(fā)光法。因此,顯色法的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度應(yīng)當(dāng)4氐于發(fā)光法。[154][155]靈敏度[156]靈敏度的定義如下[157]靈敏度=(陽性結(jié)果數(shù)量-陰性結(jié)果數(shù)量)/陽性測(cè)試體數(shù)量*100%[158]靈敏性表示根據(jù)下文表5中25-96號(hào)這72個(gè)樣品的測(cè)試所得結(jié)果計(jì)算的陽性樣品結(jié)果陽性的程度。[159]靈敏度=(72國0)/72*100=100%[160]如上文所示,參照本發(fā)明進(jìn)4亍的HBV-DNA4企測(cè)的靈壽文度顯示出了良好的結(jié)果。[161][162]特異度[163]特異度的定義如下[164]特異度=(陰性結(jié)果數(shù)量陽性結(jié)果數(shù)量)/陰性測(cè)試體數(shù)量*100%[165]特異性表示根據(jù)下文表5中l(wèi)-24號(hào)這24個(gè)樣品的測(cè)試所得結(jié)果計(jì)算的陰性樣品結(jié)果陰性的程度。[166]特異度=(24扁1)/24*100=95.8%。[167]如上文所示,參照本發(fā)明進(jìn)行的HBV-DNA一企測(cè)的特異度顯示出了良好的結(jié)果。網(wǎng)[169]重現(xiàn)性[170]重現(xiàn)性確定對(duì)相同測(cè)試體進(jìn)行重復(fù)測(cè)試時(shí)的測(cè)試結(jié)果的一致性。重現(xiàn)性對(duì)于如本發(fā)明等定量測(cè)試試劑非常重要。[171]影響重現(xiàn)性的因素為[172]結(jié)果的平均值=將各測(cè)試結(jié)果的總數(shù)除以重復(fù)的測(cè)試數(shù)所得的結(jié)果;[173]標(biāo)準(zhǔn)偏差=將平均值與各測(cè)試結(jié)果的各差值相加,然后;)尋加和除以重復(fù)的測(cè)試凄t所得的結(jié)果;以及[174]變異系It=標(biāo)準(zhǔn)偏差除以平均值所-得的比例。[175]重復(fù)性可通過變異系數(shù)表示,且當(dāng)變異系數(shù)越大,重現(xiàn)性越低,當(dāng)變異系數(shù)越小,重現(xiàn)性越高。[176]通過顯色吸光度(酶免疫測(cè)定分析〗義)^r測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的重現(xiàn)性[177]表3<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>230.3060.6911.3382.126240.2810.6751.2852.185250.2860.6651.4332.179260.3680.7111.2892.246270.3080.7071.3212.244280.3270.8741.3642.155290.2640.8831.4012.201300.3440.6921.4062.173310.2770.6871.2872.113320.2950.6631.2932.219平均0.290.711.362.19標(biāo)準(zhǔn)偏差0駕840.0667110.058120.047571變異系數(shù)9.66%9.43%4.28%2.17[178]*上述數(shù)值為吸光度值,且未采用測(cè)量單位[179][180]上文表3顯示了采用顯色吸光度4企測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品所得的重現(xiàn)性結(jié)果。從該表可以看到,標(biāo)準(zhǔn)樣品1和2的值分別為9.66%和9.43%,這是良好的變異系凄丈,而標(biāo)準(zhǔn)樣品3和4分別為4.28%和2.17%,這是極好的變異系數(shù)。該結(jié)果可認(rèn)為具有出色的重現(xiàn)性。[181]基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的觀'j試結(jié)果所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣顯示了出色的結(jié)果(圖6)。[182]通過化學(xué)發(fā)光計(jì)(發(fā)光發(fā)光度檢測(cè)"i殳備)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)才羊品的重J見性[183]表4重復(fù)的測(cè)試數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品1標(biāo)準(zhǔn)樣品2才示準(zhǔn)一羊品3標(biāo)準(zhǔn)樣品4(0.5pg/ml)(勵(lì)pg/ml)(2000pg/ml)(5000pg/ml)18510482119311201971292819412207719943238810194120303206453410210199109997199932<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>一示準(zhǔn)1"扁差8.970681038978.37117995716.0286264461.690156變異系數(shù)10.64%9.45%4.80%2.21%[184]*上述數(shù)值為發(fā)光度,以RLU為測(cè)量單位。[185][186]上文表4顯示了采用發(fā)光計(jì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品所得的重現(xiàn)性結(jié)果。乂人該表可以看到,標(biāo)準(zhǔn)樣品1和2的值分別為10.64%和9.45%,這是良好的變異系數(shù),而標(biāo)準(zhǔn)樣品3和4分別為4.80%和2.21%,這是極好的變異系數(shù)。該結(jié)果可認(rèn)為具有才及為出色的重現(xiàn)[187]基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的結(jié)果所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線同才羊顯示了出色的結(jié)果(圖7)。岡[189]與常規(guī)測(cè)試試劑的相關(guān)性[190]與美國/>司Digen基于發(fā)光法的產(chǎn)品相比,參照本發(fā)明的測(cè)試試劑的顯色法與Digen的發(fā)光法的相關(guān)系凄史為0.9554,顯示了4交高的相關(guān)性(圖8),本發(fā)明的發(fā)光法同樣與Digen的發(fā)光法具有0.9798的高相關(guān)性(圖9)。[191][192]采用本發(fā)明測(cè)試試劑的^r測(cè)方法的測(cè)試結(jié)果比專交[193]表5<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>[194]工業(yè)適用性[195]本發(fā)明目的在于通過對(duì)盡可能多的adr和adw亞型菌抹的堿基序列進(jìn)行比較搜索發(fā)現(xiàn)并提供未變異的HBV-DNA序列內(nèi)的才冢4十和引物。因此,本發(fā)明具有沖金測(cè)幾乎所有adr和adw亞型菌抹的高靈敏度和高特異性。因而本發(fā)明所述的HBV檢測(cè)試劑盒與能夠檢測(cè)不同病毒范圍,但對(duì)在韓國和東亞其它地區(qū)常見的adr和adw亞型菌抹具有較低特異性,且可能?1起假陽性反應(yīng)的產(chǎn)品相比具有出色的特異性,[196]此外,本發(fā)明的用戶可選擇酶免疫測(cè)定法(其中POD酶與雜交探針的DIG結(jié)合)或化學(xué)發(fā)光法(其中連接了AP酶)作為牙企測(cè)方法。因此,由于用戶無需額外購買其它4企測(cè)i殳備,本發(fā)明為用戶提供了經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。[197]此外,本發(fā)明的多探針由于用兩種類型的探針在同一時(shí)間雜交同一DNA鏈而具有增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度的作用。因此,本發(fā)明既可在高濃度也可在低濃度提高檢測(cè)率。權(quán)利要求1.通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)雜交過程對(duì)乙型肝炎病毒(HBV-DNA)進(jìn)行定量的方法,其特征在于采用了序列號(hào)為1和2的引物以及序列號(hào)為3和4的探針。2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于通過采用過氧化物酶(POD)的酶免疫測(cè)定法對(duì)HBV-DNA進(jìn)4亍定量。3.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于通過采用堿性磷酸酶(AP)的化學(xué)發(fā)光法對(duì)HBV-DNA進(jìn)行定量。4.如4又利要求1至34壬意一項(xiàng)所述的方法,其特征在于HBV為adr亞型或adw亞型。5.石咸基序列號(hào)為1或2且用于通過PCR雜交過程對(duì)HBV-DNA進(jìn)行定量的引物。6.如4又利要求5所述的引物,其特征在于HBV為adr亞型或adw亞型。7.石咸基序列號(hào)為3或4且用于通過PCR雜交過程對(duì)HBV-DNA進(jìn)行定量的探針。8.如—又利要求7所述的揮:4十,其特征在于HBV為adr亞型或adw亞型。9.檢測(cè)HBV-DNA的試劑盒,其特征在于包含權(quán)利要求5所述的引物和權(quán)利要求7所述的^^笨針。10.如權(quán)利要求9所述的#企測(cè)HBV-DNA試劑盒,其特征在于HBV為adr亞型或adw亞型。全文摘要本發(fā)明涉及通過PCR雜交過程對(duì)乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)進(jìn)行定量的方法,以及該方法中采用的引物和探針。本發(fā)明還涉及包含所述引物和探針的HBV-DNA檢測(cè)試劑盒。特別地,本發(fā)明的特征在于所述HBV為adr亞型或adw亞型。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101400802SQ200680053736公開日2009年4月1日申請(qǐng)日期2006年4月18日優(yōu)先權(quán)日2006年1月5日發(fā)明者崔賢一,樸亨根,李惠泳,趙孝卿,金泰宇申請(qǐng)人:凱奇拜基因有限公司;崔賢一