專利名稱：：作為妊娠相關(guān)病癥的診斷標(biāo)志物的循環(huán)mRNA的制作方法作為妊娠相關(guān)病癥的診斷標(biāo)志物的循環(huán)mRNA相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求在2003年1月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60,440,906號(hào)的優(yōu)先權(quán)，本發(fā)明引用其全文作為參考。發(fā)明背景通常采用諸如絨毛膜取樣(CVS)或羊膜穿刺術(shù)的方法從胎兒中分離細(xì)胞來(lái)進(jìn)行產(chǎn)前診斷。盡管操作非常仔細(xì)，但這些常規(guī)方法均是侵襲性的，并對(duì)母體和胎兒有一定的風(fēng)險(xiǎn)(Taboretal.,丄騰d1:1287-1293,1986)。在發(fā)現(xiàn)母體循環(huán)中存在一些類型的胎兒細(xì)胞(Johansenetal.，15:921-931,1995)之后，更重要的是在發(fā)現(xiàn)母體血漿和血清中能夠檢測(cè)到循環(huán)的無(wú)細(xì)胞的胎兒DNA(Loetal.，Lancet350:485-487,1997)之后，已經(jīng)開發(fā)了替代這些侵襲性方法的產(chǎn)前篩查方法，例如檢測(cè)胎兒異常的方法。已證明，母體血液中的胎兒DNA的含量足夠用于遺傳學(xué)分一斤，與分離和富集胎兒細(xì)胞的必需步驟相比，并不需要對(duì)所述血漿或血清進(jìn)行復(fù)雜的處理。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)母體血液中的胎兒DNA來(lái)實(shí)現(xiàn)胎兒rhesusD(RhD)基因型的檢測(cè)(Loetal.,TV.五wg/.Me丄339:1734-1738,1998)、月臺(tái)兒性別的確定(Loetal.，//wm.G匿L90:483-488,1993)、以及一些胎兒病癥的診斷(Amicuccietal"C"".CA亂46:301-302，2000;Saitoetal"丄匿W356:1170,2000;及Chiuetal.，360:998-1000，2002)。此外，也有報(bào)道稱在先兆子癇(Loetal"C//w.CA亂45:184-188，1999和Zhongetal"顛.丄G戸co/.184:414-419,2001)、月臺(tái)兒21號(hào)染色體三體性(trisomy)(Loetal"dCZ綴.45:1747-1751，1999和Zhongetal.i^Vzgw.20:795-798,2000)和妊娠劇吐癥(hyperemesisgravidarum)(Sekizawaetal"C"".C力e附.47:2164-2165,2001)的母體血漿/血清中胎兒DNA含量異常的報(bào)道。美國(guó)專利第6,258,540號(hào)也公開了用于產(chǎn)前遺傳分析的母體血液中胎兒核酸的檢測(cè)。在分析胎兒DNA時(shí)，檢測(cè)者通常利用僅出現(xiàn)在男性胎兒中的Y染色體標(biāo)志物作為胎兒的特異性標(biāo)志物。這種方法使此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用局限于50%的妊娠婦女，這些妊娠婦女懷有男性胎兒。此外，其它遺傳多態(tài)性的利用，也增加了胎兒DNA為基礎(chǔ)的分析的復(fù)雜性。母體血漿中胎兒RNA的發(fā)現(xiàn)提供了超越這些限制的可能的新方法(Poonetal.,C7/".C/^m.46:1832-1834，2000).最近，美國(guó)專利申請(qǐng)第09/876,005號(hào)公開了以母體血液中胎兒RNA檢測(cè)為基礎(chǔ)的非侵襲性技術(shù)。本發(fā)明第一次公開了在母體血液中出現(xiàn)的某些mRNA種類的含量能夠用作診斷、監(jiān)測(cè)或預(yù)測(cè)諸如先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產(chǎn)的妊娠相關(guān)病癥、以及4企測(cè)妊娠的標(biāo)志物，所述mRNA種類包括編碼人絨毛膜促性腺激素15亞基(hCG-l3)、人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(hCRH)、人胎盤促乳素(hPL)、KiSS-l轉(zhuǎn)移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的mRNA。發(fā)明概述本發(fā)明提供了通過(guò)4會(huì)測(cè)母體血液中的一種或多種循環(huán)mRNA的含量來(lái)診斷、監(jiān)測(cè)或預(yù)測(cè)諸如先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產(chǎn)的妊娠相關(guān)病癥的新方法。本發(fā)明還4是供了基于相同方法學(xué)的檢測(cè)婦女妊娠的方法。所述的mRNA可以編碼諸如人絨毛膜促性腺激素jS亞基(hCG-)S)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(hCRH)、KiSS-l轉(zhuǎn)移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的胎兒或母體來(lái)源的蛋白。同時(shí)也提供本發(fā)明的一個(gè)方面涉及i貪斷、監(jiān)測(cè)或預(yù)測(cè)妊娠婦女的先兆子癇的方法。此方法包括多個(gè)步驟第一步是定量測(cè)定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定mRNA種類的含量。所述mRNA可編碼hCG-)S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。第二步是將第一步獲得的mRNA含量與代表正常非先兆子癇的婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照進(jìn)行比較。所述mRNA水平的增加或降〗氐表明存在先兆子癇或發(fā)展為所述疾病狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)增加。在一些實(shí)施方案中，此方法中用作標(biāo)志物的mRNA編碼hCRH或GAPDH。在一些實(shí)施方案中，所述方法的第一步通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)進(jìn)行，而在其它實(shí)施方案中，第一步可采用多核苷酸雜交方法或質(zhì)譜方法來(lái)實(shí)施。在一些實(shí)施方案中，所述妊娠婦女處于妊娠期的頭三月，而其它實(shí)施方案中，所述婦女處于妊娠期的中三月或末三月。在一些實(shí)施方案中，所述妊娠婦女的血液在用于所述方法的第一步之前是無(wú)細(xì)胞的。在一些實(shí)施方案中，在所述方法的第一步中使用血漿或血清。在一些實(shí)施方案中，所述mRNA含量的增加高于標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照2倍。本發(fā)明的方法也可用于診斷、監(jiān)測(cè)或預(yù)測(cè)比先兆子癇更嚴(yán)重的諸如驚厥的臨床病程。本發(fā)明還涉及診斷、監(jiān)測(cè)或預(yù)測(cè)妊娠婦女的先兆子癇的試劑盒。所述的試劑盒包括用于定量測(cè)定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定mRNA種類的PCR引物。所述的mRNA可編碼hCG-/3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。所述試劑盒還包括代表正常非先兆子癇的婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。本發(fā)明的試劑盒在所述PCR引物之外還可包括一種或多種用于定量測(cè)定編碼hCG-/5、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA含量的探針，或用其替代所述PCR引物。本發(fā)明的另一方面涉及用于檢測(cè)妊娠婦女中諸如18號(hào)染色體三體性或21號(hào)染色體三體性的胎兒染色體非整倍性的方法:此方法包括多個(gè)步驟第一步是定量測(cè)定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定mRNA種類的含量。所述mRNA可編碼hCG-)S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH。第二步是將第一步獲得的mRNA含量與代表懷有正常染色體胎兒的正常妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照進(jìn)行比較。所述mRNA水平的增加或降低表明懷有非整倍體胎兒的風(fēng)險(xiǎn)增加。在一些實(shí)施方案中，此方法中用作標(biāo)志物的mRNA編碼hCG-/5。在一些實(shí)施方案中，所述方法的第一步通過(guò)RT-PCR進(jìn)行，而在其它實(shí)施方案中，第一步可采用多核苷酸雜交方法或質(zhì)譜方法來(lái)實(shí)施。在一些實(shí)施方案中，所述妊娠婦女處于妊娠期的頭三月，而在其它實(shí)施方案中，所述妊娠婦女處于妊娠期的中三月或末三月。在一些實(shí)施方案中，所述妊娠婦女的血液在用于所述方法的第一步之前是無(wú)細(xì)胞的。在一些實(shí)施方案中，在所述方法的第一步中使用血漿或血清。在一些實(shí)施方案中，所述增加至少為2倍，而所述降低至少為50%。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)妊娠婦女中胎兒染色體非整倍性(諸如18號(hào)染色體三體性或21號(hào)染色體三體性)的試劑盒。所述的試劑盒包括用于定量測(cè)定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定種類的mRNA的PCR引物。所述的mRNA可編碼hCG-/3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH。所述試劑盒還包括代表懷有染色體正常胎兒的正常婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。本發(fā)明的試劑盒除所述PCR引物之外還可包括一種或多種用于定量測(cè)定編碼hCG-)S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH的mRNA含量的探針，或用其^務(wù)代所述PCR引物。本發(fā)明的另一方面涉及診斷、監(jiān)測(cè)或預(yù)測(cè)妊娠婦女的早產(chǎn)(pre-termlabor)的方法。此方法包括多個(gè)步驟第一步是定量測(cè)定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定種類的mRNA的含量。所述mRNA可編碼hCG-j3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。第二步是將第一步獲得的mRNA含量與代表如期分娩或?qū)?huì)如期分娩的正常妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照進(jìn)行比較。所述mRNA水平的增加或降低表明早產(chǎn)或發(fā)展為此狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)增加。在一些實(shí)施方案中，所述方法的第一步通過(guò)RT-PCR進(jìn)4亍，而在其它實(shí)施方案中，第一步采用多核苷酸雜交方法或質(zhì)譜方法來(lái)實(shí)施。在一些實(shí)施方案中，所述妊娠婦女處于妊娠期的頭三月，而在其它的實(shí)施方案中，所述妊娠婦女處于妊娠期的中三月或末三月。在一些實(shí)施方案中，所述妊娠婦女的血液在用于所述方法的第一步之前是無(wú)細(xì)力包的。在一些實(shí)施方案中，在所述方法的第一步中使用血漿或血清。在一些實(shí)施方案中，所述mRNA含量的增加高于標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照2倍。在另一些實(shí)施方案中，所述的降低至少為50%。本發(fā)明還涉及診斷、監(jiān)測(cè)或預(yù)測(cè)妊娠婦女的早產(chǎn)的試劑盒。所述的試劑盒包括用于定量測(cè)定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定種類的mRNA的PCR引物。所述的mRNA可編碼hCG-]S、hCRH、hPL、KISSl、TPFI2、PLACl或GAPDH。所述試劑盒還包括代表如期分娩或?qū)?huì)如期分娩的正常妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。本發(fā)明的試劑盒除所述PCR引物之外還可包括一種或多種用于定量測(cè)定編碼hCG-/3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLACl或GAPDH的mRNA含量的探針，或用其替代所述PCR引物。本發(fā)明的另一方面涉及檢測(cè)婦女妊娠的方法。此方法包括多個(gè)步-驟第一步是定量測(cè)定所述婦女血液中的一種或多種特定種類的mRNA的含量。所述mRNA可編碼hCG-(S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLACl。第二步是將第一步獲得的mRNA含量與代表健康且未妊娠的正常婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照進(jìn)行比較。所述mRNA水平增加表明妊娠。在一些實(shí)施方案中，所述方法的第一步通過(guò)RT-PCR進(jìn)行，而在其它實(shí)施方案中，第一步采用多核苷酸雜交方法或質(zhì)譜方法來(lái)實(shí)施。在一些實(shí)施方案中，所述妊娠婦女的血液在用于所述方法的第一步之前是無(wú)細(xì)胞的。在一些實(shí)施方案中，在所述方法的第一步中使用血漿或血清。在一些實(shí)施方案中，所述mRNA含量的增加高于標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照2倍。在另一些實(shí)施方案中，所述的降低至少為50%。本發(fā)明還涉及檢測(cè)婦女妊娠的試劑盒。所述的試劑盒包括用于定量測(cè)定所述妊娠婦女血液中一種或多種特定種類的mRNA的PCR引物。所述的mRNA可編碼hCG-/3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLACl。所述試劑盒還包括代表健康且未妊娠的正常婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。本發(fā)明的試劑盒除所述PCR引物之外還可包括一種或多種用于定量測(cè)定編碼hCG-^、hCRH、hPL、KISSl、TPFI2或PLACl的mRNA含量的探針，或用其替代所述PCR引物。附圖的簡(jiǎn)要描述圖l所示為分娩后母體血漿中C///mRNA的清除狀況(A)為分娩前和分娩后2小時(shí)母體血漿中CiZ/mRNA的濃度，(B)則為分娩前和分娩后2小時(shí)母體血漿中GJ尸i)//RNA的濃度。每一條線代表從一個(gè)受試者獲得的一份血漿樣本。圖2為先兆子癇和對(duì)照組母體血漿中CiZ/mRNA濃度的盒須圖(boxplot)。Ci//mRNA濃度以拷貝/mL表示。所述盒中的橫線表示中位凄史。所述盒標(biāo)志25th與75th百分點(diǎn)之間的區(qū)間。所述須(whisker)表示10"與90th百分點(diǎn)之間的區(qū)間。實(shí)心原點(diǎn)標(biāo)志l(f與90th百分點(diǎn)區(qū)間以外的數(shù)據(jù)點(diǎn)。圖3所示為正常妊娠母體血漿中胎盤來(lái)源的mRNA的水平。(A)為不同妊娠階段母體血漿中hPLmRNA和母體血清中蛋白水平的盒須圖。(B)為不同妊娠階段母體血漿中/3hCGmRNA和母體血清中hCG蛋白水平的盒須圖。所述盒中的橫線表示中位數(shù)。所述盒標(biāo)志25111與75"百分點(diǎn)之間的區(qū)間。所述須表示10th與90th百分點(diǎn)之間的區(qū)間。實(shí)心原點(diǎn)標(biāo)志10th與90th百分點(diǎn)區(qū)間以外的數(shù)據(jù)點(diǎn)。(C)為母體血漿中hPLmRNA和母體血清中蛋白水平之間的相關(guān)性分析。(D)為母體血漿中/5hCGmRNA和母體血清中蛋白水平之間的相關(guān)性分析。圖4所示為分娩后母體血漿中hPLmRNA的清除狀況。(A)為分娩前和分娩后24小時(shí)的母體血漿hPLmRNA水平，而(B)為分4免前和分4免后24小時(shí)的母體血漿GAPDHmRNA水平。顯示了8例血漿樣本的結(jié)果，且每一條線代表從一個(gè)受試者獲得的一份血漿樣本。(C)為分娩前和分娩后2小時(shí)的母體血漿hPLmRNA水平，而(D)為分4免前和分4免后2小時(shí)的母體血漿GAPDHmRNA水平。顯示了13例血漿樣本的結(jié)果，且每一條線代表從一個(gè)受試者獲得的一份血漿樣本。圖5顯示了母體血漿中GAPDHmRNA的含量。樣本1-12來(lái)自正常妊娠婦女，而樣本28-37來(lái)自先兆子癇婦女。圖6顯示了非整倍體和對(duì)照妊娠的妊娠期頭三月中母體血清hCG/SmRNA的濃度。盒須圖顯示了對(duì)照、21號(hào)染色體三體性(T21)和18號(hào)染色體三體性(T18)妊娠者的血清中的hCG/3mRNA濃度(常用對(duì)數(shù)取值)。所述盒中的橫線表示中位數(shù)。所述盒標(biāo)志25"與75"百分點(diǎn)之間的區(qū)間。所述須表示10th與90th百分點(diǎn)之間的區(qū)間。實(shí)心原點(diǎn)標(biāo)志10th與90th百分點(diǎn)區(qū)間以外的數(shù)據(jù)點(diǎn)。圖7所示為用于母體血漿中妊娠特異胎盤表達(dá)的mRNA標(biāo)志物的系統(tǒng)鑒定的策略的概括。收集配對(duì)的胎盤組織和母體全血樣本，并對(duì)其進(jìn)行寡核苷酸芯片分析。挑選相對(duì)于全血在所述胎盤組織中表達(dá)增加的轉(zhuǎn)錄本，并且通過(guò)對(duì)母體血漿的定量反轉(zhuǎn)錄酶PCR(QRT-PCR)來(lái)評(píng)價(jià)其在母體血漿中的可檢測(cè)性和妊娠特異性。圖8所示為分娩后母體血漿中胎盤mRNA的清除狀況。通過(guò)QRT-PCR檢測(cè)了分娩前和分娩后24小時(shí)母體血漿中(A)TFPI2mRNA、(B)KISS1mRNA和(C)PLAC1mRNA的濃度。每一條線代表從一個(gè)受試者獲得的一份血漿樣本。圖9顯示了母體血漿和胎盤組織中標(biāo)準(zhǔn)化胎盤mRNA水平的相關(guān)性。(A)為頭三月妊娠期血漿和CVS間的標(biāo)準(zhǔn)化胎盤mRNA水平的相關(guān)性。(B)為末三月妊娠期血漿和末期胎盤間標(biāo)準(zhǔn)化胎盤mRNA水平的相關(guān)性。通過(guò)QRT-PCR測(cè)定血漿和胎盤組織中的標(biāo)準(zhǔn)化的/3hCG(ni3hCG)、TFPI2(nTFPI2)、KISS1(nKISSl)、CRH(nCRH)和PLAC1(nPLACl)mRNA的水平，并分別用圖例中所說(shuō)明的符號(hào)來(lái)表示。對(duì)于非胎盤表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，也顯示了標(biāo)準(zhǔn)化的GAPDH(nGAPDH)和/3-球蛋白(n/3-球蛋白)的結(jié)果。定義本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"先兆子癇"指在妊娠過(guò)程中發(fā)生的疾病狀態(tài)，其主要癥狀為多種形式的高血壓并常伴有尿蛋白和水腫(浮腫)。先兆子癇有時(shí)稱為妊娠毒血癥，與更嚴(yán)重的稱為驚厥的病癥有關(guān)，其為先兆子癇結(jié)合癲癇發(fā)作。盡管其在出生后可立即發(fā)生或在妊娠20周之前發(fā)生，這些疾病狀態(tài)通常在妊娠的后半程(20周后)發(fā)病。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"染色體非整倍性"指染色體異常的狀態(tài)，其中染色體數(shù)目不是通常單倍體數(shù)目的精確的多倍體經(jīng)常是增加染色體或缺失一個(gè)。染色體非整倍性的最常見的情況是三體性，其中出現(xiàn)單個(gè)增加的染色體。例如18號(hào)染色體三體性是在細(xì)胞中出現(xiàn)第三條18號(hào)染色體的染色體異常，而細(xì)胞中存在第三條21號(hào)染色體的患者則患有21號(hào)染色體三體性疾病。與非整倍性相反，"染色體正常"指染色體數(shù)目是所述單倍體數(shù)目的精確的多倍體的狀態(tài)，例如單倍體的染色體數(shù)目的兩倍，且每種染色體以相同的數(shù)目存在(除例如男性人類的性染色體外，其中兩種不同的性染色體X和Y各以一個(gè)拷貝存在)。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"早產(chǎn)"或"提前分娩，，指在約40周的完全妊娠期屆滿前3周以上發(fā)生分娩的狀態(tài)，如果不處理常導(dǎo)致早產(chǎn)。相對(duì)的，本申請(qǐng)所用的"如期分娩或?qū)?huì)如期分娩"的妊娠婦女指從懷胎至完全的孕期未發(fā)生早產(chǎn)的妊娠婦女。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"血液"指從妊娠婦女或妊娠可能性一企測(cè)的婦女荻得的血液樣本或制備產(chǎn)物。該術(shù)語(yǔ)包括全血或血液的任何組分，其基本不含造血細(xì)胞或任意母體或胎兒來(lái)源的其它類型的細(xì)胞，包括血小4反。"血液"通常不含有特定的物質(zhì)，該物質(zhì)可含有母體或胎兒來(lái)源的RNA。"血液"的例子包括血漿和血清?；静缓?xì)胞的血液樣本也稱為"無(wú)細(xì)胞的，，，其中通常不存在血小板。本文用于描述非先兆子癇、懷有染色體正常胎兒或沒(méi)有且不會(huì)出現(xiàn)早產(chǎn)的妊娠婦女的術(shù)語(yǔ)"正常，，指某些特征，例如編碼在母體血液中發(fā)現(xiàn)的一種或多種特定胎兒蛋白的mRNA水平，其在一組隨機(jī)選擇的非先兆子癇、懷有染色體正常胎兒或沒(méi)有且不會(huì)出現(xiàn)早產(chǎn)的婦女中具有代表性。所選擇的這組應(yīng)包括充足數(shù)量的婦女，從而使這些婦女中編碼特定胎兒蛋白的平均mRNA水平以適當(dāng)?shù)木_度反映懷有健康胎兒的健康妊娠婦女的整個(gè)群體的mRNA水平。此外，所選"f奪的這組婦女應(yīng)與那些抬r測(cè)血液中先兆子癇、胎兒染色體非整倍性或早產(chǎn)指征的婦女有相似的妊娠齡。根據(jù)欲篩查的病癥，用于本發(fā)明實(shí)踐的優(yōu)選的妊娠齡可以不同。例如篩查先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的妊娠婦女優(yōu)選在妊娠期中三月期間進(jìn)行，而優(yōu)選盡可能早地對(duì)胎兒染色體非整倍性進(jìn)行篩查和診斷。而且，檢測(cè)的優(yōu)選妊娠齡也依賴于檢測(cè)中所用的mRNA標(biāo)志物。例如，hPLmRNA在所有三個(gè)三月妊娠期中均可檢測(cè)，而隨著妊娠進(jìn)程hCRHmRNA的可檢測(cè)性逐步增加。術(shù)語(yǔ)"正常"也同樣用于指特定mRNA種類的含量代表在一組隨機(jī):沐選的非妊娠健康婦女血液中的含量。本發(fā)明所用的人絨毛膜促性腺激素)8亞基(hCG-Z3)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(hCRH)、KiSS-l轉(zhuǎn)移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(0六？0印，指示例性地其序列分別如GenBank登錄號(hào)NM—000737.2、NM—022640、NM—000756、U43527、NM_006528、BC022335和BC014085所給出的基因(包括其變體和突變體)和其多核苷酸轉(zhuǎn)錄本。在一些描述中，這些術(shù)語(yǔ)也指這些基因編碼的蛋白。本發(fā)明所用"標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照"指適合在本發(fā)明方法中使用來(lái)定量測(cè)定編碼特定蛋白，例如hCG-i8、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA含量的樣本。這些樣本含有已知含量的編碼特定蛋白的mRNA，其非常逼近反映正常妊娠婦女中此種mRNA的平均水平，如上所述該妊娠婦女是非先兆子癇、懷有染色體正常胎兒或沒(méi)有且不會(huì)出現(xiàn)早產(chǎn)的婦女。類似地，"標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照"也可來(lái)自正常的健康非妊娠婦女。本發(fā)明所用"mRNA含量比標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照增加或降低，，指含量相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照發(fā)生陽(yáng)性或陰性變化。增加優(yōu)選為至少2倍，更優(yōu)選為至少54咅，并最優(yōu)選為至少10倍。相似地，降低優(yōu)選為至少50%，更優(yōu)選為至少80%,并最優(yōu)選為至少90%。本發(fā)明所用的"多聚核苷酸雜交方法"指依據(jù)其形成Watson-Crick堿基配對(duì)的能力，在適合的雜交條件下，利用已知序列的多聚核苷酸探針來(lái)檢測(cè)多聚核苷酸存在和/或數(shù)量的方法。這種雜交方法的例子包括Southern印記和Northern印記雜交。本發(fā)明所用"PCR探針"指寡核苷酸，其在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中用于擴(kuò)增源于編碼諸如hCG-)8、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的目標(biāo)蛋白的mRNA的核苷酸序列。至少一種用于擴(kuò)增編碼上述指定蛋白的核苷酸序列的PCR引物對(duì)所述蛋白是序列特異的。發(fā)明的詳細(xì)描述I.引言本發(fā)明第一次提供了通過(guò)分析存在于婦女血液中的一種或多種編碼hCG-/5、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA來(lái)診斷、監(jiān)測(cè)或預(yù)測(cè)妊娠婦女中先兆子癇、胎兒染色體非整倍性(諸如18號(hào)染色體三體性和21號(hào)染色體三體性)和早產(chǎn)，以及才企測(cè)婦女妊娠的方法和試劑盒。根據(jù)本發(fā)明，能夠定量測(cè)定母體血液樣本中編碼hCG-|3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的含量，優(yōu)選通過(guò)擴(kuò)增方法來(lái)進(jìn)行，例如反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。隨后將一種或多種上述指定的mRNA種類與具有相同種類的mRNA的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的水平進(jìn)行比婦女。mRNA水平的增加或降低表明存在所述病癥或發(fā)展為所述病癥的風(fēng)險(xiǎn)增加。因而，本發(fā)明提供了診斷先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產(chǎn)的新方法，其是非侵襲性的并且是非性別和多態(tài)性依賴的。根據(jù)相同的方法學(xué)，通過(guò)將婦女血液中編碼hCG-Z5、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLAC1的一種或多種mRNA種類的水平與來(lái)自正常非妊娠婦女的對(duì)照值進(jìn)行比較，本發(fā)明也可用于檢測(cè)妊娠。II.血液樣本的制備A.獲得血液樣本妊娠婦女中或從才企測(cè)妊娠可能性的婦女中獲取血液才羊本。如上所述，依據(jù)所檢測(cè)的病癥，有時(shí)依據(jù)所用的mRNA標(biāo)志物，所述適合的妊娠齡可以不同。根據(jù)醫(yī)院和臨床通常采用的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行婦女血液的收集。收集適量的外周血，例如5-20ml，并可在進(jìn)一步制備之前根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的步驟進(jìn)行儲(chǔ)存。B.制備無(wú)細(xì)胞血液樣本婦女血液的血清或血漿適合于本發(fā)明，并可通過(guò)公知的方法來(lái)獲得。例如，將婦女血液放入含有EDTA或諸如VacutainerSST(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)的商業(yè)銷售的專用產(chǎn)品的管中來(lái)防止血液凝集，隨后通過(guò)離心可從全血中獲得血漿。另一方面，血液凝集后通過(guò)離心可獲得血清。通常在冷卻的環(huán)境例如約4-10。C的溫度中，采用適合的速度例如1,500-3,000xg下，進(jìn)行離心。在轉(zhuǎn)移至新管中進(jìn)行RNA換:取前，可對(duì)血漿或血清進(jìn)行額外的離心步驟。III.婦女血液中mRNA含量的定量測(cè)定A.mRNA的提取有多種從生物樣本中提取mRNA的方法?？梢罁?jù)通常的mRNA制備方；去(i"列^口Sambrook禾口Russell,Afo/eciz/arC7ow/gv爿丄fl60rato7Mawwa/第三版，2001中所述)來(lái)進(jìn)行；也可利用各種商業(yè)銷售的試劑或試劑盒，例如Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)、OligotexDirectmRNA試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)、RNeasyMinii式劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)以及PolyATtractSeries9600TM(Promega，Madison,WI)來(lái)從婦女血液樣本中獲取mRNA。也可將一種以上的上述方法組合釆用。從RNA制備產(chǎn)物中去除污染性的DNA是必要的。因此，應(yīng)該對(duì)樣本小心操作，利用DNase全面處理，在擴(kuò)增和定量步驟中使用適合的陰性對(duì)照。B.PCR為基礎(chǔ)的mRNA水平的定量測(cè)定一旦從婦女血液樣本中提耳又出mRNA，即可對(duì)編碼諸如hCG-]S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的目標(biāo)蛋白的mRNA含量進(jìn)行定量檢測(cè)。測(cè)定mRNA水平的優(yōu)選方法是擴(kuò)增為基礎(chǔ)的方法，例如PCR。在擴(kuò)增步驟之前，必須合成目標(biāo)mRNA的DNA復(fù)制本(cDNA)。這通過(guò)反轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)，其可分開進(jìn)行或在一種擴(kuò)增RNA的改進(jìn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)——均質(zhì)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)中進(jìn)行。適合核糖核酸的PCR擴(kuò)增的方法如Romero與Rotbart的Z)/agwas"cAfo/ecw/ar5z'o/ogy:PnTzc/p/^s14pp//c<^'owpp.401-406;Persingetal.，eds.,MayoFoundation,Rochester,MN,1993;Eggeretal"/.dM/cra6/o/.33:1442-1447，1995;及美國(guó)專利第5,075,212所述。PCR的常規(guī)方法是本領(lǐng)域公知的，因此本發(fā)明對(duì)其不作詳細(xì)描述。關(guān)于PCR方法、方案及設(shè)計(jì)引物的原則的綜述參見例如Innis,etal.,PCW/V0/0c0/5vJGwzWetoMeAcxis朋d4P///ca^/is，AcademicPress,Inc.N.Y.，1990。從諸如RocheMolecularSystems的供應(yīng)商處也可獲得PCR試劑和方案。通常PCR借助耐熱酶以自動(dòng)過(guò)程來(lái)完成。在此過(guò)程中，通過(guò)變性區(qū)、引物退火區(qū)及延伸反應(yīng)區(qū)使反應(yīng)混合物的溫度自動(dòng)循環(huán)。適合此目的的儀器可通過(guò)商業(yè)渠道獲得。盡管本發(fā)明實(shí)施時(shí)通常采用PCR來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)mRNA。^旦本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，也可通過(guò)任何公知的方法來(lái)完成母體血液樣本中的這些mRNA種類的擴(kuò)增，這些方法例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增及自我持續(xù)序列復(fù)制或核酸序列為基礎(chǔ)的擴(kuò)增(NASBA)，這些方法中的每一種都提供了充分的擴(kuò)增。最近開發(fā)的分枝DNA技術(shù)(branched-DNAtechnology)也可用于定量測(cè)定母體血液中的mRNA標(biāo)志物的含量。用于臨床樣本中核酸序列的直接定量的分枝DNA信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)的綜述可參見Nolte,恭.C//".CT復(fù)33:201-235,1998。C.其它的定量方法也可利用其它的本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)來(lái)檢測(cè)目標(biāo)mRNA。盡管所述的檢測(cè)步驟之前通常有擴(kuò)增步驟，但擴(kuò)增并不是本發(fā)明方法所必需的。例如，無(wú)論是否先進(jìn)行擴(kuò)增步驟，均可通過(guò)大小分級(jí)來(lái)鑒定所述mRNA(例如凝膠電泳)。根據(jù)公知的技術(shù)(參見上述的Sambrook和Russell)將樣本在凝膠或聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳并用溴化乙錠進(jìn)行標(biāo)記，存在與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照大小相同的條帶是存在目標(biāo)mRNA的標(biāo)志，然后根據(jù)所述條帶的強(qiáng)度可將其含量與對(duì)照進(jìn)行比較?？蛇x擇地，利用對(duì)編碼例如hCG-/3、hCRH、hPL、KISSl、TPFI2、PLACl或GAPDH的mRNA特異的寡核苷酸探針來(lái)檢測(cè)這些mRNA種類的存在，并根據(jù)所述探針輸出的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)指示相對(duì)于所述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的含量。序列特異探針雜交是公知的檢測(cè)包括其它種類核酸在內(nèi)的特定核酸的方法。在足夠嚴(yán)格的雜交條件下，所述探針僅與基本互補(bǔ)的序列特異雜交?？煞艑捤龅膰?yán)格雜交條件使得不定數(shù)目的序列錯(cuò)配。一些雜交的模式是本領(lǐng)域^^知的，包括但不限于液相、固相或混和相雜交分析。以下文章提供了多種雜交分析模式的概述Singeretal.，S/otecAw々wes4:230,1986;Haaseetal.,她Ao^sWra/ogy,pp.189-226，1984;Wilkinson,/"外6rWz""ow，Wilkinsoned.,IRLPress,OxfordUniversityPress,Oxford;及Hames和Higginseds.,M/c/e/c/fyZnWz加'亂'J尸rac"cfl/J//roac力,IRLPress,1987。根據(jù)公知的技術(shù)檢測(cè)雜交復(fù)合物，且該檢測(cè)并不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面。可使用通常用于檢測(cè)雜交核酸的存在的幾種方法中的任何一種來(lái)標(biāo)記能夠與目標(biāo)核酸(即所述的mRNA或擴(kuò)增的DNA)特異雜交的核酸才笨針。一種通用的檢測(cè)方法是借助3H、125I、35S、"C或32P等等標(biāo)記的探針的放射自顯影。依據(jù)所選擇同位素合成的難易、穩(wěn)定性和半衰期的研究參數(shù)來(lái)選擇放射性同位素。其它標(biāo)記物包括能夠與抗配體結(jié)合的化合物(例如生物素和地高辛(digoxigenin))或用熒光素、化學(xué)發(fā)光劑和酶標(biāo)記的抗體?？蛇x擇地，探針能夠與諸如熒光素、化學(xué)發(fā)光劑或酶的標(biāo)記物直接連接。依據(jù)所要求的敏感性、與所述探針連接的難易、穩(wěn)定性要求和現(xiàn)有的設(shè)備來(lái)選擇標(biāo)記物。利用公知的技術(shù)可合成和標(biāo)記本發(fā)明實(shí)施中必需的探針和引物?？刹鹏薏啪覤eaucage和Caruthers，7^ra/zedraw丄e"s.，22:1859-1862，1981中首次描述的固相石粦酰胺酉吏三酯(phosphoramiditetriester)方法，利用如Needham-VanDevanteretal.,M/cto'c爿c油L12:6159-6168,1984所述的自動(dòng)合成儀來(lái)化學(xué)合成用作探針和引物的寡核苷酸。如Pearson和Regnier,C/zraw.,255:137-149,1983所述，通過(guò)天然丙烯酰胺凝月交電泳或陰離子交換HPLC來(lái)純化寡核苷酸。IV.建立標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照為了建立標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，首先選擇懷有健康胎兒的一組健康妊娠婦女。這些婦女應(yīng)是相似妊娠齡的，并處于適合用本發(fā)明方法篩查諸如先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產(chǎn)的病癥的妊娠時(shí)間段。類似地，利用來(lái)自一組健康的非妊娠婦女的樣本建立標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。通過(guò)成熟的、常規(guī)使用的方法來(lái)確認(rèn)所選妊娠婦女和其所懷胎兒的健康狀況，所述方法包括但不限于檢測(cè)所述婦女的血壓、記錄分娩的發(fā)生和利用CVS和羊水穿刺術(shù)進(jìn)行胎兒遺傳性分析。此外，所選擇的這組懷有健康胎兒的健康妊娠婦女或健康非妊娠婦女必須有一定的規(guī)^莫，/人而^Mv該組計(jì)算得到的編碼hCG-i3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的平均含量能夠可信地代表懷有健康胎兒的健康婦女或健康非妊娠婦女總?cè)后w的正?；蚱骄?。優(yōu)選地，所選組包括至少IO位婦女。一旦依據(jù)所選組中每位婦女的個(gè)體值，建立編碼任一蛋白的mRNA含量的平均值，則該值即被認(rèn)為是所述mRNA種類的標(biāo)準(zhǔn)值。因此，任何含有相似含量的同種mRNA的血液樣本均可用作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。也可人工組合得到所含編碼hCG-(S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的濃度等于所建立的同種mRNA的平均濃度的溶液，并將其作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。域所屬技術(shù)人員應(yīng)容易地認(rèn)識(shí)到，通過(guò)改變或修改各種非關(guān)鍵性的參數(shù)也能實(shí)現(xiàn)基本相似的結(jié)果。實(shí)施例實(shí)施例1:先兆子癇婦女的hCRHmRNA水平升高A.方法憂試者在得到知情同意和研究倫理委員會(huì)(ResearchEthicsCommittee)批準(zhǔn)的前提下，從妊娠婦女收集外周血樣本，這些妊娠婦女在香港PrinceofWales醫(yī)院婦產(chǎn)科看病。在此研究的第一部分，從10例末三月妊娠期的健康妊娠婦女獲得血液樣本。在此課題的第二部分，征募具有簡(jiǎn)單妊娠的即將進(jìn)行選擇性剖腹產(chǎn)手術(shù)的4例妊娠婦女。在即將分娩前和分娩后2小時(shí)采集這些受試者的外周血樣本。此研究的第三部分，對(duì)兩組患者進(jìn)行了研究>12例先兆子癇婦女和fWIO例對(duì)照妊娠婦女。所述先兆子癇和對(duì)照組的中位妊娠齡分別為37周和38周。在沒(méi)有高血壓病史的婦女出現(xiàn)穩(wěn)定增加的舒張壓，出現(xiàn)一次N10mmHg或以至少4小時(shí)間隔出現(xiàn)兩次或多次〉90mmHg,并有顯著的蛋白尿，據(jù)此來(lái)確定先兆子癇。顯著的蛋白尿定義為〉0.3g/天或以至少4小時(shí)間隔收集的兩次清潔捕獲的中流,炎尿液樣本的才企測(cè)條檢測(cè)中2+。對(duì)照組包括沒(méi)有預(yù)先存在的醫(yī)學(xué)疾病或產(chǎn)前并發(fā)癥的妊娠婦女。J&濕袢本的^理依據(jù)以往報(bào)道的處理方法來(lái)處理血液樣本(Ngetal.,C"".CAem.48:1212-1217,2002)。簡(jiǎn)而言之，將10mL血液樣本收集在含有EDTA的管中，并在4。C以1600xg離心IO分鐘。隨后將血漿小心地轉(zhuǎn)移至清潔的聚丙烯管中。將該血漿樣本在4。C以16000xg再次離心IO分鐘，并將上清收集到新的聚丙烯管中。iiVv4提取如上述引用的Ng等的文獻(xiàn)所述，將1.6mL的血漿與2mL的TrizolLS試劑(Invitrogen,Carlsbad,California)和0.4mL氯仿混和。將所得混合物在4。C以11，900xg離心15分鐘，并將水層轉(zhuǎn)移至新的管中。向所述的水層加入等體積的70%乙醇。隨后，才艮據(jù)廠商的"^兌明書將所述混合物加到RNeasy小型柱(Qiagen，Hilden，德國(guó))中并進(jìn)行處理。用30/xL無(wú)RNase酶的水來(lái)洗脫總RNA,并在-80。C下儲(chǔ)存。進(jìn)行DNase(RNase-FreeDNaseSet，Qiagen,Hilden,德國(guó))處理來(lái)去除任何污染性的DNA?！睹攵縲r-尸ci根據(jù)上述引用的Ng等的文獻(xiàn)所述，釆用一步實(shí)時(shí)定量RT-PCR對(duì)所有mRNA進(jìn)行定量。所述Cii/引物的序列為5，-GCCTCCCATCTCCCTGGAT-3，(正向)和5，-TGTGAGCTTGCTGTGCTAACTG-3，(反向)，而所述雙標(biāo)記的熒光探針為5，-(FAM)TCCTCCGGGAAGTCTTGGAAATGGC(TAMRA)-3，。通過(guò)以1x107拷貝至1x101拷貝的濃度范圍對(duì)高效液相色語(yǔ)純化的單鏈合成DNA寡核苷酸(GensetOligos,新加坡)進(jìn)行系列稀釋來(lái)制備用于0//mRNA定量的校準(zhǔn)曲線，該寡核苷酸對(duì)89bpCi/f擴(kuò)增子(amplicon)(Genbank登錄號(hào)NM—000756)特異。C尺//mRNA的絕對(duì)濃度表示為拷貝/mL血漿的形17式。用于C7//校準(zhǔn)的合成DNA寡核苷酸序列為AGCA-3，。如上所述制作GJ尸Z)//定量的校準(zhǔn)曲線，并以表示為pg/mL血漿的形式(上述引用的Ng等)。根據(jù)廠商的說(shuō)明書以25/>iL的反應(yīng)體積進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(EZr77ARNAPCR試劑套裝，AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)。所用熒光探針(GensetOligos)的濃度為100nM。對(duì)于CW/Z體系和04尸Af/體系，所用PCR引物(GensetOligos)的濃度均為200nM。使用提取的血漿RNA進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣本分析兩次，并且在每次分析中平行運(yùn)行對(duì)應(yīng)的校準(zhǔn)曲線。用AmpliTaqGold酶(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)替代所述rrA多聚酶來(lái)檢測(cè)樣本，從而保證它們是DNA陰性的。在此對(duì)照分析中沒(méi)有觀察到擴(kuò)增，表明所述分析對(duì)對(duì)應(yīng)的mRNA具有特異性。在每一分析中也包括多個(gè)陰性空白水溶液。用于所述Ci/Z和(^4尸"http://分析的溫度方案如下為了使所包含的尿嗜啶N-糖基化酶發(fā)揮作用，將反應(yīng)在50°C引發(fā)2分鐘，隨后在60。C進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄30分鐘。在95。C變性5分鐘后，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的以下PCR:94°C變性20秒，分別對(duì)所述Ci/Z和GJ尸D7/體系在58°C和62。C退火/延伸1分鐘。鍵^f夢(mèng)為、^f利用SigmaStat2.03軟件(SPSS)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。B.結(jié)果^秒定量i:r-尸Ci為確定所述Ci//RT-PCR分析的定量特性，我們利用此系統(tǒng)對(duì)系列稀釋的校準(zhǔn)品進(jìn)行了擴(kuò)增，該校準(zhǔn)品為依據(jù)所述C7H序列合成的DNA寡核苷酸。以往的數(shù)據(jù)表明這種單鏈寡核苷酸可靠地模擬了所述反轉(zhuǎn)錄步驟的產(chǎn)物，并產(chǎn)生與利用T7-轉(zhuǎn)錄的RNA(Bustin,乂Mo/.E"^cn'船/.25:169-193，2000)獲得的校準(zhǔn)曲線相同的校準(zhǔn)曲線。C7H擴(kuò)增體系的校準(zhǔn)曲線顯示了從2.5xl(V至lxl(^拷貝的動(dòng)態(tài)范圍，并具有0.983的相關(guān)系數(shù)。這些分析的擴(kuò)增步驟的靈敏度足以檢測(cè)25個(gè)拷貝的目標(biāo)Ci//。為確定包括RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增步驟的整個(gè)分析過(guò)程的準(zhǔn)確性，我們對(duì)得自健康妊娠婦女(妊娠齡38周)的血漿樣本進(jìn)行了10次平行的RNA^是耳又，并對(duì)這些提耳又的RNA樣本進(jìn)行RT-PCR分析。這些Ci//mRNA的平行分析的Ct值的變異系數(shù)為2.8%。GJ尸D//RT-PCR分析的展開和特性如以上引用的Ng等人的文獻(xiàn)所述。為檢驗(yàn)在母體血漿中是否能夠檢測(cè)到C7//mRNA的轉(zhuǎn)錄本，通過(guò)C7/ZRT-PCR分析對(duì)IO例末三月妊娠期的妊娠婦女(妊娠齡為37到41周)的血漿樣本進(jìn)行了分析。在所有檢驗(yàn)樣本中均檢測(cè)到了C77/mRNA。血漿C7Z/mRNA濃度的中位值為73拷貝/mL(四分位數(shù)間距51至177)。作為陽(yáng)性對(duì)照，在所有這些血漿樣本中均能4企測(cè)到G^PZ)/ZRNA。為Vly^母體j&,*Ci//wiA^的清餘為證明母體血漿的Ci//mRNA來(lái)自胎兒胎盤單元(feto-placentalunit),我們對(duì)4位婦女分娩前和分娩后2小時(shí)的血漿均進(jìn)行了C7//mRNA分析。結(jié)果在所有4例分娩前的母體血漿樣本中均檢測(cè)到了C7Z/mRNA。相反，在任何分娩后的樣本中均沒(méi)有檢測(cè)到Ci/fmRNA。(X4尸i)//mRNA在所有的血漿樣本中均可檢測(cè)到，從而證明了所述樣本的質(zhì)量。所述數(shù)據(jù)如圖1A和圖1B所示。4兆子癤的必錄右女^,"/7的Ci//miiVJ的定量為、^f為比較先兆子癇和對(duì)照妊娠婦女母體血漿中的C7//mRNA的濃度，從妊娠齡相當(dāng)?shù)?2例先兆子癇婦女和IO例對(duì)照妊娠婦女獲取血漿樣本。如圖2所示，先兆子癇婦女和對(duì)照妊娠婦女的血漿Ci//mRNA濃度的中位數(shù)分別為1070拷貝/mL(四分位數(shù)間距535至M68)和102拷貝/mL(四分位數(shù)間距51至158)。先兆子癇妊娠婦女的血漿C7HmRNA濃度的中位數(shù)為對(duì)照妊娠婦女的10.5倍高(Mann-Whitney檢驗(yàn)，P<0連)。C.結(jié)論血漿C^Z/mRNA代表一種新的先兆子癇的分子標(biāo)志物。與母體血漿的胎兒DNA分析相比，血漿RNA分析具有非性別和多態(tài)性依賴的優(yōu)點(diǎn)?？梢灶A(yù)見血漿RNA分析可最終實(shí)現(xiàn)未出生胎兒的非侵襲性基因表達(dá)譜分從得到知情同意和研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的前提下，從單胎簡(jiǎn)單妊娠的健康婦女收集15ml血液樣本，這些妊娠婦女在香港PrinceofWales醫(yī)院婦產(chǎn)科看病。j&濕,本的^理將所述血液樣本收集在含有EDTA的清潔的管中，并在4°C以1600xg離心10分鐘。隨后，將血漿和血清小心地轉(zhuǎn)移至清潔的聚丙烯管中。所述的血清樣本在-20。C保存用于hPL和hCG-j8蛋白的免疫分析。將所述血漿樣本在4。C以16000xg再次離心IO分鐘，并將上清收集到新的聚丙烯管中。將所有胎盤組織樣本立即保存在RNA后續(xù)穩(wěn)定溶液(Laterstabilizingsolution)(Ambion,Austin,TX)中，并保存在-80。C直到進(jìn)行RNA提取。對(duì)于過(guò)濾試驗(yàn)，將血漿樣本分成三份兩份分別用0.45/xm或5^m孔徑的濾膜(Millex-GV;MilliporeChinaLimited,香港)進(jìn)行過(guò)濾。第三份不進(jìn)行過(guò)濾。ia^炎承對(duì)于血漿樣本，根據(jù)上述引用的Ng等的方案，將1.6mL血漿與2mLTrizolLS試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)及0.4mL氯仿混和。對(duì)于胎盤組織，根據(jù)廠商的說(shuō)明書在Trizol試劑(Invitrogen)中將樣本勻漿，隨后加入氯仿。將所得混合物在4°C以ll,900xg離心15分鐘，并將水層轉(zhuǎn)移至新的管中。向所述的水層加入等體積的70%乙醇。隨后，根據(jù)廠商的說(shuō)明書將所述混合物加到RNeasy小型柱(RNeasyMini試劑盒，Qiagen,Hilden,德國(guó))中，并進(jìn)行處理。用30pL無(wú)RNase酶的水來(lái)洗脫總RNA,并在-80。C下儲(chǔ)存。進(jìn)行DNase(RNase畫FreeDNaseSet,Qiagen，Hilden,德國(guó))處理來(lái)去除^壬何污染性的DNA。根據(jù)上述引用的Ng等的文獻(xiàn)所述，采用一步實(shí)時(shí)定量RT-PCR對(duì)所有mRNA進(jìn)行定量。用于所有hPL、hCG-i8和GAPDH的RT-PCR分析的引物均是內(nèi)含子跨越的。所述hPL引物的序列為5'-CATGACTCCCAGACCTCCTTC-3，(正義)和5'陽(yáng)TGCGGAGCAGCTCTAGATTG-3，(反義)，而雙標(biāo)記的焚光探針為5，-(FAM)TTCTGTTGCGTTTCCTCCATGTTGG(TAMRA)-3'。所述hCG-/3引物的序列為5，-CTACTGCCCCACCATGACCC-3，(正義)和5，-TGGACTCGAAGCGCACATC-3，(反義)，而雙標(biāo)記熒光4果針為5，-(FAM)CCTGCCTCAGGTGGTGTGCAACTAC(TAMRA)-3'。通過(guò)以lxl(f拷貝至lxlO'拷貝的濃度范圍對(duì)高效液相色譜純化的單鏈合成DNA寡核苦酸(GensetOligos,新加坡)進(jìn)行系列稀釋來(lái)制備用于HPL和HCG-/3定量的校準(zhǔn)曲線，這些寡核苷酸分別對(duì)所述hPL和hCG-Z3擴(kuò)增子特異。這些分析能夠測(cè)定100個(gè)拷貝的代表性校準(zhǔn)靶標(biāo)。hPL和hCG-)3mRNA的絕對(duì)濃度表示為拷貝/mL血漿的形式。以往的數(shù)據(jù)表明這種單鏈寡核苷酸可靠地模擬了所述反轉(zhuǎn)錄步驟的產(chǎn)物，并產(chǎn)生與利用T7-轉(zhuǎn)錄的RNA(見上述引用的Bustin)獲得的校準(zhǔn)曲線相同的校準(zhǔn)曲線。用于hPL和hCG-)S校準(zhǔn)的合成DNA寡核苷酸序列分別為GTCATGC-3，和5'-GATGGACTCGAAGCGCACATCGCGGTAGTTGCACTGGTGGGGCAGTAGCC-3'。根據(jù)上述引用的Ng等所述的方法制備用于GAPDH定量的校準(zhǔn)曲線，并表示為pg/mL血漿的形式。才艮據(jù)廠商的說(shuō)明書以50pL的反應(yīng)體積進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(EZr7Y力RNAPCR試劑套裝，AppliedBiosystems,FosterCity,CA)。所用熒光探針(GensetOligos)的濃度為100nM。對(duì)于hPL體系，所用PCR引物(GensetOligos)的濃度為300nM,而對(duì)于hCG-iS體系和GAPDH體系，所用PCR引物的濃度均為200nM。使用5/xL提取的血漿RNA和O.lng提取的總胎盤RNA進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣本分析兩次，并且在每次分析中平行運(yùn)行對(duì)應(yīng)的才交準(zhǔn)曲線。用AmpliTaqGold酶(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)*#代所述r77A多聚酶來(lái);f企測(cè)樣本，從而保證它們是DNA陰性的。在此對(duì)照分析中沒(méi)有觀察到擴(kuò)增，表明所述分析對(duì)對(duì)應(yīng)的mRNA具有特異性。在每一分析中也包括多個(gè)陰性空白水溶液。用于所述hPL、hCG-iS和GAPDH分析的溫度方案如下為了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶發(fā)揮作用，將反應(yīng)在50。C引發(fā)2分鐘，隨后在60。C進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄30分鐘。在95。C變性5分鐘后，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的以下PCR:94°C變性20秒、分別對(duì)hPL、hCG-/3和GAPDH體系在56。C、58。C和60°C退火/延伸1分鐘。重復(fù)RNA提取和RT-PCR分析，顯示hPL和hCG-j8mRNA的分析系統(tǒng)的Ct值的變異系數(shù)分別為2.3%和3.2%。蛋冷分浙分別利用放射免疫分析(DiagnosticProductsCorp.,LosAngeles,CA)和電化學(xué)發(fā)光免疫分析(RochemodularE170)對(duì)母體血清中的hPL和hCG蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。B.結(jié)果我們獲取了10例妊娠婦女(妊娠齡為7-14周)的外周血樣本。在樣本到達(dá)實(shí)驗(yàn)室之后(靜脈取血后1小時(shí)之內(nèi))，立即對(duì)每個(gè)受試者的一半血液樣本進(jìn)行血漿收集和RNA提取。為檢驗(yàn)hPL和hCG-/5mRNA的轉(zhuǎn)錄本在母體血漿中能否4企測(cè)到，我們用對(duì)應(yīng)的實(shí)時(shí)RT-PCR分析對(duì)提取的RNA進(jìn)行了分析。我們?cè)谒?0例血漿樣本中均觀察到了hPL和hCG-/3mRNA信號(hào)。這些結(jié)果表明在妊娠婦女血漿中確實(shí)能夠檢測(cè)到胎盤mRNA。作為陽(yáng)性對(duì)照，在所有這些血漿樣本中也檢測(cè)到了GAPDHmRNA。為研究母體血液中胎盤mRNA的穩(wěn)定性，我們將這些母體血液樣本各自余下的部分在室溫下放置24小時(shí)。隨后提取這些樣本中的RNA,并對(duì)hPL、hCG-/5和GAPDH轉(zhuǎn)錄本的水平進(jìn)行檢測(cè)。沒(méi)有觀察到hPL和hCG-(3mRNA轉(zhuǎn)錄本水平的顯著差異，而在室溫下力丈置24小時(shí)的樣本中的GAPDHmRNA顯著高于立即處理的樣本中的水平(Wilcoxon檢驗(yàn)，對(duì)于所述hPL分析P=0.770;對(duì)于所述hCG-|S分析P=0.275;對(duì)于所述GAPDH分析P<0.05)。這些結(jié)果顯示血漿中hPL和hCG-/3mRNA在室溫下可保持穩(wěn)定達(dá)24小時(shí)。喪^發(fā)//^^箱1#羞附/7\^f化從39例不同妊娠階段的妊娠婦女獲取血漿樣本。在所有三個(gè)三月妊娠期的血漿中100%(39例中有39例)沖僉測(cè)到hPLmRNA。對(duì)于hCG-0mRNA，妊娠頭三月(妊娠齡7-14周)樣本的檢出率為100%(14/14),妊娠中三月(妊娠齡15-23周)樣本的檢出率為42%(5/12),妊娠末三月(妊娠齡35-41周)樣本的檢出率為7.7%(1/13)。在所述妊娠頭三月的血漿樣本中，hPL和hCG-iSmRNA水平的中位值分別為2671(四分位數(shù)間距為375-6217)和1205拷貝/ml(四分位數(shù)間距為566-1927)(圖3A和圖3B)。妊娠中三月的血漿hPL和hCG-/3mRNA水平的中位值分別為4784(四分位數(shù)間距為2679-10139)和0拷貝/ml(四分位數(shù)間距為0-125)。在妊娠末三月的血漿樣本中，血漿hPL和hCG-^mRNA水平的中位值分別為13869(四分位數(shù)間距為7829-27434)和0拷貝/ml(四分位數(shù)間距為0-0)。綜上，循環(huán)hPL和hCG-/5mRNA水平分別顯示與妊娠齡有關(guān)的增加和降低的趨勢(shì)。同時(shí)也測(cè)定了對(duì)應(yīng)的hPL和hCG-i8蛋白的水平(圖3A和圖3B)。所有循環(huán)hPL和hCG-)8mRNA的妊娠期變化與對(duì)應(yīng)蛋白所呈現(xiàn)出的趨勢(shì)類似(Pearson相關(guān)性分析，對(duì)于hPL:r=0.622;P<0.001,對(duì)于hCG-j8:r=0.784;P<0.001,如圖3C和圖3D所示)。為、遂后母謬i,哞y^產(chǎn)miA^的炎遽;^會(huì)母體血漿中胎盤mRNA的快速清除。由于在妊娠末三月(受試者的妊娠齡38-42周)的母體血漿中hPLmRNA含量相對(duì)豐富，因此選擇hPLmRNA作為研究的靶標(biāo)。在8例分娩前的血漿樣本中，hPLmRNA轉(zhuǎn)錄本水平的中位值為50004拷貝/ml。在分娩后24小時(shí)，在任何產(chǎn)后樣本中不能檢測(cè)到hPLmRNA(圖4A)。作為對(duì)照，在所有分娩前和分娩后的血漿樣本中均能夠檢測(cè)到GAPDHmRNA(圖4B)。沒(méi)有觀察到母體血漿中GAPDHmRNA水平的系統(tǒng)改變(Wilcoxon檢驗(yàn)，P=0.313)。隨后我們研究了能否在產(chǎn)后較短時(shí)間點(diǎn)(2小時(shí))觀察到循環(huán)hPLmRNA的清除。征募了13例受試者用于此第二項(xiàng)研究，分娩前hPLmRNA水平的中位值為24499拷貝/ml(圖4C)。在產(chǎn)后2小時(shí)，13例婦女中有9例沒(méi)有檢測(cè)到血漿胎盤RNA。余下的受試者在分娩后2小時(shí)有大約66-97%的母體血漿胎兒RNA被清除。我們?cè)谒醒獫{樣本中均;險(xiǎn)測(cè)到GAPDHmRNA，從而證明了所述樣本的質(zhì)量(圖4D)。沒(méi)有觀察到母體血漿GAPDHmRNA水平的系統(tǒng)性變化(Wilcoxon檢驗(yàn)，實(shí)施例3:先兆子癇婦女中母體血漿GAPDHmRNA的升高在知情同意的條件下征募了在香港PrinceofWales醫(yī)院婦產(chǎn)科看病的妊娠婦女。利用實(shí)施例1所述的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)診斷先兆子癇。A.方法將母體血液樣本放入肝素化的管中，并如實(shí)施例1所述來(lái)處理。提取血漿RNA,并如實(shí)施例1所述定量測(cè)定GAPDHmRNA的水平。B.結(jié)果與對(duì)照組比較，觀察到先兆子癇組的母體血漿中的GAPDHmRNA濃度升高(圖5)。對(duì)照組和先兆子癇受試者的母體血漿GAPDHmRNA水平的中位值分別為70pg/ml和281pg/ml。該差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(Mann陽(yáng)Whitney檢驗(yàn)，p<0.005)。C.結(jié)論母體血漿GAPDHmRNA是一種新的非侵襲性的先兆子癇標(biāo)志物。實(shí)施例4:非整倍性妊娠婦女的母體血清中的hCGmRNA濃度A方法通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR對(duì)來(lái)自2003年1月至8月間研究的141例妊娠婦女的頭三月妊娠血清樣本中的iShCGmRNA濃度進(jìn)行了檢測(cè)。對(duì)所有被研究的受試者進(jìn)行了用于胎兒染色體組型分析的絨毛膜取樣(CVS)。在即將CVS之前收集所有母體的血液樣本。將血液樣本放入清潔的管中，并在4。C下以1600xg離心10分鐘。隨后將血清轉(zhuǎn)移至清潔的聚丙烯管中。立即將3.2mL血清放入4mLTrizol中并在-80。C保存直到進(jìn)行RNA提取。如上所述，通過(guò)改良的RNeasyRNAMini試劑盒(Qiagen,Hilden,德國(guó))從1.6mL血清中提取血清RNA(Ngetal.,A^//.Jca<i.100:4748-4753，2003)。用30/iL無(wú)RNase酶的水來(lái)洗脫總RNA，并在-80。C下保存。進(jìn)4亍DNase酶(RNase誦FreeDNaseSet,Qiagen,Hilden,德國(guó))處理來(lái)去除^f壬^T污染性的DNA。根據(jù)Ngetal.,Prac.A^/.Jcad.a&4,100:4748-4753，2003所述，利用一步實(shí)時(shí)定量RT-PCR對(duì))8hCGmRNA進(jìn)行定量分析。以25/xL的反應(yīng)體積進(jìn)行所述的RT-PCR反應(yīng)。所用的引物和熒光探針的濃度分別為300nM和100nM。用6/^L提取的血清RNA進(jìn)行擴(kuò)增。用于所述分析的溫度方案如下為了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶發(fā)揮作用，將反應(yīng)在50°C引發(fā)2分鐘，隨后在60°C進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄30分鐘。在95°C變性5分鐘后，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的以下PCR:94。C變性20秒，并在57°C退火/延伸1分鐘。Ngetal.,/Voc.Ato/.JcW.f/&4，100:4748-4753，2003已經(jīng)確立了所述分析的靈敏度、線性度和精確度。在所述反應(yīng)混合物中僅可檢測(cè)到少至100拷貝的所述合成寡核苷酸。血清hCG/3RNA濃度以拷貝/mL血清表示。因沒(méi)有進(jìn)行恢復(fù)試驗(yàn)，所報(bào)告的濃度(拷貝/mL)為最低的估計(jì)值。在所征募的149例妊娠婦女中，15例婦女懷有21號(hào)染色體三體性胎兒，11例懷有18號(hào)染色體三體性胎兒。余下的123例懷有整倍體胎兒，齡的中位值為12.5周(范圍11.2-14.3周)。懷有21號(hào)染色體三體性和18號(hào)染色體三體性胎兒的妊娠齡的中位值分別為12.5周(范圍12.1-14.2周)和12.3周(范圍:11.4-14.1周)。在三組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)妊娠齡的顯著差異(Kruskal-Wallis,P=0.706)。B.結(jié)果對(duì)149例母體血清樣本的hCG/5mRNA進(jìn)行了定量分析。在149例妊娠婦女中有140例(94%)的母體血清中能檢測(cè)到hCG/3mRNA。在對(duì)照組中，hCG/mRNA的檢出率為96.7%(123例中有119例)。在21號(hào)染色體三體性和18號(hào)染色體三體性組中，檢出率分別為93.3%(15例中有14例)和63.6%(11例中有7例)。此三組的血清hCG/3mRNA濃度的中位值分別為對(duì)照組6108拷貝/mL(四分位數(shù)間距為2867到19249拷貝/mL)，21號(hào)染色體三體性組為13165拷貝/mL(四分位數(shù)間距為4403到25265拷貝/mL)，而18號(hào)染色體三體性組為652拷貝/mL(四分位數(shù)間距為0到11662拷貝/mL)(圖6)。此三組中hCG/SmRNA濃度的中位值差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(Kmskal-Wallis,P=0,024)。進(jìn)行配對(duì)多重比較，顯示18號(hào)染色體三體性組和對(duì)照組間存在顯著差異(Du皿's檢驗(yàn)，P<0.05)，且18號(hào)染色體三體性組和21號(hào)染色體三體性組間存在顯著差異(Dutm'stest,P<0.05)。由于樣本數(shù)量有限，在21號(hào)染色體三體性組和對(duì)照組的血清mRNA濃度之間沒(méi)有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異(Dunn's檢驗(yàn)，P〉0.05)。但是，如果擴(kuò)大樣本規(guī)模，將會(huì)產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異。C.結(jié)論此研究證明，在頭三月妊娠婦女的血清中可容易和明顯地才企測(cè)到循環(huán)hCG/3RNA，并具有94%的檢測(cè)率。這些數(shù)據(jù)證明，18號(hào)染色體三體性妊娠婦女中血清hCG/3mRNA濃度的中位值約為對(duì)照妊娠婦女的濃度中位值的10%,并觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異。另一方面，盡管21號(hào)染色體三體性妊娠婦女的血清hCG/5mRNA濃度的中位值為對(duì)照妊娠婦女的濃度中位值的2.2倍高，但由于樣本數(shù)量有限沒(méi)有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異。這種統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異有望在較大規(guī)模的研究中出現(xiàn)。這些數(shù)據(jù)首次證明在18號(hào)染色體三體性妊娠婦女的頭三月妊娠期血清中的循環(huán)hCG/5mRNA濃度顯著降低，而在21號(hào)染色體三體性妊娠婦女中所述循環(huán)hCG/5mRNA濃度升高。這些數(shù)據(jù)表明，循環(huán)hCG/3RNA作為標(biāo)志物用于預(yù)測(cè)例如18號(hào)染色體三體性和21號(hào)染色體三體性的非整倍性妊娠的診斷作用。此研究觀察到在18號(hào)染色體三體性組與對(duì)照組的hCG/5mRNA濃度之間有重疊。這暗示如果將母體血清hCG/3mRNA檢測(cè)作為唯一的18號(hào)染色體三體性妊娠預(yù)測(cè)方法可能會(huì)導(dǎo)致相對(duì)較低的靈敏度和特異性?？蓪⒅T如hPL、hCRH、KiSS-l、TPFI2和PLAC1的其它標(biāo)志物與hCG/3聯(lián)合使用，從而增加診斷的靈敏度和特異性。實(shí)施例5:母體血漿中的胎盤mRNA的鑒定A.方法本研究分兩個(gè)階段進(jìn)行。首先，利用寡核苷酸芯片(Oligonucleotidemicroarmys)對(duì)頭三月和末三月妊娠婦女的胎盤組織基因表達(dá)譜進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。其后，以實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QRT-PCR)為基礎(chǔ)，發(fā)展了多種分析方法用來(lái)檢測(cè)母體血漿中6條已鑒定的胎盤表達(dá)的基因。對(duì)所研究的RNA轉(zhuǎn)錄本，評(píng)價(jià)了其在母體血漿中的可^r測(cè)性，以及其在血漿和胎盤組織中的水平的相關(guān)性。此研究采用的所有胎盤和血液樣本均是在知情同意的前提下從單胎簡(jiǎn)單妊娠的健康婦女中收集的，這些妊娠婦女在香港PrinceofWales醫(yī)院婦產(chǎn)科看病。利用在流產(chǎn)前或選擇性剖腹產(chǎn)分娩后即刻進(jìn)行的絨毛膜取樣(CVS)獲得頭三月(妊娠齡范圍9-12周)和末三月(妊娠齡范圍38-40周)妊娠期胎盤組織樣本各5例。收集后立即將所述胎盤組織樣本放入于RNA/We/M(Ambion⑧，Austin,TX)中并在-80。C保存，直到進(jìn)行RNA提取。收集組織的同時(shí)收集6mL外周血，并放入PAXgeneBloodRNA管中(PreAnalytiX,Hombrechtikon,瑞士)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書利用Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)從胎盤組織提取總RNA，并用RNeasymini-試劑盒(Qiagen,Hilden,德國(guó))進(jìn)行純化。根據(jù)制造商的說(shuō)明書利用PAXgeneBloodRNA試劑盒(PreAnalytiX，Hombrechtikon,瑞士)從外周血中提取總RNA，此過(guò)程包括DNase處理步驟(RNase-FreeDNaseSet，Qiagen,Hilden,德國(guó))。對(duì)于每種樣本，根據(jù)制造商的說(shuō)明書，標(biāo)記l(H敖克提取的RNA并將其與GeneChipHumanGenomeU133A芯片(Affymetrix,SantaClara,CA)進(jìn)行雜交。雜交后，在GeneChipFluidicsStation400(Affymetrix,SantaClara,CA)中對(duì)每塊芯片進(jìn)行洗滌和染色。將所述芯片用GeneArrayScanner(Affymetrix,SantaClara,CA)進(jìn)行掃描，并用GeneChipMicroarraySuite5.0(Affymetrix)進(jìn)4亍分斗斤。遞i2^/^gir-尸Ci乂,母舉A襲^的麼i襲這的iA^/#求本迷/^定量伴/介從10例頭三月和10例末三月妊娠婦女收集配對(duì)的胎盤和母體全血樣本。同時(shí)也征募了10例妊娠婦女在分4免前后的外周血樣本。如上所述處理胎盤組織。將12mL血液樣本收集到EDTA管中，并在4°C以1600xg離心10分鐘。隨后將血漿小心地轉(zhuǎn)移至清潔的聚丙烯管中。將所述血漿樣本在4。C以16000xg再次離心10分鐘，并將上清收集到新的聚丙烯管中。如Ng.etal.，C力em.,48:1212-1217,2002中所述從母體血漿中提取RNA。進(jìn)行DNase處理(RNase-FreeDNaseSet,Qiagen，Hilden,德國(guó))來(lái)去除污染的DNA。本研究集中于對(duì)從胎盤芯片基因表達(dá)譜中鑒定出的6條胎盤表達(dá)的mRNA轉(zhuǎn)錄本的評(píng)價(jià)，所述mRNA包括人胎盤催乳素(hPL)、人絨毛膜促性腺激素/3亞基(/5hCG)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、KiSS-l轉(zhuǎn)移抑制因子(KISS1)和胎盤特異1(PLAC1)。作為對(duì)照，進(jìn)行了兩種非胎盤特異轉(zhuǎn)錄本——甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和]8-血紅蛋白(/3-球蛋白)mRNA的定量分析。用于檢測(cè)GAPDH、hPL、hCG/3和CRHmRNA的QRT-PCR分析如上所述(Ng.etal.,C//".C力em.，48:1212-1217,2002;Ngetal.,Prac.A^/.JcfldSc/."&4，100:4748-4753,2003;和Ngetal.，CAew.,49:727-731，2003)。TFPI2分析的引物序列為5'-ACAAATTTCTACACCTGGGAGGC-3，(正義)和5，-CGGCAAACTTTGGGAACTTTT-3，(反義)，且雙標(biāo)記熒光4罙4十為5'-(FAM)TGCGACGATGCTTGCTGGAGGA(TAMRA)-3，。FAM與TAMRA分別代表6-羧基熒光素和6-羧基四曱基若丹明(rhodamine)。用于KISS1定量分析的引物序列為5'-GCCCAGGCCAGGACTGA-3，(正義)和5，-GCCAAGAAACCAGTGAGTTCATC-3，(反義)，且雙標(biāo)記熒光探針為分析的引物序歹'J為5'-ATTATCCCCAGCTGCCAGAA陽(yáng)3，(正義)和5，-GCAGCCAATCAGATAATGAACCA隱3，(反義)，且雙標(biāo)記熒光探針為白分析的引物序列為5，-GCTGCACTGTGACAAGCTGC-3，(正義)和5，-GCACACAGACCAGCACGTTG-3，(反義)，且所述熒光探針為以lxl()6拷貝至10拷貝的濃度對(duì)Bustinetal.，丄Mo/.五^/ocn'加/.,25:169-193,2000(GensetOligos,新加坡)所述的高效液相色譜純化的單鏈合成DNA寡核苷酸進(jìn)行系列稀釋來(lái)制作用于hPL、/5hCG、CRH、TPFI2、KISS1、PLAC1和/5-球蛋白mRNA定量分析的校準(zhǔn)曲線，所述寡核苷酸對(duì)各自的擴(kuò)增子特異。用于hPL、處CG和CRH校準(zhǔn)品的合成DNA寡核苦酸序列如上所述(參見Ngetal.,A^//.Sc/.100:4748-4753，2003和Ngetal.,C//".CA亂,49:727-731，2003)。用于TPFI2、KISS1、PLAC1和/5-球蛋白校準(zhǔn)品的合成DNA寡核苷酸序列分別為GAGGATAGAAAAAGTTCCCAAAGTTTGCCGGCTG-3'、5，-CTGCCCAGCTCACCAAGATGAACTCACTGGTTTCTTGGCAG-3，、5'隱ACAAATTATCCTGTGGTTCATTATCTGATTGGCTGCAGG陽(yáng)3'和5'-TGAGCTGCACTGTTGCTGGTCTGTGTGCTGG-3，。除GAPDHmRNA以外，對(duì)胎盤組織和母體血漿中所有轉(zhuǎn)錄本的絕對(duì)濃度分別以拷貝/ng總胎盤RNA和拷貝/mL血漿的形式表示。通過(guò)系列稀釋人總RNA來(lái)制作用于GAPDH定量分析29的校準(zhǔn)曲線(Ng.etal.,C/z".CA艮，48:1212-1217,2002)。根據(jù)制造商的i兌明書(EZrr"RNAPCR試劑套裝，AppliedBiosystems,FosterCity,CA，美國(guó))，以50jliL的反應(yīng)體積進(jìn)行QRT-PCR反應(yīng)。應(yīng)用聯(lián)合的溫度循環(huán)儀和熒光檢測(cè)儀(ABIPrism7700，AppliedBiosystems,FosterCity,CA，美國(guó))來(lái)進(jìn)行QRT陽(yáng)PCR分析。GAPDH、hPL、/5hCG和CRH的QRT-PCR分析的反應(yīng)條件如上所述(Ng.etal.，C//".C/zem.,48:1212-1217,2002;Ngetal.，A^z".Sc/.100:4748-4753,2003;及Ngetal.,C//".CAew.，49:727-731,2003)。對(duì)于其它的三種轉(zhuǎn)錄本，TPFI2和/3-球蛋白所用的PCR引物(GenesetOligos,新加坡)的濃度為200nM，KISS1的引物濃度為300nM,而PLAC1的引物濃度為400nM。TFPI2所用的熒光探針(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,美國(guó))的濃度為80nM，KISS1的熒光探針濃度為150nM,PLAC1的熒光探針濃度為200nM,而iS-球蛋白的熒光探針濃度為300nM。在進(jìn)行QRT-PCR之前，根據(jù)制造商的說(shuō)明書利用DNaseI消化(Invitrogen,Carlsbad,CA)去除提取的胎盤組織RNA中的污染性的DNA。用0.4ng提取的胎盤RNA和提取的血漿RNA進(jìn)行擴(kuò)增。在每個(gè)分析中包括多個(gè)陰性水空白。用于TPFI2、KISS1、PLAC1和/3-5求蛋白mRNA分析的溫度方案如下為了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶發(fā)揮作用，將反應(yīng)在50。C引發(fā)2分鐘，隨后在60。C進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄30分鐘。在95。C變性5分鐘后，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的以下PCR:92。C變性15秒，對(duì)PLAC1在56。C、對(duì)TPFI2和KISS1在57。C以及對(duì)iS-球蛋白在58°C退火/延伸1分鐘。利用SigmaStat2.03軟件(SPSS)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。B.結(jié)果遞過(guò)##產(chǎn)邀織和豕對(duì)的母沐洫濕#本的葛麥^,核茅^^^^浙^;#定靡i掙并的差^通過(guò)對(duì)每個(gè)受試者的組織樣本進(jìn)行芯片分析得到5例頭三月CVS和5例末期胎盤的基因表達(dá)譜。在所述的CVS樣本和末期胎盤中發(fā)現(xiàn)分別有總計(jì)7226和8871基因轉(zhuǎn)錄本表達(dá)。以往有報(bào)道，正常個(gè)體血漿中的4盾環(huán)DNA以造血細(xì)月包來(lái)源為主(Luietal.,C/z'".C/e/w.，48:421-427,302002)。因此，假定母體血漿中的大部分背景母體核酸也源自造血室。由于本研究的最終目的是鑒定母體血漿的循環(huán)RNA分子中的胎兒特異的胎盤表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，因此本發(fā)明者進(jìn)一步獲取了配對(duì)母體全血的基因表達(dá)譜，并使用GeneChipMicroarraySuite5.0軟件(Affymetrix)將這些表達(dá)譜與對(duì)應(yīng)的胎盤組織的表達(dá)譜進(jìn)行比較。在所有5例對(duì)比中，選擇與對(duì)應(yīng)的全血樣本相比所述CVS組織中表達(dá)水平"增加的"轉(zhuǎn)錄本，鑒定了早期妊娠中胎兒特異的胎盤表達(dá)轉(zhuǎn)錄本。類似地，與配對(duì)的母體全血樣本進(jìn)行比較，從末期胎盤中鑒定出了晚期妊娠的胎兒特異轉(zhuǎn)錄本。這些步驟之后，排除在胎盤組織和母體血細(xì)胞中表達(dá)均較高的轉(zhuǎn)錄本，從而對(duì)所述頭三月和末三月妊娠得到分別為1245和1743個(gè)鑒定轉(zhuǎn)錄本的組。隨后根據(jù)所述5例CVS或5例末期胎盤組織的芯片表達(dá)信號(hào)的中位值(參見附表A和B中分別對(duì)早期和晚期妊娠所列的50條較高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本)對(duì)這兩組轉(zhuǎn)錄本以降序歸類。所產(chǎn)生的這兩組含有作為胎兒特異標(biāo)志物在母體血漿中具有潛在可檢測(cè)性的候選轉(zhuǎn)錄本。圖1總結(jié)了鑒定這種胎兒特異標(biāo)志物的策略。前述可在母體血漿中檢測(cè)到的三種mRNA轉(zhuǎn)錄本hPL、/3hCG和CRH出現(xiàn)在列表中，為這種方法提供了獨(dú)立的證明。然而，因以往的研究沒(méi)有包括在所述胎盤和母體血漿中所述基因表達(dá)水平的信息，因此在進(jìn)一步的分析中同時(shí)包括了這三種轉(zhuǎn)錄本和在所述列表中鑒定的三種新標(biāo)志物TFPI2、KISS1和PLAC1。為比較胎盤組織和母體血漿間的相關(guān)基因表達(dá)譜，選擇了所述列表中不同位置的轉(zhuǎn)錄本。表1總結(jié)了這6種轉(zhuǎn)錄本的芯片表達(dá)信號(hào)強(qiáng)度的中位值。首先將所有陣列的總強(qiáng)度的均縮放至目標(biāo)強(qiáng)度值500,每種轉(zhuǎn)錄本的信號(hào)強(qiáng)度則按比例進(jìn)行縮放，，并確定了5例CVS和5例末期胎盤組織中按比例縮放的轉(zhuǎn)錄本強(qiáng)度的中位值。,T^金^母舉i,哞應(yīng)產(chǎn)4這的脊z夷本的^^gir-PC/為Vvf的矛發(fā)使用6個(gè)一步實(shí)時(shí)QRT-PCR分析。通過(guò)QRT-PCR對(duì)IO例頭三月和10例末三月妊娠婦女的配對(duì)胎盤組織和血漿樣本中的6種所選胎盤mRNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量分析。在所有病例的胎盤組織中均能檢測(cè)到所述的6種轉(zhuǎn)錄本。這些轉(zhuǎn)錄本在頭三月和末三月妊娠期的母體血漿中的可檢測(cè)性和濃度的中位值總結(jié)在表1中。這些結(jié)果表明，所選的通過(guò)芯片分析鑒定的胎盤表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄本中的大部分的確能在母體血漿中檢測(cè)到。一般說(shuō)來(lái)，具有較高芯片信號(hào)強(qiáng)度中位值的轉(zhuǎn)錄本在母體血漿中更容易被檢測(cè)到。相反，對(duì)這6種被研究的胎盤表達(dá)基因中豐度最低的轉(zhuǎn)錄本觀察到零拷貝的母體血漿濃度中位值，即PLAC1在頭三月妊娠期及hCG)S與PLAC1在末三月妊娠期。因此，這些數(shù)據(jù)表明，如果在母體血漿中能夠明顯檢測(cè)到胎盤表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，則表明所述表達(dá)水平超過(guò)了芯片信號(hào)的閾值。為、遂^母?jìng)鰽,哞應(yīng)i襲這的脊z夷本的清^如果所研究的轉(zhuǎn)錄本是妊娠特異的，則預(yù)計(jì)其應(yīng)當(dāng)在分娩后從母體血漿中清除。如以往研究(Ngetal.,尸rac.A^/.爿ca^.100:4748-4753,2003;和Ngetal.,C"".C/^w.,49:727-731,2003)所述，分娩后hPL和CRHmRNA分子從母體血漿中快速清除。為探討TFPI2、KISS1和PLAC1mRNA從母體血漿中的清除，在分娩前和分娩后24小時(shí)從10例妊娠婦女獲取血漿樣本。在所述分娩前的血漿樣本中，TFPI2和KISS1mRNA濃度的中位值分別為112拷貝/mL和88拷貝/mL。兩種轉(zhuǎn)錄本在任何分娩后的血漿樣本中均未檢測(cè)到(圖8A和圖8B所示分別為TFPI2和KISS1mRNA)。對(duì)于PLAC1mRNA，在10例分4免前的血漿樣本中檢測(cè)到4例，而在任何產(chǎn)后樣本中均沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)(圖8C)。作為對(duì)照，在所有分娩前和分娩后的血漿樣本中均能4全測(cè)到GAPDHmRNA，而且其濃度沒(méi)有系統(tǒng)改變(Wilcoxon檢驗(yàn)，P=0.563)。^母?jìng)鱥,f哞^miA^4為Vvf乂,舉侵襲'/4靡產(chǎn)差^^這,遽/尹確"通過(guò)檢測(cè)母體血漿中的胎盤轉(zhuǎn)錄本水平可間接檢測(cè)胎盤中的基因表達(dá)水平，從而尋找直接的證據(jù)。通過(guò)QRT-PCR對(duì)來(lái)自IO例頭三月和IO例末三月妊娠婦女的配對(duì)胎盤和血漿樣本進(jìn)行hPL、hCG/5、CRH、TFPI2、KISS1和PLAC1mRNA分析。如果這些轉(zhuǎn)錄本在母體血漿中的水平確實(shí)反映了其在胎盤中的對(duì)應(yīng)水平，那么就應(yīng)該能在這些轉(zhuǎn)錄本在胎盤和母體血漿中的相對(duì)濃度之間觀察到陽(yáng)性相關(guān)性。一種表達(dá)這些轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)水平的可行方式是將其水平相對(duì)普通的胎盤特異轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。因hPLmRNA在妊娠全程中均能檢測(cè)到(Ngetal.,A^/.JcW.Sc/.t/&4，100:4748-4753,2003)，因此選擇hPLmRNA作為參考。通過(guò)將每一胎盤或血漿樣本中的轉(zhuǎn)錄本水平除以同一樣本中對(duì)應(yīng)的hPLmRNA的水平，來(lái)計(jì)算每種轉(zhuǎn)錄本的標(biāo)準(zhǔn)化水平。只對(duì)能在母體血漿中檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較。因在所有現(xiàn)有的頭三月和末三月妊娠期母體血漿系列樣本中分別沒(méi)有檢測(cè)到PLAC1和hCG/3,因此沒(méi)有將其包括在對(duì)應(yīng)的分析中。圖9A和圖9B顯示了胎盤和配對(duì)母體血漿中hCG/3、CRH、TFPI2、KISS1和PLAC1mRNA的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)錄本水平的圖象。在頭三月妊娠期(Spearman相關(guān)性分析，r=0.452,P<0.05)和末三月妊娠期(Spearman相關(guān)性分析，r=0.661，P〈0.05)的胎盤和母體血漿結(jié)果中均觀察到陽(yáng)性相關(guān)性。作為對(duì)照，也分析了兩種非胎盤特異的mRNA轉(zhuǎn)錄本對(duì)末三月樣本分析了/3-球蛋白，對(duì)頭三月和末三月樣本均分析了GAPDH。如圖9A和9B所示，這些非胎盤特異轉(zhuǎn)錄本明顯不依從所述胎盤特異轉(zhuǎn)錄本所表現(xiàn)出的相關(guān)性趨勢(shì)。這些數(shù)據(jù)表明，從母體血漿檢測(cè)到的所述胎盤特異mRNA的水平可用于評(píng)價(jià)胎盤的基因表達(dá)。C.結(jié)論開發(fā)了用于系統(tǒng)鑒定母體血漿中大規(guī)模的胎兒特異RNA標(biāo)志物的策略(圖7)。這一策略是在胎盤是母體血漿中循環(huán)胎兒RNA的重要來(lái)源，以及正常個(gè)體中血漿DNA的主要造血來(lái)源的發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的。用高密度寡核苷酸芯片來(lái)系統(tǒng)地鑒定大規(guī)模的胎盤表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，以及選擇用于母體血漿檢測(cè)的潛在的胎兒特異的轉(zhuǎn)錄本，其中放棄將血細(xì)胞表達(dá)的基因作為潛在的靶標(biāo)(附表A和B)。以往鑒定的編碼hPL、hCG/3和CRH的三種血漿胎盤特異mRNA標(biāo)志物出現(xiàn)在所述的靶標(biāo)列表中，并為所述轉(zhuǎn)錄本的選4奪策略提供了獨(dú)立的證明。此外，通過(guò)QRT-PCR在母體血漿中也檢測(cè)到所述列表中給出的三種鑒定的mRNA標(biāo)志物TFPI2、KISS1和PLAC1，并證明其胎盤組織表達(dá)水平高于某一閾值，而其在以往沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)可用于非侵襲性產(chǎn)前監(jiān)測(cè)。分娩后其從母體血漿中快速清除證實(shí)了所述胎盤特異性。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了用于鑒定母體血漿中胎兒特異轉(zhuǎn)錄本的策略。與所述的胎盤特異mRNA種類相對(duì)，沒(méi)有觀察到非胎盤特異轉(zhuǎn)錄本GAPDH和/3-球蛋白的血漿和胎盤標(biāo)準(zhǔn)化mRNA水平間的相關(guān)性。與所述胎盤特異轉(zhuǎn)錄本相比，母體血漿中存在相對(duì)較多的GAPDH和/3-球蛋白mRNA,其可以解釋為由母體組織例如造血細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生這種非胎盤特異轉(zhuǎn)錄本。綜上，本發(fā)明證明母體血漿中的循環(huán)胎盤mRNA可用于妊娠的檢測(cè)以及非侵襲性產(chǎn)前基因表達(dá)譜的檢測(cè)。本發(fā)明還對(duì)快速、系統(tǒng)地鑒定用于此目的的新胎盤mRNA標(biāo)志物的以芯片為基礎(chǔ)的方法進(jìn)行了概述。這種開發(fā)對(duì)于產(chǎn)生新的用于研究和監(jiān)測(cè)已知與胎盤病理學(xué)有關(guān)的諸如21號(hào)染色體三體性和先兆子癇的疾病狀態(tài)的標(biāo)志物具有特殊的意義。此外，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)對(duì)非妊娠相關(guān)的疾病也有意義。例如在癌癥患者的血漿/血清中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了腫瘤相關(guān)的mRNA(參見，例如Loetal.,C7/".CAew.,45:1292-1294,1999;和Silvaetal.,50:530-534，2002)，可利用相似的方法來(lái)快速產(chǎn)生新的血漿RNA為基礎(chǔ)的腫瘤標(biāo)志物。本申請(qǐng)將所引用的全部專利、專利申請(qǐng)以及出版物全文引入作為參考。表1ACVS樣本的芯片結(jié)果和頭三月妊娠期的母體血漿中六種所選胎盤<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表IB末期胎盤組織的芯片結(jié)果和末三月妊娠期母體血漿中六種所選胎盤轉(zhuǎn)錄本的QRT-PCR結(jié)果的,,^結(jié)"、,口<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>附表A.在CVS組織中50種較高表達(dá)的基因的芯片檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>附表B在末期胎盤組織中50個(gè)較高表達(dá)基因的基因芯片檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)錄本探針組ID號(hào)GenBank登錄號(hào)信號(hào)(中位值)絨毛膜生長(zhǎng)催乳素激素2(v.l)203807—x一atNM_020991.235768.0胎盤催乳素(克隆MGC:1451)211739—x—atBC005921.135732.4胎盤催乳素(v.4)208356—x—atNM—022642.135099.3"臺(tái)盤催乳素(v.l)202493—x—atNM—001317.233972.4生長(zhǎng)激素l(v.5)208068一x—atNM_022562.133265.8絨毛膜生長(zhǎng)催乳素激素樣l(v.2)208294x_atNM—022578.132947.1胎盤催乳素(v.3)208357一xatNM_022641.132826.0絨毛膜生長(zhǎng)催乳素激素2(v.4)208341一xatNM—022646.132231.7絨毛膜生長(zhǎng)催乳素激素2(v.3)208342一xatNM_022645.131623.2生長(zhǎng)激素1(v.4)208069一x一atNM—022561.130524.9絨毛膜生長(zhǎng)催乳素激素樣1(v.4)208295一xatNM—022580.130349.2絨毛膜生長(zhǎng)催乳素激素樣1(v.5)208293一x—at畫—022581.130076.9生長(zhǎng)激素1(v.2)206885—x—atNM—022559.129888.7妊娠特異^-l-糖蛋白9209594一x—atM34421.129462.1生長(zhǎng)激素1(v.l)205840一xat顧_000515.228856.8妊娠特異/3-1-糖蛋白6209738一xatM31125.128736.3絨毛膜生長(zhǎng)催乳素激素樣1(v.l)207285—x_atNM001318.228532.6生長(zhǎng)激素1(v.3)206886一x一atNM—022560.127576,2妊娠特異/3-l-糖蛋白1208257一x一atNM—006905.126521.2妊娠特異/3-1-糖蛋白3211741一x—atBC005924.126306.1生長(zhǎng)激素變體(GHV)mRNA211151—x—atAF185611.126127.2妊娠特異/3-1-糖蛋白3203399一xatNM021016.125987.8胎盤催乳素(v.2)206475_x—atNM—022640.125873.3絨毛膜生長(zhǎng)催乳素激素樣l(v.3)205958—x_atNM_022579.125597.7解聚素和金屬蛋白酶功能域12(v.2)204943_atNM_021641.125592.8妊娠特異^-l-糖蛋白3215821_x_atAB019570.124944.4*組織因子途徑抑制劑2209278—s_atL27624.124896.438<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>權(quán)利要求1.用于檢測(cè)婦女妊娠的試劑盒，包括(i)用于定量測(cè)定所述婦女血液中一種或多種mRNA的PCR引物，其中所述的mRNA獨(dú)立地選自編碼人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(hCRH)、人胎盤催乳素(hPL)、KiSS-1轉(zhuǎn)移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)和胎盤特異1(PLAC1)蛋白的mRNA；及(ii)代表正常非妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA的含量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述妊娠婦女的血液是無(wú)細(xì)胞的。3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中所述妊娠婦女的血液是血漿。4.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中所述妊娠婦女的血液是血全文摘要本發(fā)明涉及作為妊娠相關(guān)病癥的診斷標(biāo)志物的循環(huán)mRNA，具體地說(shuō)涉及用于妊娠相關(guān)病癥的試劑盒，更具體地說(shuō)，涉及通過(guò)定量分析母體血液中的一種或多種mRNA種類的含量來(lái)診斷、監(jiān)測(cè)或預(yù)測(cè)妊娠婦女的先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產(chǎn)的疾病狀態(tài)以及檢測(cè)婦女妊娠的試劑盒，所述的mRNA編碼人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(hCRH)、KiSS-1轉(zhuǎn)移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)或胎盤特異1(PLAC1)，所述試劑盒還包括該mRNA種類的含量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101260429SQ20081000592公開日2008年9月10日申請(qǐng)日期2004年1月16日優(yōu)先權(quán)日2003年1月17日發(fā)明者盧煜明,吳啟安,徐寶賢,趙慧君申請(qǐng)人:香港中文大學(xué)