專利名稱：：作為妊娠相關病癥的診斷標志物的循環(huán)mRNA的制作方法作為妊娠相關病癥的診斷標志物的循環(huán)mRNA相關申請本申請要求在2003年1月17日提交的美國臨時申請第60,440,906號的優(yōu)先權(quán)，本發(fā)明引用其全文作為參考。發(fā)明背景通常采用諸如絨毛膜取樣(CVS)或羊膜穿刺術(shù)的方法從胎兒中分離細胞來進行產(chǎn)前診斷。盡管操作非常仔細，但這些常規(guī)方法均是侵襲性的，并對母體和胎兒有一定的風險(Taboretal.，丄awc^1:1287-1293,1986)。在發(fā)現(xiàn)母體循環(huán)中存在一些類型的胎兒細胞(Johansenetal.，D/ag".15:921-931，1995)之后，更重要的是在發(fā)現(xiàn)母體血漿和血清中能夠檢測到循環(huán)的無細胞的胎兒DNA(Loetal.,Lancet350:485-487，1997)之后，已經(jīng)開發(fā)了替代這些侵襲性方法的產(chǎn)前篩查方法，例如檢測胎兒異常的方法。已證明，母體血液中的胎兒DNA的含量足夠用于遺傳學分析，與分離和富集胎兒細胞的必需步驟相比，并不需要對所述血漿或血清進行復雜的處理。利用聚合酶鏈式反應(PCR)為基礎的技術(shù)，通過檢測母體血液中的胎兒DNA來實現(xiàn)胎兒rhesusD(RhD)基因型的檢測(Loetal.,TV.五"g/.J.339:1734-1738,1998)、胎兒性別的確定(Loetal.,//wm.G匿Z.90:483-488,1993)、以及一些胎兒病癥的診斷(Amicuccietal"C//".CA亂46:301-302,2000;Saitoetal"丄騰W356:1170,2000;及Chiuetal.,丄朋c"360:998-1000，2002)。此外，也有報道稱在先兆子癇(Loetal.,C"".CA亂45:184-188,1999和Zhongetal"無丄G戸co/.184:414-419,2001)、胎兒21號染色體三體性(trisomy)(Loetal"C//w.CA謹.45:1747-1751,1999和Zhongetal.7V函/.20:795-798，2000)和妊娠劇吐癥(hyperemesisgravidarum)(Sekizawaetal"C"",CZem.47:2164-2165,2001)的母體血漿/血清中胎兒DNA含量異常的報道。美國專利第6,258,540號也公開了用于產(chǎn)前遺傳分析的母體血液中胎兒核酸的才企測。在分析胎兒DNA時，檢測者通常利用僅出現(xiàn)在男性胎兒中的Y染色體標志物作為胎兒的特異性標志物。這種方法使此項技術(shù)的應用局限于50%的妊娠婦女，這些妊娠婦女懷有男性胎兒。此外，其它遺傳多態(tài)性的利用，也增加了胎兒DNA為基礎的分析的復雜性。母體血漿中胎兒RNA的發(fā)現(xiàn)提供了超越這些限制的可能的新方法(Poonetal.，C7/".C力ew,46:1832-1834,2000).最近，美國專利申請第09/876,005號公開了以母體血液中胎兒RNA檢測為基礎的非侵襲性技術(shù)。本發(fā)明第一次公開了在母體血液中出現(xiàn)的某些mRNA種類的含量能夠用作診斷、監(jiān)測或預測諸如先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產(chǎn)的妊娠相關病癥、以及檢測妊娠的標志物，所述mRNA種類包括編碼人絨毛膜促性腺激素15亞基(hCG-15)、人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(hCRH)、人胎盤促乳素(hPL)、KiSS-l轉(zhuǎn)移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、月臺盤特異1(PLAC1)或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(0八？011)的mRNA。發(fā)明概述本發(fā)明提供了通過才企測母體血液中的一種或多種循環(huán)mRNA的含量來診斷、監(jiān)測或預測諸如先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產(chǎn)的妊娠相關病癥的新方法。本發(fā)明還提供了基于相同方法學的檢測婦女妊娠的方法。所述的mRNA可以編碼諸如人絨毛膜促性腺激素)3亞基(hCG-)8)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(hCRH)、KiSS-l轉(zhuǎn)移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的胎兒或母體來源的蛋白。同時也提供本發(fā)明的一個方面涉及診斷、監(jiān)測或預測妊娠婦女的先兆子癇的方法。此方法包括多個步驟第一步是定量測定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定mRNA種類的含量。所述mRNA可編碼hCG-/5、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。第二步是將第一步獲得的mRNA含量與代表正常非先兆子癇的婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照進行比較。所述mRNA水平的增加或降低表明存在先兆子癇或發(fā)展為所述疾病狀態(tài)的風險增加。在一些實施方案中，此方法中用作標志物的mRNA編碼hCRH或GAPDH。在一些實施方案中，所述方法的第一步通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)進行，而在其它實施方案中，第一步可采用多核苷酸雜交方法或質(zhì)譜方法來實施。在一些實施方案中，所述妊娠婦女處于妊娠期的頭三月，而其它實施方案中，所述婦女處于妊娠期的中三月或末三月。在一些實施方案中，所述妊娠婦女的血液在用于所述方法的第一步之前是無細胞的。在一些實施方案中，在所述方法的第一步中使用血漿或血清。在一些實施方案中，所述mRNA含量的增加高于標準對照2倍。本發(fā)明的方法也可用于診斷、監(jiān)測或預測比先兆子癇更嚴重的諸如驚厥的臨床病程。本發(fā)明還涉及診斷、監(jiān)測或預測妊娠婦女的先兆子癇的試劑盒。所述的試劑盒包括用于定量測定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定mRNA種類的PCR引物。所述的mRNA可編碼hCG-|3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。所述試劑盒還包括代表正常非先兆子癇的婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照。本發(fā)明的試劑盒在所述PCR引物之外還可包括一種或多種用于定量測定編碼hCG陽/5、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA含量的探針，或用其替代所述PCR引物。本發(fā)明的另一方面涉及用于檢測妊娠婦女中諸如18號染色體三體性或21號染色體三體性的胎兒染色體非整倍性的方法。此方法包括多個步驟第一步是定量測定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定mRNA種類的含量。所述mRNA可編碼hCG-/5、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH。第二步是將第一步獲得的mRNA含量與代表懷有正常染色體胎兒的正常妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照進行比較。所述mRNA水平的增加或降低表明懷有非整倍體胎兒的風險增加。在一些實施方、案中，此方法中用作標志物的mRNA編碼hCG-iS。在一些實施方案中，所述方法的第一步通過RT-PCR進行，而在其它實施方案中，第一步可采用多核苷酸雜交方法或質(zhì)譜方法來實施。在一些實施方案中，所述妊娠婦女處于妊娠期的頭三月，而在其它實施方案中，所述妊娠婦女處于妊娠期的中三月或末三月。在一些實施方案中，所述妊娠婦女的血液在用于所述方法的第一步之前是無細胞的。在一些實施方案中，在所述方法的第一步中使用血漿或血清。在一些實施方案中，所述增加至少為2倍，而所述降低至少為50%。本發(fā)明還涉及用于檢測妊娠婦女中胎兒染色體非整倍性(諸如18號染色體三體性或21號染色體三體性)的試劑盒。所述的試劑盒包括用于定量測定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定種類的mRNA的PCR引物。所述的mRNA可編碼hCG-)S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH。所述試劑盒還包括代表懷有染色體正常胎兒的正常婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照。本發(fā)明的試劑盒除所述PCR引物之外還可包括一種或多種用于定量測定編碼hCG-)S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH的mRNA含量的探針，或用其替代所述PCR引物。本發(fā)明的另一方面涉及診斷、監(jiān)測或預測妊娠婦女的早產(chǎn)(pre-termlabor)的方法。此方法包括多個步驟第一步是定量測定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定種類的mRNA的含量。所述mRNA可編碼hCG-/5、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。第二步是將第一步獲得的mRNA含量與代表如期分娩或?qū)缙诜置涞恼Ｈ焉飲D女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照進行比較。所述mRNA水平的增加或降低表明早產(chǎn)或發(fā)展為此狀態(tài)的風險增加。在一些實施方案中，所述方法的第一步通過RT-PCR進行，而在其它實施方案中，第一步采用多核苷酸雜交方法或質(zhì)譜方法來實施。在一些實施方案中，所述妊娠婦女處于妊娠期的頭三月，而在其它的實施方案中，所述妊娠婦女處于妊娠期的中三月或末三月。在一些實施方案中，所述妊娠婦女的血液在用于所述方法的第一步之前是無細胞的。在一些實施方案中，在所述方法的第一步中使用血漿或血清。在一些實施方案中，所述mRNA含量的增加高于標準對照2倍。在另一些實施方案中，所述的降低至少為50%。本發(fā)明還涉及i貪斷、監(jiān)測或預測妊娠婦女的早產(chǎn)的試劑盒。所述的試劑盒包括用于定量測定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定種類的mRNA的PCR引物。所述的mRNA可編碼hCG-)S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。所述試劑盒還包括代表如期分娩或?qū)缙诜置涞恼Ｈ焉飲D女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照。本發(fā)明的試劑盒除所述PCR引物之外還可包括一種或多種用于定量測定編碼hCG-j3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA含量的探針，或用其替代所述PCR引物。本發(fā)明的另一方面涉及4企測婦女妊娠的方法。此方法包括多個步驟第一步是定量測定所述婦女血液中的一種或多種特定種類的mRNA的含量。所述mRNA可編碼hCG-j3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLAC1。第二步是將第一步獲得的mRNA含量與代表健康且未妊娠的正常婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照進行比較。所述mRNA水平增加表明妊娠。在一些實施方案中，所述方法的第一步通過RT-PCR進行，而在其它實施方案中，第一步采用多核苷酸雜交方法或質(zhì)譜方法來實施。在一些實施方案中，所述妊娠婦女的血液在用于所述方法的第一步之前是無細胞的。在一些實施方案中，在所述方法的第一步中使用血漿或血清。在一些實施方案中，所述mRNA含量的增加高于標準對照2倍。在另一些實施方案中，所述的降低至少為50%。本發(fā)明還涉及檢測婦女妊娠的試劑盒。所述的試劑盒包括用于定量測定所述妊娠婦女血液中一種或多種特定種類的mRNA的PCR引物。所述的mRNA可編碼hCG-/3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLAC1。所述試劑盒還包括代表健康且未妊娠的正常婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照。本發(fā)明的試劑盒除所述PCR引物之外還可包括一種或多種用于定量測定編碼hCG-/3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLAC1的mRNA含量的探針，或用其替代所述PCR引物。附圖的筒要描述圖1所示為分娩后母體血漿中Ci//mRNA的清除狀況(A)為分娩前和分娩后2小時母體血漿中CW//mRNA的濃度，(B)則為分娩前和分娩后2小時母體血漿中GAPD/fRNA的濃度。每一條線代表從一個受試者獲得的一份血漿樣本。圖2為先兆子癇和對照組母體血漿中OiZmRNA濃度的盒須圖(boxplot)。Ci//mRNA濃度以拷貝/mL表示。所述盒中的橫線表示中位數(shù)。所述盒標志25"與75"百分點之間的區(qū)間。所述須(whisker)表示10"與90th百分點之間的區(qū)間。實心原點標志10"與90th百分點區(qū)間以外的數(shù)據(jù)點。圖3所示為正常妊娠母體血漿中胎盤來源的mRNA的水平。(A)為不同妊娠階段母體血漿中hPLmRNA和母體血清中蛋白水平的盒須圖。(B)為不同妊娠階段母體血漿中/3hCGmRNA和母體血清中hCG蛋白水平的盒須圖。所述盒中的橫線表示中位數(shù)。所述盒標志25^與75111百分點之間的區(qū)間。所述須表示10"與90th百分點之間的區(qū)間。實心原點標志10th與90th百分點區(qū)間以外的數(shù)據(jù)點。(C)為母體血漿中hPLmRNA和母體血清中蛋白水平之間的相關性分析。(D)為母體血漿中]ShCGmRNA和母體血清中蛋白水平之間的相關性分析。圖4所示為分娩后母體血漿中hPLmRNA的清除狀況。(A)為分娩前和分4免后24小時的母體血漿hPLmRNA水平，而(B)為分4免前和分4免后24小時的母體血漿GAPDHmRNA水平。顯示了8例血漿樣本的結(jié)果，且每一條線代表從一個受試者獲得的一份血漿樣本。(C)為分娩前和分娩后2小時的母體血漿hPLmRNA水平，而(D)為分娩前和分娩后2小時的母體血漿GAPDHmRNA水平。顯示了13例血漿樣本的結(jié)果，且每一條線代表從一個受試者獲得的一份血漿樣本。圖5顯示了母體血漿中GAPDHmRNA的含量。樣本1-12來自正常妊娠婦女，而樣本28-37來自先兆子癇婦女。圖6顯示了非整倍體和對照妊娠的妊娠期頭三月中母體血清hCGj8mRNA的濃度。盒須圖顯示了對照、21號染色體三體性(T21)和18號染色體三體性(T18)妊娠者的血清中的hCG0mRNA濃度(常用對數(shù)取值)。所述盒中的橫線表示中位數(shù)。所述盒標志25"與75th百分點之間的區(qū)間。所述須表示10th與90th百分點之間的區(qū)間。實心原點標志10th與90"百分點區(qū)間以外的數(shù)據(jù)點。圖7所示為用于母體血漿中妊娠特異胎盤表達的mRNA標志物的系統(tǒng)鑒定的策略的概括。收集配對的胎盤組織和母體全血樣本，并對其進行寡核苷酸芯片分析。挑選相對于全血在所述胎盤組織中表達增加的轉(zhuǎn)錄本，并且通過對母體血漿的定量反轉(zhuǎn)錄酶PCR(QRT-PCR)來評價其在母體血漿中的可檢測性和妊娠特異性。圖8所示為分娩后母體血漿中胎盤mRNA的清除狀況。通過QRT-PCRJ企測了分4免前和分娩后24小時母體血漿中(A)TFPI2mRNA、(B)KISS1mRNA和(C)PLAC1mRNA的濃度。每一條線代表從一個受試者獲得的一份血漿樣本。圖9顯示了母體血漿和胎盤組織中標準化胎盤mRNA水平的相關性。(A)為頭三月妊娠期血漿和CVS間的標準化胎盤mRNA水平的相關性。(B)為末三月妊娠期血漿和末期胎盤間標準化胎盤mRNA水平的相關性。通過QRT-PCR測定血漿和胎盤組織中的標準化的/5hCG(n/3hCG)、TFPI2(nTFPI2)、KISS1(nKISSl)、CRH(nCRH)和PLAC1(nPLACl)mRNA的水平，并分別用圖例中所說明的符號來表示。對于非胎盤表達的轉(zhuǎn)錄本，也顯示了標準化的GAPDH(nGAPDH)和/3-球蛋白(ni8-球蛋白)的結(jié)果。定義本發(fā)明所用術(shù)語"先兆子癇"指在妊娠過程中發(fā)生的疾病狀態(tài)，其主要癥狀為多種形式的高血壓并常伴有尿蛋白和水肺(浮腫)。先兆子癇有時稱為妊娠毒血癥，與更嚴重的稱為驚厥的病癥有關，其為先兆子癇結(jié)合癲癇發(fā)作。盡管其在出生后可立即發(fā)生或在妊娠20周之前發(fā)生，這些疾病狀態(tài)通常在妊娠的后半程(20周后)發(fā)病。本發(fā)明所用術(shù)語"染色體非整倍性"指染色體異常的狀態(tài)，其中染色體數(shù)目不是通常單倍體數(shù)目的精確的多倍體經(jīng)常是增加染色體或缺失一個。染色體非整倍性的最常見的情況是三體性，其中出現(xiàn)單個增加的染色體。例如18號染色體三體性是在細胞中出現(xiàn)第三條18號染色體的染色體異常，而細胞中存在第三條21號染色體的患者則患有21號染色體三體性疾病。與非整倍性相反，"染色體正常，，指染色體數(shù)目是所述單倍體數(shù)目的精確的多倍體的狀態(tài)，例如單倍體的染色體數(shù)目的兩倍，且每種染色體以相同的數(shù)目存在(除例如男性人類的性染色體外，其中兩種不同的性染色體X和Y各以一個拷貝存在)。本發(fā)明所用術(shù)語"早產(chǎn)"或"提前分娩，，指在約40周的完全妊娠期屆滿前3周以上發(fā)生分娩的狀態(tài)，如果不處理常導致早產(chǎn)。相對的，本申請所用的"如期分娩或?qū)缙诜置?的妊娠婦女指從懷胎至完全的孕期未發(fā)生早產(chǎn)的妊娠婦女。本發(fā)明所用術(shù)語"血液"指/人妊娠婦女或妊娠可能性檢測的婦女獲得的血液樣本或制備產(chǎn)物。該術(shù)語包括全血或血液的任何組分，其基本不含造血細胞或任意母體或胎兒來源的其它類型的細胞，包括血小板。"血液，，通常不含有特定的物質(zhì)，該物質(zhì)可含有母體或胎兒來源的RNA。"血液，，的例子包括血漿和血清。基本不含細胞的血液樣本也稱為"無細胞的"，其中通常不存在血小板。本文用于描述非先兆子癇、懷有染色體正常胎兒或沒有且不會出現(xiàn)早產(chǎn)的妊娠婦女的術(shù)語"正常，，指某些特征，例如編碼在母體血液中發(fā)現(xiàn)的一種或多種特定胎兒蛋白的mRNA水平，其在一組隨機選擇的非先兆子癇、懷有染色體正常胎兒或沒有且不會出現(xiàn)早產(chǎn)的婦女中具有代表性。所選4奪的這組應包括充足凄t量的婦女，從而4吏這些婦女中編碼特定胎兒蛋白的平均mRNA水平以適當?shù)木_度反映懷有健康胎兒的健康妊娠婦女的整個群體的mRNA水平。此外，所選纟奪的這組婦女應與那些4企測血液中先兆子癇、胎兒染色體非整倍性或早產(chǎn)指征的婦女有相似的妊娠齡。根據(jù)欲篩查的病癥，用于本發(fā)明實踐的優(yōu)選的妊娠齡可以不同。例如篩查先兆子癇風險的妊娠婦女優(yōu)選在妊娠期中三月期間進行，而優(yōu)選盡可能早地對胎兒染色體非整倍性進行篩查和診斷。而且，檢測的優(yōu)選妊娠齡也依賴于檢測中所用的mRNA標志物。例如，hPLmRNA在所有三個三月妊娠期中均可檢測，而隨著妊娠進程hCRHmRNA的可檢測性逐步增加。術(shù)語"正常"也同樣用于指特定mRNA種類的含量代表在一組隨機挑選的非妊4長健康婦女血液中的含量。本發(fā)明所用的人絨毛膜促性腺激素]8亞基(hCG-/3)、人胎盤催乳素10(hPL)、人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(hCRH)、KiSS-l轉(zhuǎn)移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，指示例性地其序列分別如GenBank登錄號NM—000737.2、NM—022640、NM—000756、U43527、NM一006528、BC022335和BC014085所給出的基因(包括其變體和突變體)和其多核普酸轉(zhuǎn)錄本。在一些描述中，這些術(shù)語也指這些基因編碼的蛋白。本發(fā)明所用"標準對照"指適合在本發(fā)明方法中使用來定量測定編碼特定蛋白，例如hCG-)S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA含量的樣本。這些樣本含有已知含量的編碼特定蛋白的mRNA，其非常逼近反映正常妊娠婦女中此種mRNA的平均水平，如上所述該妊娠婦女是非先兆子癇、懷有染色體正常胎兒或沒有且不會出現(xiàn)早產(chǎn)的婦女。類似地，"標準對照，，也可來自正常的健康非妊娠婦女。本發(fā)明所用"mRNA含量比標準對照增加或降低"指含量相對于標準對照發(fā)生陽性或陰性變化。增加優(yōu)選為至少2倍，更優(yōu)選為至少5倍，并最優(yōu)選為至少10倍。相似地，降低優(yōu)選為至少50%,更優(yōu)選為至少80%，并最優(yōu)選為至少90%。本發(fā)明所用的"多聚核苷酸雜交方法"指依據(jù)其形成Watson-Crick堿基配對的能力，在適合的雜交條件下，利用已知序列的多聚核苦酸探針來檢測多聚核苷酸存在和/或數(shù)量的方法。這種雜交方法的例子包括Southern印記和Northern印記雜交。本發(fā)明所用"PCR探針"指寡核苷酸，其在聚合酶鏈式反應(PCR)中用于擴增源于編碼諸如hCG-^、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的目標蛋白的mRNA的核芬酸序列。至少一種用于擴增編碼上述指定蛋白的核苷酸序列的PCR引物對所述蛋白是序列特異的。發(fā)明的詳細描述I.引言本發(fā)明第一次提供了通過分析存在于婦女血液中的一種或多種編碼hCG-/3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA來診斷、監(jiān)測或預測妊娠婦女中先兆子癇、胎兒染色體非整倍性(諸如18號染色體三體性和21號染色體三體性)和早產(chǎn)，以及4全測婦女妊娠的方法和試劑盒。根據(jù)本發(fā)明，能夠定量測定母體血液樣本中編碼hCG-)8、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的含量，優(yōu)選通過擴增方法來進行，例如反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。隨后將一種或多種上述指定的mRNA種類與具有相同種類的mRNA的標準對照的水平進行比婦女。mRNA水平的增加或降低表明存在所述病癥或發(fā)展為所述病癥的風險增加。因而，本發(fā)明提供了診斷先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產(chǎn)的新方法，其是非侵襲性的并且是非性別和多態(tài)性依賴的。才艮據(jù)相同的方法學，通過將婦女血液中編碼hCG-Z、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLAC1的一種或多種mRNA種類的水平與來自正常非妊娠婦女的對照值進行比較，本發(fā)明也可用于檢測妊娠。II.血液樣本的制備A.獲得血液樣本妊娠婦女中或從檢測妊娠可能性的婦女中獲取血液樣本。如上所述，依據(jù)所4企測的病癥，有時依據(jù)所用的mRNA標志物，所述適合的妊娠齡可以不同。根據(jù)醫(yī)院和臨床通常采用的標準程序進行婦女血液的收集。收集適量的外周血，例如5-20ml,并可在進一步制備之前根據(jù)標準的步驟進行儲存。B.制備無細胞血液樣本婦女血液的血清或血漿適合于本發(fā)明，并可通過/>知的方法來獲得。例如，將婦女血液i文入含有EDTA或諸如VacutainerSST(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)的商業(yè)銷售的專用產(chǎn)品的管中來防止血液凝集，隨后通過離心可從全血中獲得血漿。另一方面，血液凝集后通過離心可獲得血清。通常在冷卻的環(huán)境例如約4-10。C的溫度中，采用適合的速度例如1,500-3,000xg下，進行離心。在轉(zhuǎn)移至新管中進行RNA提取前，可對血漿或血清進行額外的離心步驟。III.婦女血液中mRNA含量的定量測定A.mRNA的提取有多種從生物樣本中提取mRNA的方法?？梢罁?jù)通常的mRNA制備方〉去(例^口Sambrook禾口Russell,Afo/ecw/arC/om'wgv^丄aZj0rato;3;Afawwa/第三版，2001中所述)來進行；也可利用各種商業(yè)銷售的試劑或試劑盒，例如Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad,CA)、OligotexDirectmRNAi式劑盒(Qiagen,Valencia,CA)、RNeasyMini^式劑盒(Qiagen，Hilden,Germany)以及PolyATtractSeries9600TM(Promega,Madison,WI)來從婦女血液樣本中獲取mRNA。也可將一種以上的上述方法組合采用。/人RNA制備產(chǎn)物中去除污染性的DNA是必要的。因此，應該對樣本小心操作，利用DNase全面處理，在擴增和定量步驟中使用適合的陰斗生只于照。B.PCR為基礎的mRNA水平的定量測定一旦從婦女血液樣本中提取出mRNA，即可對編碼諸如hCG-)S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLACl或GAPDH的目標蛋白的mRNA含量進行定量檢測。測定mRNA水平的優(yōu)選方法是擴增為基礎的方法，例如PCR。在擴增步驟之前，必須合成目標mRNA的DNA復制本(cDNA)。這通過反轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)，其可分開進行或在一種擴增RNA的改進聚合酶鏈式反應——均質(zhì)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)中進行。適合核糖核酸的PCR擴增的方法J(口Romero與Rotbart的Z)/agwos""c7lfo/ecw/arS/o/ogy.'7V/wc/p/es1awd4P///c<3"o/wpp.401-406;Persingetal"eds.，MayoFoundation,Rochester,MN,1993;Eggeretal.，C/z.w.M'croZ^'o/.33:1442-1447,1995;及美國專利第5,075,212所述。PCR的常規(guī)方法是本領域公知的，因此本發(fā)明對其不作詳細描述。關于PCR方法、方案及設計引物的原則的綜述參見例如Innis,etal.,尸CT/VoZocoAsv爿GWdeMAto/oti51朋d4p//ZcflZ/o/w,AcademicPress,Inc.N.Y.，1990。從諸如RocheMolecularSystems的供應商處也可獲得PCR試劑和方案。通常PCR借助耐熱酶以自動過程來完成。在此過程中，通過變性區(qū)、引物退火區(qū)及延伸反應區(qū)使反應混合物的溫度自動循環(huán)。適合此目的的儀器可通過商業(yè)渠道獲得。盡管本發(fā)明實施時通常采用PCR來擴增目標mRNA。但本領域所屬技術(shù)人員應認識到，也可通過任何公知的方法來完成母體血液樣本中的這些mRNA種類的擴增，這些方法例如連接酶鏈式反應(LCR)、轉(zhuǎn)錄介導的擴增及自我持續(xù)序列復制或核酸序列為基礎的擴增(NASBA),這些方法中的每一種都提供了充分的擴增。最近開發(fā)的分枝DNA技術(shù)(branched-DNAtechnology)也可用于定量測定母體血液中的mRNA標志物的含量。用于臨床樣本中核酸序列的直接定量的分枝DNA信號擴增技術(shù)的綜述可參見Nolte,廟.C/Z".CA亂33:201-235,1998。C.其它的定量方法也可利用其它的本領域所屬技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)來纟企測目標mRNA。盡管所述的檢測步驟之前通常有擴增步驟，但擴增并不是本發(fā)明方法所必需的。例如，無論是否先進行擴增步驟，均可通過大小分級來鑒定所述mRNA(例如凝膠電泳)。根據(jù)公知的技術(shù)(參見上述的Sambrook和Russell)將樣本在凝膠或聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳并用溴化乙錠進行標記，存在與標準對照大小相同的條帶是存在目標mRNA的標志，然后根據(jù)所述條帶的強度可將其含量與對照進行比較?？蛇x擇地，利用對編碼例如hCG-/3、hCRH、hPL、KISSl、TPFI2、PLACl或GAPDH的mRNA特異的寡核苷酸探針來檢測這些mRNA種類的存在，并根據(jù)所述探針輸出的信號強度來指示相對于所述標準對照的含量。序列特異探針雜交是公知的檢測包括其它種類核酸在內(nèi)的特定核酸的方法。在足夠嚴格的雜交條件下，所述探針僅與基本互補的序列特異雜交?？煞艑捤龅膰栏耠s交條件使得不定數(shù)目的序列錯配。一些雜交的模式是本領域公知的，包括但不限于液相、固相或混和相雜交分析。以下文章提供了多種雜交分析模式的概述Smgeretal.,5/她c力w—4:230,1986;Haaseetal.，Me/力c^z'wK/ra/og_y，pp.189-226,1984;Wilkinson,/"/fy6nVfca"ow,Wilkinsoned.,IRJLPress,OxfordUniversityPress,Oxford;及Hames和Higginseds.,M/c/e/cJc/d//j^nV;feaZ/亂.JPrac"ca/々jraac力,IRLPress,1987。根據(jù)公知的技術(shù)檢測雜交復合物，且該檢測并不是本發(fā)明的關鍵方面?？墒褂猛ǔＳ糜跈z測雜交核酸的存在的幾種方法中的任何一種來標記能夠與目標核酸(即所述的mRNA或擴增的DNA)特異雜交的核酸探針。一種通用的檢測方法是借助3H、125I、35S、"C或32P等等標記的探針的放射自顯影。依據(jù)所選擇同位素合成的難易、穩(wěn)定性和半衰期的研究參數(shù)來選擇放射性同位素。其它標記物包括能夠與抗配體結(jié)合的化合物(例如生物素和地高辛(digoxigenin))或用熒光素、化學發(fā)光劑和酶標記的抗體?？蛇x擇地，探針能夠與諸如熒光素、化學發(fā)光劑或酶的標記物直接連接。依據(jù)所要求的敏感性、與所述探針連接的難易、穩(wěn)定性要求和現(xiàn)有的設備來選^奪標記物。利用公知的技術(shù)可合成和標記本發(fā)明實施中必需的探針和引物?？筛鶕?jù)Beaucage和Camthers，7^raAWraw22:1859-1862,1981中首次描述的固相磷酰胺酸三酯(phosphoramiditetriester)方法，利用如Needham-VanDevanteretal"M/c/e/cJc油to.12:6159-6168，1984所述的自動合成儀來化學合成用作探針和引物的寡核苷酸。如Pearson和Regnier,J.CAram.,255:137-149，1983所述，通過天然丙烯酰胺凌是膠電泳或陰離子交換HPLC來純化寡核苷酸。IV.建立標準對照為了建立標準對照，首先選擇懷有健康胎兒的一組健康妊娠婦女。這些婦女應是相似妊娠齡的，并處于適合用本發(fā)明方法篩查諸如先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產(chǎn)的病癥的妊娠時間段。類似地，利用來自一組健康的非妊娠婦女的樣本建立標準對照。通過成熟的、常規(guī)使用的方法來確認所選妊娠婦女和其所懷胎兒的健康狀況，所述方法包括但不限于檢測所述婦女的血壓、記錄分娩的發(fā)生和利用CVS和羊水穿刺術(shù)進行胎兒遺傳性分析。此外，所選擇的這組懷有健康胎兒的健康妊娠婦女或健康非妊娠婦女必須有一定的規(guī)模，從而從該組計算得到的編碼hCG-/3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的平均含量能夠可信地代表懷有健康胎兒的健康婦女或健康非妊娠婦女總?cè)后w的正常或平均含量。優(yōu)選地，所選組包括至少IO位婦女。一旦依據(jù)所選組中每位婦女的個體值，建立編碼任一蛋白的mRNA含量的平均值，則該值即被認為是所述mRNA種類的標準值。因此，任何含有相似含量的同種mRNA的血液樣本均可用作標準對照。也可人工組合得到所含編碼hCG-z3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的濃度等于所建立的同種mRNA的平均濃度的溶液，并將其作為標準對照。域所屬技術(shù)人員應容易地認識到，通過改變或修改各種非關鍵性的參數(shù)也能實現(xiàn)基本相似的結(jié)果。實施例實施例1:先兆子癇婦女的hCRHmRNA水平升高A.方法憂試者在得到知情同意和研究倫理委員會(ResearchEthicsCommittee)批準的前提下，從妊娠婦女收集外周血樣本，這些妊娠婦女在香港PrinceofWales醫(yī)院婦產(chǎn)科看病。在此研究的第一部分，從IO例末三月妊娠期的健康妊娠婦女獲得血液樣本。在此課題的第二部分，征募具有簡單妊娠的即將進行選擇性剖腹產(chǎn)手術(shù)的4例妊娠婦女。在即將分娩前和分娩后2小時采集這些受試者的外周血樣本。此研究的第三部分，對兩組患者進行了研究fa)12例先兆子癇婦女和^)jIO例對照妊娠婦女。所述先兆子癇和對照組的中位妊娠齡分別為37周和38周。在沒有高血壓病史的婦女出現(xiàn)穩(wěn)定增加的舒張壓，出現(xiàn)一次〉110mmHg或以至少4小時間隔出現(xiàn)兩次或多次〉90mmHg，并有顯著的蛋白尿，據(jù)此來確定先兆子癇。顯著的蛋白尿定義16為>0.3g/天或以至少4小時間隔收集的兩次清潔捕獲的中流段尿液樣本的才全測條檢測中2+。對照組包括沒有預先存在的醫(yī)學疾病或產(chǎn)前并發(fā)癥的妊娠婦女。j&濕^^本的A理依據(jù)以往報道的處理方法來處理血液樣本(Ngetal.,C7/".C力ew.48:1212-1217，2002)。簡而言之，將10mL血液樣本收集在含有EDTA的管中，并在4。C以1600xg離心IO分鐘。隨后一尋血漿小心地轉(zhuǎn)移至清潔的聚丙烯管中。將該血漿樣本在4。C以16000xg再次離心10分鐘，并將上清收集到新的聚丙烯管中。iA^炎承如上述引用的Ng等的文獻所述，將1.6mL的血漿與2mL的TrizolLS試劑(Invitrogen，Carlsbad，California)和0.4mL氯仿混和。將所得混合物在4。C以ll，卯Oxg離心15分鐘，并將水層轉(zhuǎn)移至新的管中。向所述的水層加入等體積的70%乙醇。隨后，根據(jù)廠商的說明書將所述混合物加到RNeasy小型柱(Qiagen,Hilden，德國)中并進4亍處理。用30pL無RNase酶的水來洗脫總RNA,并在-80。C下儲存。進行DNase(RNase-FreeDNaseSet,Qiagen,Hilden,德國)處理來去除任何污染性的DNA。根據(jù)上述引用的Ng等的文獻所述，采用一步實時定量RT-PCR對所有mRNA進行定量。所述引物的序列為5'-GCCTCCCATCTCCCTGGAT-3，(正向)和5，-TGTGAGCTTGCTGTGCTAACTG-3，(反向)，而所述雙標記的熒光探針lxl(^拷貝至lxl(V拷貝的濃度范圍對高效液相色語純化的單鏈合成DNA寡核苷酸(GensetOligos,新加坡)進行系列稀釋來制備用于C7//mRNA定量的校準曲線，該寡核苷酸對89bpCi/7擴增子(amplicon)(Genbank登錄號NM—000756)特異。Ci//mRNA的絕對濃度表示為拷貝/mL血漿的形式。用于C7//校準的合成DNA寡核苷酸序列為AGCA-3'。如上所述制作GAPD//定量的校準曲線，并以表示為pg/mL血漿的形式(上述引用的Ng等)。才艮據(jù)廠商的說明書以25/xL的反應體積進4亍RT-PCR反應(EZrrARNAPCR試劑套裝，AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)。所用熒光探針(GensetOligos)的濃度為100nM。對于C7/Z體系和G^PD/Z體系，所用PCR引物(GensetOligos)的濃度均為200nM。使用5gL提取的血漿RNA進行擴增。每個樣本分析兩次，并且在每次分析中平行運行對應的校準曲線。用AmpliTaqGold酶(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)^齊4戈所述rrA多聚酶來檢測樣本，從而保證它們是DNA陰性的。在此對照分析中沒有觀察到擴增，表明所述分析對對應的mRNA具有特異性。在每一分析中也包括多個陰性空白水溶液。用于所述Ci/Z和G^PD7/分析的溫度方案如下為了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶發(fā)揮作用，將反應在50°C引發(fā)2分鐘，隨后在60。C進行反轉(zhuǎn)錄30分鐘。在95。C變性5分鐘后，進行40個循環(huán)的以下PCR:94。C變性20秒，分別對所述C7/Z和(24P"/Z體系在58°C和62°C退火/延伸1分鐘。利用SigmaStat2.03軟件(SPSS)進行統(tǒng)計學分析。B.結(jié)果多収量燈-尸Ci的建i為確定所述O//RT-PCR分析的定量特性，我們利用此系統(tǒng)對系列稀釋的校準品進行了擴增，該校準品為依據(jù)所述Ci/Z序列合成的DNA寡核苷酸。以往的數(shù)據(jù)表明這種單鏈寡核苷酸可靠地模擬了所述反轉(zhuǎn)錄步驟的產(chǎn)物，并產(chǎn)生與利用T7-轉(zhuǎn)錄的RNA(Bustin,丄Mo/.E"docn7zo/.25:169-193,2000)獲得的校準曲線相同的校準曲線。Ci//擴增體系的校準曲線顯示了從2.5xl(^至lxl(^拷貝的動態(tài)范圍，并具有0.983的相關系數(shù)。這些分析的擴增步驟的靈敏度足以檢測25個拷貝的目標Ci//。為確定包括RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和擴增步驟的整個分析過程的準確性，我們對得自健康妊娠婦女(妊娠齡38周)的血漿樣本進行了IO次平行的RNA提取，并對這些提取的RNA樣本進行RT-PCR分析。這些Ci//mRNA的平行分析的Ct值的變異系數(shù)為2.8%。CL4尸/)//RT-PCR分析的展開和特性如以上引用的Ng等人的文獻所述。為檢驗在母體血漿中是否能夠檢測到Ci//mRNA的轉(zhuǎn)錄本，通過Ci/ZRT-PCR分析對IO例末三月妊娠期的妊娠婦女(妊娠齡為37到41周)的血漿樣本進行了分析。在所有檢驗樣本中均才企測到了Ci/ZmRNA。血漿C7Z/mRNA濃度的中位值為73拷貝/mL(四分位凄史間距51至177)。作為陽性對照，在所有這些血漿樣本中均能^企測到(24PZ)7/RNA。為S^^母謬i襲哞CiZ/wWA^的清^為證明母體血漿的C7//mRNA來自胎兒胎盤單元(feto-placentalunit)，我們對4位婦女分娩前和分娩后2小時的血漿均進行了CiZ/mRNA分析。結(jié)果在所有4例分娩前的母體血漿樣本中均^r測到了CiZ/mRNA。相反，在任何分娩后的樣本中均沒有檢測到C7Z/mRNA。G^PZ)Z/mRNA在所有的血漿樣本中均可檢測到，從而證明了所述樣本的質(zhì)量。所述凄t據(jù)如圖1A和圖1B所示。^兆f的喪嫌力女i,^的CiH附/A^4的定量為V^f為比較先兆子癇和對照妊娠婦女母體血漿中的0Z/mRNA的濃度，從妊娠齡相當?shù)?2例先兆子癇婦女和10例對照妊娠婦女獲取血漿樣本。如圖2所示，先兆子癇婦女和對照妊娠婦女的血漿C7ifmRNA濃度的中位數(shù)分別為1070拷貝/mL(四分位數(shù)間距535至1468)和102拷貝/mL(四分位數(shù)間距51至158)。先兆子癇妊娠婦女的血漿Ci//mRNA濃度的中位數(shù)為對照妊娠婦女的10.5倍高(Mann-Whitney檢驗，P<0.001)。C.結(jié)論血漿C7Z/mRNA代表一種新的先兆子癇的分子標志物。與母體血漿的胎兒DNA分析相比，血漿RNA分析具有非性別和多態(tài)性依賴的優(yōu)點?？梢灶A見血漿RNA分析可最終實現(xiàn)未出生胎兒的非侵襲性基因表達譜分析。實施例2:妊娠婦女血漿中的hPL和hCG-卩mRNA的檢測A.方法f試者從得到知情同意和研究倫理委員會批準的前提下，從單胎簡單妊娠的健康婦女收集15ml血液樣本，這些妊娠婦女在香港PrinceofWales醫(yī)院婦產(chǎn)科看病。j&濕^^本的義理將所述血液樣本收集在含有EDTA的清潔的管中，并在4°C以1600xg離心10分鐘。隨后，將血漿和血清小心地轉(zhuǎn)移至清潔的聚丙烯管中。所述的血清樣本在-20。C保存用于hPL和hCG-]S蛋白的免疫分析。將所述血漿樣本在4。C以16000xg再次離心IO分鐘，并將上清收集到新的聚丙烯管中。將所有胎盤組織樣本立即保存在RNA后續(xù)穩(wěn)定溶液(Laterstabilizingsolution)(Ambion,Austin,TX)中，并保存在-80。C直到進行RNA提取。對于過濾試驗，將血漿樣本分成三^分兩份分別用0.45/xm或5/rni孔徑的濾膜(Millex-GV;MilliporeChinaLimited,香港)進行過濾。第三〈分不進^于過濾。提取對于血漿樣本，根據(jù)上述引用的Ng等的方案，將1.6mL血漿與2mLTrizolLS試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)及0.4mL氯仿混和。對于胎盤組織，根據(jù)廠商的說明書在Trizol試劑(Invitrogen)中將樣本勻漿，隨后加入氯仿。將所得混合物在4°C以ll,900xg離心15分鐘，并將水層轉(zhuǎn)移至新的管中。向所述的水層加入等體積的70%乙醇。隨后，根據(jù)廠商的說明書將所述混合物加到RNeasy小型柱(RNeasyMini試劑盒，Qiagen，Hilden,德國)中，并進行處理。用無RNase酶的水來洗脫總RNA,并在-80。C下儲存。進行DNase(RNase-FreeDNaseSet,Qiagen,Hilden，德國)處理來去除任何污染性的DNA。其収量燈？CW根據(jù)上述引用的Ng等的文獻所述，采用一步實時定量RT-PCR對所有mRNA進行定量。用于所有hPL、hCG-/3和GAPDH的RT-PCR分析的引物均是內(nèi)含子跨越的。所述hPL引物的序列為5'-CATGACTCCCAGACCTCCTTC-3'(正義)和5'-TGCGGAGCAGCTCTAGATTG-3，(反義)，而雙標記的熒光探針為5，-(FAM)TTCTGTTGCGTTTCCTCCATGTTGG(TAMRA)-3，。所述hCG-/3引物的序列為5，-CTACTGCCCCACCATGACCC-3，(正義)和5，-TGGACTCGAAGCGCACATC-3，(反義)，而雙標記熒光4笨針為5，-(FAM)CCTGCCTCAGGTGGTGTGCAACTAC(TAMRA)-3'。通過以lxlO拷貝至lx101拷貝的濃度范圍對高效液相色譜純化的單鏈合成DNA寡核苷酸(GensetOligos，新加坡)進行系列稀釋來制備用于HPL和HCG-/3定量的校準曲線，這些寡核苷酸分別對所述hPL和hCG-Z3擴增子特異。這些分析能夠測定100個拷貝的代表性校準靶標。hPL和hCG-/3mRNA的絕對濃度表示為拷貝/mL血漿的形式。以往的數(shù)據(jù)表明這種單鏈寡核苷酸可靠地模擬了所述反轉(zhuǎn)錄步驟的產(chǎn)物，并產(chǎn)生與線。用于hPL和hCG-)S4交準的合成DNA寡核苷酸序列分別為GTCATGC-3'和5，-GATGGACTCGAAGCGCACATCGCGGTAGTTGCACTGGTGGGGCAGTAGCC-3，。根據(jù)上述引用的Ng等所述的方法制備用于GAPDH定量的校準曲線，并表示為pg/mL血漿的形式。根據(jù)廠商的說明書以50/xL的反應體積進4亍RT-PCR反應(EZrTYARNAPCR試劑套裝，AppliedBiosystems,FosterCity,CA)。所用熒光探針(GensetOligos)的濃度為100nM。對于hPL體系，所用PCR引物(GensetOligos)的濃度為300nM，而對于hCG-/3體系和GAPDH體系，所用PCR引物的濃度均為200nM。使用5/iL提取的血漿RNA和O.lng提取的總胎盤RNA進行擴增。每個樣本分析兩次，并且在每次分析中平行運行對應的校準曲線。用AmpliTaqGold酶(AppliedBiosystems,FosterCity，CA)替代所述r7Y/z多聚酶來檢測樣本，從而保證它們是DNA陰性的。在此對照分析中沒有觀察到擴增，表明所述分析對對應的mRNA具有特異性。在每一分析中也包括多個陰性空白水溶液。用于所述hPL、hCG-iS和GAPDH分析的溫度方案如下為了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶發(fā)揮作用，將反應在50。C引發(fā)2分鐘，隨后在60。C進行反轉(zhuǎn)錄30分鐘。在95。C變性5分鐘后，進行40個循環(huán)的以下PCR:94°C變性20秒、分別對hPL、hCG-/5和GAPDH體系在56°C、58°C和60°C退火/延伸1分鐘。重復RNA提取和RT-PCR分析，顯示hPL和hCG-/5mRNA的分析系統(tǒng)的Ct值的變異系數(shù)分別為2.3%和3.2%。蛋^為、浙分別利用放射免疫分析(DiagnosticProductsCorp.,LosAngeles,CA)蛋白濃度進行測定。B.結(jié)果母謬j&濕哞的#產(chǎn)miA^W^Vi^f/if^i;t'/i我們獲取了10例妊娠婦女(妊娠齡為7-14周)的外周血樣本。在樣本到達實驗室之后(靜脈取血后1小時之內(nèi))，立即對每個受試者的一半血液樣本進行血漿收集和RNA提取。為檢驗hPL和hCG-/3mRNA的轉(zhuǎn)錄本在母體血漿中能否4企測到，我們用對應的實時RT-PCR分析對提取的RNA進行了分析。我們在所有10例血漿樣本中均觀察到了hPL和hCG-0mRNA信號。這些結(jié)果表明在妊娠婦女血漿中確實能夠檢測到胎盤，在所有這些血漿樣本中也一全測到了GAPDHmRNA。為研究母體血液中胎盤mRNA的穩(wěn)定性，我們將這些母體血液樣本各自余下的部分在室溫下放置24小時。隨后提取這些樣本中的RNA,并對hPL、hCG-/3和GAPDH轉(zhuǎn)錄本的水平進行;險測。沒有觀察到hPL和hCG-j3mRNA轉(zhuǎn)錄本水平的顯著差異，而在室溫下;^文置24小時的樣本中的GAPDHmRNA顯著高于立即處理的樣本中的水平(Wilcoxon檢驗，對于所述hPL分析P=0.770;對于所述hCG-/3分析P=0.275;對于所述GAPDH分析P<0.05)。這些結(jié)果顯示血漿中hPL和hCG-/5mRNA在室溫下可保持穩(wěn)定達24小時。喪媒餘^7趟的潘i^^產(chǎn)miA^f化從39例不同妊娠階段的妊娠婦女獲取血漿樣本。在所有三個三月妊娠期的血漿中100%(39例中有39例)檢測到hPLmRNA。對于hCG-/5mRNA,妊娠頭三月(妊娠齡7-14周)樣本的檢出率為100%(14/14)，妊娠中三月(妊娠齡15-23周)樣本的檢出率為42%(5/12),妊娠末三月(妊娠齡3541周)樣本的檢出率為7.7%(1/13)。在所述妊娠頭三月的血漿樣本中，hPL和hCG-/3mRNA水平的中位值分別為2671(四分位數(shù)間距為375-6217)和1205拷貝/ml(四分位數(shù)間距為566-1927)(圖3A和圖3B)。妊娠中三月的血漿hPL和hCG-/3mRNA水平的中位值分別為4784(四分位數(shù)間距為2679-10139)和0拷貝/ml(四分位數(shù)間距為0-125)。在妊娠末三月的血漿樣本中，血漿hPL和hCG-)SmRNA水平的中位值分別為13869(四分位數(shù)間距為7829-27434)和0拷貝/ml(四分位數(shù)間距為0-0)。綜上，循環(huán)hPL和hCG-jSmRNA水平分別顯示與妊娠齡有關的增加和降4氐的趨勢。同時也測定了對應的hPL和hCG-i3蛋白的水平(圖3A和圖3B)。所有循環(huán)hPL和hCG-/3mRNA的妊娠期變化與對應蛋白所呈現(xiàn)出的趨勢類似(Pearson相關性分析，對于hPL:r=0.622;P<0.001，對于hCG-化r=0.784;P<0.001,如圖3C和圖3D所示)?！匪靆母沐i,哞/^凌wi7VJ的鍵遽,餘23我們隨后研究了分娩是否會導致母體血漿中胎盤mRNA的快速清除。由于在妊娠末三月(受試者的妊娠齡38-42周)的母體血漿中hPLmRNA含量相對豐富，因此選擇hPLmRNA作為研究的靶標。在8例分娩前的血漿樣本中，hPLmRNA轉(zhuǎn)錄本水平的中位值為50004拷貝/ml。在分娩后24小時，在任何產(chǎn)后樣本中不能才企測到hPLmRNA(圖4A)。作為對照，在所有分娩前和分娩后的血漿樣本中均能夠檢測到GAPDHmRNA(圖4B)。沒有觀察到母體血漿中GAPDHmRNA水平的系統(tǒng)改變(Wilcoxon檢驗，P=0.313)。隨后我們研究了能否在產(chǎn)后較短時間點(2小時)觀察到循環(huán)hPLmRNA的清除。征募了13例受試者用于此第二項研究，分娩前hPLmRNA水平的中位值為24499拷貝/ml(圖4C)。在產(chǎn)后2小時，13例婦女中有9例沒有檢測到血漿胎盤RNA。余下的受試者在分娩后2小時有大約66-97%的母體血漿胎兒RNA被清除。我們在所有血漿樣本中均檢測到GAPDHmRNA，從而證明了所述樣本的質(zhì)量(圖4D)。沒有觀察到母體血漿GAPDHmRNA水平的系統(tǒng)性變化(Wilcoxon檢驗，實施例3:先兆子癇婦女中母體血漿GAPDHmRNA的升高在知情同意的條件下征募了在香港PrinceofWales醫(yī)院婦產(chǎn)科看病的妊娠婦女。利用實施例1所述的標準來診斷先兆子癇。A.方法將母體血液樣本放入肝素化的管中，并如實施例1所述來處理。提取血漿RNA，并如實施例1所述定量測定GAPDHmRNA的水平。B.結(jié)果與對照組比較，觀察到先兆子癇組的母體血漿中的GAPDHmRNA濃度升高(圖5)。對照組和先兆子癇受試者的母體血漿GAPDHmRNA水平的中位值分別為70pg/ml和281pg/ml。該差異具有統(tǒng)計學顯著性(Mann-Whitney檢驗，p<0.005)。C.結(jié)論母體血漿GAPDHmRNA是一種新的非侵襲性的先兆子癇標志物。實施例4:非整倍性妊娠婦女的母體血清中的hCGmRNA濃度A方法通過實時定量RT-PCR對來自2003年1月至8月間研究的141例妊娠婦女的頭三月妊娠血清樣本中的/3hCGmRNA濃度進行了檢測。對所有被研究的受試者進行了用于胎兒染色體組型分析的絨毛膜取樣(CVS)。在即將CVS之前收集所有母體的血液樣本。將血液樣本放入清潔的管中，并在4°C下以1600xg離心10分鐘。隨后將血清轉(zhuǎn)移至清潔的聚丙烯管中。立即將3.2mL血清放入4mLTrizol中并在-80。C保存直到進行RNA提取。如上所述，通過改良的RNeasyRNAMini試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)從1.6mL血清中提取血清RNA(Ngetal.，尸rac.A^//.Sc/.OSJ,100:4748-4753,2003)。用30^L無RNase酶的水來洗脫總RNA，并在-80。C下保存。進行DNase酶(RNase-FreeDNaseSet,Qiagen，Hilden,德國)處理來去除任何污染性的DNA。根據(jù)Ngetal.,胸/.W.園,100:4748-4753，2003所述，利用一步實時定量RT-PCR對/hCGmRNA進行定量分析。以25/xL的反應體積進行所述的RT-PCR反應。所用的引物和熒光探針的濃度分別為300nM和100nM。用6;^L提取的血清RNA進行擴增。用于所述分析的溫度方案如下為了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶發(fā)揮作用，將反應在50。C引發(fā)2分鐘，隨后在60°C進行反轉(zhuǎn)錄30分鐘。在95。C變性5分鐘后，進行40個循環(huán)的以下PCR:94°C變性20秒，并在57。C退火/延伸1分鐘。Ngetal.,TVa".爿caASc/.100:4748-4753，2003已經(jīng)確立了所述分析的靈敏度、線性度和精確度。在所述反應混合物中僅可檢測到少至100拷貝的所述合成寡核苷酸。血清hCG)8RNA濃度以拷貝/mL血清表示。因沒有進行恢復試驗，所報告的濃度(拷貝/mL)為最低的估計值。在所征募的149例妊娠婦女中，15例婦女懷有21號染色體三體性胎兒，11例懷有18號染色體三體性胎兒。余下的123例懷有整倍體胎兒，并用作對照。對照組的妊娠齡的中位值為12.5周(范圍11.2-14.3周)。懷有21號染色體三體性和18號染色體三體性胎兒的妊娠齡的中位值分別為12.5周(范圍12.1-14.2周)和12.3周(范圍:11.4-14.1周)。在三組中沒有發(fā)現(xiàn)妊娠齡的顯著差異(Kruskal-Wallis,P=0.706)。B.結(jié)果對149例母體血清樣本的hCG)8mRNA進行了定量分析。在149例妊娠婦女中有140例(94%)的母體血清中能檢測到hCGj8mRNA。在對照組中，hCG/3mRNA的檢出率為96.7%(123例中有119例)。在21號染色體三體性和18號染色體三體性組中，檢出率分別為93.3%(15例中有14例)和63.6%(11例中有7例)。此三組的血清hCG)SmRNA濃度的中位值分別為對照組6108拷貝/mL(四分位數(shù)間距為2867到19249拷貝/mL),21號染色體三體性組為13165拷貝/mL(四分位數(shù)間距為4403到25265拷貝/mL)，而18號染色體三體性組為652拷貝/mL(四分位數(shù)間距為0到11662拷貝/mL)(圖6)。此三組中hCG/SmRNA濃度的中位值差異是統(tǒng)計學顯著的(Kmskal-Wallis，P=0.024)。進行配對多重比較，顯示18號染色體三體性組和對照組間存在顯著差異(Dunn's檢驗，P<0.05)，且18號染色體三體性組和21號染色體三體性組間存在顯著差異(Dunn'stest,P<0.05)。由于樣本數(shù)量有限，在21號染色體三體性組和對照組的血清hCG/5mRNA濃度之間沒有觀察到統(tǒng)計學顯著的差異(Dunn's檢驗，P〉0.05)。但是，如果擴大樣本規(guī)模，將會產(chǎn)生統(tǒng)計學顯著的差異。C.結(jié)論此研究證明，在頭三月妊娠婦女的血清中可容易和明顯地4企測到循環(huán)hCG)3RNA,并具有94%的片企測率。這些數(shù)據(jù)證明，18號染色體三體性妊娠婦女中血清hCG/3mRNA濃度的中位值約為對照妊娠婦女的濃度中位值的10%，并觀察到統(tǒng)計學顯著的差異。另一方面，盡管21號染色體三體性妊娠婦女的血清hCG/5mRNA濃度的中位值為對照妊娠婦女的濃度中位值的2.2倍高，但由于樣本數(shù)量有限沒有觀察到統(tǒng)計學顯著的差異。這種統(tǒng)計學顯著的差異有望在較大規(guī)模的研究中出現(xiàn)。這些數(shù)據(jù)首次證明在18號染色體三體性妊娠婦女的頭三月妊娠期血清中的循環(huán)hCG)SmRNA濃度顯著降低，而在21號染色體三體性妊娠婦女中所述循環(huán)hCG0mRNA濃度升高。這些數(shù)據(jù)表明，循環(huán)hCG)3RNA作為標志物用于預測例如18號染色體三體性和21號染色體三體性的非整倍性妊娠的診斷作用。此研究觀察到在18號染色體三體性組與對照組的hCG/5mRNA濃度之間有重疊。這暗示如果將母體血清hCG/5mRNA檢測作為唯一的18號染色體三體性妊娠預測方法可能會導致相對較低的靈敏度和特異性?？蓪⒅T如hPL、hCRH、KiSS-l、TPFI2和PLAC1的其它標志物與hCG/5聯(lián)合使用，從而增加診斷的靈敏度和特異性。實施例5:母體血漿中的胎盤mRNA的鑒定A.方法本研究分兩個階段進行。首先，利用寡核苷酸芯片(Oligonucleotidemicroarrays)對頭三月和末三月妊娠婦女的胎盤組織基因表達譜進行系統(tǒng)鑒定。其后，以實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(QRT-PCR)為基礎，發(fā)展了多種分析方法用來檢測母體血漿中6條已鑒定的胎盤表達的基因。對所研究的RNA轉(zhuǎn)錄本，評價了其在母體血漿中的可凈全測性，以及其在血漿和胎盤組織中的水平的相關性。此研究采用的所有胎盤和血液樣本均是在知情同意的前提下從單胎簡單妊娠的健康婦女中收集的，這些妊娠婦女在香港PrinceofWales醫(yī)院婦產(chǎn)牙牛看病。#產(chǎn)差@4這#的筌定利用在流產(chǎn)前或選擇性剖腹產(chǎn)分娩后即刻進行的絨毛膜取樣(CVS)獲得頭三月(妊娠齡范圍9-12周)和末三月(妊娠齡范圍38-40周)妊娠期胎盤組織樣本各5例。收集后立即將所述胎盤組織樣本放入于RNA/WerTM(Ambion,Austin,TX)中并在-80。C保存，直到進行RNA提取。收集組織的同時收集6mL外周血，并放入PAXgeneBloodRNA管中(PreAnalytiX,Hombrechtikon，瑞士》才艮據(jù)制造商的說明書利用Tnzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)乂人月臺盤組織提取總RNA，并用RNeasymini-試劑盒(Qiagen,Hilden,德國)進4亍純化。根據(jù)制造商的說明書利用PAXgeneBloodRNA試劑盒(PreAnalytiX,Hombrechtikon，瑞士)從外周血中提取總RNA，此過程包括DNase處理步驟(RNase-FreeDNaseSet,Qiagen,Hilden，德國)。對于每種樣本，根據(jù)制造商的說明書，標記IO微克提取的RNA并將其與GeneChipHumanGenomeU133A芯片(Affymetrix,SantaClara,CA)進行雜交。雜交后，在GeneChipFluidicsStation400(Affymetrix，SantaClara,CA)中對每塊芯片進行洗滌和染色。將所述芯片用GeneArrayScanner(Affymetrix,SantaClara,CA)進4亍掃描，并用GeneChipMicroarraySuite5.0(Affymetrix)進行分析。遞i2^T^2^r-尸CW^母^:A《哞W應i4這^WWv4-餘^本迷/f定#^/,從10例頭三月和10例末三月妊娠婦女收集配對的胎盤和母體全血樣本。同時也征募了10例妊娠婦女在分娩前后的外周血樣本。如上所述處理胎盤組織。將12mL血液樣本收集到EDTA管中，并在4。C以1600xg離心10分鐘。隨后將血漿小心地轉(zhuǎn)移至清潔的聚丙烯管中。將所述血漿樣本在4。C以16000xg再次離心IO分鐘，并將上清收集到新的聚丙烯管中。如Ng.etal.,C/zem.,48:1212-1217，2002中所述從母體血漿中提取RNA。進行DNase處理(RNase-FreeDNaseSet,Qiagen,Hilden,德國)來去除污染的DNA。本研究集中于對從胎盤芯片基因表達譜中鑒定出的6條胎盤表達的mRNA轉(zhuǎn)錄本的評價，所述mRNA包括人胎盤催乳素(hPL)、人絨毛膜促性腺激素/3亞基03hCG)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、KiSS-l轉(zhuǎn)移抑制因子(KISS1)和胎盤特異1(PLAC1)。作為對照，進行了兩種非胎盤特異轉(zhuǎn)錄本——甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和/3-血紅蛋白(/5-球蛋白)mRNA的定量分析。用于檢測GAPDH、hPL、hCG/3和CRHmRNA的QRT-PCR分析如上所述(Ng.etal.,C"w.C/zew,，48:1212-1217,2002;Ngetal.,ZVoc.iVa".JcadSc/.100:4748-4753,2003;和Ngetal.,C//".C力ew.,49:727-731,2003)。TFPI2分析的引物序列為5'-ACAAATTTCTACACCTGGGAGGC-3，28(正義)和5'-CGGCAAACTTTGGGAACTTTT-3，(反義)，且雙標記熒光探針為5，-(FAM)TGCGACGATGCTTGCTGGAGGA(TAMRA)-3，。FAM與TAMRA分別代表6-羧基熒光素和6-羧基四甲基若丹明(rhodamine)。用于KISS1定量分析的引物序列為5'-GCCCAGGCCAGGACTGA-3，(正義)和5，-GCCAAGAAACCAGTGAGTTCATC-3，(反義)，且雙標記熒光4罙針為分析的引物序歹'J為5，-ATTATCCCCAGCTGCCAGAA-3，(正義)和5，-GCAGCCAATCAGATAATGAACCA-3，(反義)，且雙標記熒光〗笨針為白分析的引物序列為5，-GCTGCACTGTGACAAGCTGC-3，(正義)和5，-GCACACAGACCAGCACGTTG-3，(反義)，且所述熒光4果針為以lxl()6拷貝至10拷貝的濃度對Bustinetal.,丄Mo/.￡m/ocn'"o/.，25:169-193，2000(GensetOligos,新加坡)所述的高效液相色譜純化的單鏈合成DNA寡核苷酸進行系列稀釋來制作用于hPL、/3hCG、CRH、TPFI2、KISS1、PLAC1和/3-球蛋白mRNA定量分析的校準曲線，所述寡核苷酸對各自的擴增子特異。用于hPL、/5hCG和CRH校準品的合成DNA寡核苷酸序列如上所述(參見Ngetal.,尸rac.A^/.Jc"A100:4748-4753，2003和Ngetal.，C"".CAew.,49:727-731,2003)。用于TPFI2、KISS1、PLAC1和/3-球蛋白校準品的合成DNA寡核苦酸序列分別為GAGGATAGAAAAAGTTCCCAAAGTTTGCCGGCTG-3'、5，-CTGCCCAGCTCACCAAGATGAACTCACTGGTTTCTTGGCAG-3，、5，-ACAAATTATCCTGTGGTTCATTATCTGATTGGCTGCAGG-3'和5，-TGAGCTGCACTGTTGCTGGTCTGTGTGCTGG-3，。除GAPDHmRNA以外，對胎盤組織和母體血漿中所有轉(zhuǎn)錄本的絕對濃度分別以拷貝/ng總胎盤RNA和拷貝/mL血漿的形式表示。通過系列稀釋人總RNA來制作用于GAPDH定量分析的校準曲線(Ng.etal.,C7/".CAe附.，48:1212-1217,2002)。才艮據(jù)制造商的說明書(EZr7^RNAPCR試劑套裝，AppliedBiosystems,FosterCity,CA，美國)，以的反應體積進行QRT-PCR反應。應用聯(lián)合的溫度循環(huán)儀和焚光檢測儀(ABIPrism7700,AppliedBiosystems,FosterCity,CA,美國)來進行QRT-PCR分析。GAPDH、hPL、/3hCG和CRH的QRT-PCR分析的反應條件如上所述(Ng.etal.,C/zem"48:1212-1217,2002;Ngetal.,i^oc.iVa".爿cad.100:4748-4753,2003;及Ngeta1.,C//".CT^m.,49:727-731,2003)。對于其它的三種轉(zhuǎn)錄本，TPFI2和)3-球蛋白所用的PCR引物(GenesetOligos,新加坡)的濃度為200nM，KISS1的引物濃度為300nM，而PLAC1的引物濃度為400nM。TFPI2所用的熒光探針(AppliedBiosystems,FosterCity，CA,美國)的濃度為80nM，KISS1的熒光探針濃度為150nM，PLAC1的熒光纟笨針濃度為200nM，而/5-球蛋白的熒光探針濃度為300nM。在進行QRT-PCR之前，根據(jù)制造商的說明書利用DNaseI消化(Invitrogen，Carlsbad,CA)去除提取的胎盤組織RNA中的污染性的DNA。用0.4ng提取的胎盤RNA和提取的血漿RNA進行擴增。在每個分析中包括多個陰性水空白。用于TPFI2、KISS1、PLAC1和]8-球蛋白mRNA分沖斤的溫度方案如下為了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶發(fā)揮作用，將反應在50。C引發(fā)2分鐘，隨后在60°C進行反轉(zhuǎn)錄30分鐘。在95°C變性5分鐘后，進行40個循環(huán)的以下PCR:92。C變性15秒，對PLAC1在56。C、對TPFI2和KISS1在57。C以及對/3-球蛋白在58。C退火/延伸1分鐘。利用SigmaStat2.03軟件(SPSS)進行統(tǒng)計學分析。B.結(jié)果遞過義,/^^"遂歡和虎,,的母體A濕存本的葛麥產(chǎn)寡^"芬^為、^f^峑通過對每個受試者的組織樣本進行芯片分析得到5例頭三月CVS和5例末期胎盤的基因表達譜。在所述的CVS樣本和末期胎盤中發(fā)現(xiàn)分別有總計7226和8871基因轉(zhuǎn)錄本表達。以往有沖艮道，正常個體血漿中的循環(huán)DNA以造血細月包來源為主(Lmetal.,C//".CAem.,48:421-427,2002)。因此，假定母體血漿中的大部分背景母體核酸也源自造血室。由于本研究的最終目的是鑒定母體血漿的循環(huán)RNA分子中的胎兒特異的胎盤表達轉(zhuǎn)錄本，因此本發(fā)明者進一步獲取了配對母體全血的基因表達譜，并使用GeneChipMicroarraySuite5.0軟件(Affymetrix)將這些表達譜與對應的胎盤組織的表達譜進行比較。在所有5例對比中，選擇與對應的全血樣本相比所述CVS組織中表達水平"增加的"轉(zhuǎn)錄本，鑒定了早期妊娠中胎兒特異的胎盤表達轉(zhuǎn)錄本。類似地，與配對的母體全血樣本進行比較，從末期胎盤中鑒定出了晚期妊娠的胎兒特異轉(zhuǎn)錄本。這些步驟之后，排除在胎盤組織和母體血細胞中表達均較高的轉(zhuǎn)錄本，從而對所述頭三月和末三月妊娠得到分別為1245和1743個鑒定轉(zhuǎn)錄本的組。隨后根據(jù)所述5例CVS或5例末期胎盤組織的芯片表達信號的中位值(參見附表A和B中分別對早期和晚期妊娠所列的50條較高表達的轉(zhuǎn)錄本)對這兩組轉(zhuǎn)錄本以降序歸類。所產(chǎn)生的這兩組含有作為胎兒特異標志物在母體血漿中具有潛在可檢測性的候選轉(zhuǎn)錄本。圖1總結(jié)了鑒定這種胎兒特異標志物的策略。前述可在母體血漿中檢測到的三種mRNA轉(zhuǎn)錄本hPL、)ShCG和CRH出現(xiàn)在列表中，為這種方法4是供了獨立的證明。然而，因以往的研究沒有包括在所述胎盤和母體血漿中所述基因表達水平的信息，因此在進一步的分析中同時包括了這三種轉(zhuǎn)錄本和在所述列表中鑒定的三種新標志物TFPI2、KISS1和PLAC1。為比4交胎盤組織和母體血漿間的相關基因表達譜，選擇了所述列表中不同位置的轉(zhuǎn)錄本。表1總結(jié)了這6種轉(zhuǎn)錄本的芯片表達信號強度的中位值。首先將所有陣列的總強度的均縮放至目標強度值500，每種轉(zhuǎn)錄本的信號強度則按比例進行縮放，，并確定了5例CVS和5例末期胎盤組織中按比例縮放的轉(zhuǎn)錄本強度的中位值。使用6個一步實時QRT-PCR分析。通過QRT-PCR對IO例頭三月和10例末三月妊娠婦女的配對胎盤組織和血漿樣本中的6種所選胎盤mRNA轉(zhuǎn)錄本進行定量分析。在所有病例的胎盤組織中均能檢測到所述的6種轉(zhuǎn)錄本。這些轉(zhuǎn)錄本在頭三月和末三月妊娠期的母體血漿中的可檢測性和濃度的中位值總結(jié)在表1中。這些結(jié)果表明，所選的通過芯片分析鑒定的胎盤表達基因轉(zhuǎn)錄本中的大部分的確能在母體血漿中檢測到。一般說來，具有較高芯片信號強度中位值的轉(zhuǎn)錄本在母體血漿中更容易被檢測到。相反，對這6種被研究的胎盤表達基因中豐度最低的轉(zhuǎn)錄本觀察到零拷貝的母體血漿濃度中位值，即PLAC1在頭三月妊娠期及hCG/3與PLAC1在末三月妊娠期。因此，這些數(shù)據(jù)表明，如果在母體血漿中能夠明顯檢測到胎盤表達的轉(zhuǎn)錄本，則表明所述表達水平超過了芯片信號的閾值。為、說^母舉A,獎^0i^這的脊z秀本的清^如果所研究的轉(zhuǎn)錄本是妊娠特異的，則預計其應當在分娩后從母體血漿中清除。如以往研究(Ngetal.，A^//.爿caJ.100:4748-4753,2003;和Ngetal.,C//".C/zew.,49:727-731,2003)所述，分娩后hPL和CRHmRNA分子從母體血漿中快速清除。為探討TFPI2、KISS1和PLAC1mRNA從母體血漿中的清除，在分娩前和分娩后24小時從10例妊娠婦女獲取血漿樣本。在所述分娩前的血漿樣本中，TFPI2和KISS1mRNA濃度的中位值分別為112拷貝/mL和88拷貝/mL。兩種轉(zhuǎn)錄本在任何分娩后的血漿樣本中均未檢測到(圖8A和圖8B所示分別為TFPI2和KISS1mRNA)。對于PLAC1mRNA,在10例分娩前的血漿樣本中檢測到4例，而在任何產(chǎn)后樣本中均沒有才企測到信號(圖8C)。作為對照，在所有分娩前和分娩后的血漿樣本中均能檢測到GAPDHmRNA，而且其濃度沒有系統(tǒng)改變(Wilcoxon檢驗，P=0.563)。在母雄i,獎哞^miA^4#浙##侵襲'^應產(chǎn)差^《這*遽#確"通過檢測母體血漿中的胎盤轉(zhuǎn)錄本水平可間接檢測胎盤中的基因表達水平，從而尋找直接的證據(jù)。通過QRT-PCR對來自IO例頭三月和IO例末三月妊娠婦女的配對胎盤和血漿樣本進行hPL、hCG/3、CRH、TFPI2、KISS1和PLAC1mRNA分析。如果這些轉(zhuǎn)錄本在母體血漿中的水平確實反映了其在胎盤中的對應水平，那么就應該能在這些轉(zhuǎn)錄本在胎盤和母體血漿中的相對濃度之間觀察到陽性相關性。一種表達這些轉(zhuǎn)錄本的相對水平的可行方式是將其水平相對普通的胎盤特異轉(zhuǎn)錄本進行標準化。因hPLmRNA在妊娠全程中均能檢測到(Ngetal.,Prac.7Vw/.Jcad.6^4,100:4748-4753,2003)，因此選擇hPLmRNA作為參考。通過將每一胎盤或血漿樣本中的轉(zhuǎn)錄本水平除以同一樣本中對應的hPLmRNA的水平，來計算每種轉(zhuǎn)錄本的標準化水平。只對能在母體血漿中檢測到的轉(zhuǎn)錄本進行比較。因在所有現(xiàn)有的頭三月和末三月妊娠期母體血漿系列樣本中分別沒有4企測到PLAC1和hCG/,因此沒有將其包括在對應的分析中。圖9A和圖9B顯示了胎盤和配對母體血漿中hCG/3、CRH、TFPI2、KISS1和PLAC1mRNA的標準化轉(zhuǎn)錄本水平的圖象。在頭三月妊4艮期(Spearman相關性分析，r=0.452，P<0.05)和末三月妊娠期(Spearman相關性分析，r=0.661,P〈0.05)的胎盤和母體血漿結(jié)果中均觀察到陽性相關性。作為對照，也分析了兩種非胎盤特異的mRNA轉(zhuǎn)錄本對末三月樣本分析了/5-球蛋白，對頭三月和末三月樣本均分析了GAPDH。如圖9A和9B所示，這些非胎盤特異轉(zhuǎn)錄本明顯不依從所述胎盤特異轉(zhuǎn)錄本所表現(xiàn)出的相關性趨勢。這些數(shù)據(jù)表明，從母體血漿檢測到的所述胎盤特異mRNA的水平可用于評價胎盤的基因表達。C.結(jié)論開發(fā)了用于系統(tǒng)鑒定母體血漿中大規(guī)模的胎兒特異RNA標志物的策略(圖7)。這一策略是在胎盤是母體血漿中循環(huán)胎兒RNA的重要來源，以及正常個體中血漿DNA的主要造血來源的發(fā)現(xiàn)的基礎上設計的。用高密度寡核苷酸芯片來系統(tǒng)地鑒定大規(guī)模的胎盤表達轉(zhuǎn)錄本，以及選擇用于母體血漿檢測的潛在的胎兒特異的轉(zhuǎn)錄本，其中放棄將血細胞表達的基因作為潛在的靶標(附表A和B)。以往鑒定的編碼hPL、hCG/5和CRH的三種血漿胎盤特異mRNA標志物出現(xiàn)在所述的靶標列表中，并為所述轉(zhuǎn)錄本的選擇策略提供了獨立的證明。此外，通過QRT-PCR在母體血漿中也一企測到所述列表中給出的三種鑒定的mRNA標志物TFPI2、KISS1和PLAC1，并證明其胎盤組織表達水平高于某一閾值，而其在以往沒有被發(fā)現(xiàn)可用于非侵襲性產(chǎn)前監(jiān)測。分娩后其從母體血漿中快速清除證實了所述胎盤特異性。這些發(fā)現(xiàn)進一步驗證了用于鑒定母體血漿中胎兒特異轉(zhuǎn)錄本的策略。與所述的胎盤特異mRNA種類相對，沒有觀察到非胎盤特異轉(zhuǎn)錄本GAPDH和)8-球蛋白的血漿和胎盤標準化mRNA水平間的相關性。與所述胎盤特異轉(zhuǎn)錄本相比，母體血漿中存在相對較多的GAPDH和/3-球蛋白mRNA，其可以解釋為由母體組織例如造血細胞來產(chǎn)生這種非胎盤特異轉(zhuǎn)錄本。綜上，本發(fā)明證明母體血漿中的循環(huán)胎盤mRNA可用于妊娠的檢測以及非侵襲性產(chǎn)前基因表達i普的檢測。本發(fā)明還對快速、系統(tǒng)地鑒定用于此目的的新胎盤mRNA標志物的以芯片為基礎的方法進行了和l述。這種開發(fā)對于產(chǎn)生新的用于研究和監(jiān)測已知與胎盤病理學有關的諸如21號染色體三體性和先兆子癇的疾病狀態(tài)的標志物具有特殊的意義。此外，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)對非妊娠相關的疾病也有意義。例如在癌癥患者的血漿/血清中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了肺瘤相關的mRNA(參見，例如Loetal.,C"".CAew.,45:1292-1294,1999;和Silvaetal.，50:530-534，2002)，可利用相似的方法來快速產(chǎn)生新的血漿RNA為基礎的腫瘤標志物。本申請將所引用的全部專利、專利申請以及出版物全文引入作為參考。表1ACVS樣本的芯片結(jié)果和頭三月妊娠期的母體血漿中六種所選胎盤轉(zhuǎn)錄本的QRT-PCR結(jié)果的總結(jié)轉(zhuǎn)錄本CVS芯片信號的中位值頭三月妊娠期血漿中頭三月妊娠期血漿濃度的中的可檢測性(％)位值(拷貝/mL)31857904969hPL2650390769TFPI2241807038KISS1197565018CRH69417016PLAC1302000表1B末期胎盤組織的芯片結(jié)果和末三月妊娠期母體血漿中六種所選胎盤轉(zhuǎn)錄本的QRT-PCR結(jié)果的總結(jié)轉(zhuǎn)錄本末期胎盤芯片信號的中位值末三月妊娠期血漿中末三的可檢測性(％).月妊娠期血漿濃度的中位值(拷貝/mL)hPL3397210014707TFPI224896100189CRH170777098KISS11603310050/3hCG975900PLAC19755400附表A.在CVS組織中50種較高表達的基因的芯片檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>22097.636妊娠特異/3-l-糖蛋白4208191一x—atNM一002780.120730.7妊娠特異/3-1-糖蛋白2208134—xat雇一031246.120233.5妊娠特異/3-1-糖蛋白9209594一xatM34421.119939.4承KiSS陽l轉(zhuǎn)移抑制因子205563—atNM—002256.119755.8胎盤催乳素(v.2)206475—x—at顧—022640.119367.1妊娠特異/3-1-糖蛋白5204830—x—atNM_002781.119182.6生長激素2211508—s—atAF006060,118019.7S100鈣結(jié)合蛋白P204351—atNM一005980.117970.2妊娠特異/3-1-糖蛋白6208106—x_at畫—002782.317566.8絨毛膜生長催乳素激素2(v.2)207770_x_atNM—022644.117244.2CD63抗原(黑色素瘤1抗原)200663_at顧一OOl780.117061.25樣1同源物(果蠅)209560—s_atU15979.116415,0纖維粘連蛋白1210495_x_atAF130095.116046.9人cDNA:FLJ22066fis，克隆HEP10611202409_atX0786816024.8纖維粘連蛋白1216442—x—atAK026737.115834,1核糖體蛋白L31200963_x_at顧000993.115252.6解聚素和金屬蛋白酶功能域12(v.2)204943—atNM—021641.115007,3膠原，III型，al(克隆HEMBA1001071)215076—satAU14416714999.1妊娠特異/3-l-糖蛋白9207733—x—atNM一002784.114819.7分泌性磷蛋白1209875_s_atM83248.114665.3伊波(Epstein-Barr)病毒誘導基因3219424—at廳—005755.114617.0膠原，III型，al201852—x—atAI81375814494.7纖維粘連蛋白1211719—x_atBC005858.114157.1v，轉(zhuǎn)錄本變體；*選擇用于QRT-PCR研究的轉(zhuǎn)錄本*cortocotropin釋放激素位于此表中的第156位*胎盤特異l位于此表中的第412位附表B在末期胎盤組織中50個較高表達基因的基因芯片檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>權(quán)利要求1.用于檢測妊娠婦女中18號或21號染色體三體性胎兒存在的試劑盒，包括(i)用于定量測定所述妊娠婦女血液中mRNA含量的PCR引物，其中所述的mRNA為編碼人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)蛋白的mRNA；及(ii)代表懷有正常染色體胎兒的正常妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA的含量的標準對照。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述妊娠婦女的血液是無細胞的。3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中所述妊娠婦女的血液是血漿。4.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中所述妊娠婦女的血液是血5.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中所述婦女處于頭三月妊娠期。6.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中所述婦女處于中三月或末三月妊娠期。全文摘要本發(fā)明涉及作為妊娠相關病癥的診斷標志物的循環(huán)mRNA，具體地說涉及用于妊娠相關病癥的試劑盒，更具體地說，涉及通過定量分析母體血液中的一種或多種mRNA種類的含量來診斷、監(jiān)測或預測妊娠婦女的先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產(chǎn)的疾病狀態(tài)以及檢測婦女妊娠的試劑盒，所述的mRNA編碼人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)，所述試劑盒還包括該mRNA種類的含量的標準對照。文檔編號C12Q1/68GK101245376SQ20081000592公開日2008年8月20日申請日期2004年1月16日優(yōu)先權(quán)日2003年1月17日發(fā)明者盧煜明,吳啟安,徐寶賢,趙慧君申請人:香港中文大學