專利名稱：一種生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法及其專用工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法及其專用工程菌。
背景技術(shù)：
聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，簡稱PHA)是廣泛存在于微生物體內(nèi)的一類高分子生物聚酯，在生物體內(nèi)主要作為碳源和能量的貯藏物質(zhì)(Anderson AJ，Dawes EA.Occurrence，metabolism，metabolic role，and industrial use ofbacterial polyhydroxyalkanoates.Microbiol.Rev.，1990，54450-472；MadisonLL，Huisman GW.Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates)from DNAto plastic.Microbiol.Mol.Biol.Rev.，1999，6321-53)。自然界的多種微生物均可以合成PHA，其分子量一般由幾萬至幾百萬(Sudesh K，Abe H，Doi Y.Synthesis，structure and properties of polyhydroxyalkanoatesbiologicaipolyesters.Prog.Polym.Sci.，2000，251503-1555)。
PHA的結(jié)構(gòu)通式為 其中n＝1、2、3或4；通常n＝1，即為聚-3-羥基脂肪酸酯。m表示聚合度，決定分子量的大小。R是可變基團，可為飽和或不飽和、直鏈或含側(cè)鏈及取代基的烷基。
PHA與傳統(tǒng)的、以石油為原料合成的塑料如聚乙烯、聚丙烯等有相似的材料學(xué)性質(zhì)，但可以用可再生的能源(如植物光合作用產(chǎn)生的碳水化合物、脂肪酸等)合成，并且可以完全降解進入自然界的生態(tài)循環(huán)，因此被認為是一種環(huán)境友好的“綠色塑料”，可以替代不可降解的傳統(tǒng)塑料，而引起世界各國科學(xué)界和產(chǎn)業(yè)界的廣泛重視(Steinbüchel A.Perspectives for biotechnological production andutilization of biopolymersmetabolic engineering of polyhydroxyalkanoatebiosynthesis pathways as a successful example.Macromol.Biosci.，2001，11-24；Chen GQ，Wu Q，Xi JZ，et al.Microbial production of biopolyesters-polyhydroxyalkanoates.Prog.Nat.Sci.，2000，10843-850；Lee SY.Bacterialpolyhydroxyalkanoates.Biotechnol.Bioeng.，1996，491-14)。當(dāng)前困擾PHA產(chǎn)業(yè)化的主要原因是其生產(chǎn)成本相對石油塑料來說仍然較高。
目前，傳統(tǒng)的生產(chǎn)PHA的方法多為利用野生PHA生產(chǎn)菌在好氧條件下發(fā)酵積累PHA。然而在好氧條件下，作為碳源的糖類經(jīng)過糖酵解途徑產(chǎn)生的乙酰輔酶A隨即進入三羧酸循環(huán)體系為生物體生長提供能量，最終一部分碳源變成二氧化碳被排出，剩余碳源則分別用于菌體生長和產(chǎn)物PHA的積累。在此過程中，有氧代謝還會產(chǎn)生額外的NADH造成代謝的不平衡，導(dǎo)致發(fā)酵過程中的高耗氧和原料中能量的浪費。此外，在實際的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，發(fā)酵過程的耗氧動力成本往往高達發(fā)酵總耗能成本的50％左右。因此現(xiàn)在已有的PHA發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)存在碳源轉(zhuǎn)化率低，且發(fā)酵成本高的問題。所以迫切需要開發(fā)能夠在缺氧條件下合成PHA的技術(shù)，降低PHA的生產(chǎn)成本。所謂缺氧發(fā)酵是指在無氧或微氧(溶解氧DO＜0.5mg/L)狀態(tài)下進行的發(fā)酵培養(yǎng)。相比好氧條件下的培養(yǎng)，缺氧發(fā)酵無需向發(fā)酵液中額外供應(yīng)純氧或者空氣供微生物代謝之用。嚴格的厭氧發(fā)酵需要在培養(yǎng)過程中不斷通入氮氣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法及其專用工程菌。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯用工程菌，是將含有缺氧誘導(dǎo)啟動子和串聯(lián)于所述缺氧誘導(dǎo)啟動子下游的聚羥基脂肪酸酯合成基因的重組表達載體轉(zhuǎn)入到宿主菌后得到的重組菌。
所述缺氧誘導(dǎo)啟動子可為乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase簡稱ADH)的啟動子(簡稱PadhE)(自GENBANK號為NC_000913的5′端第1294197-1294669位核苷酸)，丙酮酸-甲酸裂解酶(pyruvate formate lyase簡稱PFL)的啟動子(自GENBANK號為NC_000913的5′端第4143715-4144281位核苷酸)，乳酸脫氫酶(D-lactate dehydrogenase)的啟動子(自GENBANK號為NC_000913的5′端第1439568-1439878位核苷酸)，甘油脫氫酶(glycerol dehydrogenase簡稱GLD)的啟動子(PldhA)(自GENBANK號為NC_000913的5′端第4135492-4135955位核苷酸)，有氧呼吸調(diào)控蛋白(aerobic respiration control protein簡稱ARC)的啟動子(ParcA)(自GENBANK號為NC_000913的5′端第3348236-3348711位核苷酸)等。
所述聚羥基脂肪酸酯合成基因可為合成短鏈PHA-聚羥基丁酸酯PHB的基因，如來源于羅氏真養(yǎng)菌Ralstonia eutropha的合成短鏈PHA的PHB合成基因phaCAB(自GENBANK號為AM260479的5′端第1557353-1561203位核苷酸)或者巨大產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes latus的PHB合成基因phaCAB(自GENBANK號為U47026的5′端第533-4336位核苷酸)；也可為合成中長鏈PHA的合成基因，如來源于假單胞菌屬Pseudomonas的中長鏈PHA合成基因phaC1ZC2(自GENBANK號為AY278219的5′端第1-4746位核苷酸)和phaC(自GENBANK號為NC_002947的5′端第1-1683位核苷酸)，還可為短鏈和中長鏈PHA共聚物合成基因，如來源于氣單胞菌屬Aeromonas的PHA合成基因phaPCJ(自GENBANK號為AY093685的5′端第292-2920位核苷酸)。
所述宿主菌可為大腸桿菌、巨大產(chǎn)堿桿菌、羅氏真養(yǎng)菌、假單胞菌或嗜水性氣單孢菌，優(yōu)選為大腸桿菌，比如野生大腸桿菌K-12及其兩株乙酸合成途徑的缺失突變體E.coli ackA-和E.coli pta-等。一些啟動子如乙醇脫氫酶啟動子(簡稱PadhE)和丙酮酸-甲酸裂解酶啟動子(簡稱Pflp)在某些大腸桿菌的突變體(如乙酸合成途徑突變體E.coli ackA-和E.coli pta-)中活性會高于野生型大腸桿菌。
所述在大腸桿菌中重組表達的載體的出發(fā)載體為pBluescript II SK(-)(NCBIGenBank檢索號為X52330)。所述在假單胞菌和嗜水性氣單孢菌中重組表達的載體的出發(fā)載體為pBBR1MCS-2(NCBI GenBank號為U23751)。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，是將上述工程菌，在缺氧條件下，發(fā)酵得到聚羥基脂肪酸酯。
所述缺氧條件為無氧或微氧條件，即溶解氧DO＜0.5mg/L；在發(fā)酵過程中不需要在PHA積累過程中通入空氣或富氧氣體或者提供嚴格厭氧條件；根據(jù)工藝需要，也可在培養(yǎng)前期進行有氧發(fā)酵積累菌體，培養(yǎng)至中后期停止通氣轉(zhuǎn)為缺氧培養(yǎng)，并在缺氧條件下進行PHA的合成。
所述大腸桿菌工程菌的發(fā)酵溫度為28-38℃；優(yōu)選為37℃。
所述大腸桿菌工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為含有3-7g/L酵母提取物、6-12g/L蛋白胨、6-12g/L NaCl、10-30g/L葡萄糖的培養(yǎng)基；為了防止雜菌污染，所述培養(yǎng)基中還可加入60-100ug/mL氨芐青霉素。大腸桿菌工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl、20g/L葡萄糖和100ug/mL氨芐青霉素。
所述假單胞菌工程菌可選用下述三種培養(yǎng)基中的任意一種1)每升培養(yǎng)基含酵母提取物4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，NaCl 8-12g/L，葡萄糖18-22g/L，其余為水。
2)每升培養(yǎng)基含酵母提取物4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，葡萄糖40-60g/L，(NH4)2SO45-7g/L；MgSO40.38-0.45g/L；Na2HPO4·12H2O 9.6-9.7g/L；KH2PO41.2-1.8g/L，微量元素溶液I 8-12mL/L，微量元素溶液II 0.8-1.2mL/L，其余為水；每升微量元素溶液I含F(xiàn)e(III)-NH4-Citrate 4-6g/L，CaCl2·2H2O 1.8-2.2g/L，其余為0.4-0.6M HCl；每升微量元素溶液II含ZnSO4·7H2O 80-120mg/L，MnCl2·4H2O 25-35mg/L，H3BO3280-320mg/L，CoCl2·6H2O 180-220mg/L，CuSO4·5H2O8-12mg/L，NiCl2·6H2O 18-22mg/L，NaMoO4·2H2O 28-32mg/L，其余為0.4-0.6M HCl。
3)每升培養(yǎng)基含月桂酸7-9g/L，(NH4)2SO41.8-2.2g/L；MgSO40.38-0.45g/L；Na2HPO4·12H2O 9.6-9.7g/L；KH2PO41.2-1.8g/L，微量元素溶液I 8-12mL/L，微量元素溶液II 0.8-1.2mL/L，其余為水；每升微量元素溶液I含F(xiàn)e(III)-NH4-Citrate 4-6g/L，CaCl2·2H2O 1.8-2.2g/L，其余為0.4-0.6M HCl；每升微量元素溶液II含ZnSO4·7H2O 80-120mg/L，MnCl2·4H2O 25-35mg/L，H3BO3280-320mg/L，CoCl2·6H2O 180-220mg/L，CuSO4·5H2O 8-12mg/L，NiCl2·6H2O 18-22mg/L，NaMoO4·2H2O 28-32mg/L，其余為0.4-0.6M HCl。
在實際培養(yǎng)過程中，可向上述培養(yǎng)基中再添加一定濃度的抗生素以維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，如30-50μg/mL硫酸卡那霉素和60-100μg/mL氨芐青霉素。
所述假單胞菌工程菌的發(fā)酵溫度為30-35℃。
所述巨大產(chǎn)堿桿菌、羅氏真養(yǎng)菌和嗜水氣單胞菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為礦物培養(yǎng)基(MM培養(yǎng)基)中加入長鏈脂肪酸或葡萄糖酸鈉作為碳源。
所述礦物培養(yǎng)基包括以下四種組分組分I(20×)Na2HPO4·12H2O 180g/L，KH2PO430g/L；組分II(NH4)2SO40.5～2g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L；組分III(100×)Fe(III)-NH4-Citrate 5g/L，CaCl2·2H2O 2g/L；組分IV(1000×)ZnSO4·7H2O 100mg/L，MnCl2·4H2O 30mg/L，H3BO3300mg/L，CoCl2·6H2O 200mg/L，CuSO4·5H2O 10mg/L，NiCl2·6H2O 20mg/L，NaMoO4·2H2O 30mg/L。
其中組分III和組分IV為微量元素，用1mol/L的鹽酸溶液配制。
滅菌時，以組分II為基底，四種組分分開單獨滅菌，使用前按所述比例混合。組分IV在滅菌前稀釋成100倍濃度的母液再滅菌。
接種前在上述礦物培養(yǎng)基中加入8-10g/L長鏈脂肪酸如癸酸、月桂酸等作為碳源。在實際培養(yǎng)過程中，可向上述培養(yǎng)基中再添加1g/L酵母粉來促進菌體生長；還有一定濃度的抗生素以維持質(zhì)粒穩(wěn)定性，如30-50μg/mL硫酸卡那霉素和60-100μg/mL氨芐青霉素。
所述巨大產(chǎn)堿桿菌、羅氏真養(yǎng)菌和嗜水氣單胞菌的工程菌的發(fā)酵溫度為30-35℃。
本發(fā)明的方法通過構(gòu)建得到的缺氧發(fā)酵條件下可高效表達PHA菌種，利用該菌種，在缺氧條件下合成PHA。本發(fā)明的方法，在發(fā)酵合成PHA過程中無須通入空氣或氧氣，也無須提供嚴格的厭氧條件，即不用不斷通入氮氣，利用廉價碳源發(fā)酵，綜合降低了PHA的生產(chǎn)成本。
具體實施例方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中涉及分子生物學(xué)操作所用的酶，均購自TaKaRa公司，相應(yīng)的操作步驟完全按照相關(guān)的產(chǎn)品說明書進行；提取質(zhì)粒、回收DNA片段所用的試劑盒購自申能博彩公司，相應(yīng)的操作完全按照其產(chǎn)品說明書進行；實驗中涉及的測序工作交由奧科生物公司進行。
下述實施例中涉及的細菌培養(yǎng)基如下，如未特殊指明，培養(yǎng)基均用去離子水配制；如未特殊指明，培養(yǎng)基的滅菌條件均為115℃，20分鐘LB液體培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl，pH 7.0；LB-Amp液體培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl和100ug/mL氨芐青霉素；LB-Amp固體培養(yǎng)基含有15g/L瓊脂、5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl和100ug/mL氨芐青霉素；LB-Km液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl和50μg/mL硫酸卡那霉素，其余為水。
LB-Km固體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl和50μg/mL硫酸卡那霉素，其余為水。
LB-Km-Amp液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，50μg/mL硫酸卡那霉素和100μg/mL氨芐青霉素，其余為水。
LB-Km-Amp固體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，50μg/mL硫酸卡那霉素和100μg/mL氨芐青霉素，其余為水。
LBG-Amp液體培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl、20g/L葡萄糖和100ug/mL氨芐青霉素。
MM培養(yǎng)基包括以下四種組分組分I(20×)Na2HPO4·12H2O 180g/L，KH2PO430g/L；組分II(NH4)2SO40.5～2g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L；組分III(100×)Fe(III)-NH4-Citrate 5g/L，CaCl2·2H2O 2g/L；組分IV(1000×)ZnSO4·7H2O 100mg/L，MnCl2·4H2O 30mg/L，H3BO3300mg/L，CoCl2·6H2O 200mg/L，CuSO4·5H2O 10mg/L，NiCl2·6H2O20mg/L，NaMoO4·2H2O 30mg/L；其中組分III和組分IV為微量元素，用1mol/L的鹽酸溶液配制。
滅菌時，以組分II為基底，四種組分分開單獨滅菌，使用前按照倍數(shù)稀釋混合。
組分IV在滅菌前稀釋成100倍濃度的母液再滅菌。
本發(fā)明是利用缺氧誘導(dǎo)啟動子啟動聚羥基脂肪酸酯(PHA)合成基因表達生成聚羥基脂肪酸酯(PHA)；所述缺氧誘導(dǎo)啟動子包括乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase簡稱ADH)的啟動子(PadhE)(自GENBANK號為NC_000913的5′端第1294197-1294669位核苷酸)，丙酮酸-甲酸裂解酶(pyruvate formate lyase簡稱PFL)的啟動子(PpflC)(自GENBANK號為NC_000913的5′端第4143715-4144281位核苷酸)，乳酸脫氫酶(D-lactate dehydrogenase)的啟動子(自GENBANK號為NC_000913的5′端第1439568-1439878位核苷酸)，甘油脫氫酶(glycerol dehydrogenase簡稱GLD)的啟動子(自GENBANK號為NC_000913的5′端第4135492-4135955位核苷酸)，有氧呼吸調(diào)控蛋白(aerobic respiration control protein簡稱ARC)的啟動子(ParcA)(自GENBANK號為NC_000913的5′端第3348236-3348711位核苷酸)，以及其它在缺氧條件下能夠表達的啟動子；所述聚羥基脂肪酸酯合成基因可為合成短鏈PHA-聚羥基丁酸酯PHB的基因，如來源于羅氏真養(yǎng)菌Ralstonia eutropha的合成短鏈PHA的PHB合成基因phaCAB(自GENBANK號為AM260479的5′端第1557353-1561203位核苷酸)或者巨大產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes latus的PHB合成基因phaCAB(自GENBANK號為U47026的5′端第533-4336位核苷酸)；也可為合成中長鏈PHA的合成基因，如來源于假單胞菌屬Pseudomonas的中長鏈PHA合成基因phaC1ZC2(自GENBANK號為AY278219的5′端第1-4746位核苷酸)和phaC(自GENBANK號為NC_002947的5′端第1-1683位核苷酸)，還可為短鏈和中長鏈PHA共聚物合成基因，如來源于氣單胞菌屬Aeromonas的PHA合成基因phaPCJ(自GENBANK號為AY093685的5′端第292-2920位核苷酸)。
實施例1、利用乙醇脫氫酶啟動子(簡稱PadhE)和聚-3-羥基丁酸酯(PHB)合成的相關(guān)基因(phaCAB)生產(chǎn)PHA及其效果驗證下述實施例的方法利用乙醇脫氫酶啟動子(簡稱PadhE)和聚-3-羥基丁酸酯(PHB)合成的相關(guān)基因(phaCAB)為例子構(gòu)建缺氧誘導(dǎo)表達聚-3-羥基丁酸酯的重組載體pPadhE-CAB，通過電轉(zhuǎn)化的方式將pPadhE-CAB導(dǎo)入野生大腸桿菌E.coli K-12及其兩株乙酸合成途徑的缺失突變體E.coli ackA-和E.coli pta-得到三株缺氧誘導(dǎo)表達聚-3-羥基丁酸酯的工程菌。其中phaCAB來源于質(zhì)粒pBHR68(按照文獻(Spiekermann，P.，et al.，A sensitive，viable-colony staining method usingNile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoicacids and other lipid storage compounds.Arch Microbiol，1999.171(2)p.73-80)所述方法構(gòu)建)，乙醇脫氫酶啟動子(簡稱PadhE)來源于野生大腸桿菌Escherichia coli K-12(ATCC編號25404)基因組，使用原核表達載體pBluescriptII SK(-)(NCBI GenBank檢索號為X52330)作為出發(fā)載體。
一、缺誘導(dǎo)氧表達聚-3-羥基丁酸酯的工程菌的獲得1、缺氧誘導(dǎo)啟動子PadhE的克隆及其表達載體質(zhì)粒pPadhE的構(gòu)建1)大腸桿菌基因組的提取取1.5mL大腸桿菌Escherichia coli K-12(ATCC編號25404)37℃過夜培養(yǎng)物于離心管中，12000rpm離心1min，棄去上清，收集菌體。加入400uL裂解液(40mM Tris-醋酸，20mM醋酸鈉，1Mm EDTA，1％SDS，pH 7.8)混勻，置于37℃水浴1小時。然后加入5M的氯化鈉溶液200uL，混勻后于13000rpm離心15min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。加兩倍體積無水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3M，pH 5.8)，-20℃保存1小時后，13000rpm離心15min，棄上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室溫干燥后得到大腸桿菌基因組DNA，溶于50uL TE溶液中。
2)乙醇脫氫酶基因的啟動子的獲得在標(biāo)準的聚合酶鏈反應(yīng)條件下，以步驟1)中提取的大腸桿菌基因組為模板，以P1AAAACTCGAGGGTTAGCTCCGAAGCAAAAG(XhoI)和P2CAGCCATATGGCTCTCCTGATAATGTTAAAC(NdeI)為上下游引物擴增得到473bp的片段，經(jīng)測序表明，該片段含有乙醇脫氫酶基因的啟動子(具有GENBANK號為NC_000913的5′端第1294197-1294669位核苷酸序列)，用限制性內(nèi)切酶XhoI/NdeI酶切處理后，回收該473bp含有乙醇脫氫酶基因的啟動子的片段。
3)含有乙醇脫氫酶基因的啟動子的重組載體(pPadhE)的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶XhoI和NdeI對質(zhì)粒pBluescript II SK(-)(NCBI GenBank檢索號為X52330)進行雙酶切，回收酶切片段，將該片段與上述PCR獲得的乙醇脫氫酶基因的啟動子片段用T4 DNA連接酶進行連接，連接反應(yīng)完成后，將連接產(chǎn)物用電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coli JM109(ATCC編號53323)中，將轉(zhuǎn)化子涂布于LB-Amp固體培養(yǎng)平板上，在37℃、200rpm下培養(yǎng)12h；挑取在LB-Amp固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Amp液體培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶XhoI和NdeI對質(zhì)粒進行酶切鑒定，陽性質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后可產(chǎn)生大小約為2969bp及473bp的DNA片段，以pBluescript II SK(-)載體多克隆位點上游引物M13 primer對克隆得到的乙醇脫氫酶啟動子(PadhE)進行測序，確認其序列正確無誤，將經(jīng)檢測表明正確的含有PadhE的重組載體命名為pPadhE。
2、缺氧誘導(dǎo)表達聚羥基脂肪酸酯(PHA)的重組表達載體(pPadhE-CAB)的構(gòu)建在標(biāo)準的聚合酶鏈式反應(yīng)條件下，以質(zhì)粒pBHR68(按照文獻(Spiekermann，P.，et al.，A sensitive，viable-colony staining method using Nile red for directscreening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and otherlipid storage compounds.Arch Microbiol，1999.171(2)p.73-80)所述方法構(gòu)建)為模板，用P3AGCCATATGGCGACCGGCAAAGGC(NdeI)和P4CGCGGATTCGTCAGCCCATGTGCAGGC(BamHI)為上下游引物擴增出phaCAB基因，將擴增出的片段用NdeI和BamHI酶切處理后，回收得到3863bp的片段(具有自GenBank檢索號為NC_008313的5′端第1557353-1561203位核苷酸序列)，即為phaCAB基因片段；使用限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI酶切處理質(zhì)粒pPadhE，回收酶切后片段，將其與步驟1)中得到的phaCAB基因片段用T4連接酶進行連接；連接反應(yīng)完成后，將連接產(chǎn)物用電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coli JM109(ATCC編號53323)中，將轉(zhuǎn)化子涂布于LB-Amp固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h；從LB-Amp固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Amp液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h(37℃搖床，200rpm)，提取質(zhì)粒，并通過XhoI和BamHI酶切確認質(zhì)粒構(gòu)建是否成功；陽性質(zhì)粒經(jīng)上述步驟處理后，酶切產(chǎn)物為兩段DNA片斷，大小為4320bp及2969bp，將檢測表明正確的含有乙醇脫氫酶啟動子(PadhE)和PHA合成基因phaCAB的質(zhì)粒命名為pPadhE-CAB。
3、缺氧誘導(dǎo)表達聚羥基脂肪酸酯(PHA)的重組工程菌(E.coli K-12(pPadhE-CAB)、E.coli ackA-(pPadhE-CAB)或E.coli pta-(pPadhE-CAB))的獲得1)大腸桿菌乙酸合成途徑缺失突變體E.coli ackA-和E.coli pta-的獲得i)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備分別接種E.coliK-12新鮮種子液1mL至裝有100mL LB液體培養(yǎng)基，37℃下劇烈振蕩培養(yǎng)1.5-2小時至OD 600值達到0.4時，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻15分鐘；細胞在4℃、5000rpm下離心10分鐘，棄上清液；用滅菌的冰水重懸浮細胞，然后按照上面步驟重復(fù)離心，小心棄去上清液；用20mL滅菌的、預(yù)冷后的10％甘油重懸浮細胞，然后按照上面步驟離心，小心棄去上清液，用1ml預(yù)冷的10％甘油重懸浮細胞，即得到E.coli K-12的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)；將感受態(tài)細胞液分別按100uL等份裝入微量離心管，于-80℃保存；ii)將質(zhì)粒pKD46(GENBANK號為AY048746，大小為6329bp；按照文獻(Datsenko，K.A.and B.L.Wanner，One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A，2000.97(12)p.6640-5)所述的方法構(gòu)建)轉(zhuǎn)入E.coli K-12感受態(tài)得到含有pKD46的E.coli K-12；iii)以pKD13(GENBANK號為AY048744，大小為3434bp；按照文獻(Datsenko，K.A.and B.L.Wanner，One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A，2000.97(12)p.6640-5)所述的方法構(gòu)建)為模板，以P1GTGTCCCGTATTATTATGCTGATCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC和P2TTACTGCTGCTGTGCAGACTGTTTCCGGGGATCCGTCGACC為上下游引物擴增得到含有磷酸轉(zhuǎn)乙酸酶phosphotransacetylase基因(簡稱pta)同源序列(引物下劃線部分)的Km(卡那霉素)抗性基因片段，將PCR產(chǎn)物經(jīng)測序表明正確后回收；iV)通過電轉(zhuǎn)化的方式將上述PCR產(chǎn)物導(dǎo)入到含有質(zhì)粒pKD46的E.coli K-12中，通過存在于質(zhì)粒pKD46上的red重組酶作用將pta基因用Km抗性基因替換，因而重組子具有了Km(卡那霉素)抗性可在LB-Km-Amp固體培養(yǎng)基平板上篩選得到重組子(即E.coli K-12基因組中pta基因用Km抗性基因替換，并含有pta基因置換了Km抗性基因的質(zhì)粒pKD46的菌株)；將得到的重組子在無抗性的LB培養(yǎng)基中42℃培養(yǎng)24小時后，將重組子分別接種到LB-Km固體培養(yǎng)基和LB-Amp固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選有Km抗性而無Amp抗性的菌株(即E.coli K-12基因組中pta基因用Km抗性基因替換，而pta基因置換了Km抗性基因的質(zhì)粒pKD46丟失的菌株)，即為pta基因缺失突變體E.coli pta-。
V)以pKD13為模板，以P3ATGTCGAGTAAGTTAGTACTGGTTCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC和P4TCAGGCAGTCAGGCGGCTCTTTCCGGGGATCCGTCGACC為上下游引物擴增得到含有乙酸激酶acetate kinase基因(簡稱ackA)同源序列(引物下劃線部分)的Km抗性基因片段，將PCR產(chǎn)物經(jīng)測序表明正確后回收；Vi)通過電轉(zhuǎn)化的方式將PCR產(chǎn)物導(dǎo)入到含有質(zhì)粒pKD46的E.coli K-12中，通過存在于質(zhì)粒pKD46上的red重組酶作用將ackA基因用Km抗性基因替換，因而重組子具有了Km抗性可在Amp(氨卞青霉素)，Km雙抗平板上篩選得到重組子(即E.coli K-12基因組中ackA基因用Km抗性基因替換，并含有ackA基因置換了Km抗性基因的質(zhì)粒pKD46的菌株)；將得到的重組子在無抗性的LB培養(yǎng)基中42℃培養(yǎng)24小時后，將重組子分別接種到LB-Km固體培養(yǎng)基和LB-Amp固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選有Km抗性而無Amp抗性的菌株(即E.coli K-12基因組中ackA基因用Km抗性基因替換，而ackA基因置換了Km抗性基因的質(zhì)粒pKD46丟失的菌株)，即為ack基因缺失突變體E.coli ackA-。
2)從E.coli JM109(pPadhE-CAB)中提取新鮮質(zhì)粒pPadhE-CAB，分別取1L質(zhì)粒加入步驟1)制備的E.coli K-12、E.coli ackA-和E.coli pta-的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)中，冰上混合約5分鐘；轉(zhuǎn)移DNA/細胞混合物至冷卻后的1mm電穿孔容器(Bio-rad公司)中；對電穿孔容器進行脈沖(200歐姆，25μFd，1.25千伏)，立即添加800uL的LB至電穿孔容器中，37℃下培養(yǎng)細胞復(fù)蘇45分鐘后涂布LB-Amp固體培養(yǎng)基；從LB-Amp固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Amp液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h(37℃搖床，200rpm)，提取質(zhì)粒驗證轉(zhuǎn)化是否成功，正確的質(zhì)粒大小為7.308kb；通過XhoI和BamHI酶切進一步確認該質(zhì)粒，質(zhì)粒pPadhE-CAB經(jīng)上述步驟處理后，酶切產(chǎn)物為兩段DNA片段，大小為4320bp及2969bp，將經(jīng)檢測確認含有pPadhE-CAB質(zhì)粒的E.coli K-12命名為E.coli K-12(pPadhE-CAB)；將經(jīng)檢測確認含有pPadhE-CAB質(zhì)粒的E.coliackA-命名為E.coli ackA-(pPadhE-CAB)；或?qū)⒔?jīng)檢測確認含有pPadhE-CAB質(zhì)粒的E.coli pta-命名為E.coli pta-(pPadhE-CAB))。
二、工程菌E.coli K-12(pPadhE-CAB)厭氧培養(yǎng)生產(chǎn)PHA的搖瓶實驗將E.coli K-12(pPadhE-CAB)在LB-Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h(37℃搖床，200rpm)作為種子液；按體積比1％的接種量(即5×109cfu/L)將種子液接種到LBG-Amp液體培養(yǎng)基中，接種后隨即在搖瓶中加入20mL滅菌石蠟隔絕空氣，形成缺氧環(huán)境；分成兩組，分別在30℃或37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)48h。用氣相色譜法(Gaschromatography，GC)對發(fā)酵產(chǎn)物定性檢測，結(jié)果表明采用這種方法生產(chǎn)得到的PHA組分為聚β-羥基丁酸酯(PHB)。
按照下述方法進行菌體中PHA含量的氣相色譜法(Gas chromatography，GC)檢測氣相色譜分析使用安捷倫公司的HP 6890氣相色譜儀。色譜柱為HP-5毛細管柱，長30m，內(nèi)徑320μm，固定相為25nm厚的苯基甲基聚硅氧烷。檢測器為火焰離子化檢測器(Flame ionization detector，F(xiàn)ID)。用高純氮氣作為載氣，氫氣作為燃氣，空氣為助燃氣。
氣相色譜分析的條件如下柱溫80℃開始，停留1.5min；30℃/min的速率升溫到140℃，停留0min；40℃/min的速率升溫到220℃，停留0.5min；總計時間為6min。
柱壓10psi開始，停留1.5min；2.5psi/min的速率升壓到20psi，停留0.5min。(psi為壓力單位，即磅/平方英寸，1psi＝6.89476kPa)進樣口溫度為200℃，分流模式，分流比為30～100。
檢測器溫度為220℃，氫氣流量為30mL/min，空氣為400mL/min。
檢測步驟如下1)將上述發(fā)酵培養(yǎng)的E.coli K-12(pPadhE-CAB)菌液，離心(8000rpm，10min)收集細菌，然后用蒸餾水洗滌后再次離心；將細胞冰凍干燥，測定細胞干重(Cell dryweight，CDW)；2)取30-50mg左右干細胞于酯化管中，加入2mL酯化液(3％體積的濃硫酸溶于甲醇中，含1g/L苯甲酸作為內(nèi)標(biāo))、2mL氯仿，加蓋密閉，100℃烘箱中酯化4h；冷卻至室溫后，加入1mL蒸餾水，充分振蕩，靜置分層；待氯仿相與水相完全分離后，取氯仿相進行氣相色譜(GC)分析；3)根據(jù)樣品濃度的不同，進樣量為0.4～1uL，使用安捷倫公司的微量進樣器。采用內(nèi)標(biāo)法對PHA進行定量分析，根據(jù)峰面積定量。PHA含量定義為PHA對細胞干重的比值，PHA產(chǎn)量＝PHA含量×細胞干重。
菌體內(nèi)積累PHA的含量及細胞干重結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明，E.coli K-12(pPadhE-CAB)在上述缺氧條件下能夠合成PHB，且在37℃培養(yǎng)時PHB的含量可達細胞干重的50％。表1中剩余生物量為細胞干重扣除PHA的量。
表1.菌株E.coli K-12(pPadhE-CAB)缺氧培養(yǎng)積累PHA搖瓶結(jié)果

三、工程菌E.coli ackA-(pPadhE-CAB)缺氧培養(yǎng)生產(chǎn)PHA搖瓶實驗將E.coli ackA-(pPadhE-CAB)在LB-Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h(3℃搖床，200rpm)作為種子液；按體積比1％的接種量(即5×109cfu/L)將種子液接種到LBG-Amp液體培養(yǎng)基中，接種后隨即在搖瓶中加入20mL滅菌石蠟隔絕空氣，形成缺氧環(huán)境；分成兩組，分別在30℃或37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)48h。用氣相色譜法對發(fā)酵產(chǎn)物定性檢測，結(jié)果表明采用這種方法生產(chǎn)得到的PHA組分為聚β-羥基丁酸酯(PHB)。
按照實施例2中所述方法檢測進行菌體中PHA含量，每升發(fā)酵液積累PHA的含量及細胞干重檢測結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，E.coli ackA-(pPadhE-CAB)在上述缺氧條件下能夠合成PHB，且在37℃培養(yǎng)時PHB的含量可提高至細胞干重的58％。
表2菌株E.coli ackA-(pPadhE-CAB)缺氧培養(yǎng)積累PHA搖瓶結(jié)果


四、工程菌E.coli pta-(pPadhE-CAB)缺氧培養(yǎng)生產(chǎn)PHA的搖瓶實驗將E.coli pta-(pPadhE-CAB)在LB-Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h(3℃搖床，200rpm)作為種子液；按體積比1％的接種量(即5×109cfu/L)將種子液接種到LBG-Amp液體培養(yǎng)基中，接種后隨即在搖瓶中加入20mL滅菌石蠟隔絕空氣，形成缺氧環(huán)境；分成兩組，分別在30℃或37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)48h。用氣相色譜法對發(fā)酵產(chǎn)物定性檢測，結(jié)果表明采用這種方法生產(chǎn)得到的PHA組分為PHB。
按照實施例2中所述方法檢測進行菌體中PHA含量，菌體內(nèi)積累PHA的含量及細胞干重檢測結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，E.coli paa-(pPadhE-CAB)在上述缺氧條件下能夠合成PHB，且在37℃培養(yǎng)時PHB的含量可進一步提高至細胞干重的65％。
表3菌株E.coli pta-(pPadhE-CAB)缺氧培養(yǎng)積累PHA搖瓶實驗結(jié)果

實施例2、利用丙酮酸-甲酸裂解酶的啟動子和phaCAB基因串聯(lián)在缺氧條件下生產(chǎn)PHA及其效果驗證利用丙酮酸-甲酸裂解酶啟動子(簡稱PpflC)和聚-3-羥基丁酸酯(PHB)合成的相關(guān)基因(phaCAB)為例子構(gòu)建缺氧誘導(dǎo)表達聚-3-羥基丁酸酯的重組載體pPpflC-CAB，通過電轉(zhuǎn)化的方式將pPpflC-CAB導(dǎo)入野生大腸桿菌E.coli K-12及其兩株乙酸合成途徑的缺失突變體E.coli ackA-和E.coli pta-得到三株缺氧誘導(dǎo)表達聚-3-羥基丁酸酯(PHB)的工程菌。其中phaCAB來源于質(zhì)粒pBHR68(按照文獻(Spiekermann，P.，et al.，A sensitive，viable-colony staining method using Nile red fordirect screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids andother lipid storage compounds.Arch Microbiol，1999.171(2)p.73-80)所述方法構(gòu)建)，丙酮酸-甲酸裂解酶啟動子(簡稱PpflC)來源于野生大腸桿菌Escherichia coli K-12(ATCC編號25404)基因組，使用原核表達載體載體pBluescript II SK(-)(NCBI GenBank檢索號為X52330)作為載體。
一、缺氧誘導(dǎo)表達聚羥基脂肪酸酯(PHA)的重組工程菌的獲得1、丙酮酸-甲酸裂解酶啟動子(簡稱PpflC)DNA片段的獲得以大腸桿菌Escherichia coli K-12(ATCC編號25404)基因組為模板，在標(biāo)準的聚合酶鏈式反應(yīng)條件下，以P1AAAACTCGAGAAAAGTCCGCGCTCGCTTA(XhoI)和P2CAGCCATATGCCTGGATCTCCTTCGAC(NdeI)為上下游引物擴增得到567bp的片段，經(jīng)測序表明，該片段含有丙酮酸-甲酸裂解酶基因的啟動子(具有自GENBANK號NC_000913的5′端第4143715-4144281位核苷酸序列)，用限制性內(nèi)切酶XhoI/NdeI酶切處理后，回收該567bp含有丙酮酸-甲酸裂解酶基因的啟動子的片段。
2、缺氧誘導(dǎo)表達聚羥基脂肪酸酯(PHA)的重組表達載體(pPpflC-CAB)的構(gòu)建使用限制性內(nèi)切酶XhoI/NdeI酶切處理質(zhì)粒pPadhE-CAB(實施例1步驟一中的步驟2制備)，使其中含有的乙醇脫氫酶啟動子(PadhE)切掉。將上述得到的含有丙酮酸-甲酸裂解酶基因的啟動子的片段用XhoI/NdeI雙酶切后，與去掉乙醇脫氫酶啟動子(PadhE)的pPadhE-CAB連接，使丙酮酸-甲酸裂解酶基因的啟動子(PpflC)與丙酮酸-甲酸裂解酶基因的啟動子(PpflC)替換；測序驗證，將驗證表明含有丙酮酸-甲酸裂解酶基因的啟動子(PpflC)片段和PHA合成基因phaCAB的質(zhì)粒命名為pPpflC-CAB。
3、工程菌株E.coli K-12(pPpflC-CAB)、E.coli ackA-(pPpflC-CAB)和E.colipta-(pPpflC-CAB)的獲得按照實施例1的步驟一中的步驟3所述方法將質(zhì)粒pPpflC-CAB分別導(dǎo)入E.coliK-12、E.coli ackA-和E.coli pta-中，得到工程菌株E.coli K-12(pPpflC-CAB)、E.coli ackA-(pPpflC-CAB)和E.coli pta-(pPpflC-CAB)。
二、工程菌E.coli K-12(pPpflC-CAB)、E.coli ackA-(pPpflC-CAB)和E.colipta-(pPpflC-CAB)缺氧培養(yǎng)生產(chǎn)PHA的搖瓶實驗按照實施例1的步驟一中步驟2所述方法對上述三株菌進行厭氧搖瓶發(fā)酵實驗和產(chǎn)物PHA的氣相色譜檢測。結(jié)果表明，工程菌E.coli K-12(pPpflC-CAB)、E.coliackA-(pPpflC-CAB)和E.coli pta-(pPpflC-CAB)采用這種方法生產(chǎn)得到的PHA組分均為PHB。其中E.coli K-12(pPpflC-CAB)可以在菌體中積累44％的PHB，在突變體工程菌E.coli ackA-(pPpflC-CAB)和E.coli pta-(pPpflC-CAB)中，菌體內(nèi)PHB的含量可分別提高至54％和57％。
實施例3、利用甘油脫氫酶(glycerol dehydrogenase簡稱GLD)的啟動子(簡稱PgldA)和phaC2基因串聯(lián)在缺氧條件下生產(chǎn)PHA下述方法利用甘油脫氫酶啟動子(簡稱PgldA)和低底物特異性PHA合成基因(phaC2)(GENBANK檢索號AY278219的5′端第2873-4555位核苷酸序列)為例子構(gòu)建缺氧誘導(dǎo)表達聚-3-羥基丁酸酯的重組載體pPgld-phaC2，通過電轉(zhuǎn)化的方式將pPgld-phaC2導(dǎo)入野生大腸桿菌E.coli K-12及羅氏真養(yǎng)菌Ralstonia eutropha合成缺陷型突變株Ralstonia eutropha PHB-4中得到大腸桿菌工程菌E.coli K-12(pPgld-phaC2)或羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pPgld-phaC2)。其中低底物特異性PHA合成基因(phaC2)來自Pseudomonas stutzeri 1317(Chen JY，Liu T，ZhengZ，et al.Polyhydroxyalkanoate synthases PhaC1and PhaC2 from Pseudomonasstutzeri 1317 had different substrate specificities，F(xiàn)EMS MICROBIOLOGYLETTERS 234(2)231-237MAY 15 2004)；突變體R.eutropha PHB-4購自德國微生物菌種公司(DSM 541)。
一、缺氧誘導(dǎo)表達聚羥基脂肪酸酯(PHA)的重組工程菌的獲得1、缺氧誘導(dǎo)表達聚羥基脂肪酸酯(PHA)的重組表達載體pPgld-phaC2的構(gòu)建1)甘油脫氫酶啟動子(簡稱PgldA)DNA片段的獲得以大腸桿菌Escherichia coli K-12(ATCC編號25404)基因組為模板，在標(biāo)準的聚合酶鏈式反應(yīng)條件下，以P1AAAAATCGATAGGATAAGTAAGCTGCACA(ClaI)和P2CAGCAAGCTTACCTACTCCAAACTCCCG(HindIII)為上下游引物擴增得到464bp的片段，經(jīng)測序表明，該片段含有甘油脫氫酶的啟動子(具有自GENBANK號為NC_000913的5′端第4135492-4135955位核苷酸序列)。
用限制性內(nèi)切酶ClaI和HindIII雙酶切上述獲得的含有甘油脫氫酶的啟動子的片段插入到含有phaC2的質(zhì)粒pCJY08(質(zhì)粒pCJY08來源于廣范宿主載體pBBR1MCS-2(NCBI GenBank號為U23751)，按照文獻(Chen JY，Song G and Chen GQ.A LowerSpecificity PhaC2 Synthase from Psuedomonas stutzeri Catalyses theProduction of Copolyesters Consisting of Short-Chain-Length andMedium-Chain-Length 3-Hydroxyalkanoates.Antonie van Leewenhoek 89(2006)157-167)所述的方法構(gòu)建)經(jīng)過ClaI和HindIII酶切位點之間，并測序檢測，將經(jīng)測序表明含有甘油脫氫酶啟動子和phaC2基因的重組質(zhì)粒命名為pPgldA-phaC2。
2、大腸桿菌工程菌E.coli K-12(pPgldA-phaC2)和羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)的獲得將質(zhì)粒pPgld-phaC2用電轉(zhuǎn)化的方式分別導(dǎo)入大腸桿菌E.coli K-12及羅氏真養(yǎng)菌合成缺陷型突變株R.eutropha PHB-4中，將轉(zhuǎn)入pPgld-phaC2的大腸桿菌E.coli K-12命名為大腸桿菌工程菌E.coli K-12(pPgldA-phaC2)和將轉(zhuǎn)入pPgld-phaC2的羅氏真養(yǎng)菌命名為羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)。
二、大腸桿菌工程菌E.coli K-12(pPgldA-phaC2)和羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)生產(chǎn)PHA的搖瓶發(fā)酵實驗分別對大腸桿菌工程菌E.coli K-12(pPgldA-phaC2)和羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)進行厭氧搖瓶發(fā)酵實驗，大腸桿菌工程菌E.coli K-12(pPgldA-phaC2)的搖瓶發(fā)酵實驗同實施例1的步驟一中步驟2所述方法；羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)的厭氧搖瓶發(fā)酵是將羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)按照5×109cfu/L的量接入含有20g/L葡萄糖酸鈉和8g/L辛酸鈉的MM培養(yǎng)基中，在30℃靜置培養(yǎng)48h。
發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，分別收集菌體并進行產(chǎn)物PHA的氣相色譜檢測。結(jié)果表明，大腸桿菌工程菌E.coli K-12(pPgldA-phaC2)和羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)生產(chǎn)得到的PHA組分均為短鏈共聚PHA或中長鏈共聚PHA，其中4碳組分約占80％，其余為6碳、8碳、10碳和12碳組分，含量從2％到12％不等。在大腸桿菌工程菌E.coli K-12(pPgldA-phaC2)中PHA的總積累量達到38.4％，在羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pPgldA-phaC2)中PHA的總積累量達到42.5％。
實施例4、乳酸脫氫酶啟動子(簡稱PldhA)與phaPCJ基因串聯(lián)在缺氧條件下生產(chǎn)PHA及其效果實驗利用乳酸脫氫酶啟動子(簡稱PldhA)和來源于嗜水氣單胞菌屬Aeromonas的PHA合成基因phaPCJ(自GENBANK號為AY093685的5′端第292-2920位核苷酸)構(gòu)建缺氧誘導(dǎo)表達聚-3-羥基丁酸酯的重組載體pPldh-PCJ，通過結(jié)合轉(zhuǎn)化的方式將pPldh-PCJ導(dǎo)入嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)中，并在缺氧條件下合成PHA。
1、重組載體pMCS-Pldh-PCJ的構(gòu)建1)乳酸脫氫酶啟動子(簡稱PldhA)DNA片段的獲得以大腸桿菌Escherichia coli K-12(ATCC編號25404)基因組為模板，在標(biāo)準的聚合酶鏈式反應(yīng)條件下，以P1CAGCAAGCTTCACATGCTGCCGGAAATC(HindIII)和P2AAAAGAATTCATCTTGCCGCTCCCCTGC(EcoRI)為上下游引物擴增得到311bp的片段，經(jīng)測序表明，該片段含有甘油脫氫酶的啟動子(具有自GENBANK號為NC_000913的5′端第1439568-1439878位核苷酸序列)。
2)生產(chǎn)PHA的重組表達載體的獲得用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI酶切處理上述得到的含有甘油脫氫酶的啟動子的片段后，插入到載體pBBR1MCS-2(NCBI GenBank號為U23751)的HindIII和EcoRI酶切位點之間，得到重組載體，測序驗證，將經(jīng)測序表明含有甘油脫氫酶的啟動子的重組載體命名為pMCS-ldh。
以質(zhì)粒pQd-APCJ(按照(Qiu YZ，Han J，Guo JJ，Chen GQ.Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)from gluconate and glucose byrecombinant Aeromonas hydrophila and Pseudomonas putida.Biotech Lett 27(2005)1381-1386)所述的方法構(gòu)建)為模板，在標(biāo)準的聚合酶鏈式反應(yīng)條件下，以P1AGCTGAATTCATGAATATGGACGTGATCA(EcoRI)和P2AAAAGGATCCTTAAGGCAGCTTGACCAC(BamHI)為上下游引物擴增得到2629bp的片段，經(jīng)測序表明，該片段含有Aeromonas hydrophila 4AK4的PHA合成基因phaPCJ(具有自GENBANK號為AY093685的5′端第292-2920位核苷酸序列)，用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI雙酶切處理后連接到2)中得到的中間質(zhì)粒pMCS-ldh的BamHI和EcoRI酶切位點之間，測序驗證，將含有乳酸脫氫酶啟動子(簡稱PldhA)和來源于嗜水氣性單胞菌Aeromonas hydrophila 4AK4的PHA合成基因phaPCJ的重組載體命名為pMCS-Pldh-PCJ。
2、工程菌Aeromonas hydrophila(pMCS-Pldh-PCJ)的獲得及搖瓶實驗1)將構(gòu)建的載體質(zhì)粒pMCS-Pldh-PCJ用電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到E.coli S17-1(ATCC編號47055)中，并將轉(zhuǎn)化子涂布于LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，得到菌株E.coli S17-1(pMCS-Pldh-PCJ)；2)挑取陽性單克隆E.coli S17-1(pMCS-Pldh-PCJ)，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，同時將Aeromonas hydrophila 4AK4菌株(Shaoping Ouyang，Jing Han，Yuanzheng Qiu，Lingfang Qin，Song Chen，QiongWu，Michael L.Leski，Guoqiang Chen.
Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)Production in RecombinantAeromonas hydrophila 4AK4Harboring phbA，phbB and vgb Genes.MacromolecularSymposia 224(2005)21-34)接種到LB液體培養(yǎng)基中，在30℃、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，然后各取1mL上述兩種菌株的培養(yǎng)液至無菌小管中，8000rpm離心2分鐘，棄去上清液，再各加入0.5mL無菌LB液體培養(yǎng)基，重懸細菌后，將兩管重懸菌液混合，置于30℃培養(yǎng)箱中1小時，用無菌接種環(huán)通過劃線法將一環(huán)混合菌液涂布于LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；3)挑取在LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種至LB-Km-Amp液體培養(yǎng)基中，在30℃、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h后，提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶BamH I對質(zhì)粒進行酶切鑒定，陽性質(zhì)粒經(jīng)酶切后可產(chǎn)生大小約為5144bp及2940bp的DNA片斷，將正確轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒pMCS-Pldh-PCJ的重組嗜水氣性單胞菌命名為Aeromonas hydrophila(pMCS-Pldh-PCJ)。
4)對工程菌Aeromonas hydrophila(pMCS-Pldh-PCJ)行厭氧搖瓶發(fā)酵實驗，培養(yǎng)基組分為礦物培養(yǎng)基(MM培養(yǎng)基)加8g/L月桂酸，培養(yǎng)方法為30℃靜置培養(yǎng)48小時。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體并進行產(chǎn)物PHA的氣相色譜檢測。結(jié)果表明，采用這種方法生產(chǎn)得到的PHA組分為4碳或6碳共聚PHA(簡稱PHBHHx)，其中4碳組分約占85.3％，6碳組分含量約占14.7％。在嗜水氣性單胞菌工程菌Aeromonashydrophila(pMCS-Pldh-PCJ)中PHA的積累量達到35.5％。
實施例5、有氧呼吸調(diào)控蛋白的啟動子(簡稱ParcA)與假單胞菌的中長鏈PHA合成基因phaC1ZC2串聯(lián)在缺氧條件下生產(chǎn)PHA利用有氧呼吸調(diào)控蛋白啟動子(簡稱ParcA)和來源于假單胞菌Pseudomonasputida KT2440的PHA合成基因phaC1ZC2(自GENBANK號為NC_002947的5′端第1-1683位核苷酸)構(gòu)建缺氧誘導(dǎo)表達中長鏈PHA的重組載體pMCS-arcA-phaC，通過結(jié)合轉(zhuǎn)化的方式將pMCS-arcA-phaC導(dǎo)入羅氏真養(yǎng)菌R.eutropha合成缺陷型突變株R.eutropha PHB-4(購自德國微生物菌種公司(DSM 541))中得到羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-phaC)，并在缺氧條件下合成中長鏈PHA。
具體獲得方法如下所述1、重組載體pMCS-arcA-phaC的構(gòu)建1)有氧呼吸調(diào)控蛋白啟動子(簡稱ParcA)DNA片段的獲得以大腸桿菌Escherichia coli K-12(ATCC編號25404)基因組為模板，在標(biāo)準的聚合酶鏈式反應(yīng)條件下，以P1CAGCAAGCTTATCGGCCTGGGCCAGAGG(HindIII)和P2AAAAGAATTCCCCCGGCTAGACCGGGGT(EcoRI)為上下游引物擴增得到475bp的片段，經(jīng)測序表明，該片段含有氧呼吸調(diào)控蛋白啟動子(簡稱ParcA)(具有自GENBANK號為NC_000913的5′端第3348236-3348711位核苷酸序列)。
2)生產(chǎn)PHA的重組表達載體的獲得用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切處理上述獲得的含有氧呼吸調(diào)控蛋白啟動子的片段，回收后，插入到pBBR1MCS-2(NCBI GenBank號為U23751)的HindIII和EcoRI酶切位點之間，測序驗證，將經(jīng)測序表明含有氧呼吸調(diào)控蛋白啟動子片段的重組載體命名為pMCS-acrA。
以Pseudomonas putida KT2440(ATCC編號47054)的基因組為模板，以P1AGCTGAATTCATGACAGACAAACCGGCCA(EcoRI)和P2AAAAGGATCCTCATCGGGTCAGCACGTA(BamHI)為上下游引物擴增得到1683bp的片段，經(jīng)測序表明，該片段含有假單胞菌Pseudomonas putida KT2440的PHA合成基因phaC1ZC2(自GENBANK號為NC_002947的5′端第1-1683位核苷酸)，將該片段用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI酶切處理后連接到中間質(zhì)粒pMCS-acrA的BamHI和EcoRI酶切位點之間，測序驗證，將測序表明含有氧呼吸調(diào)控蛋白啟動子和來源于假單胞菌屬Pseudomonas的中長鏈PHA合成基因的重組載體命名為pMCS-arcA-phaC。
2、工程菌羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-phaC)的獲得及搖瓶實驗結(jié)果將質(zhì)粒pMCS-arcA-phaC用電轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入羅氏真養(yǎng)菌合成缺陷型突變株R.eutropha PHB-4中得到羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-phaC)。將羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-phaC)接入到含有8g/L月桂酸的MM培養(yǎng)基中在30℃靜置培養(yǎng)48小時。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體并進行產(chǎn)物PHA的氣相色譜檢測。結(jié)果表明，羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-phaC)生產(chǎn)得到的PHA組分為中長鏈PHA(簡稱mcl-PHA)，其中6碳PHA組分約占13.7％，8碳PHA組分約占45.3％，10碳PHA組分約占23.6％，12碳PHA組分約占17.4％。在羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-phaC)中PHA的總積累量為38.4％。
實施例6、有氧呼吸調(diào)控蛋白的啟動子(簡稱ParcA)與巨大產(chǎn)堿桿菌的PHB合成基因phaCAB串聯(lián)在缺氧條件下生產(chǎn)PHA將有氧呼吸調(diào)控蛋白的啟動子與來自巨大產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes latus DSM1124(購自德國微生物菌種公司)的PHB合成基因phaCAB(自GENBANK號為U47026的5′端第533-4336位核苷酸)串聯(lián)在廣泛宿主載體pBBR1MCS-2(NCBI GenBank號為U23751)上，構(gòu)成載體pMCS-arcA-CAB。將載體pMCS-arcA-CAB分別導(dǎo)入巨大產(chǎn)堿桿菌A.latus和羅氏真養(yǎng)菌合成缺陷型突變株R.eutropha PHB-4中得到巨大產(chǎn)堿桿菌工程菌A.latus(pMCS-arcA-CAB)或羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-CAB)。
具體獲得方法如下所述1、重組載體pMCS-arcA-CAB的構(gòu)建以巨大產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes latus DSM 1124(購自德國微生物菌種公司)的基因組為模板，以P1AGCTGAATTCGTGACCCTGCAAGCCATT(EcoRI)和P2AAAAGGATCCTCAGCCCATGTGCAGGCC(BamHI)為上下游引物擴增得到3804bp的片段，經(jīng)測序表明，該片段含有巨大產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes latus的PHB合成基因(自GENBANK號為U47026的5′端第533-4336位核苷酸)，用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI雙酶切處理后連接到實施例5中得到的含有有氧呼吸調(diào)控蛋白啟動子的中間質(zhì)粒pMCS-acrA BamHI和EcoRI酶切位點之間，測序驗證，將經(jīng)測序表明含有氧呼吸調(diào)控蛋白啟動子和來源于巨大產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes latus的PHB合成基因phaCAB的重組載體pMCS-arcA-CAB。
2、工程菌巨大產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes latus(pMCS-arcA-CAB)和羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-CAB)的獲得及搖瓶實驗結(jié)果通過電轉(zhuǎn)化的方式將載體pMCS-arcA-CAB分別導(dǎo)入巨大產(chǎn)堿桿菌A.latus DSM1124(購自德國微生物菌種公司)(缺氧下不能合成PHA)和羅氏真養(yǎng)菌合成缺陷型突變株R.eutropha PHB-4(購自德國微生物菌種公司(DSM 541))中，將轉(zhuǎn)入pMCS-arcA-CAB的巨大產(chǎn)堿桿菌A.latus命名為巨大產(chǎn)堿桿菌工程菌A.latus(pMCS-arcA-CAB)，將轉(zhuǎn)入pMCS-arcA-CAB的羅氏真養(yǎng)菌命名為羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-CAB)。將巨大產(chǎn)堿桿菌工程菌A.latus(pMCS-arcA-CAB)或羅氏真養(yǎng)菌工程菌R.eutropha(pMCS-arcA-CAB)分別按照5×109cfu/L的量接種于含有8g/L月桂酸的MM培養(yǎng)基中在30℃靜置培養(yǎng)48小時。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體并進行產(chǎn)物PHA的氣相色譜檢測。結(jié)果表明，采用這種方法在兩株工程菌中得到的PHA組分均為PHB。在巨大產(chǎn)堿桿菌A.latus(pMCS-arcA-CAB)中PHB的積累量可以達到菌體干重的63.8％；在羅氏真養(yǎng)菌R.eutropha(pMCS-arcA-CAB)中PHB的積累量可以達到菌體干重的54.2％。
權(quán)利要求
1.一種缺氧誘導(dǎo)表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌，是將含有缺氧誘導(dǎo)啟動子和串聯(lián)于所述缺氧誘導(dǎo)啟動子下游的聚羥基脂肪酸酯合成基因的重組表達載體轉(zhuǎn)入到宿主菌后得到的重組菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于所述缺氧誘導(dǎo)啟動子具有自GENBANK號為NC_000913的5′端第1294197-1294669位核苷酸序列、自GENBANK號為NC_000913的5′端第4143715-4144281位核苷酸序列、自GENBANK號為NC_000913的5′端第1439568-1439878位核苷酸序列、自GENBANK號為NC_000913的5′端第4135492-4135955位核苷酸序列或自GENBANK號為NC_000913的5′端第3348236-3348711位核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程菌，其特征在于所述聚羥基脂肪酸酯合成基因具有自GENBANK號為AM260479的5′端第1557353-1561203位的核苷酸序列、自GENBANK號為U47026的5′端第533-4336位核苷酸、自GENBANK號為AY278219的5′端第1-4746位的核苷酸序列、GENBANK號為NC_002947的5′端第1-1683位核苷酸序列或自GENBANK號為AY093685的5′端第292-2920位的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的工程菌，其特征在于所述宿主菌為大腸桿菌、巨大產(chǎn)堿桿菌、羅氏真養(yǎng)菌、假單胞菌或嗜水性氣單孢菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的工程菌，其特征在于當(dāng)所述宿主菌為大腸桿菌、羅氏真養(yǎng)菌時，所述重組表達載體的出發(fā)載體為pBluescript II SK(-)或pBBR1MCS-2；當(dāng)所述宿主菌為巨大產(chǎn)堿桿菌、假單胞菌或嗜水性氣單孢菌時，所述重組表達載體的出發(fā)載體為pBBR1MCS-2。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的工程菌，其特征在于所述大腸桿菌為大腸桿菌K-12、E.coli ackA-或E.coli pta-。
7.一種生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，是將權(quán)利要求1-6任一項所述的工程菌，在缺氧條件下，發(fā)酵得到聚羥基脂肪酸酯。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述缺氧條件為無氧或微氧條件；當(dāng)所述工程菌的宿主菌為大腸桿菌時，所述發(fā)酵溫度為28-38℃；優(yōu)選為37℃；當(dāng)所述工程菌的宿主菌為巨大產(chǎn)堿桿菌、羅氏真養(yǎng)菌、假單胞菌或嗜水性氣單孢菌時，所述發(fā)酵溫度為30-35℃。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述大腸桿菌工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為含有3-7g/L酵母提取物、6-12g/L蛋白胨、6-12g/L NaCl、10-30g/L葡萄糖的培養(yǎng)基；所述大腸桿菌工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl、20g/L葡萄糖和100ug/mL氨芐青霉素；所述假單胞菌工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基選自下述三種培養(yǎng)基中的任意一種1)含4-6g/L酵母提取物，8-12g/L蛋白胨，8-12g/L NaCl，18-22g/L葡萄糖的培養(yǎng)基；2)含4-6g/L酵母提取物，8-12g/L蛋白胨，40-60g/L葡萄糖，5-7g/L(NH4)2SO4；MgSO40.38-0.45g/L，9.6-9.7g/L Na2HPO4·12H2O，1.2-1.8g/LKH2PO4，8-12mL/L微量元素溶液I，0.8-1.2mL/L微量元素溶液II的培養(yǎng)基；所述微量元素溶液I為含4-6g/L Fe(III)-NH4-Citrate，1.8-2.2g/L CaCl2·2H2O，0.4-0.6Mol/L的HCl溶液；所述微量元素溶液II為含80-120mg/L ZnSO4·7H2O，25-35mg/L MnCl2·4H2O，280-320mg/L H3BO3，180-220mg/L CoCl2·6H2O，8-12mg/L CuSO4·5H2O，18-22mg/L NiCl2·6H2O，28-32mg/L NaMoO4·2H2O，0.4-0.6Mol/L的HCl溶液；3)含7-9g/L月桂酸，1.8-2.2g/L(NH4)2SO4，0.38-0.45g/L MgSO4；9.6-9.7g/L Na2HPO4·12H2O；1.2-1.8g/L KH2PO4，8-12mL/L微量元素溶液I，0.8-1.2mL/L微量元素溶液II的培養(yǎng)基；所述微量元素溶液I為含4-6g/L Fe(III)-NH4-Citrate，1.8-2.2g/L CaCl2·2H2O，0.4-0.6Mol/L的HCl溶液；所述微量元素溶液II為含80-120mg/L ZnSO4·7H2O，25-35mg/L MnCl2·4H2O，280-320mg/L H3BO3，180-220mg/L CoCl2·6H2O，8-12mg/L CuSO4·5H2O，18-22mg/L NiCl2·6H2O，28-32mg/LNaMoO4·2H2O，0.4-0.6Mol/L的HCl溶液；所述巨大產(chǎn)堿桿菌工程菌、羅氏真養(yǎng)菌工程菌和嗜水氣單胞菌工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為添加有長鏈脂肪酸和/或葡萄糖酸鈉的礦物培養(yǎng)基；所述礦物培養(yǎng)基為含9g/L Na2HPO4·12H2O，1.5g/L KH2PO4，0.5～2g/L(NH4)2SO4，0.4g/L MgSO4·7H2O，0.05g/L Fe(III)-NH4-Citrate，0.02g/LCaCl2·2H2O，0.1mg/L ZnSO4·7H2O，0.03mg/L MnCl2·4H2O，0.3mg/L H3BO3，0.2mg/L CoCl2·6H2O，0.01mg/L CuSO4·5H2O，0.02mg/L NiCl2·6H2O，0.03mg/L NaMoO4·2H2O的溶液；
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有30-50μg/mL硫酸卡那霉素和/或60-100μg/mL氨芐青霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法及其專用工程菌。該工程菌，是將含有串聯(lián)的缺氧誘導(dǎo)啟動子與聚羥基脂肪酸酯合成基因的重組表達載體轉(zhuǎn)入宿主菌后得到的重組菌。該生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法是將所述的工程菌，在缺氧條件下，發(fā)酵得到聚羥基脂肪酸酯。本發(fā)明的方法，在發(fā)酵合成PHA過程中無須通入空氣或氧氣，也無須提供嚴格的厭氧條件，即不用不斷通入氮氣，利用廉價碳源發(fā)酵，綜合降低了PHA的生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P7/64GK101058799SQ20071009851
公開日2007年10月24日 申請日期2007年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月19日
發(fā)明者陳國強, 魏曉星, 吳瓊 申請人:清華大學(xué) 被以下專利引用 (1),